Khóa luận Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP

Lặp lại 35 chu kỳ: 94oC – 1 phút; 33oC – 1 phút(**); 72oC – 2 phút. 72oC – 10 phút. Giữ 4oC. 42  Thí nghiệm 3: Thực hiện tăng số chu kỳ nhiệt độ lên 37 chu kỳ, đồng thời giữ nguyên nồng độ các thành phần phản ứng như thí nghiệm 2 (bảng 3.6). Thực hiện với 4 primer: 1, 2, 9 và 11. Bảng 3.6. Thí nghiệm 3. Các mẫu thực hiện Thành phần (25 μl/ống) Chu trình nhiệt TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 Taq buffer 10 X 1,5 mM MgCl2 0,5 U Taq polymerase 100 μM dNTPs 20 ng primer (0,65 μl) (*) 20 ng DNA khuôn Thêm nước đến 25 μl. 94 o C – 4 phút. Lặp lại 37 chu kỳ: 94 o C – 1 phút; 33 o C – 1 phút (**); 72 o C – 2 phút. 72 o C – 10 phút. Giữ 4oC.  Thí nghiệm 4: Chúng tôi thực hiện 6 nghiệm thức thay đổi nồng độ các thành phần tham gia phản ứng (được trình bày trong bảng 3.7), đồng thời giữ nguyên chu trình phản ứng như thí nghiệm 3. Sử dụng primer 11, thực hiện với DNA của các mẫu TT1, TT4 và TT8. Chu trình phản ứng thí nghiệm 4: 94oC – 4 phút. Lặp lại 37 chu kỳ: 94oC – 1 phút; 33oC – 1 phút; 72oC – 2 phút. 72oC – 10 phút. 4oC – tùy ý. 43 Bảng 3.7. Thí nghiệm 4. TP MgCl2 25 mM Taq poly- merase 5 U dNTPs 10 mM Primer Nƣớc và DNA template Thể tích hút (μl) Nồng độ cuối (mM) Thể tích hút (μl) Nồng độ cuối (U) Thể tích hút (μl) Nồng độ cuối (μM) Thể tích hút (μl) Lượng sử dụng (ng) NT1(ĐC) 1,5 1,5 0,1 0,5 0,25 100 0,65 20 2,5 μl Taq buffer 10x. Thêm nước sau cùng để đạt 25μl/ống. NT2 2 2 0,1 0,5 0,25 100 0,65 20 NT3 2 2 0,12 0,6 0,25 100 0,65 20 NT4 2 2 0,1 0,5 0,25 100 0,75 22 NT5 2 2 0,1 0,5 0,3 120 0,65 20 NT6 2 2 0,12 0,6 0,3 120 0,75 22 3.2.2.3. Kỹ thuật AFLP Thực hiện kỹ thuật AFLP với 8 mẫu DNA có chất lượng tốt (nồng độ DNA cao trên 100 ng/μl và tương đối sạch) là các mẫu: TT1, TT4, TT9, TT31, VT38, CĐ40, CĐ45, XM78.  Cắt giới hạn và gắn adapter: Kiểm tra phản ứng cắt DNA của enzyme: Sau khi có được DNA, bước đầu tiên là kiểm tra xem những enzyme cắt EcoRІ và MseІ có phù hợp với bộ gene đó hay không. Phản ứng cắt thử:  300 ng DNA bộ gene. NT 44  4 U enzyme EcoRI.  3 U enzyme MseI.  6 μl buffer 5 X. Để ở nhiệt độ phòng qua đêm hay ở 37oC trong 2h, sau đó để 15 phút ở 70oC. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5 %. Thực hiện phản ứng cắt giới hạn và gắn adapter: - Thực hiện biến tính adapter để bảo đảm các adapter hoàn toàn tách ra khỏi nhau:  Ủ ống chứa adapter ở 95oC trong 5 phút.  Để nguội đến nhiệt độ phòng.  Ly tâm 1.400 vòng/phút. - Chuẩn bị hỗn hợp enzyme (cho 20 mẫu): Cho vào ống 200 μl:  2 μl buffer 5 X T4 DNA ligase có ATP.  2 μl 0,5 M NaCl.  1 μl BSA1mg/ml (làm loãng từ dung dịch gốc 10 mg/ml).  20 Unit MseI.  100 Unit EcoRI.  20 Weiss Unit T4 DNA ligase.  Cho thêm nước cất siêu sạch để được 40 μl. Trộn kỹ, ly tâm trong 10 giây. Luôn giữ trong đá. - Chuẩn bị phản ứng cắt và gắn: Cho vào ống 200 μl/phản ứng:  1 μl buffer T4 DNA ligase 10 X có ATP ( hay 2 μl đệm T4 DNA ligase 5 X có ATP).  1 μl NaCl 0,5 M.  0,5 μl BSA1mg/ml. 45  1 μl MseI adapter.  1 μl EcoRI adapter.  1 μl hỗn hợp enzyme đã chuẩn bị ở trên.  Cho thêm 0,5 μl mẫu (mẫu đối chứng cho 5,5 μl DNA từ KIT). Trộn kỹ, ly tâm 10 giây. Để ở nhiệt độ phòng qua đêm hay 37oC trong 2 giờ.  Nhân bản tiền chọn lọc: Thành phần hỗn hợp phản ứng: - Pha loãng sản phẩm của phản ứng cắt và gắn adapter: Cho thêm 189 μl TE vào mỗi ống phản ứng cắt và gắn, bảo quản ở 4oC hay –20oC. - Trộn các thành phần sau trong ống 200 μl:  4 μl DNA đã cắt và pha loãng.  1 μl primer tiền nhân bản.  15 μl AFLP mix (P/N 402005). Chu trình nhiệt phản ứng nhân bản tiền chọn lọc: bảng 3.8. Bảng 3.8. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân bản tiền chọn lọc. Nhiệt độ và thời gian Chu trình Nhiệt độ và thời gian Nhiệt độ và thời gian Thực hiện 20 chu kỳ. 72 o C 2 phút. 94 o C 20 giây. 56 o C 30 giây. 72 o C 2 phút. 60 o C 30 giây. 4 o C giữ tùy ý. Kiểm tra sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc bằng gel agarose 1,5%. 46  Nhân bản chọn lọc: Để thực hiện bước này chúng tôi tiến hành chọn những tổ hợp primer EcoRI – MseI. Sau khi thực hiện phản ứng nhân bản chọn lọc xong, sản phẩm được điện di trên máy giải trình tự. Thành phần hỗn hợp phản ứng: - Chuẩn bị khuôn DNA:  10 μl sản phẩm tiền nhân bản.  190 μl đệm TE. Trộn kỹ, ly tâm 10 giây tốc độ thấp và giữ ở 4oC. - Chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 12 tổ hợp primer nhân bản chọn lọc:  MseI + CAA – EcoRI + ACT (phát màu xanh dương).  MseI + CAA – EcoRI + AAC (phát màu vàng).  MseI + CAA – EcoRI + AGG (phát màu xanh lá cây).  MseI + CAA – EcoRI + ACA (phát màu xanh dương).  MseI + CAA – EcoRI + AGC (phát màu vàng).  MseI + CAA – EcoRI + ACG (phát màu xanh lá cây).  MseI + CAG – EcoRI + ACT (phát màu xanh dương).  MseI + CAG – EcoRI + AAC (phát màu vàng).  MseI + CAG – EcoRI + AGG (phát màu xanh lá cây).  MseI + CAG – EcoRI + ACA (phát màu xanh dương).  MseI + CAG – EcoRI + AGC (phát màu vàng).  MseI + CAG – EcoRI + AAG (phát màu xanh lá cây). - Trộn hỗn hợp phản ứng:  3,0 μl sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc đã pha loãng.  1,0 μl primer MseI + Cxx (5 μM). 47  1,0 μl primer EcoRI + Axx đánh dấu huỳnh quang (1 μM).  15,0 μl hổn hợp AFLP (P/N 402005). (Luôn để hỗn hợp trong đá) Chu trình nhiệt phản ứng nhân bản chọn lọc: bảng 3.9. Bảng 3.9. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân bản chọn lọc. Nhiệt độ, thời gian Chu trình Số chu kỳ 94 oC, 2 phút. 60 oC, 30 phút. 4 oC, giữ tùy ý. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 66 o C, 30 giây. 65 oC, 30 giây. 64 oC, 30 giây. 63 oC, 30 giây. 62 oC, 30 giây. 61 oC, 30 giây. 60 oC, 30 giây. 59 oC, 30 giây. 58 oC, 30 giây. 57 oC, 30 giây. 56 oC, 30 giây. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 20 1 1  Điện di: Kết quả phản ứng nhân bản chọn lọc được điện di trên máy giải trình tự AB sequencer 3100. 