Khóa luận Bước đầu khảo sát khả năng nhân sinh khối và đánh giá hiệu quả phòng trừ nấm bệnh cùa một số chủng nấm Trichoderma sp

xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân. Quá trình này gây phản ứng của cây, tạo ra các hợp chất phenol và thể sần có màu nâu. Những hợp chất này gây hiện tượng hóa nâu của mạch dẫn, một dấu hiệu dễ nhận thấy của bệnh héo khi cắt ngang thân. Hiện tượng tắc mạch xylem làm giảm lượng nước di chuyển lên cây, khiến cho cây bệnh bị héo rồi chết. Bệnh héo do Fusarium sp. thường liên hệ với tuyến trùng nốt sưng. Nấm Fusarium sp. xâm nhiễm vào cây qua vết thương do tuyến trùng gây ra. Phòng trừ Các bệnh héo do Fusarium sp. rất khó phòng trừ do bào tử hậu tồn tại qua thời gian dài trong đất. Luân canh các cây trồng có khả năng kháng bệnh ít nhất 2 năm trước khi trồng lại các cây trồng mẫn cảm có thể giúp làm giảm nguồn bệnh. Tuy nhiên, loại nấm này có thể tồn tại bằng cách xâm nhiễm vào vỏ rễ các cây trồng không phải là ký chủ và không biểu hiện triệu chứng. Vì vậy rất khó quản lý được sự tồn tại của chúng trong đất. Có những giống cây trồng có khả năng kháng bệnh héo do Fusarium sp. Tuy nhiên, một giống kháng bệnh không có nghĩa là có khả năng kháng với tất cả các chủng của một dạng loài nào đó. Hiện chưa có thuốc trừ nấm hữu hiệu để phòng trừ các bệnh do nấm Fusarium sp. gây nên, có thể sử dụng nấm đối kháng làm tác nhân phòng trừ nấm bệnh. Nấm Phytophthora sp. Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora sp. Sợi nấm Phytophthora sp. có cấu tạo đơn bào, hình thành vòi hút hình trụ hoặc hình cầu trong quá trình ký sinh trong tế bào cây. Sinh sản vô tính của nấm tạo ra cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh lộ ra trên bề mặt vết bệnh, đặc biệt là ở mặt dưới lá bệnh. Cành bào tử không màu, phân nhiều nhánh so le với nhau, trên mỗi nhánh có nhiều vết lồi lõm. Bào từ phân sinh hình trứng hoặc hình quả chanh yên có núm nhỏ ở phía đỉnh bào tử. Kích thước trung bình của bào tử phân sinh là 22 – 32 x 16 – 24 µm. Bào tử phân sinh có hai kiểu nẩy mầm, nẩy mầm gián tiếp khi nhiệt độ môi trường trong khoảng 12 – 180C, thích hợp là 14 – 180C và nảy mầm trực tiếp thích hợp ở 20 – 240C. Hình 1.3: Bào tử nấm Phytophthora sp. Sinh sản hữu tính tạo ra bào tử trứng, nhưng chỉ xảy ra trong điều kiện rất lạnh và kéo dài. Ở các nước có điều kiện nhiệt đới nóng ẩm chưa tìm thấy giai đoạn hữu tính trong chu kỳ phát triển của nấm. Nấm Phytophthora sp. có khả năng hình thành nhiều chủng khác nhau. Nấm Phytophthora sp. là nguyên nhân gây rất nhiều bệnh trên cây ăn quả, rau màu, và cây công nghiệp ở Việt Nam. Các bệnh bao gồm thối rễ, thối thân và quả sầu riêng; thối rễ ớt; thối nõn dừa; thối gốc (héo nhanh) hồ tiêu; mốc sương cà chua, khoai tây; thối rễ, thân và quả đu đủ; tàn lụi cao su và các cây trồng khác. Triệu chứng bệnh Cây bị bệnh chết dần từ ngọn cây và có thể có triệu chứng thối rễ và nứt ở phần thân gần mặt đất. Các cây rau bị thối rễ, như ớt, trở nên còi cọc và héo. Cây thường chết nhanh sau khi các triệu chứng héo trầm trọng xảy ra. Cơ chế xâm nhiễm Cách thức xâm nhiễm tùy thuộc từng loài. Tuy nhiên, bào tử trứng, bọc bào tử động và du động bào tử tạo điều kiện cho việc xâm nhiễm vào các bộ phận khác của cây. Mưa tạt phân tán bào tử lên bộ lá của cây vì vậy quá trình xâm nhiễm có thể bắt đầu từ thân, lá và quả, tùy thuộc loài Phytophthora sp. và ký chủ. Côn trùng bò hoặc bay cũng có thể mang nấm từ đất tới các bộ phận phía trên của cây. Phòng trừ Để phòng trừ thành công các bệnh do nấm Phytophthora sp. thường phải có sự kết hợp các biện pháp phòng trừ khác nhau: thoáng nước tốt, dùng giống sạch bệnh, ngăn chặn Phytophthora sp., tiêm phosphonate vào cây, nhúng rễ cây con vào thuốc trước khi trồng để giảm số cây con chết, sử dụng nấm đối kháng. GIỚI THIỆU VỀ NẤM ĐỐI KHÁNG Trichoderma sp. Lịch sử nghiên cứu nấm Trichoderma sp. Lịch sử nghiên cứu về Trichoderma sp. đã được phát hiện ra gần 200 năm trước nhưng không được chú ý đến cho đến khi Thế Chiến lần thứ II xảy ra... Trichoderma sp. được phát hiện ra và hiện nay loài đó được biết là Trichoderma viride. Hơn 150 năm sau, Trichoderma sp. chỉ là đối tượng của vài nhà phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học khác. Tình hình thay đổi trong Thế Chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiện tượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương. Chương trình điều tra của quân đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma "viride" mã số QM 6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này. Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người đã khám phá ra loài này là Elwyn T. Reese, tác giả làm việc tại Viện nghiên cứu Natick với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó. Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma sp. vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma. Việc nuôi cấy dể dàng và không tốn kém các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản về Trichoderma hơn là ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma sp. là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma sp. được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Tiềm năng sử dụng nấm Trichoderma sp. trong đất Trichoderma sp. có khả năng tái tạo quân thể, được xem là một hiện tượng phòng trừ sinh học vẫn chưa được giải thích về cơ chế. Theo Bliss (1959) Trichoderma sp. có khả năng thiết lập quần thể và tái hoạt động rất nhanh trên đất đã được xử lý khử trùng xông hơi bằng cacbon disulfide để diệt nấm Armillaria mellea trên cây cam, quýt, nhưng không công bố những bằng chứng quần thể nấm Trichoderma sp. phòng bệnh. Ohr và cộng tác viên (1973), cung cấp bằng chứng thuyết phục nhất quần thể Trichoderma sp. trong đất có khả năng phòng trừ nấm Armillaria mellea trên đất đã được xử lý xông hơi bằng methyl bromide. Khả năng phòng trừ bệnh của nấm Trichoderma sp. tăng lên trong môi trường đất của acid. Theo Cook và Baker, 1983, khi bón thêm