Khóa luận Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây mắm trắng (Avicennia alba) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD

e, hay RFLP marker) đƣợc đánh dấu bằng phóng xạ. Quá trình lai giữa DNA và probe nhƣ vậy đƣợc gọi là lai DNA. Sau khi lai, tấm lọc hay màng lọc đƣợc rửa để loại bỏ các probe không gắn, hoặc gắn yếu với DNA đang nghiên cứu. Tiếp sau đó, DNA lai với probe tự ghi trên biểu đồ phát xạ. Sau khi điện di, gel đƣợc chụp dƣới tia cực tím. Các đoạn DNA xuất hiện thành các đốm liên tục. DNA lai với probe sẽ cho tín hiệu khi thể hiện ra trên phim X – quang. Các sọc có tính đa hình (polymorphism) có thể đƣợc quan sát để đánh giá [10]. RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhƣng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe ngƣời thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lƣợng và chất lƣợng rất cao. Do đó, ngƣời ta có xu hƣớng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase [3], [4], [11]. 2.6.2. Nhóm dựa trên PCR 2.6.2.1 SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) Ngƣời ta đã tìm thấy có sự chuyển dịch của đoạn DNA dạng dây đơn, ngắn, trong điều kiện chƣa qua quá trình biến tính DNA thành dây đơn . Ngƣời ta giả định rằng: sự thay đổi chuỗi mã di truyền DNA là do sự thay đổi ngoại hình của dây đơn (single – strand conformation). Sự thay đổi này làm cho DNA chuyển dịch trên gel, tạo ra thể đa hình [1], [4]. 24 Trong phân tích SSCP, phản ứng chuẩn PCR đã hoàn thành. Sản phẩm của PCR này lại bị mở dây đơn lần nữa và ngâm vào trong nƣớc đá. Khi đó hiện tƣợng snap – back sẽ xảy ra trên cấu trúc thứ cấp. Để tránh hiện tƣợng đứt gãy cấu trúc thứ cấp, các mẫu phải đƣợc xử lý trong điều kiện lạnh. Nếu P32 đƣợc dùng trong PCR, thì phim chụp X – quang sẽ thể hiện vị trí của DNA trên gel. Nếu không, ngƣời ta sẽ dùng bạc để nhuộm gel. DNA khi nhuộm bằng bạc sẽ nhạy cảm gấp trăm lần nhuộm Ethidium bromide [11]. SSCP marker là công cụ rất mạnh và nhanh, nhƣng nó chỉ áp dụng cho việc tìm kiếm thể đa hình của những đoạn phân tử DNA tƣơng đối ngắn. SSCP có thể xác định tính chất dị hợp tử của những đoạn phân tử DNA (có cùng trọng lƣợng phân tử), và nó có thể phân biệt đƣợc sự thay đổi của một vài nucleotide nào đó. Ngƣời ta cho nó là công cụ hữu dụng trong xét nghiệm bệnh di truyền ở ngƣời. Trong thực vật, SSCP chƣa đƣợc phát triển nhiều. Ngƣời ta hi vọng, SSCP marker sẽ giúp cho việc phân nhóm di truyền ở con lai trở nên dễ dàng hơn, khi chúng ta có primer thích hợp đối với tính trạng quan trọng nào đó [11]. 2.6.2.2. Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) SSR là các trình tự hai nucleotide ((AC)n, (AG)n, (AT)n) hoặc ba nucleotide ((TAT)n, (TCT)n, (CAG)n) lặp lại. Do vậy nguyên tắc của phƣơng pháp này là dựa trên sự khuếch đại các trình tự lặp lại trên bộ gien bằng các primer đặc hiệu có khả năng bổ sung vào hai đầu của locus microsatellite. Sản phẩm PCR là các đoạn DNA có chiều dài khác nhau do sự biến thiên về độ dài đƣợc tách ra trên gel polyacrylamid hoặc trong mao quản của máy giải trình tự DNA. Do số lần lặp lại cao của microsatellite ở các cá thể nên sự đa hình cao hơn ở các trƣờng hợp khác nhƣ RFLP, RAPD và sự đa hình ở các cá thể khác nhau tất nhiên là khác nhau. Chiều dài các đoạn DNA qua điện di thƣờng có kích thƣớc 100 – 200 bp. Tuy nhiên, SSR thƣờng đƣợc phân tích trên DNA hệ gien nhỏ mang trình tự lặp lại và kích thƣớc của chúng đƣợc nhận biết sau khi điện di trên gel [4], [11]. SSR đƣợc thực hiện theo bốn bƣớc:  Tách chiết và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu. 25  Thực hiện phản ứng khuếch đại qua PCR với các primer đặc trƣng cho các đoạn lặp đơn giản.  Điện di kết quả trên gel polyacrylamid và tính toán số liệu, xác định mức độ giống và khác nhau giữa các đoạn lặp DNA.  Xử lý số liệu bằng các phần mềm nhƣ Map Marker Program, SYSTAT, NTSYSpc lập bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại. 2.6.2.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) AFLP, đa hình chiều dài các đoạn DNA đƣợc khuếch đại chọn lọc, do Vos và cộng sự phát minh 1975, là kỹ thuật đƣợc áp dụng để phân tích tính đa dạng của sinh vật từ hàng trăm đoạn DNA giới hạn đã đƣợc khuếch đại đồng thời nhờ phản ứng PCR [13], [18], [20]. Trên nguyên tắc, AFLP gồm hai nội dung cơ bản:  Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn có bổ sung các adapter đặc hiệu tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trƣng cho các primer đã chọn trƣớc. Adapter là một đoạn oligonucleotide đôi, đƣợc tổng hợp nhân tạo và có trình tự tƣơng ứng với trình tự ở đầu đoạn DNA đƣợc phân cắt bởi một loại enzyme nhất định.  Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR qua hai giai đoạn với hai loại primer khác nhau.  Các thành phần tham gia trong phản ứng AFLP: Các enzyme: Để cắt DNA của bộ gien, 2 enzyme cắt hạn chế đƣợc sử dụng:  MseI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 4 base  EcoRI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 6 base Sau phản ứng cắt, có ba loại đoạn DNA thu nhận đƣợc: một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi EcoRI ở cả hai đầu kết thúc, một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi EcoRI ở một đầu kết thúc này và MseI ở đầu kết thúc khác, và một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi MseI ở cả hai đầu kết thúc [13]. 26 Hình 2.6. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI. Adapter: Adapters là trình tự sợi đôi chuyên biệt cho cả vị trí của EcoRI và vị trí của MseI. Sự gắn kết của adapter đối với DNA đã đƣợc cắt thay đổi vị trí cắt để ngăn chặn sự phân cắt thứ hai xảy ra sau khi đã gắn kết [13]. Hình 2.7. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI. Các primer: Có hai loại primer đƣợc sử dụng: Primer dùng trong khuếch đại tiền chọn lọc:  EcoRI A 5’-GAC TGC GTA CCA ATT CA-3’  MseI C 5’-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3’ Primer này đƣợc thiết kế tƣơng ứng với adapter đã sử dụng, đồng thời có gắn thêm một nucleotide ở đầu 3’ để chọn lọc những đoạn DNA cần khuếch đại, cụ thể là EcoRI gắn thêm nucleotide A và MseI gắn thêm nucleotide C ở đầu 3’. Kết quả chủ yếu của việc chọn trƣớc PCR là các đoạn DNA đó có một vị trí cắt của MseI và EcoRI, và cũng có nucleotide quan tâm. Bƣớc khuếch đại tiền chọn lọc sẽ làm giảm đi sự phức tạp trong việc thu nhận những đoạn DNA [13]. 27 Hình 2.8. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP. Primer dùng trong khuếch đại chọn lọc: Là các primer khuếch đại tiền chọn lọc đƣợc thêm vào từ 1 đến 2 nucleotide ở đầu 3’. Ví dụ: EcoRI A gắn thêm CT và MseI C gắn thêm AG vào đầu 3’. Kết quả là so với primer đƣợc thiết kế tƣơng ứng với adapter thì primer khuếch đại chọn lọc có thêm ba nucleotide ở đầu 3’. Điều này giúp cho việc lựa chọn các đoạn DNA chặt chẻ hơn, giảm sự phức tạp khi đọc kết quả các đoạn DNA trên gel. Sau khi đƣợc khuếch đại PCR với các primer này, kết quả của mỗi mẫu đƣợc phân tích trên máy giải trình tự DNA. Việc chọn lựa sự khuếch đại với hai primer EcoRI và MseI là khuếch đại chủ yếu các đoạn DNA đƣợc gắn hai primer EcoRI-MseI. Các đoạn DNA EcoRI-EcoRI không đƣợc khuếch đại. Các đoạn DNA MseI-MseI không đƣợc nhận biết trong quá trình khuếch đại do không chứa chất phát huỳnh quang. Chỉ có những sợi chứa EcoRI đƣợc nhận biết [1], [13].  EcoRI 5’FAM-GACTGCGTACCAATTC ACT-3’  MseI 5’-GATGAGTCCTGAGTAA CAG-3’ 28 Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP. Trên cơ sở đó quy trình thực hiện AFLP có thể gồm bốn bƣớc cơ bản:  Tách chiết và tinh sạch DNA.  Cắt các mẫu DNA nghiên cứu bằng các cặp enzyme giới hạn chọn lọc có bổ sung adapter tƣơng ứng.  Tiến hành PCR hai giai đoạn với hai loại primer đặc hiệu, primer 1 + 1 nucleotide và primer 2 + 2 nucleotide.  Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập cây phát sinh chủng loại để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu. Ta có thể tóm tắt kỹ thuật AFLP nhƣ sau: 29 Hình 2.10. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP.  Kỹ thuật AFLP có các ƣu điểm:  Lƣợng DNA cần cho phản ứng rất ít.  Cho kết quả nhanh, ổn định và các lần lặp lại có độ tin cậy cao do kỹ thuật AFLP có các điều kiện nghiêm ngặt của phản ứng PCR.  Kỹ thuật AFLP thực hiện trên nhiều đối tƣợng sinh vật khác nhau.  Không cần biết trật tự nucleotide của hệ gien.  Tạo nhiều băng khuếch đại – khả năng tạo đa hình cao, chỉ thị phân tử cho lƣợng thông tin cao.  AFLP đƣợc ứng dụng trong việc xây dựng bản đồ gien thực vật bao gồm:  Thiết lặp nhóm gien liên kết nhau trong một thể nhiễm sắc trong quá trình cho tạp giao.  Làm bão hòa các vùng có gien lạ đƣa vào.  Ƣớc lƣợng mức độ có quan hệ giữa các giống. 30 2.6.2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật này cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, mạch đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR [4]. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di [11]. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những marker để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu [7]. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại hóa trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Có thể tóm tắt kỹ thuật RAPD nhƣ sau: 3’ 1 2 3 5’ DNA mẫu 5’ 4 5 6 3’ Hình 2.11. Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR.  Chú giải: Các mũi tên biểu thị cho các primer (các primer có trình tự giống nhau, khoảng 10 nucleotide); các số 1, 2, 3, 4, 5, 6 tƣợng trƣng cho các vị trí trên DNA mẫu mà primer gắn vào; các primer bắt cặp vào các vị trí 1, 2, 3 trên mạch đơn DNA mẫu 3’- 5’, các primer bắt cặp vào các vị trí 4, 5, 6 trên mạch đơn DNA mẫu 5’ - 3’. Trong trƣờng hợp này, có 2 sản phẩm PCR đƣợc tạo thành: Sản phẩm B Sản phẩm A 31  Sản phẩm A: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 2 và 5.  Sản phẩm B: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 3 và 6.  Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4 do hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại.  Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và 5, do các primer không có chiều hƣớng vào nhau.  Kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc cơ bản:  Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR  Điện di trên gel Agarose hoặc gel Polyacrylamid  Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Tuy nhiên trong thực tế khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR thƣờng gặp phải một số vấn đề sau:  Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số băng trên bảng gel điện di. Vì vậy nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng.  PCR buffer thƣờng đƣợc cung cấp theo Taq DNA polymerase và có thể có hoặc không có Mg2+. Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau.  Taq DNA polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn. Vì vậy, loại Taq DNA polymerase và nồng độ của Taq đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm.  Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf [1], [8].  Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD [11]:  Không đòi hỏi chất lƣợng DNA mẫu cao, lƣợng DNA mẫu cần ít. 32  Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản.  Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao.  Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.  Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD [11]:  Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định.  Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao.  Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao. 33 Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 3.1.1. Thời gian tiến hành Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007. 3.1.2. Địa điểm Các mẫu lá cây mắm trắng (Avicennia alba) đƣợc thu thập tại Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh. Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và thực hiện phân tích RAPD tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Mẫu thực vật Địa điểm lấy: Mẫu đƣợc lấy tại một số tiểu khu của Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Cách lấy mẫu: Lấy mẫu theo hai đƣờng chéo của rừng, một theo đƣờng bộ và một theo đƣờng sông. Lấy theo khoảng cách, khoảng 1 km lấy một mẫu, ghi nhận các đặc tính hình thái (thân cây to, mọc khỏe hoặc yếu ớt, các cây có khối u, hình dáng dị thƣờng) và tọa độ vị trí nơi lấy mẫu bằng máy định vị GPS. Chọn những lá tƣơi tốt, còn non, thƣờng là phần ngọn của các cành. Lấy 8 – 10 lá trên mỗi cây. Kí hiệu cho mẫu theo kiểu AAxx Trong đó: AA: tên loài (Avicennia alba) và xx: số thứ tự. Bảo quản và vận chuyển mẫu: Lá đƣợc cho vào bịch nylon, buộc kín miệng, bảo quản tạm thời trong thùng xốp lạnh, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản. 34 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm 3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA CTAB (C19H42NBr, M=364,5 g/mol) Phá vỡ màng tế bào, màng nhân Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65 o C Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ muối Sodium acetate cao và nhiệt độ thấp Dung dịch gốc Ethanol 70% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng Iso Propanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, không cần muối Sodium Acetate Dung dịch gốc Chloroform Biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm Dung dịch gốc Iso Amylalcohol Tránh tạo bọt trong quá trình vortex hay ly tâm tốc độ cao Dung dịch gốc Hỗn hợp Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) Biến tính protein và các sắc tố trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc phóng thích sẽ nằm trong pha nƣớc ở lớp trên Pha với tỷ lệ 24 thể tích Chloroform và 1 thể tích Isoamyl Alcohol EDTA 0,5M (C10H14N2Na2O3, M=372,54 g/mol) Gắn nối các ion hóa trị II (Mg ++ , Ca ++…) có trong dịch ly trích, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân hủy DNA. Các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có sự có mặt của các ion hóa trị II nhất là ion Mg++ Pha 100ml: - 18,622 g bột EDTA + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. - Hấp 121oC/20phút trƣớc khi dùng. NaCl 5M (M=58,5 g/mol) Môi trƣờng đệm thuận lợi cho việc kết tủa DNA Pha 100ml: - 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. 35 TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml: - 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 1X Hòa tan DNA Pha 100ml: 10ml TE 10X + 90ml nƣớc cất 2 lần EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml: - 57ml nƣớc cất 2 lần + 2g CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65 oC cho tan, hạn chế tạo bọt). - Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml Mercaptro Ethanol. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Sodium Acetate 3M (CH3COONa, M=82 g/mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion trong dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% trong điều kiện -20oC Pha 100ml: - 24,6g bột Sodium Acetate + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng RNase (Ribonuclease) (10%, w/v) Enzyme thủy phân RNA có trong dịch trích Pha 1ml: - 10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất 2 lần. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc PVP (polyvinylpyrrolydol) Biến tính các hợp chất phenol Dạng bột, sử dụng 2g PVP, thêm vào thành phần của dịch trích EB 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra DNA Nƣớc cất 2 lần khử ion TE 1X TAE 0,5 X Loading dye 6X Ethidium bromide 36 3.2.2.3. Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD  Nƣớc cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV  dNTP 25mM (Promega)  Buffer free Mg2+ 10X (Promega)  MgCl2 25mM (Promega)  Taq DNA Polymerase 5U (Promega)  Primer: Sử dụng 7 primer có trình tự và Tm nhƣ sau: Primer OPAC10 _ 5’AGC AGC GAG G3’, Tm = 34 Primer 1 (OPA02) _ 5’TGC CGA GCT G3’, Tm = 40,7 Primer 2 (OPA03) _ 5’AGC CAG CCA C3’, Tm = 34,3 Primer 9 (OPN03) _ 5’GGT ACT CCC C, Tm = 33,9 Primer OPA05 _ 5’AGG GGT CTT G3’, Tm = 34,2 Primer OPA10 _ 5’GTG ATC GCA G3’, Tm=30,7 Primer RAH8 _ 5’GAG AGC CAA C 3’, Tm = 31,9 3.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm Chén sứ và chày giã (Đức) Máy Vortex (IKA - Đức) Cân điện tử (Ohaus - Mỹ) Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh) Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh) Tủ sấy (Jencons-Anh) Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức) Bồn điện di (Biorad) Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) Lò Viba (Electrolux) Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển) Đầu típ các loại (Đức) 37 Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) Máy PCR (PTC 100 - MJ) Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản) Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp) Pipet các loại (Nichiryo - Nhật Bản) 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA Chúng tôi đã tiến hành thực hiện ly trích DNA theo các quy trình sau:  Quy trình 1: Theo quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) nhƣng không sử dụng Rnase. Gồm 11 bƣớc: Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào cối, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650C trong 45 phút. Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), vortex 10 phút, ly tâm 14.000 vòng/5 phút ở 100C. Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2. Bƣớc 4: Thêm 300 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200C qua đêm. Bƣớc 5: Li tâm 14.000 vòng/5 phút ở 100C. Bƣớc 6: Thêm vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để – 200C trong 60 phút. Bƣớc 8: Li tâm 14.000 vòng/10 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 14.000 vòng/2 phút ở 100 C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 30 phút. Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở 40C. 38  Quy trình 2: Cải tiến quy trình của Doyle: thay đổi thời gian và số vòng ly tâm, thời gian ủ, trọng lƣợng mẫu. Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá đã rửa sạch, lau khô. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng/phút). Ủ ở 650C trong 60 phút. Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), đảo nhẹ vài lần, li tâm 10.000 vòng/20 phút ở 100C. Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2. Thu đƣợc V l dịch nổi. Bƣớc 4: Thêm V l dung dịch Isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200C qua đêm. Bƣớc 5: Li tâm 8.000 vòng/20 phút ở 100C. Đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 6: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút. Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và ủ – 200C trong 60 phút. Bƣớc 8: Li tâm 8.000 vòng/15 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 6.000 vòng/5 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 30 phút. Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở 40C.  Quy trình 3: Cải tiến quy trình 2, bổ sung PVP 2% vào dịch trích EB.  Quy trình 4: Cải tiến quy trình 3, nghiền mẫu trong N2 lỏng thay vì nghiền mẫu trong dích trích EB, tăng số vòng vortex. Bƣớc 1: Cân 0,4 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong N2 lỏng, cho vào eppendorf. Bƣớc 2: Thêm 1 ml dịch trích EB, vortex đều cho đến khi hỗn hợp có màu đồng nhất ở 14.000 vòng/phút trong khoảng 1 phút. Ủ ở 650C trong 1 giờ. Bƣớc 3: Ly tâm 10.000 vòng/20 phút. Thu đƣợc V µl dịch nổi. 39 Bƣớc 4: Thêm V Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều. Ly tâm 10.000 vòng trong 20 phút ở 40C. Thu dịch nổi. Bƣớc 5: Lập lại bƣớc 4. Bƣớc 6: Thêm 300 µl Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ - 200C qua đêm. Bƣớc 7: Ly tâm 8.000 vòng trong 15 phút. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa. Bƣớc 8: Thêm 300 l TE 1X, đem ủ ở 370C trong 30 phút. Thêm 20 l Sodium acetate 3M và 64 l Ethanol 100%, trộn đều, đem ủ - 200C trong 1 giờ. Bƣớc 9: Li tâm 15 phút, 8.000 vòng ở 40C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 5 phút 6.000 vòng ở 100C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 30 phút, bảo quản mẫu ở - 200C. 3.3.2. Kiểm tra DNA ly trích 3.3.2.1 Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 400 mA trong 20 phút. Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các băng trên gel [6], [7]. 3.3.2.2 Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Hàm lƣợng DNA trong mẫu ly trích đƣợc tính theo công thức sau: DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n Trong đó:  OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260nm  OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280nm 40  n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100) Cách tiến hành:  Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn.  Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X. Hút 20 l dung dịch DNA cho vào Curvette, hòa tan với 1,8 ml TE 1X. Tiến hành đo OD [7]. 3.3.3. Thực hiện kỹ thuật RAPD Nhằm tìm ra quy trình chạy RAPD phù hợp và tối ƣu cho cây mắm trắng, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng RAPD trên 2 thí nghiệm:  Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình phản ứng RAPD trên 2 nghiệm thức Sử dụng primer OPAC10 và primer 1 Mục đích: Khảo sát quy trình RAPD – PCR trên cây mắm trắng Chỉ tiêu đánh giá: Các băng DNA trên gel điện di Nghiệm thức 1: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Lâm Vỹ Nguyên, 2006 theo bảng 2.1 và 2.2 nhƣ sau: Bảng 2.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 2,5 l 2,5 mM dNTP 10 mM 0,25 l 100 M Primer 100 pmol/ l 6,5 l 26 pmol/ l Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng H2O 12,05 l Tổng thể tích phản ứng 25 l 41 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 Số chu kì Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 3 40 94 1 Ta 1 72 2 1 72 15 Hold 4 0 C Trong đó: Ta(OPAC10) = 36 và Ta(primer1) = 38 Nghiệm thức 2: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Nguyễn Hồng Phong, 2007 (Kết quả chƣa công bố) theo bảng 2.3 và 2.4 nhƣ sau : Bảng 2.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 3 l 3 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM Primer 100 M 0,3 l 1,2 M Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng H2O 17,8 l Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 5 phút 42 40 94 30 s Ta 30 s 72 1 phút 1 72 5 Hold 4 0 C Trong đó: Ta (OPAC10) = 36 và Ta (primer1) = 38  Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng cho sản phẩm khuếch đại của các primer. Sử dụng 5 primer OPA05, OPA10, RAH8, primer 9, primer 2 Điều kiện thí nghiệm nhƣ ở nghiệm thức 2, thí nghiệm 1. Trong đó : Ta (OPA05) = 36 Ta (OPA10) = 34 Ta (primer2) = 36 Ta (primer9) = 36 Ta (primerRAH8) = 34 2.3.4 Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1 Nguyên tắc của phần mềm là dựa trên sự có mặt hay không của các băng DNA quan tâm trên gel điện di dƣới dạng mã hóa theo ma trận với các thông số 0 và 1 (0: không có băng, 1: có băng). Phần mềm sẽ xử lý và xây dựng nên cây phân nhóm di truyền, qua đó ta có thể quan sát đƣợc mức độ gần gũi hay xa cách về mặt di truyền giữa những bộ gel nghiên cứu. 43 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ Trong công tác thu thập mẫu, chúng tôi gặp nhiều trở ngại trong việc tìm kiếm những mẫu có đặc tính khác nhau, có hình dáng khác lạ hoặc đặc tính đặc biệt nhƣ trong dự kiến đã đề ra. Một trong những nguyên nhân chính của vấn đề này là do việc đi lại trong rừng rất hạn chế bởi những vùng đất lún hoặc ngập nƣớc, vì thế chúng tôi chƣa thể đi sâu để tìm những mẫu này. Trong thời gian tiến hành đề tài, chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc 50 mẫu lá mắm trắng phân bố theo hai đƣờng chéo của rừng ngập mặn Cần Giờ, một chạy dọc theo đƣờng bộ và một chạy theo đƣờng sông. Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. Trong những mẫu đã thu thập, cho thấy công tác thu thập mẫu trải rộng trên nhiều tiểu khu. Do đó, mặc dù số lƣợng mẫu chỉ là 50 nhƣng nó cũng mang đƣợc tính đại diện cho quần thể mắm trắng của rừng. 44 4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu Sau khi đƣợc đem về phòng thí nghiệm, đầu tiên mẫu đƣợc bảo quản ở 40C. Kết quả, chỉ sau 2-3 ngày, thấy xuất hiện những dấu hiệu hóa nâu trên lá. Khi lấy mẫu ra khỏi bịch nilon ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, mẫu lập tức hóa nâu và chuyển sang đen. Theo chúng tôi, điều này có thể là do bảo quản mẫu ở điều kiện này, các enzyme trong lá vẫn hoạt động và các hoạt động chuyển hóa trong lá vẫn xảy ra dẫn đến sự hóa nâu của lá. Thay đổi điều kiện bảo quản ở - 200C, sau 15 – 20 ngày, màu sắc mẫu bắt đầu sậm hơn. Khi lấy mẫu ra ở điều kiện phòng thí nghiệm, mẫu nâu hóa nhẹ sau 5 phút. Nguyên nhân có thể là do khi trữ ở - 200C, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá. Ở điều kiện nhiệt độ phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá đƣợc phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá. Tuy nhiên vẫn có thể tiến hành ly trích DNA trên những mẫu này do mẫu chƣa hóa đen hoàn toàn. 4.3. Kết quả quy trình ly trích DNA tổng số Ban đầu, khi sử dụng quy trình ly trích 1, kết quả điện di cho thấy phần lớn có nhiều vệt smear trên gel và sản phẩm không mong muốn cũng rất nhiều. Chỉ số đo OD của những mẫu này chỉ từ 1,0 – 1,5. Mặc dù chúng tôi đã cố gắng nghiền nhẹ, đều tay và chuyển sang quy trình 2, giảm số vòng ly tâm và tăng thời gian ly tâm và ủ mẫu ở quy trình 1, nhƣng kết quả vẫn không tốt hơn, tuy vết smear ít hơn nhƣngsản phẩm không mong muốn lại rất nhiều và lƣợng DNA thu đƣợc rất ít, chỉ số OD của những mẫu này cũng chỉ dao động từ 1,1 – 1,6. Điều này cho thấy rằng những mẫu này chƣa đủ tinh sạch để có thể tiến hành cho những phân tích tiếp theo. Theo chúng tôi điều này có thể là do mắm trắng là cây của vùng ngập mặn, lá mắm trắng có hàm lƣợng muối, polysaccharide và các hợp chất phenol nhiều hơn so với những cây bình thƣờng, do đó việc tiến hành ly trích theo quy trình 1 và 2 không thể loại hết những hợp chất này. Có thể sự tồn tại các hợp chất này ở hàm lƣợng cao nhƣ vậy trong lá sẽ làm ảnh hƣởng xấu đến tác dụng của các hóa chất 45 dùng trong ly trích, làm DNA dễ bị tổn hại trong các thao tác vortex hay ly tâm, từ đó dẫn đến việc DNA bị gãy nhiều. Vì các lí do này, chúng tôi đã quyết định sử dụng quy trình 3, bổ sung PVP2% vào thành phần của dịch ly trích EB, với mục đích loại bỏ các hợp chất phenol có trong lá tốt hơn. Hình 4.2. Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2. Kết quả điện di trên gel agarase 1% cho thấy việc sử dụng quy trình 3 làm giảm đáng kể sản phẩm không mong muốn. Chỉ số đo OD của những mẫu này từ 1,6 – 2, có thể sử dụng để thực hiện phản ứng RAPD. Hình 4.3. Kết quả ly trích theo quy trình 3. Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy quá trình nghiền mẫu trong dịch trích EB có một số hạn chế là tốn nhiều thời gian, công sức và cho kết quả không ổn định, còn phụ thuộc nhiều vào thao tác nghiền mẫu. Ngoài ra thao tác nghiền phải đƣợc tiến hành trong các tủ hút để tránh sự khuếch tán của Mercaptro ethanol vào không khí sẽ gây ra mùi khó chịu và gây nhều tác dụng xấu nếu nhƣ hít phải. Đồng thời, nhằm thu đƣợc những mẫu DNA tinh sạch hơn với độ tin cậy cao hơn, chúng tôi quyết Nhiều vết smear trên 46 định tiếp tục thử nghiệm quy trình 4, nghiền mẫu trong N2 lỏng thay vì nghiền trong EB và sử dụng các bƣớc tiếp theo giống nhƣ quy trình 3. Hình 4.4. Kết quả ly trích theo quy trình 4 Kết quả đạt đƣợc tốt hơn hẳn. Kết quả điện di ở hình 3.5 cho thấy việc gãy DNA đã giảm xuống, các băng DNA dày và sáng. Chỉ số đo OD từ 1,75 – 2,2. Những mẫu này đáp ứng đựoc các yêu cầu về độ tinh sạch, và có thế đƣợc dùng cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền. Nhƣ vậy việc nghiền mẫu trong N2 tỏ ra hiệu quả hơn nhiều so với nghiền trong dịch trích EB là không cần phải nghiền trong tủ hút, lá dễ nghiền hơn do đã khô cứng và giòn trong N2 lỏng. Ngoài ra mẫu có thể nghiền mạnh tay mà không sợ làm gãy DNA, kết quả thu đƣợc tốt hơn, tốn ít thời gian và công sức hơn. Với kết quả nhƣ trên, chúng tôi quyết định tiến hành ly trích DNA theo quy trình cải tiến (đƣợc chỉ rõ ở sơ đồ 3.1) để lấy nguyên liệu cho phân tích RAPD. Hình 4.5 Kết quả ly trích theo quy trình 4 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 47 Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4 Đây là một quy trình ổn định và có độ tin cậy, vấn đề còn lại chỉ là thao tác hút dịch trong sau mỗi lần ly tâm đòi hỏi phải cẩn thận, tránh hút vào lớp ngăn cách giữa 2 pha. Chúng tôi tiến hành ly trích 48 mẫu lá mắm trắng, kết quả thu đƣợc 40 mẫu cho băng DNA rõ nét, 6 mẫu cho băng DNA mờ (mẫu ở vị trí 1,2,3,4,19,33) và 2 mẫu cho băng DNA rất mờ ( mẫu số 31 và 50), đạt tỉ lệ 83%. Với kết quả này, các mẫu thu đƣợc hoàn toàn có thể thực hiện phản ứng RAPD. 4.4. Kết thực hiện phản ứng RAPD 4.4.1. Kết quả thí nghiệm 1 Nghiệm thức 1: Nghiền 0,4 g lá trong N2 lỏng thành bột mịn Thêm 1 ml dịch trích EB, vortex kĩ, ủ 65 0C/1 giờ Thêm 1V hỗn hợp CIA, đảo đều. Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/40C, thu V’ dịch trong Thêm V’ hỗn hợp CIA, đảo đều. Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/40C, thu dịch trong. Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 1:1, ủ ở - 20 0C qua đêm Ly tâm 9.000 vòng/20 phút/40C, đổ bỏ dịch trong, thu tủa Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/ 40C, thu V dịch nổi. Thêm 300µl TE1X, ủ 370C/30 phút. Thêm 20 µl Sodium acetate và 640 µl Ethanol 100%, đem ủ -200C/1 giờ Ly tâm 8.000/20 phút/40C. Đổ bỏ dịch trong, thu tủa. Rửa cặn với 300 µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 5 phút/6.000 vòng Lặp lại bƣớc 10, làm khô tủa DNA trong không khí. Hòa tan tủa trong 100 µl TE1X, ủ ở 37 0C/30 phút. Bảo quản ở -20 0 C 48 Sử dụng primer OPAC10 và primer 1 với thành phần các chất và chu kì nhiệt đã nêu ở bảng 2.1 và 2.2 để thực hiện phản ứng RAPD, chúng tôi thu đƣợc kết quả là không có băng nào trên gel điện di, nhƣ thể hiện ở hình 3.6 Hình 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 Trong nghiệm thức này, chúng tôi đã sử dụng quy trình phân tích RAPD của Lâm Vỹ Nguyên, 2006 cho cây đƣớc. Mặc dù với quy trình này, Lâm Vỹ Nguyên đã thu đƣợc kết quả rất tốt. Theo chúng tôi, điều này có thể là do một số lý do sau:  Thao tác của chúng tôi còn chƣa chính xác.  Đây chƣa phải là quy trình phù hợp cho cây mắm trắng. Nghiệm thức 2: Khi sử dụng primer OPAC10 và primer 1 với chu kì nhiệt và thành phần hóa chất nhƣ đã đƣa ra trong bảng 2.3 và 2.4, chúng tôi thu đƣợc 4 băng khi chạy với primer OPAC10, và chỉ 1 băng khi chạy với primer 1 nhƣ ở hình 3.7 Hình 4.7. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 Không có sản phẩm tạo thành Avicennia officinalis Avicennia alba Avicennia marina OPAC10 Primer 1 49 Từ kết quả này, chúng tôi kết luận rằng thực hiện phản ứng RAPD theo điều kiện ở nghiệm thức 2 này là phù hợp cho cây mắm trắng. Với OPAC10, chúng tôi thu đƣợc 4 băng cho mỗi mẫu DNA đem phân tích. Các băng tách rõ và có thể quan sát bằng mắt thƣờng. Với primer 1, tuy kết quả PCR tốt nhƣng chúng tôi chỉ thu đƣợc chỉ 1 băng đồng hình duy nhất. Do chỉ có 1 băng nên kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm này không có ý nghĩa trong việc so sánh sự đa dạng di truyền trên cây mắm trắng. Tuy nhiên khi so sánh kết quả này với kết quả chạy primer 1 trên 2 loài mắm đen (Avicennia officinalis) và mắm biển (Avicennia marina), chúng tôi kết luận có thể đây là băng đặc trƣng không những chỉ cho cây mắm trắng mà còn cho cả chi Avicennia và có thể là một vùng bảo tồn của chi Avicennia, là chỉ thị phân tử để phân biệt chi mắm với các chi khác trong họ Avicenniacea. Kết quả điện di với ladder cho thấy băng này có kích thƣớc khoảng 400 bp. Với kết quả nhƣ trên, chúng tôi quyết định khảo sát thêm một số primer khác với mong muốn tìm đƣợc primer cho sản phẩm khuếch đại trên gel cao hơn nhƣ trong thí nghiệm 2. Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RAPD với primer 1 trên cây mắm đen (Avicennia officinalis) Băng đặc trưng 400 bp Ladder 1kb 50 4.4.2. Kết quả thí nghiệm 2 Hình 4.9. Sản phẩm RAPD ở thí nghiệm 3 trên cây mắm trắng. Với các primer đã sử dụng, chỉ có primer OPA05 và OPA10 không cho băng nào, primer 9 và primer 2 đều cho 3 băng, primer RAH8 chỉ cho 2 băng. Theo chúng tôi, lý do không có băng ở mẫu thực hiện với primer OPA05 và OPA10 là do các primer này đã đƣợc bảo quản trong thời gian dài (từ năm 2004), hoạt tính có thể đã giảm đi, vì vậy không xảy ra phản ứng khuếc đại. Ở các primer khác, mặc dù có cho băng, nhƣng số băng còn ít (chỉ từ 2 – 3 băng), do đó chúng tôi không chọn để phân tích đa dạng di truyền. Với kết quả trên, chúng tôi quyết định sử dụng primer OPAC10 để thực hiện phản ứng RAPD, phân tích đa dạng di truyền trên cây mắm trắng. 4.5. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền cây mắm trắng tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ Chúng tôi đã tiến hành phản ứng RAPD với primer OPAC10 sử dụng thành phần hóa chất và chu kì nhiệt ở nghiệm thức 2, thí nghiệm 1 trên 16 mẫu DNA đã ly trích có kết quả đo OD đạt từ 1,8 -2,2. Kết quả có 2 mẫu không cho sản phẩm khuếch đại. Đối chiếu với thao tác thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy đây là mẫu cuối cùng khi chúng tôi tiến hành chia từ ống trộn chính sang các eppendorf khác, sự hao Primer 2 Primer 9 RAH8 OPA05 OPA10 51 hụt không thể tránh khỏi khi tiến hành với những thể tích nhỏ nhƣ vậy, do đó nồng độ thành phần các chất ở mẫu này có thể đã bị thay đổi, do đó phản ứng khuếch đại đã không xảy ra. Với 16 mẫu thực hiện phản ứng RAPD – PCR, chúng tôi thực hiện thành công 14 mẫu (chiếm tỉ lệ 87%), thu đƣợc tổng cộng là 49 băng, với 7 băng có kích thƣớc khác nhau, trung bình 3,5 băng/mẫu. Số băng tối đa chúng tôi thu đƣợc là 5 băng (ở 2 mẫu 11.AA07 và 5A.AA19), số băng ít nhất là 2 băng (thu đƣợc đƣợc ở 2mẫu 11.AA09 và 11.AA11). Măc dù số băng còn thấp nhƣng cũng thấy xuất hiện những băng đa hình ở những mẫu này. Kết quả thu đƣợc 6 băng đa hình (chiếm tỉ lệ 85%) và 1 băng đồng hình (chiếm tỉ lệ 15%) có kích thƣớc khoảng 200 bp. Hình 4.10. Kết quả thực hiện RAPD trên cây mắm trắng. Trong các mẫu phân tích, băng đồng hình 200 bp luôn xuất hiện, vì vậy chúng tôi nghĩ rằng có thể đây là băng đặc trƣng để phân biệt giữa cây mắm trắng với các cây khác trong chi mắm. Từ kết quả điện di thu đƣợc trên gel điện di, chúng tôi mã hóa số liệu thành dạng nhị phân 1 và 0 (1 là có băng, 0 là không có băng), và đem kết quả này phân tích với phần mềm NTSYSpc2.1 để phân tích sự đa dạng di truyền. Kết quả chúng tôi thu đƣợc cây phân nhóm của các mẫu đã phân tích. AA01 AA03 ladder AA06 AA07 AA08 AA09 AA11 AA12 AA13 AA19 AA25 ladder AA32 AA45 AA47 AA48 AA49 52 Hình 4.11. Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích Với 14 mẫu đem phân tích chia thành 2 nhánh chính có khoảng cách phân nhóm là 0,55. Nhóm I gồm 5 mẫu 10A.AA12, 2B.AA48, 6B.AA32, 10A.AA13 và 1.AA49. Nhánh này lại chia thành 2 nhánh phụ có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,81 – 1, điều này cho thấy có sự tƣơng đồng cao giữa 5 mẫu này. Đặc biệt giữa 2 cặp mẫu 10A.AA13 và 1.AA49; 10A.AA12 và 2B.AA48, có hệ số đồng dạng lên đến 1, chứng tỏ những cặp mẫu này có bộ gien hoàn toàn giống nhau. Mặc dù các mẫu này đƣợc lấy ở các tiểu khu khác nhau và khoảng cách cũng khá xa nhau. Điều này có thể là do chúng là những cây đƣợc tái sinh cùng thời điểm từ một nguồn cây mẹ giống nhau do đó mang bộ gien giống nhau. Bên cạnh đó, khi so sánh tọa độ lấy mẫu của những mẫu này, chúng tôi nhận thấy chúng đƣợc lấy tại những tiểu khu liền kề nhau dọc theo đƣờng thủy, nhƣ vậy theo chúng tôi nhận định, có thể đây là một dạng phát tán tự nhiên của cây mắm trắng. Trong nhánh II gồm 5 mẫu còn lại đƣợc chia làm nhiều nhánh nhỏ, phức tạp, có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,63 – 1. Đáng chú ý là 2 mẫu 17A.AA01 và 17A.AA03 có hệ số đồng dạng di truyền là 1. Hai mẫu này đều đƣợc lấy từ tiểu khu 17, mẫu 17A.AA01 là cây con, trong khi mẫu 17A.AA03 là cây đã trƣởng thành. Coefficient 0.55 0.66 0.78 0.89 1.00 10A.AA12 17.AA01 17.AA03 21.AA06 11.AA09 11.AA11 5A.AA19 10B.AA25 7.AA45 11.AA07 10A.AA12 2B.AA48 6B.AA32 10A.AA13 1.AA49 53 Điều này cho thấy có thể đây là những cây đƣợc phát tán tự nhiên hoặc đƣợc trồng từ một nguồn gốc chung. Tƣơng tự, hai mẫu 11.AA09 và 11.AA11 đƣợc lấy tại tiểu khu 11 cũng có hệ số đồng dạng di truyền là 1, và đều là cây con. Nhƣ vậy, có thể chúng cũng đƣợc phát tán tự nhiên cùng một nguồn gốc chung, hoặc có thể là cây đƣợc tái sinh theo các chƣơng trình phục hồi rừng với cùng một nguồn cây giống. Nhƣ vậy một cách tổng quát, kết quả phân tích trên phần mềm NTSYSpc2.1 cho thấy quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có hệ số đồng dạng di truyền tƣơng đối cao, từ 0,55 – 1, và có đến 3 cặp mẫu có hệ số này là 1. Điều này có thể nhận định rằng sự đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng nơi đây ở mức thấp. Ở những mẫu đƣợc lấy theo đƣờng bộ và lấy theo đƣờng sông đều cho thấy có vài trƣờng hợp hệ số đồng dạng di truyền là 1. Với kết quả nhƣ vậy, chúng tôi nhận định rằng, mắm trắng tuy là cây tiên phong của rừng ngập mặn nhƣng nó không phải là cây chủ lực của rừng Cần Giờ, chủ yếu là mọc tự nhiên. Công tác tái tạo, trồng mới quần thể mắm trắng cũng ít đƣợc tiến hành do đó sự phân bố rộng của mắm trắng có thể chủ yếu là do tính thích nghi, sinh trƣởng mạnh của cây mắm trắng trên những rừng ngập mặn, hình thức sinh sản chủ yếu là của mắm trắng là tự thụ phấn và phát tán, lan rộng nhờ vào hạt và cây con mọc lên từ rễ chính, trong đó hình thức phán tán của hạt chiếm ƣu thế hơn ở cây mắm trắng. Ở những cây mọc theo sông, nhờ dòng nƣớc mà hạt mắm trắng đƣợc mang khắp nơi. Có thể vì lý do này mà tính đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại nơi đây ở mức thấp. Bên cạnh đó cũng nguồn giống cây mắm trắng đƣợc tái sinh lúc ban đầu chủ yếu lấy từ nguồn giống tại chỗ do đó mức độ đa dạng về di truyền thấp là điều hoàn toàn có thể xảy ra. Nhƣ vậy càng về sau, hệ số đồng dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại nơi đây sẽ càng tăng cao hơn nữa do sự tự thụ phấn và lại giống. Điều này có thể dẫn đến sự hủy diệt quần thể mắm trắng nơi đây khi có dịch bệnh, sâu hại tấn công trên diện rộng. Vì vậy các công tác tái tạo, phục hồi tính đa dạng di truyền của cây mắm trắng cần đặc biệt đƣợc chú trọng để nâng cao tính đa dạng của quần thể mắm, giữ gìn tính đa dạng sinh học rừng và giữ gìn một hệ sinh thái rừng bền vững. 54 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận  Mẫu lá mắm trắng không giữ đƣợc lâu trong điều kiện bảo quản 40C và chỉ giữ đƣợc khoảng 1 tháng ở điều kiện -200C.  Quy trình ly trích 4, sử dụng N2 lỏng khá ổn định (đạt tỉ lệ 83%), cho DNA đạt tiêu chuẩn trong phân tích sinh học phân tử.  Quy trình RAPD theo nghiệm thức 2, sử dụng primer OPAC10 cho kết quả khá ổn định, vấn đề còn lại chỉ là do thao tác, nên trộn thật kĩ để đảm bảo nồng độ các chất đƣợc chính xác.  Primer 1 cho 1 băng có kích thƣớc 400 bp đặc trƣng cho cả 3 loài mắm đƣợc khảo sát.  Phân tích kết quả thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 trên quần thể mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ cho hệ số đồng dạng di truyền trong cây nhân nhóm di truyền dao động từ 0,55 – 1.  Sự đa dạng di truyền quần thể mắm trắng tại đây ở mức thấp. 55 5.2. Đề nghị  Khảo sát thêm các primer khác trên cây mắm trắng cho số sản phẩm khuếch đại nhiều hơn, có ý nghĩa hơn trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền.  Phân tích trên số lƣợng mẫu lớn hơn để cho kết quả chính xác hơn.  Tách riêng băng 400 bp khi chạy RAPD với primer 1 và băng 200 bp khi chạy với primer OPAC10 đem giải trình tự phục vụ cho công tác phân loại giống giữa cây mắm trắng với các cây khác trong họ Avicenniacea.  Phải có chính sách làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng và bảo đảm sự phát triển bền vững của Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nói chung và của quần thể mắm trắng (Avicennia alba) nói riêng. Trong công tác tái tạo quần thể mắm trắng, nên thu thập thêm nhiều nguồn giống từ các địa phƣơng khác, và nên trồng xen kẽ những cây thuộc những tiểu khu khác nhau và xen kẽ những cây trên đƣờng thủy, đƣờng bộ, để nâng cao tính đa dạng vốn có của quần thể mắm trắng tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC 1. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 2. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. 3. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản Giáo Dục, TP Hồ Chí Minh 4. Phạm Thành Hổ, 2006. Bài giảng Một số chỉ thị phân tử và ứng dụng trong công tác giống cây trồng. 5.Lê Văn Khôi, Viên Ngọc Nam, Lê Đức Tuân, 2006. Khôi phục và phát triển bền vững hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh (1978 – 2000). Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 6. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 7. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 8. Lâm Vỹ Nguyên, 2006. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata BLUME) ở khu Dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD. Đại học Nông Lâm. 9. Phạm Bình Quyền, 2002. Đa dạng sinh học. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội. 10. Lê Duy Thành, 2001. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 159 trang. 11. Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản Viện khoa học và công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ sinh học Hà Nội. 57 12. Bùi Trang Việt, 2002. Bài giảng Sinh học phân tử. Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 13. Ambike Baldev Gaikwad. Amplified Fragment Length polymorphism (AFLP) technique. 14. Kazutoshi Okuno and Shuichi Fukuoka, 1998. Manual for DNA extraction in plants. Japan international cooperation agency. TRANG WEB 15. 16. 17. 18. Word_files/AFLP%20Workshop%20Manual.doc 19. 20. 21. 22. PHỤ LỤC Phụ lục 1. Bảng thống kê các mẫu mắm trắng được thu thập tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ STT Tên mẫu Tên tiểu khu lấy Tọa độ GPS Đặc điểm hình thái 48P UTM 1 AA01 17 0707699 1153876 Cây non, nhiều hoa, chƣa trái 2 AA02 17 0706956 1153990 Cây cao, lá xanh tƣơi, nhiều trái 3 AA03 17 0706752 1154072 Cây già, sâu bệnh nhiều 4 AA04 21 0706678 1154972 Thân nhỏ, lùn, nhiều cành ngang 5 AA05 21 0706898 1156443 Cây to cao nhung chƣa thấy hoa trái. 6 AA06 21 0706380 1157741 Cây trẻ, có hoa, chƣa trái, lá bị sâu 7 AA07 11 0705765 1158774 Cây trẻ, tƣơi tốt, cành lá xum xuê, hoa trái rất nhiều. 8 AA08 11 0705441 1159250 Cây trƣởng thành, cao, lá xanh tốt 9 AA09 11 0705161 1159715 Cây non, chƣa có hoa, trái, sâu nhiều. 10 AA10 11 0704781 1160407 Lá có nhiều vết sâu bệnh, già cỗi 11 AA11 11 0704086 1161940 Cây già cỗi, sâu nhiều, lá bạc xám. 12 AA12 10A 0703881 1162362 Cây non, sâu nhiều. 13 AA13 10A 0703258 1163077 Cây cao, to , lá tƣơi tốt, không bị sâu so với những cây xung quanh. 14 AA14 10A 0702913 1163559 Thân nhỏ, cành gầy guộc, bị sâu 15 AA15 5 0702489 1164263 Cây cao, ốm, nhiều cành, lá già cỗi 16 AA16 5 0701380 1165102 Cây mọc trong gò mối, già cỗi 17 AA17 5 0700452 1165786 Không bị sâu bệnh mặc dù những cây gần kề có rất nhiều bệnh tích 18 AA18 5 0700650 1166971 Thân rất gầy, ít sâu bệnh, có trái 19 AA19 5 0700167 1167848 Cây non, tuoi tốt 20 AA20 5 0699834 1168876 Cây đã già, cao, nhiều sâu 21 AA21 5 0699673 1169617 Cây to, cao, tƣơi tốt 22 AA22 5 0699710 1169929 Cây cao, nhiều sâu 23 AA23 10B 0704861 1161423 Thân to, cành nhiều, lá bị sâu nhẹ 24 AA24 10B 0704929 1161680 Rất ít cành, không bị sâu, chƣa có hoa 25 AA25 10B 0704353 1167004 Ít bị sâu bệnh so với cây xung quanh 26 AA26 10A 0704815 1162305 Cây cao, là cằn cỗi, sâu nhiều 27 AA27 10A 0704402 1162602 Thân cong queo, nhiều cành 28 AA28 10A 0704558 1162782 Cây cao, to , tƣơi tốt 29 AA29 10A 0704676 1163013 Nhiều trái, tƣơi tốt 30 AA30 10A 0704682 1163310 Thân ốm, ít hoa, nhiều sâu 31 AA31 6B 0705498 1163893 Lá xanh tƣơi, hoa nhiều 32 AA32 6B 0706990 1163864 Cây non, không sâu 33 AA33 6B 0707502 1163708 Cây nhiều hoa, cành nhiều 34 AA34 6B 0708076 1163518 Thân thẳng, nhiều cánh, lá tốt 35 AA35 7 0710899 1165414 Lá bị nâu, nhiều sâu bệnh 36 AA36 7 0711177 1165656 Cây non,rất tƣơi tốt 37 AA37 7 0711211 1165828 Thân nhỏ, cao chƣa có hoa 38 AA38 7 0711384 1166061 Cây non, sâu nhiều 39 AA39 2B 0712166 1167219 Cây cao, lá không sâu, ít cành 40 AA40 2B 0712411 1167411 Thân nhiều cành, hoa lá tƣơi tốt 41 AA41 7 0712675 1167702 Cây trƣởng thành, rất xanh tốt 42 AA42 7 0712901 1167384 Hoa rất to, cây xanh tốt 43 AA43 7 0713223 1167803 Thân nhỏ, nhiều canh, có hoa 44 AA44 7 0713506 1168311 Thân to, lá rất tƣơi tốt 45 AA45 7 0714012 1168222 Lá bạc nhiều, ít sâu bệnh, thân cao 46 AA46 7 0714263 1168125 Thân nhỏ, bị sâu nhẹ 47 AA47 2B 0715316 1168346 Nhiều cành, lá xanh tốt 48 AA48 2B 0715338 1168639 Chƣa có hoa, cây to, cao 49 AA49 1 0713958 1169946 Cây non, lá bị sâu nhẹ 50 AA50 1 0713439 1170475 Cây rất cao, nhiều cành, bị sâu nhiều Phụ lục 2. Bảng chỉ số đo OD của các mẫu ly trích # Name Dilut. Factor Ratio Abs Abs 1 AA05 1.00000 1.91300 0.12156 6.3545E-2 2 AA06 1.00000 1.83980 0.10012 5.4418E-2 3 AA08 1.00000 1.90610 7.0246E-2 3.36853E-2 4 AA09 1.00000 1.98070 9.9778E-2 5.0376E-2 5 AA10 1.00000 2.03590 0.14718 7.2293E-2 6 AA11 1.00000 1.92170 9.4518E-2 4.9186E-2 7 AA12 1.00000 2.08880 0.15239 7.2957E-2 8 AA13 1.00000 2.03000 8.8066E-2 4.3383E-2 9 AA14 1.00000 2.04050 0.10603 5.1963E-2 10 AA15 1.00000 1.98990 0.11276 5.6663E-2 11 AA16 1.00000 2.02680 0.19094 9.4208E-2 12 AA18 1.00000 1.97070 6.2707E-2 3.1819E-2 13 AA20 1.00000 2.04920 3.7462E-2 1.8581E-2 14 AA21 1.00000 2.07400 1.6814E-2 8.1072E-3 15 AA22 1.00000 1.88520 2.2685E-2 1.2033E-2 16 AA23 1.00000 2.79790 2.9511E-3 1.0548E-3 17 AA24 1.00000 2.08490 3.0027E-2 1.4402E-2 18 AA25 1.00000 1.79140 8.1058E-2 4.5249E-2 19 AA26 1.00000 1.83270 7.9355E-2 4.3300E-2 20 AA27 1.00000 1.84070 7.8523E-2 4.2660E-2 21 AA28 1.00000 1.96280 0.12397 6.3162E-2 22 AA29 1.00000 1.97520 0.12302 6.2280E-2 23 AA30 1.00000 2.18210 2.5607E-2 1.1735E-2 24 AA32 1.00000 2.16600 2.5790E-2 1.1907E-2 25 AA34 1.00000 1.95050 0.53627 0.27494 26 AA35 1.00000 2.06870 1.16020 0.56084 27 AA36 1.00000 2.25560 2.9507E-2 1.3082E-2 28 AA37 1.00000 2.22720 3.0115E-2 1.3522E-2 29 AA38 1.00000 2.23550 1.9769E-2 8.8434E-3 30 AA39 1.00000 2.16300 2.0506E-2 9.4805E-3 31 AA40 1.00000 2.11070 1.6807E-2 7.9627E-3 32 AA41 1.00000 2.09760 3.6278E-2 1.7295E-2 33 AA42 1.00000 1.98150 6.2750E-2 3.1669E-2 34 AA43 1.00000 2.04170 0.18972 9.2922E-2 35 AA44 1.00000 2.02050 0.11123 5.5.50E-2 36 AA45 1.00000 2.04880 0.10576 5.1622E-2 37 AA46 1.00000 2.03360 8.7981E-2 4.3263E-2 38 AA47 1.00000 2.09790 0.15192 7.2417E-2 39 AA48 1.00000 1.98180 9.1039E-2 4.5937E-2 40 AA49 1.00000 2.00540 9.8450E-2 4.9093E-2 Phụ lục 3. Bảng mã hóa kết quả điện di các mẫu đem chạy RAPD trong phân tích với phần mềm NTYSYSpc2.1 Tên mẫu 450bp 390bp 330bp 300bp 200bp 100bp 50bp 17.AA01 0 0 0 1 1 1 0 17.AA03 0 0 0 1 1 1 0 21.AA06 1 0 0 1 1 1 0 11.AA07 1 0 1 1 1 1 0 11.AA09 0 0 0 1 1 0 0 11.AA11 0 0 0 1 1 0 0 10A.AA12 0 0 1 0 1 1 0 10A.AA13 0 1 1 0 1 1 0 5A.AA19 0 1 0 1 1 1 1 10B.AA25 0 1 0 1 1 1 0 6B.AA32 0 0 1 0 1 0 0 7.AA45 1 1 0 1 1 1 0 2B.AA48 0 0 1 0 1 1 0 1.AA49 0 1 1 0 1 1 0