48 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau thời gian thực hiện các thí nghiệm chúng tôi thu được một số kết quả: 4.1. Phần điều tra và thu thập mẫu lá cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Sau giai đoạn thu thập mẫu chúng tôi có được 80 mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật và điển hình tại các địa phương thuộc tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu: Thành phố Vũng Tàu; Thị xã Bà Rịa; các huyện: Châu Đức, Long Điền, Long Đất, Tân Thành, Xuyên Mộc. Đặc điểm các mẫu được thống kê trong bảng 4.1 Bảng 4.1. Kết quả thu thập mẫu lá cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Đặc điểm cây chọn lấy mẫu Tỉ lệ % Năng suất Cao 79 % (63/80 mẫu) Thấp 21 % (17/80 mẫu) Hoa Ra nhiều hoa 90 % (72/80 mẫu) Ra ít hoa 10 % (8/80 mẫu) Ra hoa sớm 71 % (56/80 mẫu) Ra hoa muộn 29 % (24/80 mẫu) Ra hoa một đợt 55 % (44/80 mẫu) Ra hoa nhiều đợt 45 % (36/80mẫu) Hoa nở đồng loạt 59 % (47/80 mẫu) Hoa nở phân tán 41 % (33/80 mẫu) 49 Chùm Nhiều chùm 65 % (52/80 mẫu) Ít chùm 22 % (18/80 mẫu) Chùm có nhiều hạt 81 % (65/80 mẫu) Chùm có ít hạt 19 % (15/80 mẫu) Hạt To 73 % (58/80 mẫu) Nhỏ 27 % (22/80 mẫu) Thân và cành cây Sum suê 86 % (69/80 mẫu) Thưa thớt 14 % (11/80 mẫu) Hiện tƣợng rụng trái non Nhiều 22 % (18/80 mẫu) Ít 68 % (55/80 mẫu) Quả giả To 37 % (30/80 mẫu) Nhỏ 63 % (50/80 mẫu) Quả màu vàng 33 % (26/80 mẫu) Quả màu đỏ 67 % (54/80 mẫu) Quả ngon 23 % (18/80 mẫu) Quả dở 4 % (5/80 mẫu) Khả năng chống chịu sâu hại Cao 100 % (80/80 mẫu) Thấp 0 % (0/80 mẫu) Khả năng chống chịu bệnh Cao 76 % (62/80 mẫu) Thấp 24 % (18/80 mẫu) 50 Như vậy, thông qua điều tra và thu thập mẫu chúng tôi nhận thấy sự phân bố kiểu hình của cây điều ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu rất đa dạng. 4.2. Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm 4.2.1. Kết quả tách chiết DNA 4.2.1.1. Kết quả chung Chúng tôi thực hiện tách chiết DNA 80 mẫu lá điều thu thập được, kết quả có 55 mẫu đạt yêu cầu, đạt tỉ lệ khoảng 70 %. Chúng tôi chỉ sử dụng những mẫu DNA sau khi tách chiết điện di thấy có band và đo OD thấy giá trị OD từ 1,5 trở lên. Nồng độ DNA trung bình khoảng 70 – 80 ng/μl. Chất lượng DNA được chia làm 2 nhóm:  Tỉ số OD từ 1,5 – 1,8: Có chất lượng trung bình, có 16/55 mẫu, chiếm 29 %.  Tỉ số OD từ 1,8 – 2,2: Có chất lượng tốt, có 39/55 mẫu, chiếm 71 %. Kết quả được minh họa trên hình 4.1. Hình 4.1 Kết quả tách chiết DNA lá điều tươi trưởng thành. 4.2.1.2. Một số vấn đề tách chiết DNA ở lá điều  Đặc điểm: Sau khi tách chiết, DNA lá điều thường bị gãy nhiều (hình 4.1), có lẽ do tế bào lá điều có lớp thành tế bào dày và cứng, khó nghiền nên khi nghiền mạnh tay dễ làm gãy DNA. Lượng DNA thu được trong nghiên cứu này không cao, TT1 TT7 TT13 TT27TT33 CĐ45CĐ50 CĐ79 51 trung bình khoảng 70 – 80 ng/μl, có thể do lá điều có nhiều chất thứ cấp khác như polyphenol, polypeptide,…gây khó khăn cho quá trình tách chiết. Một số mẫu có nồng độ DNA rất thấp (khoảng 30 ng/μl trở xuống) đều là của những mẫu lá non hay những lá đã trưởng thành nhưng còn mềm.  Khó khăn: Khó tách DNA từ lá điều còn non. Trong 80 mẫu thực hiện có 25 mẫu lá non cho kết quả tách chiết DNA không tốt (giá trị OD cao hơn 1,8 nhưng nồng độ DNA rất thấp, khi điện di không thấy kết quả). Lặp lại việc tách 25 mẫu lá non trên khoảng 2 – 3 lần nhưng vẫn không cho kết quả. Điều này có thể do lá non đang trong thời kỳ sinh trưởng mạnh nên nồng độ các hợp chất thứ cấp nhiều, ảnh hưởng không tốt đến việc tách chiết DNA, ngoài ra trong lá non hàm lượng nước cao làm cho số lượng DNA trong lá non ít hơn lá trưởng thành (hình 4.2). Hình 4.2 Kết quả tách chiết DNA lá điều tươi còn non  Biện pháp khắc phục: Đối với lá điều trưởng thành: Chúng tôi cũng đưa ra một số lưu ý khi thực hiện quá trình tách chiết: - Bước 1: Bước này cần phải giữ cho lá không bị khô trước khi nghiền, công đoạn nghiền phải đều tay, không nghiền mạnh. Sử dụng máy vortex khuấy trộn kỹ ở tốc độ thấp, khoảng 600 – 1.000 vòng/phút. TT16 TT20TT23 TT26TT28 TT30 52 - Bước 2: Thêm 500 μl chloroform : isoamylalcohol (24:1), sau đó có thể dùng máy vortex khuấy trộn ở tốc độ thấp như bước 1 hay chỉ cần đảo nhẹ trong khoảng 10 phút để hạn chế gãy DNA. - Bước 3: Chỉ nên hút khoảng 500 μl dịch ở bên trên, tránh chạm đầu tip vào phần ngăn cách giữa 2 pha vì đây là phần chứa nhiều protein bị loại bỏ. - Bước 4: Chỉ nên hút khoảng 250 – 300 μl dịch trích. - Bước 5: Thêm vào 250 μl dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –20oC trong khoảng 1 giờ (nên để qua đêm). Nên lấy tỉ lệ DNA : dung dịch isopropanol lạnh = 1 : 1. - Bước7: Cho vào 300 μl TE 1 X, ủ 37oC trong 1 giờ. Có thể chỉ để khoảng 30 phút vì mục đích của bước này chỉ để cho DNA tan ra. - Bước 11: Lặp lại bước 10, để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 μl TE 1 X, ủ ở 37oC trong 30 phút, phải để thật khô, không còn ethanol trong kết tủa DNA do ethanol ảnh hưởng xấu tới DNA và phản ứng PCR. Đối với lá điều non: Có thể tăng nồng độ các hóa chất có tác dụng làm kết tủa protein, peptide, polyphenol,…như CTAB, mercaptroethanol, chloroform,… và tăng lượng mẫu lá. 4.2.2. Kết quả thực hiện kỹ thuật RAPD, bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền và nhận diện một số band có thể là chỉ thị phân tử 4.2.2.1. Kết quả thí nghiệm 1: Thực hiện theo quy trình của các tác giả nƣớc ngoài Bước đầu chúng tôi đã thực hiện theo quy trình của Samal và ctv (2002) đưa ra nhưng không thấy kết quả với cả 4 primer đã dùng. Kết quả PCR – RAPD với primer 11 được trình bày trên hình 4.3. 53 Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD primer 11 của thí nghiệm 1. Chúng tôi nhận định có thể do việc sử dụng hóa chất khác nguồn gốc nên việc áp dụng theo quy trình của các tác giả trên là không phù hợp. Mặt khác chúng tôi nhận thấy việc thực hiện tới 45 chu kỳ là quá nhiều, vì vậy chúng tôi đưa ra thí nghiệm 2 có 35 chu kỳ phản ứng và nồng độ các thành phần của phản ứng được giữ nguyên. 4.2.2.2 . Kết quả thí nghiệm 2: Giảm số chu kỳ xuống còn 35 chu kỳ và giử nguyên thành phần hoá chất nhƣ thí nghiệm 1 Sau khi thực hiện PCR – RAPD thu được kết quả với primer 1 và primer 11, trong khi primer 2 và 9 không có kết quả (hình 4.4). (A) (B) Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 2 với primer 11 (A) và primer 2 (B). Chúng tôi nhận thấy phản ứng PCR với primer 1 và primer 11đã có sản phẩm nhưng mờ, không thể hiện được bản chất của kỹ thuật RAPD là cho nhiều band với TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 54 khả năng nhân bản lớn do sử dụng primer ngẫu nhiên, vì vậy chúng tôi thực hiện thí nghiệm 3: tăng số chu kỳ phản ứng lên 36 và 37 chu kỳ và giữ nguyên nồng độ các hoá chất. Đối với primer 2 và 9 không thấy kết quả, chúng tôi tiếp tục thực hiện với thí nghiệm 3. 4.2.2.3. Kết quả thí nghiệm 3: Tăng số chu kỳ lên 37 chu kỳ và giữ nguyên thành phần hoá chất nhƣ thí nghiệm 1 Thực hiện phản ứng PCR qua 37 chu kỳ, với primer 1 và 11, số band xuất hiện nhiều hơn song còn mờ trong khi với primer 2 và 9 vẫn không có kết quả (hình 4.5). (C) (D) Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 3 với primer 11 (C) và primer 2 (D) Với primer 2 và 9 chúng tôi nhận thấy không có khả năng nhân bản DNA lá điều đã thu thập được, vì vậy chúng tôi không sử dụng 2 primer này ở các bước nghiên cứu tiếp theo. Với primer 1 và 11 chúng tôi nhận thấy primer 11 cho số band nhiều hơn và các band sáng hơn, do đó chúng tôi chọn primer 11 để tiến hành tiếp. Chúng tôi đã thử số chu kỳ nhiều hơn với primer 11song kết quả cũng không tốt hơn. Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm 4 bằng cách thay đổi nồng độ các hóa chất phản ứng và giữ nguyên 37chu kỳ. Chúng tôi nhận định vấn đề chủ yếu nằm ở việc tối ưu hóa nồng độ của MgCl2, nồng độ của Taq polymerase, dNTPs, primer, vì vậy chúng tôi đưa ra 5 nghiệm thức (NT) thay đổi nồng độ của MgCl2 kết hợp với việc thay đổi nồng độ của TT1TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 55 Taq polymerase, dNTPs, primer và 1 nghiệm thức giữ nguyên nồng độ các chất như ở thí nghiệm 3 để làm đối chứng (ĐC). 4.2.2.4 . Kết quả thí nghiệm 4: Thay đổi thành phần hóa chất, thực hiện phản ứng PCR qua 37 chu kỳ Tiến hành trên 3 mẫu TT1, TT4 và TT8, chúng tôi thu được kết quả, được trình bày trong hình 4.6. (E) (F) Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 4 với primer 11 (E) và (F). Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 Nghiệm thức 4 Nghiệm thức 5 Nghiệm thức 6 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 56 Chúng tôi nhận thấy sau khi tăng nồng độ của MgCl2, phản ứng PCR có hiệu quả hơn nhiều, các nghiệm thức NT2, NT3, NT4, NT5, NT6 xuất hiện nhiều band hơn hẳn so NT1 và độ sáng của các band cũng tăng lên rõ rệt. Chúng tôi thấy NT5 và NT6 cho kết quả tốt hơn cả, trong khi NT6 tăng cả MgCl2, Taq polymerase, dNTPs và primer thì NT5 chỉ tăng MgCl2 và dNTPs, đồng thời sau một vài lần thực hiện lặp lại NT5 chúng tôi thấy NT5 cho kết quả khá ổn định, do đó chúng tôi thống nhất chọn NT5 để thực hiện phản ứng PCR – RAPD cho tất cả các mẫu ly trích được DNA. Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD được trình bày trong bảng 4.2. Bảng 4.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD. Thành phần hóa chất (25 μl/ống) Chu trình nhiệt Taq buffer 10 X 2 mM MgCl2 0,5 U Taq polymerase 120 μM dNTPs 20 ng primer11 20 ng DNA khuôn. Thêm nước để đạt 25 μl. 94 o C – 4 phút. Lặp lại 37 chu kỳ: 94 o C – 1 phút; 33 o C – 1 phút; 72 o C – 2 phút. 72 o C – 10 phút. 4 o C – giữ. 4.2.2.5. Kết quả thực hiện kỹ thuật PCR – RAPD trên các mẫu DNA thu đƣợc Khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD với 50 mẫu DNA, kết quả có 41/50 mẫu có kết quả, đạt tỉ lệ 82 %. Những mẫu không có kết quả, khi so sánh với kết quả tách chiết DNA chúng tôi nhận thấy những mẫu này có nồng độ DNA rất thấp (dưới 30 ng/μl), vì vậy chúng tôi nghi ngờ rằng trong khi hút DNA để thực hiện PCR – RAPD, do nồng độ quá thấp nên đã không hút đủ lượng DNA cần thiết. Các kết quả điện di được trình bày trong hình 4.7, 4.8 và 4.9. 57 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT1 – TT13. Hình 4.7 là kết quả điện di các mẫu từ TT1 – TT13 cho thấy có 3 band đồng hình và 6 band đa hình. Band đồng hình là những band có ở tất cả các mẫu, band đa hình là những band có ở mẫu này mà không có ở mẫu kia. Trên hình 4.7 ta thấy mẫu TT1 không có band 750 base pairs, 2300 base pairs, TT5 không có band 1600 base pairs, TT6 không có band 1600 base pairs. Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT14 – TT25 Từ hình 4.8 chúng tôi nhận thấy có mẫu TT24 và TT25 cho kết quả không tốt, vì vậy chúng tôi không sử dụng làm kết quả đánh giá đa dạng di truyền. TT14 TT15 TT17TT19 TT21 TT22 TT24 TT25 La Kết quả PCR – RAPD không tốt TT01 TT04 TT05 TT06 TT07 La TT08 TT09 TT10 TT11 TT12 TT13 Band khó xác định Band đa hình Band đồng hình 58 Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT27 – XM79. Chúng tôi chia hình 4.9 ra thành 2 hình cho dễ phân tích: hình 4.9A và 4.9B. Hình 4.9A Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT27–CD53. Khi sử dụng kỹ thuật RAPD với 11 primer để đánh giá tính đa dạng di truyền của các giống điều (Samal và ctv, 2002) thì với primer 11 đã thu được 11 band trong đó có 9 band đa hình và 2 band đồng hình, điều này chứng tỏ primer 11 cho kết quả có tính đa hình cao và khá ổn định [7] [15]. TT TT TT TT TT VT CD CD La CD CD CD CD BR BR BR CD 27 29 31 33 36 38 39 40 41 43 44 45 46 49 50 53 Band đa hình 59 Hình 4.9B Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR– RAPD các mẫu từ XM61– M79. Vì một số band khó nhận biết bằng mắt thường nên chúng tôi sử dụng công cụ Detectband của phần mềm Quantity One 4.2.1 trong máy Geldoc để phát hiện band. Hình 4.10 Màn hình phát hiện band các kết quả PCR – RAPD. Chúng tôi đã phát hiện được 3/11 band đồng hình, chiếm tỉ lệ khoảng 27,3 % tổng số các band được phát hiện, có độ dài khoảng 550 base pairs, 900 base pairs và 1050 base pairs. La CĐ CĐ CĐ CĐ BR BR BR TT La XM XM XM XM XMXMXMXM a 41 43 44 45 46 49 50 53 61 64 70 72 76 77 78 79 60 Đối với tất cả các mẫu đã thực hiện thành công phản ứng PCR – RAPD có 8/11 band đa hình được phát hiện, chiếm tỉ lệ 72,7 % tổng số các band được phát hiện. Đặc điểm của các band đa hình được trình bày trong bảng 4.3. Bảng 4.3. Các band đa hình và mối liên quan với các đặc điểm của cây lấy mẫu. Các band Số lƣợng mẫu có Những đặc điểm chung của những cây có tạo band đa hình 600 base pairs 17/41 mẫu, tỉ lệ 41 %. Có đến 16/17 mẫu là của những cây cho rất nhiều hoa, ra hoa sớm và năng suất rất cao, vì vậy chúng tôi giả thuyết có thể band 600base pairs là chỉ thị phân tử của những tính trạng ra hoa sớm, rất nhiều hoa và năng suất rất cao. 700 base pairs 2/41 mẫu, tỉ lệ 5 %. Mẫu CĐ39 và CĐ41 giống nhau và khá đặc biệt so với những mẫu khác, trong đó có tính trạng trái đỏ, rất ngon nhưng ít hạt. Chúng tôi giả định có thể band 700base pairs này là chỉ thị của tính trạng trái đỏ và rất ngon. 750 base pairs 35/41 mẫu, tỉ lệ 85 %. Chưa xác định. 1200 base pairs 25/41 mẫu, tỉ lệ 61 %. Chưa xác định. 1400 base pairs 27/41 mẫu, tỉ lệ 66 %. Chưa xác định. 1600 base pairs 26/41 mẫu, tỉ lệ 63 %. Chưa xác định. 1900 base pairs 35/41 mẫu, tỉ lệ 85 %. Chưa xác định. 2300 base pairs 30/41 mẫu, tỉ lệ 73 %. Chưa xác định. Khi điện di bằng gel agarose, độ dài của các band sẽ không thật sự chính xác do những hạn chế của gel agarose. Những band trên bản điện di có thể không hoàn toàn bằng nhau nhưng không thể phát hiện bằng mắt thường. Có thể giải trình tự của 61 những band đa hình này để biết chính xác độ dài và trình tự của chúng có thật sự bằng nhau hay không. Trong 8 band đa hình mà chúng tôi phát hiện được, các band 600 base pairs, 700 base pairs là 2 band rất đáng quan tâm, có thể giải trình tự và sử dụng như những chỉ thị phân tử để phân biệt những cây có những tính trạng đáng quan tâm (thống kê ở bảng 4.3). 4.2.2.6. Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD khá ổn định, cho nhiều band, có độ phân giải và độ sáng khá tốt, song còn một số vấn đề:  Khả năng nhân bản qua phản ứng PCR cao, tuy nhiên khả năng làm phát sinh chỉ thị phân tử lại thấp, thể hiện ở mức độ giống nhau về số lượng và độ dài các band trong tổng số các mẫu thực hiện PCR – RAPD thành công. Như vậy, hiệu quả phát hiện chỉ thị phân tử bằng kỹ thuật RAPD có hạn chế.  Một số mẫu không ra kết quả tốt: Chúng tôi nhận thấy một điều là những mẫu ra kết quả không tốt là những mẫu lá trưởng thành nhưng còn mềm, có nồng độ DNA ly trích được rất thấp (chỉ khoảng 20 – 30 ng/μl). Với những mẫu này có thể thực hiện lại và có thể cho nhiều hơn 1 μl DNA khuôn vào hỗn hợp phản ứng.  Một số band tách không rõ: Có thể trong quá trình điện di, các band có độ dài gần bằng nhau nên khó tách ra rõ ràng. Chúng tôi sử dụng nồng độ 2 % agarose và điện di ở 50 V trong 1 h cho độ phân tách cao hơn, đồng thời điện di trong bồn lớn hơn xong vẫn gặp một số khó khăn, điển hình là các band di chuyển không đều, có thể do điện cực bị cong hay do hiệu ứng thành máy điện di ảnh hưởng đến sự di chuyển của các DNA. Những mẫu này nên thực hiện lại phản ứng PCR hay chạy điện di lại, cho lượng mẫu nhiều hơn và chỉnh sửa máy điện di có thể cho kết quả tốt hơn. 4.2.2.7. Phân tích kết quả phản ứng PCR – RAPD bằng phần mềm NTSYS Kết quả phát hiện band được đem sử lý bằng phần mềm NTSYSpc2.1. Các band được mã hoá dạng nhị phân, theo nguyên tắc có band thì ghi 1 và không có band thì ghi 0 (phụ lục 5). Kết quả được hiển thị theo dạng số liệu và dạng cây di truyền. 62 4.2.2.8. Đánh giá đa dạng di truyền Đánh giá đa dạng di truyền thông qua cây di truyền dựa trên các yếu tố:  Hệ số tương đồng di truyền.  Mức độ phân nhánh của cây di truyền. Trên địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, các huyện Tân Thành, Xuyên Mộc và Châu Đức có diện tích trồng điều nhiều nhất, vì vậy chúng tôi chủ yếu thu thập mẫu ở những huyện này. Khi đánh giá đa dạng di truyền của cây điều của từng huyện chúng tôi có các kết quả sau: Đa dạng di truyền của cây điều ở huyện Châu Đức: Có 7 mẫu có kết quả PCR – RAPD, kết quả đánh giá đa dạng di truyền được hiển thị theo dạng bảng và dạng cây di truyền (hình 4.11 và 4.12). Hình 4.11. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS đối với các mẫu thu được tại huyện Châu Đức. Bảng số liệu hiển thị mức độ tương quan di truyền giữa các mẫu một cách chính xác và cụ thể, song không tiện để đánh giá tổng thể nhiều mẫu nên thường sử dụng dạng cây di truyền để phân tích. 63 Hình 4.12. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Châu Đức. Các mẫu cây điều thu được ở huyện Châu Đức chia làm 2 nhánh riêng biệt, có mức độ tương đồng về di truyền khoảng 52 %. Nổi bật là CD39 và CD44 giống nhau đến khoảng 91 %, trong khi CD39 cho năng suất không cao nhưng CD44 lại cho năng suất rất cao. Các mẫu có mức độ giống nhau từ 73 % - 91 %, chia ra làm 5 nhánh nhỏ (trung bình 1,4 mẫu/nhánh). Nhận xét chung là tính đa dạng di truyền ở mức trung bình khá. Đa dạng di truyền của cây điều ở huyện Xuyên Mộc (hình 4.13): Các mẫu cây điều thu được ở huyện Xuyên Mộc chia làm 2 nhánh khác biệt, có mức độ tương đồng di truyền khoảng 61 %. Điểm đặc biệt là các cây thu thập được mẫu của huyện Xuyên Mộc đều có tính chất chung là năng suất rất cao nhưng lại thuộc những nhánh khác biệt nhau, dù mức độ khác biệt không cao (từ 80 % – 90 %). Cây di truyền chia ra làm 6 nhánh, trung bình 1,3 mẫu/nhánh). Các cây điều ở huyện Xuyên Mộc có thể có mức độ đa dạng cao hơn huyện Châu Đức. 0,52 0,62 0,71 0,81 0,91 Coefficient CD39 CD44 CD40 CD43 CD45 CD41 CD53 64 Hình 4.13. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Xuyên Mộc. Đa dạng di truyền của cây điều ở huyện Tân Thành (hình 4.14). Hình 4.14. Cây di truyền các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Tân Thành. 0,68 0,76 0,84 0,92 1,0 Coefficient TT1 TT29 TT31 TT4 TT7 TT10 TT11 TT12 TT22 TT21 TT6 TT8 TT33 TT9 TT14 TT5 TT13 TT15 TT19 TT17 TT27 TT36 0,61 0,71 0,81 0,90 1,0 Coefficient XM61 XM64 XM70 XM72 XM78 XM76 XM77 XM79 65 Các mẫu cây điều thu được ở huyện Tân Thành chia ra làm 2 nhánh tương đồng di truyền khoảng 68 %, tuy chia ra nhiều nhánh nhỏ (12 nhánh, trung bình 1,8 mẫu/nhánh) nhưng lại có mức độ tương đồng di truyền khá cao, do có nhiều mẫu hoàn toàn giống nhau về di truyền và một số mẫu có mức độ tương đồng di truyền khá cao (80 % - 90 %), vì vậy mức độ đa dạng di truyền chỉ ở mức trung bình. Đặc biệt có TT12 có tính trạng ra hoa nhiều nhưng trễ, rụng trái non nhiều lại hoàn toàn giống với TT4, TT7, TT10, TT22 ra hoa sớm và ít rụng trái non. Tương tự, TT13 cũng mang những tính trạng hoàn toàn khác biệt so với TT15 và TT19 nhưng 3 mẫu này lại hoàn toàn tương đồng nhau về di truyền. Các cây điều thu được ở Thị xã Bà Rịa và Thành phố Vũng Tàu: Đây là 2 nơi chúng tôi thu thập được ít mẫu nhất do diện tích canh tác rất ít và phân tán, do vậy không phát hiện được những cá thể nổi trội (hình 4.15). Hình 4.15. Cây di truyền các cây điều đã lấy mẫu ở Thị xã Bà Rịa và Thành phố Vũng Tàu. Tóm lại, bước đầu chúng tôi nhận thấy quần thể điều tại các địa phương trong tỉnh chỉ ở mức trung bình. Để giải thích điều này có nhiều lý do, song chúng tôi nhận định một lý do chủ yếu là: Địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có điều kiện tự nhiên (đất đai và khí hậu) phù hợp cho việc canh tác cây điều với mục đích kinh tế là chính, vì vậy nông dân thường chọn mua cây giống có chất lượng tốt từ các công ty giống hay chọn những cây mẹ có chất lượng tốt nhất lấy hạt làm giống, vì vậy làm cho quần thể điều của tỉnh có mức độ tương đồng di truyền cao. 0,60 0,63 0,65 0,67 0,70 Coefficient VT38 BR46 BR49 BR50 66 Qua phỏng vấn nông hộ chúng tôi nhận thấy người nông dân thích chọn những cây điều có những đặc điểm: năng suất cao, ra hoa nhiều (tốt nhất là ra hoa nhiều và sớm để tránh bị ảnh hưởng của sương muối và thời tiết quá khô hạn) và hạt to. Chúng tôi thực hiện đánh giá mức độ đa dạng di truyền của những đặc điểm này và thu được kết quả: Với đặc điểm cho năng suất cao: Trong 41 mẫu thực hiện thành công phản ứng PCR – RAPD có 31 mẫu cho năng suất rất cao. Mức độ đa dạng di truyền được đánh giá thông qua cây di truyền (hình 4.16). Hình 4.16. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm cho năng suất cao. 0,57 0,68 0,79 0,89 1,00 Coefficient TT1 TT29 CD44 BR49 TT4 TT6 TT8 TT10 TT11 TT22 XM72 XM78 TT33 BR50 CD53 XM76 TT15 TT17 TT27 XM64 XM70 TT5 TT19 TT36 XM77 BR46 TT31 CD45 CD43 CD40 XM79 67 Với đặc điểm cho năng suất cao, các cây điều của tỉnh chia ra làm 2 nhánh lớn có mức độ tương đồng khoảng 57 %, trong đó các nhánh lại phân thành nhiều nhóm nhỏ khác. Mặc dù được phân thành nhiều nhóm nhỏ (21 nhóm, trung bình 1,5 mẫu/nhóm) nhưng các cá thể cùng nhóm lại có mức độ tương đồng khá cao (như CD40 và XM79 có mức độ tương đồng khoảng 90 %). Những cá thể điều cho năng suất cao ở huyện Tân Thành có mức độ tương đồng rất cao, có thể đến 100 % (theo hướng mũi tên trên hình 4.16). Vì vậy, nhận xét chung của chúng tôi là tính đa dạng của các cây điều cho năng suất cao tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu ở mức trung bình, có nghĩa là các cây điều cho năng suất cao ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có mức độ tương đồng về bản chất di truyền cao, điều này có thể giải thích dựa vào cách nông dân nhân giống điều và sử dụng cây giống của các công ty giống cây trồng. Điều này chứng tỏ nông dân trong tỉnh đã có ý thức khá tốt về việc canh tác cây điều, rất thuận lợi cho chiến lược phát triển cây điều cao sản của tỉnh. Với đặc điểm cho hạt to: Cây di truyền biểu hiện 15 mẫu của những cây cho hạt rất to (hình 4.17). Hình 4.17. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm cho hạt to. 0,59 0,69 0,80 0,90 1,0 Coefficient TT1 TT33 BR49 CD39 TT5 TT13 TT7 TT14 CD45 CD53 XM64 XM70 XM72 XM76 CD41 68 Đặc điểm cho hạt rất to chia ra làm 2 nhánh có mức tương đồng di truyền khoảng 59 %, trong đó các cá thể trong từng nhánh nhỏ có mức tương đồng khá cao (từ 65 % - 100%). Cây di truyền chia ra làm 14 nhánh, trung bình 1,1 mẫu/nhánh. Điều này nói lên tính đa dạng di truyền cao của các cá thể mang đặc điểm cho hạt to. Đặc điểm hạt to được người nông dân rất ưa chuộng, do bán được giá cao hơn so với hạt nhỏ, còn có thể cho năng suất cao hơn nếu như cây cho nhiều hoa và đậu nhiều quả. Đặc điểm ra hoa nhiều: Cây di truyền thể hiện 22 mẫu các cây ra hoa nhiều (hình 4.18). Hình 4.18. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm ra hoa nhiều. Cây di truyền phân thành 2 nhánh có mức độ tương đồng di truyền khoảng 66 %. Chúng tôi vẫn thấy các cây điều tại huyện Tân Thành có mức độ tương đồng rất cao (hướng mũi tên), TT12 cho hoa nhiều nhưng rất trễ nhưng lại hoàn toàn giống với TT4, TT7, TT22 cho hoa rất sớm. Cây di truyền chia ra làm 13 nhánh, trung bình 1,7 0,66 0,75 0,83 0,92 1,0 Coefficient TT4 TT7 TT10 TT11 TT12 TT22 XM72 XM78 BR50 XM76 TT27 XM64 XM70 XM79 TT13 TT15 TT17 BR46 XM77 TT29 TT31 CD41 69 mẫu/nhánh, các mẫu tương đồng nhau từ 73 % - 100 %. Đánh giá chung tính đa dạng di truyền của đặc điểm ra hoa nhiều chỉ ở mức trung bình. Như vậy, khi đánh giá tính đa dạng di truyền của các cây điều dựa trên những đặc điểm nổi bật chúng tôi thấy mức độ tương đồng về di truyền của các cá thể đối với từng đặc điểm nổi bật vẫn rất cao, đồng thời nhận thấy các cây điều của huyện Tân Thành có đặc điểm cho năng suất cao liên quan chặt chẽ với đặc điểm ra hoa nhiều. Cây điều của huyện Tân Thành có mức độ tương đồng di truyền rất cao, ở cả 3 đặc điểm: cho năng suất cao, hạt to và ra nhiều hoa. 4.2.2.9. Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Chúng tôi đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu trên cơ sở các mẫu đã thu thập (hình 4.19). Quần thể điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu về di truyền được chia ra làm 2 nhánh I và II có mức độ tương đồng di truyền khoảng 59 %. Trong đó:  Nhánh I chia ra làm 2 nhánh nhỏ hơn: IB chỉ có BR49 có mức độ tương đồng di truyền khoảng 75 % với IA gồm 4 mẫu. Tại nhánh IA có CD39 có những đặc điểm khác biệt hoàn toàn so với CD44 nhưng 2 mẫu này lại giống nhau đến khoảng 92 %.  Tại nhánh II, chia ra làm 2 nhánh IIA và IIB. Nhánh IIB chỉ có CD41 có mức độ tương đồng di truyền khoảng 62 % với nhánh IIA – nhánh có nhiều mẫu nhất. Nhánh IIA chia thành 2 nhánh nhỏ hơn IIA1 và IIA2 có mức độ tương đồng di truyền khoảng 72 %. Các mẫu có thể có những đặc điểm giống nhau (năng suất cao, hạt to, chống chịu sâu bệnh tốt,…) nhưng lại có bản chất di truyền giống nhau khoảng 75 % đến 100 % (TT5, TT17, TT36, XM77,…). Ngược lại, có những mẫu có một số tính trạng hoàn toàn trái ngược nhau nhưng lại hoàn toàn giống nhau về di truyền (TT12 ra hoa nhiều nhưng nở trễ, rụng nhiều trái non lại được xếp chung với TT10, TT11, TT22,…không mang đặc điểm giống TT12). 70 Hình 4.19. Cây di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Theo như cây di truyền, quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu được chia thành 26 nhánh, trung bình mỗi nhánh có 1,6 mẫu, có mức độ tương đồng di truyền từ 59 % đến 100 %. Theo đánh giá của chúng tôi thông qua kỹ thuật RAPD, quần thể 0,59 0,69 0,79 0,90 1,0 Coefficient I II IIA IIB IIA2 IIA1 IIA1.1 IIA1.2 IA IB 71 điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có tính đa dạng di truyền ở mức từ trung bình đến trung bình khá. Chúng tôi nhận thấy quần thể điều tại huyện Tân Thành có mức độ phân bố rộng nhất, đồng thời có mức độ tương đồng di truyền cao nhất, thể hiện ở điều có nhiều mẫu hoàn toàn giống nhau (hướng mũi tên). Quần thể cây điều tại huyện Xuyên Mộc cũng có mức độ đa dạng di truyền khá cao, đồng thời có bản chất di truyền giống với quần thể điều của huyện Tân Thành. Quần thể điều ở huyện Châu Đức có mức độ đa dạng khá cao, biểu hiện ở mức độ phân bố phân tán rộng trên cây di truyền, đồng thời bản chất di truyền cũng khá gần với quần thể điều ở huyện Tân Thành. Như vậy, với mức độ đa dạng di truyền cao cho thấy quần thể điều của các huyện Châu Đức, Tân Thành, Xuyên Mộc khá đa dạng, đồng thời có mức độ tương đồng di truyền cao với các quần thể điều của các huyện khác cho thấy quần thể điều của các huyện Châu Đức, Tân Thành, Xuyên Mộc có thể có khả năng thích nghi cao với những điều kiện canh tác của các huyện khác nói riêng và của toàn tỉnh nói chung. Công tác chọn giống nên tập trung tại 3 huyện này, nếu có khả năng chọn được giống điều tốt nhất tại 3 huyện này thì khả năng phổ biến giống tốt nhất này trên địa bàn toàn tỉnh có thể rất lớn. Tính đa dạng di truyền của các đặc điểm nổi bật có liên quan đến hiệu quả kinh tế cũng được đánh giá là trung bình, vì vậy có thể nói, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có tiềm năng lớn để phát triển cây điều có chất lượng cao và đồng đều trên địa bàn toàn tỉnh, rất thuận lợi cho các công việc phổ biến kỹ thuật canh tác. Công việc sau thu hoạch cũng thuận lợi hơn do sử dụng công nghệ đồng bộ để chế biến hạt điều, sủ dụng một loại tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng nhân điều thành phẩm, góp phần làm tăng và ổn định giá trị nhân điều thành phẩm. 4.2.2.10. Hạn chế của kết quả đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật PCR – RAPD Kết quả đánh giá đa dạng di truyền chưa thực sự chính xác và đầy đủ, bắt nguồn từ những nguyên nhân sau:  Số lượng mẫu thu thập được chưa đủ để thể hiện thực tế, chưa mang tính đại diện cao. 72  Kết quả ly trích DNA không tốt, chỉ thực hiện phản ứng PCR – RAPD cho 50 mẫu, thu được kết quả của 41 mẫu. Các mẫu không tách chiết được DNA chủ yếu thuộc huyện Châu Đức và Xuyên Mộc, làm ảnh hưởng đến kết quả chung do đây là 2 huyện có diện tích trồng điều nhiều nhất tỉnh.  Phản ứng PCR – RAPD chưa hoàn thiện.  Do những hạn chế của kỹ thuật điện di bằng agarose không cho độ phân tách cao, độ dài của các band có thể không bằng nhau nhưng không thể phân biệt được bằng mắt thường nên có thể nhận định sai độ dài của band. 4.2.3. Kết quả thực hiện kỹ thuật AFLP trên một số mẫu DNA lá điều 4.2.3.1. Kết quả cắt giới hạn và gắn adapter (hình 4.20) Hình 4.20. Kết quả phản ứng cắt và gắn adapter. Chúng tôi thấy có dấu hiệu sự cắt và gắn adapter một số đoạn có kích thước khác nhau trải dài trên bản điện di. Số lượng các đoạn tạo ra có thể là rất lớn. 4.2.3.2. Kết quả phản ứng nhân bản tiền chọn lọc (hình 4.21) TT1 TT31 CD40 TT78 TT4 TT9 VT38 CD45 ĐC 73 Hình 4.21. Kết quả phản ứng nhân bản tiền chọn lọc. Trên bản điện di có dấu hiệu sự nhân bản tiền chọn lọc một số phân đoạn. 4.2.3.3. Kết quả thực hiện phản ứng nhân bản chọn lọc Sử dụng máy giải trình tự gene AB Applied Biosystem 3100 điện di sản phẩm phản ứng nhân bản chọn lọc. Các đoạn DNA được nhân bản được hiển thị dạng peak đồng thời cho ta biết độ dài của đoạn. Kết quả được minh họa trên hình 4.23. Hình 4.22. Kết quả AFLP điện di trên máy AB sequencer 3100. Kết quả điện di AFLP cho thấy có sự khác biệt rõ ràng giữa các mẫu, các đoạn nhân bản chọn lọc được tạo ra có thể phân biệt với nhau đến từng nucleotide, giúp phát TT1 TT31 CD40 XM78 TT4 TT9 VT38 CD45 74 hiện sự khác biệt rất rõ ràng mà phương pháp điện di truyền thống không thể có được. Chiều dài các đoạn tạo ra có độ tin cậy lớn do mức độ lặp lại hoàn toàn giống nhau giữa các mẫu cao, được ước lượng bằng cách so sánh vị trí tương đối của các đoạn nhân bản chọn lọc với thang chuẩn. Tuy nhiên vẫn còn nhiều những đoạn ngắn khoảng dưới 100 basepairs (không được lấy làm kết quả do không có độ tin cậy cao), cho thấy kỹ thuật AFLP trên DNA cây điều vẫn còn phải được tiến hành hoàn thiện hơn nữa. 4.2.3.4. Phân tích kết quả AFLP trên một số mẫu DNA lá điều Kết quả cho thấy có 4 tổ hợp primer cho số band nhiều nhất, được trình bày trong bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả thực hiện AFLP trên một số mẫu DNA lá điều. Tổ hợp primer nhân bản chọn lọc Tổng số band tạo ra Band đồng hình Band đa hình MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green) 36 1 (2,8 %) 35 (97,2 %) MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green) 14 1 (7,3 %) 13 (92,7 %) Từ kết quả AFLP chúng tôi nhận thấy một số điều sau:  Tổng số band tạo ra của kỹ thuật AFLP nhiều hơn hẳn so với kỹ thuật RAPD, do đó làm tăng khả  Các đoạn tạo ra có chiều dài ngắn, dưới 500 basepairs.  Có thể phân biệt được những đoạn chỉ hơn kém nhau đến 1 nucleotide, điều này làm tăng độ tin cậy năng chính xác khi phân tích kết quả để đánh giá đa dạng di truyền.của kết quả. 75  Mức độ phát hiện các band đa hình cao hơn nhiều so với kỹ thuật RAPD. Theo kết quả điện di giải trình tự (danh sách các band của các tổ hợp primer nhân bản chọn lọc được trình bày trong phụ luc), chúng tôi nhận thấy một số band đặc biệt:  Với 4 mẫu TT4, TT9, VT38 và CD45 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất gồm: MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green), kết quả thu được 36 band, trong đó chúng tôi nhận thấy các band 127 base pairs, 224 base pairs, 255 base pairs, 307 base pairs và 309 base pairs chỉ có ở mẫu CD45, có thể là chỉ thị phân tử cho tính trạng quả nhỏ ở mẫu CD45. Band 223 base pairs chỉ có ở mẫu VT8, có thể là chỉ thị phân tử của tính trạng ít hạt chỉ có ở mẫu VT8. Band 456 base pairs chỉ có ở mẫu TT4, có thể là chỉ thị phân tử của tính trạng quả rất nhỏ, còn xanh mà đã già chỉ có ở mẫu TT4.  Với 4 mẫu TT1, TT31, CD40 và XM78 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ hai gồm: MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green), kết quả thu được 14 band, trong đó chúng tôi nhận thấy band 181 base pairs và band 254 base pairs chỉ có ở mẫu TT31 có thể là chỉ thị phân tử của tính trạng quả vàng của mẫu TT31. Các band này nếu được tiếp tục nghiên cứu (giải trình tự,…) có thể cho một số thông tin quan trọng liên quan đến tính trạng hạt to và một số tính trạng khác. Chúng tôi đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của từng tổ hợp primer khác nhau. Sử dụng phần mềm NTSYS chúng tôi xây dựng được 2 cây di truyền như hình 4.23 và 4.25:  Hình 4.23 là cây di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38 và CD45 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất gồm 2 tổ hợp: MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green). 76 Hình 4.23. Cây di truyền kết quả AFLP tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất. Qua hình 4.23 chúng tôi nhận thấy mức độ tương đồng di truyền của các mẫu đã hạ thấp xuống chỉ còn từ 37 % – 61 %, đồng thời các mẫu đều thuộc các nhánh riêng biệt, điều này cho ta thấy mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38 và CD45 là khá cao. Chúng tôi tiến hành so sánh với mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu này khi thực hiện bằng kỹ thuật RAPD (hình 4.24). Hình 4.24. Cây di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực hiện RAPD. Chúng tôi nhận thấy mức độ tương đồng di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực hiện RAPD khá cao, từ 70 % – 90 %, cao hơn hẳn so với khi sử dụng kỹ thuật AFLP. Như TT9 và VT38 giống nhau tới 90 % theo RAPD, nhưng chỉ 61 % theo AFLP. Như vậy, mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực hiện theo kỹ thuật AFLP cao hơn so với kỹ thuật RAPD. 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 Coefficient TT4 CD45 TT9 VT38 0,37 0,43 0,49 0,55 0,61 Coefficient TT4 CD45 TT9 VT38 77  Hình 4.25 là cây di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40 và XM78 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ hai gồm 2 tổ hợp: MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green). Hình 4. 25. Cây di truyền kết quả AFLP tổ hợp thứ hai. Tương tự như tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất, mức độ tương đồng di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40 và XM78 từ 45 % - 65 %, đồng thời thuộc 4 nhánh khác nhau, cho thấy mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu này khá cao. Chúng tôi cũng thực hiện so sánh với mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu này khi thực hiện bằng kỹ thuật RAPD (hình 4.26). Hình 4.26. Cây di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40, XM78 thực hiện RAPD. Chúng tôi cũng nhận thấy mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40, XM78 thực hiện theo kỹ thuật AFLP cao hơn so với thực hiện theo kỹ thuật RAPD do nhận thấy mức độ tương đồng di truyền của RAPD cao hơn so với AFLP. 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 Coefficient TT1 CD40 XM78 TT31 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 Coefficient TT1 XM78 TT31 CD40 78 4.2.3.5. Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD Sau khi so sánh kết quả của kỹ thuật AFLP với kết quả cảu kỹ thuật RAPD, bước đầu chúng tôi nhận định những đặc điểm nổi bật của kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD là:  Tổng số sản phẩm khuếch đại tạo ra của kỹ thuật AFLP nhiều hơn hẳn so với kỹ thuật RAPD.  Mức độ phát hiện đa hình của kỹ thuật AFLP cao hơn hẳn so với kỹ thuật RAPD do có khả năng phân biệt độ dài các đoạn rất cao.  Kỹ thuật AFLP có khả năng đánh giá mức độ đa dạng di truyền với độ tin cậy cao hơn nhiều so với kỹ thuật RAPD.  Kỹ thuật AFLP có khả năng tốt hơn trong việc phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao hơn so với kỹ thuật RAPD. Tuy nhiên khi tiến hành kỹ thuật AFLP có một số khó khăn hơn so với kỹ thuật RAPD, đó là quy trình tiến hành mất nhiều thời gian, chi phí cao và máy móc thiết bị phức tạp khó thao tác. 79 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua quá trình thực hiện các thí nghiệm trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 5.1.1. Phần thu thập mẫu Thu thập được mẫu lá từ 80 cá thể nổi trội và đã thu thập các dữ liệu có liên quan của tất cả các cá thể này. 5.1.2. Phần tách chiết DNA Chúng tôi đã tiến hành tách chiết 80 mẫu lá thu thập được, kết quả thu được 55 mẫu cho nồng độ DNA trung bình khoảng 70 – 80.ng/μl. Chúng tôi nhận thấy DNA lá điều sau khi tách chiết thường bị gãy nhiều, nồng độ DNA thấp và rất khó tách được DNA của lá điều non. 5.1.3. Phần kỹ thuật RAPD, đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử Nói chung, phản ứng PCR – RAPD sử dụng primer 11 mà chúng tôi thực hiện là khá ổn định, khả năng nhân bản cao. Đã nhận biết được những band có độ dài khoảng 550 base pairs, 600 base pairs, 700 base pairs, 750 base pairs, 900 base pairs, 1050 base pairs, 1200 base pairs, 1400 base pairs, 1600 base pairs, 1900 base pairs và 2300 base pairs, trong đó các bands khoảng 550 base pairs, 900 base pairs và 1050 base pairs là các band đặc trưng khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD với primer 11. Hai band 600 base pairs và 700 base pairs khá đặc biệt, có thể tiếp tục nghiên cứu để sử dụng như là các chỉ thị phân tử cho những tính trạng liên quan. Bước đầu chúng tôi nhận định tính đa dạng di truyền của cây điều được trồng tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu ở mức trung bình đến trung bình khá. Theo sơ đồ cây di truyền thì hệ số tương đồng di truyền biến động từ 0,53 – 1, điều này đồng nghĩa với nhận định là quần thể cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có mức độ tương đồng về di 80 truyền khá cao, mức độ tập trung giống cao, vì vậy rất thuận lợi cho công tác phân loại giống và phổ biến kỹ thuật canh tác, phát triển mạnh diện tích canh tác những giống có chất lượng cao hay tìm kiếm những cá thể nổi trội để lai tạo giống mới với chất lượng tốt hơn hẳn các giống hiện có. 5.1.4. Phần kỹ thuật AFLP Quá trình xây dựng phương pháp tiến hành kỹ thuật AFLP trên cây điều chúng tôi nhận thấy 4 tổ hợp primer nhân bản chọn lọc cho nhiều band với mức độ xuất hiện đa hình rất cao, gồm:  MseI + CAA – EcoRI + ACT (màu xanh dương).  MseI + CAA – EcoRI + AGG (màu xanh lá cây).  MseI + CAA – EcoRI + ACA (màu xanh dương).  MseI + CAA – EcoRI + ACG (màu xanh lá cây). Bước đầu chúng tôi nhận thấy kết quả đánh giá đa dạng di truyền dựa trên kỹ thuật RAPD và AFLP có sự khác nhau rõ rệt, trong đó kỹ thuật AFLP cho kết quả tốt và có độ tin cậy cao hơn hẳn kỹ thuật RAPD, ngoài ra khả năng nhận diện chỉ thị phân tử của kỹ thuật AFLP tốt hơn và đáng tin cậy hơn 5.2. Đề nghị 5.2.1. Về phƣơng hƣớng phát triển canh tác điều ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Dựa trên những kết luận được rút ra, chúng tôi đề nghị các ban ngành có liên quan đến ngành nông nghiệp nói chung và đến việc quy hoạch phát triển cây điều nói riêng của tỉnh cần tiến hành khảo sát tình hình canh tác cây điều trên địa bàn tỉnh ở quy mô lớn, từ đó rút ra được tình hình canh tác cây điều của tỉnh để tiến hành phổ biến kỹ thuật canh tác đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân trồng điều, và quan trọng hơn là đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều, tìm được giống điều tốt nhất và phù hợp nhất cho điều kiện canh tác của tỉnh. Ngoài ra còn có thể tìm được nguồn gene của những cá thể hay giống điều tốt và ổn định để làm nguyên liệu cho những nghiên cứu về lai tạo giống. Chỉ khi nào đánh giá được đầy đủ tính đa dạng di truyền của cây điều tỉnh nhà mới có thể vạch ra chiến lược phát triển cây điều phù hợp, tránh được tình trạng phát triển tự phát như hiện nay. 81 5.2.2. Về những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử trên cây điều  Thực hiện công việc lấy mẫu lá điều trên quy mô lớn hơn và khảo sát kỹ đặc điểm của những cây điều nổi bật.  Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tách chiết DNA của lá điều, đặc biệt đối với lá điều còn non.  Tiếp tục hoàn thiện quy trình PCR – RAPD đối với DNA cây điều.  Với những band đặc biệt (600 base pairs và 700 base pairs) có thể cho những thông tin hữu ích, chúng tôi khuyến cáo nên cắt band và giải trình tự của những band này. Bên cạnh đó tiếp tục thử nghiệm các kỹ thuật khác (như kỹ thuật microsatellies – SSR) để đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử trên cây điều.  Có thể khi điện di bằng agarose không thể nhận diện hết các band hay không thể phân biệt được những band có độ dài gần bằng nhau, vì vậy chúng tôi khuyến cáo cần cải tiến điện di (điện di bản gel lớn hơn, máy điện di tốt, ….) hoặc giải trình tự để biết được độ dài của các đoạn.  Từ kết quả bước đầu xây dựng phương pháp tiến hành kỹ thuật AFLP trên cây điều, tiếp tục hoàn thiện quy trình này để có hiệu quả cao nhất, làm tiền đề cho việc áp dụng kỹ thuật này trên cây điều ở quy mô lớn, cũng như xem xét khả năng áp dụng của kỹ thuật này đối với các đối tượng nghiên cứu khác. 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp.HCM. 275 trang. 2. Hoàng Chương và Cao Vĩnh Hải, 2002. Kỹ thuật trồng điều. Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. 147 trang. 3. Đường Hồng Dật, 1999. Cây điều-Kỹ thuật trồng và triển vọng phất triển. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. 153 trang. 4. Đề án phát triển cây điều đến năm 2010. Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, 2000. 5. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản Giáo Dục Tp. HCM. 612 trang. 6. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp. HCM. 220 trang. 7. Hoàng Thị Liễu, 2004. Phân tích mức độ đa dạng di truyền và xây dụng phương pháp nhận diện giống cacao trên cơ sở kỹ thuật PCR. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Nông học, Đại học Nông lâm Tp. HCM. 8. Hoàng Văn Tiến, Lê Khắc Thận và Lê Doãn Diên, 1997. Sinh hóa học với cơ sở khoa học của Công nghệ gene. Viện khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp. HCM. 9. Nguyễn Thị Trinh, 2005. Bước đầu điều tra hiện trạng canh tác và xây dựng ngân hàng gene invitro cho các dòng và giống điều tỉnh Bình Thuận. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Nông học, Đại học Nông lâm Tp. HCM. 10. Nguyễn Văn Uyển và Nguyễn Tiến Thắng, 2000. Những kiến thức cơ bản về Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Giáo Dục Tp. HCM. 244 trang. 11. Bùi Trang Việt, 2001. Sinh học Phân tử. Khoa sinh học, ĐH Quốc gia Tp. HCM, trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp. HCM. 83 Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 12. Brown T.A., 1997. Gene cloning an introduction. Third edition. UMIST, Manchester, UK.. Chapman and Hall. 334 pages. 13. Kazutoshi Okuno, Shuichi Fukuoka, 1998. Manual for DNA extraction in plants. Japan international cooperation agency. 42 pages. 14. Roger L. Miesfeld, 1999. Applied Molecular Genetics. The University of Arizona Tucson, Arizona. Wiley – Liss. 293 pages. 15. Samal S., Rout G..R., Lenka P.C., 2003. Analysis of genetic relationships between populations of cashew (Anacardium occidental L.) by using morphologicalcharacterisation and RAPD markers. Plant soil environ; p. 176 – 182. 16. www.keygene.com/technologies/technologies.aflp.htm 17. www.appliedbiosystems.com. Các từ khóa: AFLP, CTAB, AFLP protocol,… 18. www.keygene.com. Các từ khóa: AFLP,… 84