sulfur vào đất để duy trì pH < 3,9 nhằm hạn chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. gây bệnh thối rễ và ngọn dưa, đồng thời lại làm tăng quần thể Trichoderma sp. Khả năng thứ hai là kháng nấm: đánh giá khả năng kháng nấm Rhizoctonia solani của chủng nấm T. hamatum phân lập từ đất vườn ươm ở California, Chet và Baker (1980) cho biết, và T. harziannum được phân lập từ đất tại Mexico có khả năng ngăn chặn nhiều loại nấm đất (Lumsden, 1977) nấm R. solani không bị tiêu diệt bởi nhiệt độ và tia phóng xạ gamma nhưng bị diệt trên trên môi trường chứa nấm T. harziannum (Nelson và ctv., 1983), đây là vai trò chính của Trichoderma sp. trong việc phòng trừ sinh học. Trichoderma sp. có khả năng khống chế các loại nấm gây bệnh trong đất như R. solani, Phythium spp. theo Baker (1974, 1980), Barnett và ctv (1974), Cook và Baker (1983). Đặc điểm của nấm Trichoderma sp. Vị trí phân loại Trichoderma sp. là loại nấm phổ biến trong tự nhiên, tuy nhiên hệ thống phân loại của chúng chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến khác nhau đưa ra khi phân loại giống nấm này. Theo Rifai (1996), H.Barnett và Barry Bhunter (1972), Trichoderma sp. thuộc loại nấm toàn Deuteromycetes (Fungi Inperfect). Nhóm nấm bất toàn là những nấm sinh sản bằng bào tử bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử, thứ tự phân loại như sau: Ngành: Ascomycota Lớp: Deuteromycetes Bộ: Moniliaceae Họ: Moniliaceae Hai nhà khoa học Brazil là Esposito và Manuela da silva cho biết Trichoedrma họ Hypocreaceea, lớp nấm túi Ascomycetes, cũng theo hai tác giả này, những loài Trichoderma được phân thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Satunisporum, Pachibarium, Hypocrenum. Hình thái, sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử của nấm Trichoderma Đặc điểm hình thái: Trichoderma sp. là một loại nấm đất, phát triển tốt trên các loại đất giàu dinh dưỡng hoặc trên tàn dư thực vật. Đặc điểm hình thái của nấm này là cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn. Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hình trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy theo từng loài. Bào tử đính ở đỉnh của cành. Hình 1.4: Nấm Trichoderma sp. Sự sinh trưởng của Trichoderma: là loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma sp. có khả năng sử dụng nguồn hỗn hợp cacbon và nitrogen. Nguồn cacbon và năng lượng Trichoderma sp. sử dụng được là đường đơn và đường đa, cùng với hỗn hợp purines, pyrimidines acid amin, tannins, aldehydes và acid hữu cơ. Đặc biệt là acid béo, methanol methylamine, formate và NH3 là nguồn đạm bắt buộc phải có trong môi trường nuôi cấy Trichoderma sp. Môi trường có nhiều dinh dưỡng muối, các nguồn sulfur và các hỗn hợp như vitamin cũng có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma sp. Nhưng muối sodium chloride sẽ làm giảm sinh trưởng và phát triển của một số loài nấm Trichoderma sp. Do đó trong muôi trường nuôi cấy không được có mặt của muối này. Nồng độ CO2 trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm Trichoderma sp. Tuy nhiên ảnh hưởng của CO2 đến sinh trưởng và sản xuất của Trichoderma sp. phụ thuộc vào nồng độ pH của môi trường trong đất. Nồng độ CO2 10% không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma sp. Tốc độ mọc nhanh của Trichoderma sp. ở nồng độ CO2 cao trong môi trường kiềm. Điều này có thể giải thích vì sao Trichoderma sp. thường sống trong môi trường đất phèn, ẩm ướt, ít hiện diện trên đất kiềm. Vì thế CO2 có ảnh hưởng đến sinh trưởng của Trichoderma sp. tại độ pH có giá trị cao. Sự hình thành bào tử trên môi trường: phần lớn các loại Trichoderma sp. có cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều kiện môi trường tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện tối sáng lẫn lộn, hay bào tử có thể xuất hiện trong điều kiện sáng. Nhiều tác giả công bố, Trichoderma sp. không hình thành bào tử ở bước sóng dưới 254 nm hoặc trên 1.100 nm và hình thành nhiều bào tử ở bước sóng 380 – 440 nm. Các hỗn hợp như azaguanie, 5 – fluororacil, actiomycin D, cycloheximide, phennethyl alcohol và ethidium bromide ngăn cản sự hình thành các bào tử hậu, làm tăng khả năng phòng trừ sinh học của các loài nấm T. hamatum, T. viride, T. virens. Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến nấm Trichoderma sp. Nhiệt độ: Trichoderma sp. có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ khá rộng từ 15 đến 350C; trong đó, ở nhiệt độ từ 15 đến 200C Trichoderma sp. chậm hình thành bào tử. Nhiệt độ 25 – 300C là khoảng nhiệt độ tối ưu để Trichoderma sp. sinh trưởng và phát triển nhanh, lượng bào tử nhiều và thời gian sinh sản bào tử sớm. Ở 350C Trichoderma sp. phát triển kém, khả năng sinh bào tử yếu. Ánh sáng: với cường độ chiếu sáng liên tục, nấm phát triển nhanh, nhưng mật độ bào tử ít. Tối liên tục sợi nấm phát triển chậm, mật độ thưa, sợi nấm chưa hình thành xong sau đó bào tử hình thành theo từng đợt rất rõ. Sáng tối xen kẽ sợi nấm hình thành nhiều (chỉ sau 2 ngày), mật độ dày, sau đó xuất hiện nhiều bào tử. Khả năng đối kháng nấm gây bệnh cây Nấm đối kháng là những thành viên phổ biến của hệ vi sinh vật đất. Chúng thường tiết ra các enzyme, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc cạnh tranh điều kiện sống với nấm gây bệnh. Nấm đối kháng có thể kìm hãm sự sinh trưởng và sự phát triển của nấm gây bệnh, giúp cây hồi phục, sinh trưởng và phát triển. Một số loài nấm đối kháng đã được tìm thấy trong đất là: Penicillium axalicum, P. frequetans, P. vermiculata, P. nigricans, P. chergsogetum đối kháng với nấm Pythium sp., Rhizioctonia solani, sclerotium cepivorum, verticillium alboatrum. Trichoderma sp. cũng là một trong những loài nấm có khả năng ức chế một số nấm gây bệnh khác như: Sclerotium rolfsii, Phytophthora sp., Fusarium sp., Pythium sp., Rhizoctonia sp. gây bệnh trên nhiều loại cây trồng như: các cây họ đậu, cây ăn trái, hòa thảo, cây công nghiệp và cây hoa kiểng. Cơ chế đối kháng nấm gây bệnh cây của nấm Trichoderma sp. Cơ chế giao thoa sợi nấm: Sự đối kháng của nấm Trichoderma sp. thông qua nhiều cơ chế. Weidling (1932) đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma sp. ký sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho hiện tượng đó là “giao thoa sợ nấm”. hiện tượng giao thoa gồm 3 giai đoạn như sau: (1) Sợi nấm Trichoderma sp. vây quanh sợi nấm gây bệnh. (2) Sau sự vây quanh, sợi nấm Trichoderma sp. thắt chặt lấy các sợi nấm gây bệnh. Hình 1.5: Nấm Trichoderma sp. quấn lấy sợi nấm gây bệnh. (3 ) Cuối cùng là sợi nấm Trichoderma sp. đâm xuyên làm thủng lớp tế bào của nấm gây bệnh dẫn đến sự gây bệnh làm cho chất nguyên sinh trong nấm gây bệnh bi phân hủy và dẫn đến nấm bệnh chết. Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của nấm Trichoderma sp. Sau này quan sát dưới kính hiểm vi, hiện tượng ký sinh của nấm Trichoderma sp. được mô tả như sau: tại những điểm nấm Trichoderma sp. tiếp xúc với nấm gây bệnh dã làm cho nấm gây bệnh teo lại và chết. Ngược lại ở những điểm không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma sp. với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sp. sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh. Cơ chế kháng sinh: nấm Trichoderma sp. có khả năng sinh ra một số kháng sinh. Khả năng sinh ra chất kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau. Chúng gồm: Gliotoxin: là chất kháng sinh được R.Weindling và O. Emerson mô tả năm 1936 do nấm Trichoderma lignorum tạo thành. Trichoderma sinh kháng sinh Gliotoxin với điều kiện hàm lượng oxy phải cao. Chất Gliotoxin được tích luỹ nhiều trong dịch môi trường. Sự tích luỹ tối đa chất Gliotoxin thường ở giai đoạn phát triển sớm của nấm Trichoderma. Chất Gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, pisi; Botrytis, R.solani). Viridin: là chất kháng sinh thứ hai do nấm Trichoderma sp. tạo thành trong hoạt động sống của chúng.Chất kháng sinh này được phát hiện vào năm 1945. Viridin độc hơn rất nhiều so với Gliotoxin và có hoạt tính chống nấm cao. Ngoài ra, một số chất kháng sinh khác do nấm Trichoderma sp. sinh ra như: chất kháng sinh U – 21693 được Meyer phát hiện năm 1996. Năm 1975, ở Nhật Bản, các tác giả Atsushi, Shunsuke đã phát hiện được 2 chất kháng sinh: Trichodermin và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài T.koningii và T.aureoviride. Nấm Trichoderma còn có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh dễ bay hơi có hoạt tính sinh lý cao. Theo Hutchinson (1973) thì thành phần chính của những chất này là khí Cacbonic (CO2) và ethanol (Seiketov, 1982). Tác động của enzyme: nhiều loài Trichoderma sp. có khả năng sinh ra enzyme phân giải (như enzyme laminarinaza, chitinaza,…) (Score et al., 1994). Khi phát triển ở trên thành tế bào nấm vật chủ thì nấm Trichoderma sp. có thể tiết ra những loại enzyme gây suy biến thành tế bào của nấm gây bệnh cho cây như enzyme β -(1-3)-glucanase và chitinase. Cơ chế cạnh tranh: nấm Trichoderma sp. có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nguồn gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú. Nấm Trichoderma sp. thường định cư trước so với các nguồn gây bệnh cây. Do đó, chúng chiếm các chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nguồn gây bệnh (Green et al., 1996; Martin et al., 1985). Hầu hết các cơ chế nêu trên về tính đối kháng của nấm Trichoderma sp. được quan sát trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tại Viện Bảo Vệ Thực Vật đã có các thí nghiệm về tính đối kháng của nấm Trichoderma sp. (khả năng ký sinh, khả năng sinh các chất kháng sinh). Cơ chế tác động của nấm đối kháng Trichoderma sp. trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam là rất có triển vọng cho việc nhân sinh khối nguồn nấm tạo ra chế phẩm sử dụng phòng trừ bệnh hại cây trồng (Viện Bảo Vệ Thực Vật, 2007). MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA NẤM Trichoderma sp. Lĩnh vực bảo vệ thực vật Trichoderma sp. có hiệu quả nhất trong việc phòng trừ bệnh chết cây non, tạo sinh khối trong đất và hệ rễ ngăn cản sự phát triển của nấm gây hại cây trồng bằng cách cạnh tranh, ký sinh trên nấm hoặc kháng sinh học. Ngoài ra, chúng còn gây ảnh hưởng mạnh đến vi khuẩn (Hadar và ctv, 1984) và các loại nấm khác trong đất. Bón vào đất Đối với những bệnh hại do nấm, những bệnh liên quan dến các bộ phận nằm trong đất (thân ngầm và rễ) rất khó xử lý bằng phương pháp hóa học truyền thống. Trichoderma sp. là loại vi sinh vật đối kháng mạnh với nấm gây bệnh trong đất và được nhiều nghiên cứu ứng dụng như là một yếu tố kiểm soát sinh học. Cơ chế này chủ yếu nhờ vào độc tố (Trichodermin, viridian) do nấm tiết ra và ký sinh trực tiếp trong nấm bệnh. Phòng trừ bệnh chết ỉu trên cây họ đậu do nấm Rhizoctonia solani và Pythium sp. gây ra. T. lignorum được bón vào trong các hốc cây con (7 – 8 tỷ bào tử/g chế phẩm) cho thấy bệnh thối rễ giảm 2 – 3 lần và năng xuất tăng lên rõ rệt. Xử lý hạt giống Sử dụng Trichoderma sp. trong việc xử lý hạt giống có liên quan đến khả năng xâm nhập của nấm Trichoderma sp. vào trong đất. Phương pháp này cần một số lượng lớn bào tử nấm để áp dụng. Tuy nhiên, đây là một phương pháp rất có ý nghĩa trong việc phòng trừ nấm bệnh ở giai đoạn từ khi gieo hạt đến giai đoạn cây con. Khả năng phòng trừ sinh học của nấm T. hamatum có hiệu quả trên hạt giống đậu hà lan và củ cải đường, làm giảm bệnh rạp cây con do nấm R.solani và Pythium.ssp. (Haman và công tác viên năm 1980). Dòng nấm T.hazianum xử lý qua tia hồng ngoại (Papavizas và Lewis 1982) và T.viride có hiệu quả trong phòng trừ sinh học (Papavizas và Lewis, 1981). Hạt đậu nành được xử lý T.pseudokoningii và hạt bắp được xử lý T.harzianum có hiệu quả ngăn chăn mần bệnh và làm tăng năng suất trong việc phòng trừ nấm Rhizoctonia sp. Dùng T.harzianum xử lý hạt bông cho hiệu quả cao trong phòng trừ nấm R. solani tại Israel. Hiệu quả thành công trong việc dùng Trichoderma sp. xử lý hạt giống ảnh hưởng nhiều từ yếu tố phân lập (Papavizas và Lewis, 1981) tuổi của hạt giống gieo trồng (Kommedahi và Windels, 1981), nhiệt độ của đất (Harman và cộng tác viên, 1981), loại đất và vi sinh vật hiện diện trong đất (Hadar và cộng tác viên,1981), dinh dưỡng trong quá trình cấy nấm (Harman và ctv, 1981), mật độ nấm khi cấy vào đất (Nelson, 1975), tiềm năng gây bệnh hại cây trồng (Kommedahi và Windels,1981). Lương thực và ngành dệt Trichoderma sp. là những nhà máy sản xuất nhiều enzyme ngoại bào tử có hiệu quả. Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzyme khác phân hủy polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng được sử dụng trong thực phẩm và ngành dệt. Chất kiểm soát sinh học Hiện nay loài nấm này được sử dụng một cách hợp pháp cũng như không được đăng ký trong việc kiểm soát trên thực vật. Các chế phẩm Trichoderma sp. được sản xuất và sử dụng như là chất soát sinh học một các hiệu quả. Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng vừa tăng khả năng kháng bệnh cho cây. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng Nhưng lợi ích mà loại nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua. Bao gồm kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và sự phát triển mạnh hơn của bộ rễ thông thường. Những cơ chế giải thích cho hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ hơn trong thời gian gần đây. Hiện nay, một giống Trichoderma sp. phát hiện chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp, cây cảnh có khả năng chống chịu được hạn hán. Một số loài nấm Trichoderma sp. có khả năng kích thích sự nảy mầm và ra hoa. Nhiều công trình nghiên cứu chứng minh rằng T.harzianum và T. konigii kích thích sự nẩy mầm và sinh trưởng của cây. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen Nhiều vi sinh vật có khả năng kiểm soát sinh học đều có chứa 1 số lượng lớn gen mã hóa các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học. Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma sp. đã tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo cây có khả năng kháng lại nhiều loại bệnh. Chưa có gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen đang được nghiên cứu và phát triển. Lĩnh vực xử lý môi trường T.hazianum có khả năng phân hủy các chất ô nhiễm trong đất rừng. Sự tồn tại của các hợp chất chloroguaiacol, các hợp chất halogen thấm nước (AOX) trong chất thải nhà máy sản xuất bột giấy ở hồ Bonney, vùng đông nam nước Úc và các sản phẩm phân giải của T.hazianum đã được nhiều nhà khoa học Van Leeuwen cùng công tác viên nghiên cứu. Chất tẩy trắng chlor của nhà máy sử dụng sulfite hóa bột giấy được tháo ra hồ một cách gián tiếp đã làm xuất hiện các hợp chất chlorophennol trong nước và cặn bẩn. hợp chất chlorophennol rất độc. T.hazianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp chất tự do 2,4,6- tricholorophenol; 4,5 – di chlorophenol và cả AOX trong môi trường chứa muối khoáng. Loại nấm này cũng có khả năng đề halogen hóa tertra chloroguaiacol tự do trong môi trường khoáng mặn. T.hazianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chủng trên ciliatin, glycophosphat và amino methyphosphonic acid (3 - methoxyphenyl). T.hazianum (khoa sinh lý Trường Đại học california) có thể phân giải DDT, endosufan, pentachloronotrobenzen và pentachcholorophennol. Nấm này phân giải endosufan trong điều kiện dinh dưỡng khác nhau trong suốt quá trình sinh sống của nó. KHẢ NĂNG TẠO CHẾ PHẨM CỦA NẤM Trichoderma sp. Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm Trichoderma sp. Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp lên men tạo chế phẩm sinh học để trừ nấm bệnh, sâu hại cây trồng trong nông nghiệp. Người ta đã xây dựng những quy trình để thu nhận sản phẩm lên men khá hoàn chỉnh và được áp dụng vào thực tế sản xuất lớn ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, quy trình lên men vẫn đang còn nằm trong giai đoạn tim kiếm một phương pháp thích hợp, chọn lựa điều kiện và môi trường nuôi cấy tối ưu để đạt số lượng bào tử gồm chất khô cao, giá thành sản phẩm rẻ, đồng thời sản phẩm tạo ra rễ bảo quản, giữ được hoạt tính lâu bền ở nhiệt độ bình thường. Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất vì đây là quá trình lên men đơn giản, dễ thành công hơn các quy trình khác. Trong quy trình này, các loại cơ chất dung để làm môi trường cho nấm đối kháng phát triển là cám trấu, bột gạo, bột bắp cùng với dịch dinh dưỡng để nuôi cấy nấm. Lên men xốp sẽ thu nhận được chế phẩm sinh học dạng đính bào tử (conidiospore) của các nấm đối kháng, ổn định và bền vững hơn dạng chlamydospores (bào tử chồi), vì vậy phương pháp này đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm từ lâu. Khi nuôi nấm đối kháng trên môi trường xốp (hạt) Solivey F.F (1984), cho biết đã đạt hiệu suất bào tử so với các phương pháp lên men khác để chống sâu bệnh. Tuy nhiên, khả năng sống của bào tử trong chế phẩm phụ thuộc không chỉ vào điều kiện bảo quản mà còn phụ thuộc vào sự sấy khô và cơ chất dinh dưỡng. kết quả cho thấy các chế phẩm sinh học nấm diệt sâu Metarrhhizium anisopliae và Bauverria bassiana nếu bảo quản ở nhiệt độ từ 5 – 100C có thể giữ được hoạt tính 6 – 8 tháng. Ngược lại bảo quản ở nhiệt độ phòng thì chỉ giữ được 6 – 8 tuần. Như vậy các chế phẩm sinh học từ nấm được sản xuất ra cần phải được bảo quản trong điều kiện lạnh, nơi khô ráo và sẽ có khả năng giữ được hoạt tính của chế phẩm 6 – 8 tháng. Người ta cũng thường áp dụng quy trình lên men xốp để tạo sinh khối, đã áp dụng trong sản xuất để diệt các loài nấm gây hại cây trồng. Bởi vì, môi trường lên men xốp cho lượng bào tử/gram chế phẩm cao, quy trình đơn giản dễ thực hiện, giá thành sản phẩm tạo ra thấp, đáp ứng được nhu cầu của người nông dân. Để có được sản phẩm tạo ra có nhiều bào tử, các điều kiện môi trường như độ ẩm tương đối không khí Rh = 95 %; nhiệt độ đạt 30 – 32oC và thời gian nuôi cấy 5 – 8 ngày. Thành phần các loại môi trường dùng để lên men xốp, cũng là tạo chế phẩm Trichoderma như sau: Bột gạo + bã đậu phộng Cám gạo + bột ngô Cám gạo + bột ngô + bột đậu nành Cám gạo + bột ngô + bã đậu khô Lúa nấu chín Gạo nấu chín Ngoài ra, các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Tú (1997) còn thử nghiệm trên 3 loại môi trường khác để nhân sinh khối Trichoderma đó là: Môi trường gồm các thành phần là cám, trấu. Môi trường than, bùn. Môi trường bột thạch cao tẩm mật rỉ 10%. Thí nghiệm được tiến hành trong cùng điều kiện về ẩm độ, nhiêt độ và thời gian nuôi cấy và 2 dòng Trichoderma được chọn là Trichoderma 1 và Trichoderma 2. Kết quả của thí nghiệm như sau: Môi trường cám trấu cho sản phẩm Trichoderma có lượng bảo tử trong chế phẩm khô đạt 109 bào tử/gram, số lượng bào tử cao nhất ở nhiệt độ phòng. Môi trường than bùn và bột thạch cao tẩm mật rỉ cho số lượng bào tử/gram chế phẩm khô thấp hơn, khoảng 107 – 108 bào tử/gram. Tiếp tục thực nghiệm thời gian bảo quản của chế phẩm Trichoderma 1 và Trichoderma 2 đã lên men từ môi trường cám trấu sau 3 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng (29 – 32oC), tác giả Nguyễn Ngọc Tú (1997) cho biết số lượng số lượng bào tử tính được/ gram chất khô như sau: Trichoderma 2 còn 2,72.109 bào tử/gram so với ban đầu là 5,88.109 bào tử/gram và Trichoderma 1 còn 0,65.109 tế bào/gram so với ban đầu là 2,24.109 bào tử/gram. Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm đã được thực hiện bởi Evlacchova (1968). Môi trường dinh dưỡng được nấu sôi ở 1000C, và khi nguội cho thêm chất kháng sinh Streptomycine (0,01%) để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men. Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp này có hiệu quả cần thực hiện 5 nguyên tắc chủ yếu sau: Bào tử nấm được cấy phủ kín khắp bề mặt môi trường dịch (đã đun sôi ở 1000C/20 phút). Các bào tử nấm sau khi cấy vào môi trường chúng phát triển nhanh thành một màng mỏng khắp bề mặt môi trường, ngăn ngừa được khả năng nhiễm các vi sinh vật lạ. Lượng bào tử trên một đơn vị bề mặt môi trường được cấy với một lượng lớn đủ áp đảo được phát triển ban đầu của vi sinh vật lạ (1 – 2 tỷ bào tử/cm2). Ngay sau khi nảy mầm, bào tử của các nấm sẽ tiết ra các chất trao đổi chất, giống kháng sinh để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm lạ. Tạo môi trường pH thấp 5 – 5,5 thuận lợi hơn cho sự phát triển của nấm, ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Sử dụng dụng cụ, thiết bị và phòng nuôi cấy sạch sẽ hạn chế tối thiểu sự nhiễm của nấm nuôi. Nói chung, hai phương pháp lên men này thì phương pháp lên men xốp đạt hiệu quả cao hơn, khả năng bị nhiễm vi sinh vật lạ thấp hơn. Một số chế phẩm nấm Trichoderma đã được sản xuất và ứng dụng trên thế giới và trong nước Trên thế giới: Nền nông nghiệp hiện đại với phương thức chỉ độc canh một vài loài cây trồng trên diện tích rộng lớn, xem thuốc hóa học là một biện pháp tốt nhất để phòng trừ dịch hại trên cây trồng đã dẫn đến một loạt các hậu quả mà con người và thiên nhiên phải gánh chịu đó là: Ô nhiễm môi trường, ô nhiễm nguồn nước gây chết cho các động vật thủy sản, gia súc, gia cầm. Làm mất cân bằng sinh thái trong tự nhiên; tạo nòi mới kháng thuốc ở côn trùng làm tăng thêm mức độ tàn phá trên cây trồng nhiều hơn. Tồn dư thuốc hóa học quá mức cho phép trên sản phẩm nông nghiệp, gây hại tới sức khỏe con người. Hơn nữa, sử dụng thuốc hóa học chi phí đầu tư cao nhưng ngày càng không hiệu quả. Do đó, cần phải nhanh chóng giảm bớt lượng thuốc sử dụng hoặc chuyển sang chế phẩm vi sinh nhằm khắc phục các hậu quả trên. Từ những thực tại đó, trên thế giới hiện nay đã có nhiều quốc gia sự dụng chế phẩm vi sinh để trừ sâu bệnh hại cây trồng. Theo Dunin (1979) ở Liên Xô cũ đã sử dụng chế phẩm Trichoderma (từ nấm Trichoderma lignorum) trên cây bông vải làm giảm 15 – 20% bệnh héo do nấm Verticillium và làm tăng năng suất 3 – 9 tạ bông/ha. Sử dụng chế phẩm Trichoderma cũng làm giảm 2,5 – 3 lần bệnh thối rễ cây non ở thuốc lá và rau màu. Trong những thập kỉ 80, chế phẩm Trichoderma ở Liên Xô cũ đã sử dụng trên diện tích 3.000ha (Filippa, 1987), sử dụng 30 – 40g/m2 chế phẩm (Badai, 1986). Chế phẩm nấm Trichoderma ở Liên Xô cũ có tên thương mại là Trichodermin với 4 dòng chế phẩm: Trichodermin 1: Nấm nhân nuôi trên môi trường dinh dưỡng giàu chất đạm và chất bột. Trichodermin 2: Nấm nhân nuôi trên môi trường các phụ liệu thực vật. Trichodermin 3: Nấm nhân trên môi trường than bùn sấy khô. Trichodermin 4: Là nấm được nhân theo phương pháp cấy sâu các nguồn nấm Trichoderma lignorum. Ngoài ra, còn có một số chế phẩm khác từ nấm Trichoderma đang được các quốc gia trên thế giới sử dụng như: Pencellase, Onzuka (Nhật): từ T.viride chứa nhiều enzyme cellulase, hemicellulase. Furfural: ở Trung Quốc có sản xuất chế phẩm cellulase từ T.konigii áp dụng trong nuôi nấm men thu Furfural. Rootshield, T – 22 Planterbox, Top – shield, Turfshield (from Biowork Inc), Bio- Trek (Wilbur – Ellis Co): từ T.harzianum (Rifai Strain KRL – AG2), vi sinh vật có lợi dùng xử lý hạt, rễ và đất để phòng ngừa bệnh hại rễ, cũng có thể sử dụng trên lá để ngăn ngừa bệnh. Bioderma (From Biotech International. ltd): từ T.viride nấm đối kháng và ký sinh trên nấm bệnh cây, kích thích tăng trưởng và nảy mầm hạt. Dùng kiểm soát bệnh sương mai, phấn trắng, đốm lá, thối rễ, thối thân. Ở trong nước Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng Sông Cửu long và Đông nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani. Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng đặc tính này người ta đã trộn nấm Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng. Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt (TP. Hồ Chí Minh) phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai) đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan nghênh và ứng dụng hiệu quả (theo TS Dương Hoa Xô, 2005). Một số sản phẩm chế phẩm nấm Trichoderma trên thị trường Việt Nam: TRI-CAB – sản phẩm thử nghiệm của TRUNG TÂM SINH HỌC ỨNG DỤNG – Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh: một chế phẩm sinh học chứa thành phần chính là các vi sinh vật Trichoderma và các enzyme thủy phân như cellulase, chitinase, xylanase, hemicellulase, giúp cho cây trồng kháng bệnh. Chế phẩm vi sinh Tam Nông Trichoderma – Công ty TNHH TAM NÔNG: Trong 1 gam chế phẩm Tam Nông Trichoderma có 2 triệu bào tử Trichoderma konigii M8, M32, M65 được tuyển chọn từ các thể đột biến bằng kỹ thuật hạt nhân, bền với thuốc trị nấm bệnh hóa học khi ra đồng. BIMA – Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. Hồ Chí Minh (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn): chứa nấm đối kháng Trichoderma có khả năng tiêu diệt và khống chế được các loại nấm bệnh hại cây trồng, gây thối rễ, chết yểu, héo rũ. PHẦN 2: NỘI DUNG – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu Các chủng nấm Trichoderma sp. Trichoderma (T40, T14) lấy từ Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt. Giống nấm Trichoderma còn trong giai đoạn thử nghiệm. Các chủng nấm gây bệnh hại cây trồng Fusarium sp., Phytophthora sp. lấy từ Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.Hồ Chí Minh. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ Các dụng cụ thủy tinh thông dụng dùng cho phân tích của phòng thí nghiệm. Thiết bị Tủ sấy MEM MERT, Germary Tủ cấy ESCO AIRS TREAM, Indonesia Nồi hấp HL – 340 SPEEDS AUTOCLEVA Môi trường nuôi cấy 2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy nấm bệnh và Trichoderma sp.và khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp giữa nấm gây bệnh với chủng Trichoderma sp.: môi trường PGA (peptone glucose agar) Thành phần môi trường Khoai tây 200g Glucose 20g Agar 20g Nước cất đủ 100ml Hấp khử trùng 1210C trong 15 phút Cách tiến hành Khoai tây gọt vỏ, cắt vỏ và nấu chín. Chiết dịch khoai tây và lọc bỏ tinh bột. Cho agar vào dịch khoai tây từ từ và khuấy liên tục, sau đó cho glucose vào tiếp tục khuấy. Đổ vào ống nghiệm, đậy nút bông và khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Khoáng Crapek NaNO3 3.5g K2HPO4 1.5g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g Saccarose 30g KCl 0.5g Nước cất đủ 1000ml Môi trường lên men xốp Thành phần môi trường Cám gạo 21g Trấu 9g Khoáng Crapek 13.5ml Độ ẩm 55% Hấp khử trùng 1210C trong 15 phút Cách tiến hành Tiến hành cân cám và trấu. Trộn đều cám, trấu với môi trường khoáng Crapek. Sau đó cho vào 3 erlen, đem hấp khử trùng ở 1210C, 15 phút. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Quan sát hình thái của nấm Quan sát hình thái đại thể Dùng que cấy móc vô trùng gạt nhẹ lên bào tử đính của nấm sợi chuyển sang đĩa petri chứa môi trường PGA, cắm đầu que cấy xuống mặt thạch 1 – 3 điểm. Quan sát khuẩn lạc của nấm sợi (hình dạng, màu sắc) ở mặt trên và mặt dưới của khuẩn lạc. Quan sát hình thái vi thể (phương pháp phòng ẩm) Nguyên tắc Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với các thành phần khác của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững. Thường để quan sát hình thái cấu trúc sợi nấm và các cơ quan sinh sản của nấm ở trạng thái tự nhiên có thể làm phương pháp phòng ẩm. Cách thực hiện Lót giấy thấm ở đáy đĩa petri rồi đặt vào một miếng lame, gói giấy và đem hấp khử trùng, nấu chảy môi trường PGA (đã vô trùng), rót chảy theo nửa tấm lame và chờ đông lại, làm ẩm giấy thấm bằng nước cất vô trùng (vừa đủ ướt giấy). Cấy một ít bào tử lên một hoặc hai điểm lên phần thạch của miếng lame trong phòng ẩm, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 ngày lấy lame ra khỏi hợp petri, nhỏ lên lame (nơi có nấm sợi mọc) một giọt thuốc nhuộm xanh methylen, dùng lamelle đè nhẹ lên tơ nấm, quan sát dưới kính hiển vi (X40) cuống sinh bào tử đính và vách ngăn tế bào. Phương pháp đối kháng trực tiếp Nguyên tắc Tác động đối kháng của nấm Trichoderma với tác nhân gây bệnh nhờ cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng, nhờ cơ chế ký sinh hay tạo chất kháng sinh do chúng tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Cách tiến hành Chuẩn bị môi trường PGA: đổ vào các ống nghiệm, mỗi ống chứa 20ml môi trường. Hấp khử trùng 1210C trong 15 phút, để nguội 50 – 600C. Đổ 20ml môi trường trên vào các đĩa Petri vô trùng kích thước bằng nhau. Thí nghiệm Cấy điểm chủng Trichoderma lên thạch đĩa petri, sau đó cách khoảng 3cm cấy điểm nấm bệnh lên đĩa cấy chủng Trichoderma. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 ngày, quan sát, ghi nhận sự phát triển về kích thước (đường kính khuẩn lạc, thời gian tiếp xúc, ức chế). Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và số liệu kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 3 lần, theo công thức: KT = (a + b + c)/3 Trong đó: KT: kích thước đường kính khuẩn lạc trung bình. a, b, c: lần lượt là đường kính khuẩn lạc của các lần thí nghiệm 1, 2, 3. Tóm tắc theo sơ đồ sau: Hình 2.1: Thí nghiệm đối chứng trực tiếp. Bố trí thí nghiệm Bố trí thí nghiệm khả năng đối kháng trực tiếp của Trichoderma với nấm bệnh, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đối chứng 1 Đối chứng 2 Thí nghiệm T40 Phytophthora sp. T40 + Phytophthora sp. T40 Fusarium sp. T40 + Fusarium sp. T14 Fusarium sp. T14 + Fusarium sp. T14 Phytophthora sp. T14 + Phytophthora sp. Phương pháp lên men xốp thu nhận chế phẩm Trichoderma sp. Mục đích Số lượng bào tử/1 gam càng cao thì càng tốt. Quy trình thu nhận khá đơn giản, vật liệu dễ tìm, rẻ tiền. Tiến hành thực nghiệm trên môi trường lên men xốp Nấm Môi trường Độ ẩm (%) Nhiệt độ (0C) Thời gian Trichoderma T40 Cám trấu 55 29 – 32 8 – 10 ngày Trichoderma T14 Cám trấu 55 29 – 32 8 – 10 ngày Ống giống Nhân giống trong bình tam giác Lên men trong bình tam giác 250ml Nuôi 8 – 10 ngày, nhiệt độ 29 – 320C Sấy nhẹ ở 400C trong 12h tới hàm lượng ẩm còn khoảng 8 – 10% Xay cho chế phẩm được mịn Bột Trichoderma (bảo quản nơi thoáng mát trong bao nilông) Cách tiến hành Cấy vô trùng giống Trichoderma vào bình tam giác có sẵn môi trường cám trấu đã được hấp khử trùng và ủ trong khoảng 8 – 10 ngày ở nhiệt phòng cho đến khi nấm mọc xanh đều. Sau đó lấy sinh khối ra đem sấy ở nhiệt độ 400C tới hàm lượng ẩm còn 8 – 10% rồi cho vào bao nilông. Phương pháp đếm số lượng bào tử trên 1 gam chế phẩm Nguyên tắc Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. phương pháp này có đăc điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy. Phương pháp này có thể thực hiện bằng kỹ thuật trải đĩa hay đổ đĩa. Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Mật độ tế bào quá lớn làm cho khuẩn lạc chồng chéo lên nhau hoặc tạo thành màng sinh khối. Ngược lại, số lượng khuẩn lạc trên một đĩa quá nhỏ sẽ không có giá trị thống kê. Số lượng khuẩn lạc tối đa khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa. Cách tiến hành Cân 10g chế phẩm Trichoderma vào erlen chứa 90ml nước muôi sinh lý vô trùng lắc đều, ta được huyền phù có độ pha loãng là 10-1. Cho vào máy lắc, trong 30 phút, hút 1ml mẫu có độ pha loãng 10-1, cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý vô trùng lắc đều ta được độ pha loãng 10-2, tiếp tục pha loãng mẫu bậc 10 để có các độ pha loãng là 10-3, 10-4,.. Trải và ủ: cho 0,1ml dung dịch có độ pha loãng thích hợp vào đĩa petri chứa sẵn môi trường. Dùng que trang đã khử trùng, trải đều dung dịch mẫu lên mặt thạch, lật ngược đĩa petri, gói lại. Đặt vào tủ ấm ở 300C trong 48h. Thực hiện tương tự các mẫu còn lại. Hình 2.2 : Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân. Đọc và tính toán kết quả Ghi nhận các nồng độ pha loãng và đếm số khuẩn lạc đã mọc trên đĩa petri (sao cho từ khoảng 10 – 300 khuẩn lạc/đĩa). Nhân số khuẩn lạc với hệ số pha loãng và nhân với 10 để có mật độ bào tử/gam môi trường nuôi cấy. Trung bình cộng số liệu các mẫu có độ pha loãng khác nhau và thể hiện mật độ pha loãng ở dạng CFU/g môi trường. Theo công thức: A x 10 x 10 x n Trong đó: A: số khuẩn lạc trên đĩa 10: hệ số dung tích mẫu sử dụng 10: hệ số quy đổi về gam môi trường n: hệ số pha loãng. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN HÌNH THÁI NẤM Trichoderma sp. Quan sát hình thái dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40X, cho thấy cành bào tử của nấm không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều. Bào tử có màu xanh, đơn bào hình trứng, tròn. Bào tử đính ở đỉnh của cành. Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc Trichoderma chủng T40 (40X). KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG TRỰC TIẾP CỦA NẤM Trichoderma sp. Trichoderma kháng lại nấm bệnh hại cây trồng bằng cơ chế cạnh tranh chất dinh dưỡng, cơ chế ký sinh của nó trên nấm bệnh và cơ chế tiết ra một số chất kháng sinh ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh. Kết quả đối kháng của các chủng Trichoderma trong thí nghiệm được trình bày như sau: Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma chủng T40 với nấm Phytophthora sp. Kết quan sát ở hình 3.2 cho thấy: Sau 2 ngày nuôi cấy: nấm Phytophthora sp. phát triển khá nhanh, đường kính khuẩn lạc đã đạt đến khoảng 40mm và không có sự khác nhau giữa lô đối chứng và lô thí nghiệm. Tương tự, nấm Trichoderma chủng T40 cũng phát triển nhanh, đường kính khuẩn lạc cũng đạt khoảng 41mm ở cả mẫu đối chứng cũng như mẫu thí nghiệm. Điều này cho thấy, sau 2 ngày nuôi cấy, chưa có sự ảnh hưởng và ức chế lẫn nhau của 2 chủng nấm Phytophthora sp. và chủng nấm T40. Sau 4 ngày nuối cấy: Nấm Phytophthora sp. ở lô thí nghiệm phát triển chậm hơn so với lô đối chứng. Đường kính khuẩn lạc của lô thí nghiệm chỉ đạt 42mm so với 67mm ở lô đối chứng. Chủng nấm T40 ở lô thí nghiệm cũng có phát triển chậm hơn so với lô đối chứng (theo thứ tự là 43mm và 50mm). Điều này cho thấy rằng, trong điều kiện môi trường thí nghiệm, ở giai đoạn này, sự phát triển của cả nấm bệnh và nấm đối chứng đều tác động, ảnh hưởng qua lại lẫn nhau. Trong đó, khả năng ức chế của nấm đối kháng cao mạnh hơn hẳn so với nấm bệnh. Sau 6 ngày nuôi cấy: Đường kính khuẩn lạc của nấm Phytophthora sp. bị thu hẹp lại so với trước và kém hơn hẳn so với đối chứng (chỉ còn 28mm so với 2 ngày trước đó là 42mm và đối chứng đã mọc kín đĩa petri). Trong khi đó, nấm T40 đã phát triển kín bề mặt đĩa petri và vây quanh nấm Phytophthora sp. Điều này chứng tỏ rằng, đến ngày thứ 6 sau khi cấy, chủng T40 đã ức chế hẳn sự sinh trưởng, phát triển và tấn công tiêu diệt nấm Phytophthora sp. Sau 8 ngày nuôi cấy: nấm bệnh Phytophthora sp. bị tiêu diệt hoàn toàn, biểu hiện ở sự phủ kín toàn bộ bề mặt đĩa petri của chủng nấm T40. . Ngày khi sau cấy Đối chứng Thí nghiệm Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau 2 4 6 8 Hình 3.2: Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma chủng T40 với nấm Phytophthora sp. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma (T40) với nấm Fusarium sp. Kết quả quan sát hình 3.2 cho thấy: Sau 2 ngày nuôi cấy: nấm Fusarium sp. phát triển chậm, đường kính khuẩn lạc ở lô thí nghiệm đạt đến khoảng 17mm so với 40mm ở lô đối chứng và có sự khác biệt giữa lô đối chứng và lô thí nghiệm. Tương tự, nấm Trichoderma chủng T40 cũng phát triển nhanh, đường kính khuẩn lạc cũng đạt khoảng 40mm ở cả mẫu đối chứng cũng như mẫu thí nghiệm. Điều này cho thấy, sau 2 ngày nuôi cấy, đã có sự ảnh hưởng và ức chế lẫn nhau của 2 nấm Fusarium sp.và chủng nấm T40. Sau 4 ngày nuối cấy: nấm Fusarium sp. ở lô thí nghiệm phát triển chậm hơn so với lô đối chứng. Đường kính khuẩn lạc của lô thí nghiệm chỉ đạt 30mm so với 84mm ở lô đối chứng. Chủng nấm T40 ở lô thí nghiệm cũng có phát triển chậm hơn so với lô đối chứng (theo thứ tự là 43mm và 50mm). Điều này cho thấy rằng, trong điều kiện môi trường thí nghiệm, ở giai đoạn này, sự phát triển của cả nấm bệnh và nấm đối chứng đều tác động, ảnh hưởng qua lại lẫn nhau. Trong đó, khả năng ức chế của nấm đối kháng cao mạnh hơn hẳn so với nấm bệnh. Sau 6 ngày nuôi cấy: đường kính khuẩn lạc của nấm Fusarium sp. bị thu hẹp lại so với trước và kém hơn hẳn so với đối chứng (chỉ còn 27mm so với 41mm so với 2 ngày trước đó và đối chứng đã mọc kín đĩa petri). Trong khi đó, nấm T40 đã phát triển kín bề mặt đĩa petri và vây quanh nấm Fusarium sp. Điều này chứng tỏ rằng, dến ngày thứ 6 sau khi cấy, chủng T40 đã ức chế hẳn sự sinh trưởng, phát triển và đã bắt tấn công tiêu diệt nấm Fusarium sp. Sau 8 ngày nuôi cấy: nấm bệnh Fusarium sp. bị tiêu diệt hoàn toàn, biểu hiện ở sự phủ kín toàn bộ bề mặt đĩa petri của chủng nấm T40. Ngày khi sau cấy Đối chứng Thí nghiệm Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau 2 4 6 8 Hình 3.3: Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma chủng T40 với nấm Fusarium sp. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma chủng T14 với nấm Phytophthora sp. Kết quả quan sát ở hình 3.4 cho thấy: Sau 2 ngày nuối cấy: nấm Phytophthora sp. phát triển nhanh và không có sự khác biệt so với lô đối chứng, đường kính khuẩn lạc đạt 40mm. Trong điều kiện môi trường thí nghiệm, chủng T14 phát triển kém và kém hơn hẳn so với đối chứng, đường kính khuẩn lạc chỉ đạt 14mm so với 24mm ở mẫu đối chứng. Sau 4 ngày nuôi cấy: nấm Phytophthora sp. vẫn phát triển nhanh, đường kính khuẩn lạc đạt 70mm. Trong khi đó, chủng T14 chỉ đạt 23mm. Như vậy, cho đến 4 ngày sau khi cấy, chủng nấm T14 chưa có biểu hiện ức chế nấm Phytophthora sp. Sau 6 ngày nuôi cấy: nấm Trichoderma chủng T14 bắt đầu ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. Biểu hiển ở chổ, đường kính khuẩn lạc của nấm T14 tăng đến 26mm. Trong khi đó, đường kính của Phytophthora sp.chỉ còn 67mm (so với 70mm của 2 ngày trước đó và đối chứng đã phát triển kín đĩa). Tuy nhiên, mức độ đối kháng này không cao. Sau 8 ngày theo dõi: Tuy nấm T14 và tiếp tục ức chế nấm Phytophthora sp. nhưng biểu hiện kém nên sinh viên không theo dõi tiếp và dừng lại ở đây. Ngày Đối chứng Thí nghiệm Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau 2 4 6 8 Hình 3.4: Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma chủng T14 với nấm Phytophthora. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma (T14) nấm Fusarium sp. Kế quả ở hình 3.5 cho thấy: Sau 2 ngày nuôi cấy: nấm Fusarium sp. phát triển nhanh, ở lô đối chứng và thí nghiệm không có sự khác biệt, đường kính khuẩn lạc đạt 44mm. Nấm Trichoderma chủng T14 phát triển khá chậm, ở lô thí nghiệm đạt 14mm so với 24mm ở lô đối chứng. Sau 4 ngày nuôi cấy: nấm Fusarium sp. vẫn phát triển nhanh, đường kính khuẩn lạc đạt 75mm. Trong khi đó, chủng T14 ở lô thí nghiệm chỉ đạt 24mm so với 30mm ở lô đối chứng. Như vậy, cho đến 4 ngày sau khi cấy, chủng nấm T14 chưa có biểu hiện ức chế nấm Fusarium sp. Sau 6 ngày nuôi cấy: nấm Trichoderma chủng T14 bắt đầu ức chế sự phát triển của nấm bệnh. Biểu hiển ở chổ, đường kính khuẩn lạc của nấm T14 tăng đến 28mm. Trong khi đó, đường kính của Fusarium sp. chỉ còn 64mm (so với 75mm của 2 ngày trước đó và đối chứng đã phát triển kín đĩa). Tuy nhiên, mức độ đối kháng này không cao. Sau 8 ngày theo dõi: tuy nấm Trichoderma chủng T14 tiếp tục ức chế nấm Fusarium sp. nhưng biểu hiện kém nên sinh viên không theo dõi tiếp và dừng lại ở đây Ngày Đối chứng Thí nghiệm Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau 2 4 6 8 Hình 3.5: Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma T14 chủng nấm Fusarium. Bảng 3.1: Đường kính(mm) khuẩn lạc nấm Trichoderma và nấm gây bệnh. Ngày Phy Fu T40 T14 T14 + Phy T14 + Fu T40 + Phy T40 + Fu 2 43 40 39 24 14 ; 40 13 ; 44 41 ; 40 41 ; 17 4 67 84 50 30 23 ; 70 24 ; 75 43 ; 42 42 ; 30 6 90 90 70 40 26 ; 67 28 ; 64 59 ; 28 62 ; 27 8 90 90 90 71 32 ; 58 33 ; 60 90 ; 11 90 ; 10 Nhận xét chung: Thực nghiệm trên hai chủng nấm Trichoderma T40 và T14, sau 10 ngày theo dõi khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh. Dựa vào kết quả thực nghiệm ở bảng 3.1 cho thấy nấm Trichoderma chủng T40 tiêu điệt nấm Phytophthora sp. và Fusarium sp. tốt hơn so với nấm Trichoderma chủng T14. KẾT QUẢ LÊN MEN XỐP 3.3.1. Số lượng bào tử của các chủng thu nhận được sau 8 – 10 ngày nuôi cấy bằng phương pháp lên men xốp Khả năng thu nhận sinh khối của các chủng nấm Trichoderma T14 và T40 bằng phương pháp lên men xốp sau 8 – 10 ngày nuôi cấy kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: Sau 8 ngày nuôi cấy, số lượng bào tử của chủng T40 đã lên đến 6,2.109 bào tử/gam chế phẩm. Trong khi đó, chủng T14 đến 10 ngày nuôi cấy mới đạt đến 4,15.109 bào tử/gam phẩm. Như vậy, ngoài khả năng đối kháng với nấm bệnh Phytophthora và Fusarium, chủng T40 có khả năng nhân sinh khối tốt hơn hẳn so với chùng T14. Bảng 3.2: Số lượng bào tử (bào tử/gam)Trichoderma trên môi trường nuôi cấy. Chủng nấm Trước khi sấy Sau khi sấy (400C/12h) Tỷ lệ (%) sống sót sau khi sấy Trichoderma (T40) 6,2.109 4,8.109 77 Trichoderma (T14) 4,15.109 3,05.109 73 Hình 3.6: Chế phẩm Trichoderma thô. 3.3.2. Tỷ lệ sống sót của bào tử sau khi sấy Với thời gian có hạn, chúng tôi chỉ tìm hiểu tỷ lệ sống sót của bào tử nấm Trichoderma sau khi sấy ở điều kiện nhiệt độ 400C trong 12h. Kết quả cho thấy, với điều kiện phòng thí nghiệm của trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ, tỷ lệ sống sót của bào tử nấm Trichoderma đạt từ 70 – 80%. Theo chúng tôi, tỷ lệ này tuy không thật cao nhưng có thể chấp nhận được và có thể khuyến cáo sử dụng điều kiện nhiệt độ, thời gian này để sấy nấm Trichoderma cho những nghiên cứu sau. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN: Qua quan sát thực hiện đề tài và những số liệu thu nhận được ta có thể đi đến kết luận sau: Hai chủng nấm Trichoderma khảo sát đều có khả năng chống lại nấm bệnh bằng cách tiếp xúc trực tiếp nhưng khả năng tiêu diệt nấm bệnh của Trichoderma chùng T40 mạnh hơn so với chủng T14. Khả năng sinh bào tử của nấm Trichoderma chủng T40 trên môi trường cám gạo và trấu (3:1) cho số lượng bào tử nhiều hơn so với chủng T14. KIẾN NGHỊ: Thực nghiệm khả năng kháng nấm bệnh của chủng T40 trên nhiều đối tượng nấm bệnh khác nhau. Tiến hành thử nghiệm chế phẩm T40 trừ nấm Phytophthora và Fusarium trên các loại cây trồng. Tiến hành kết hợp giữa chế phẩm Trichoderma với các chất dinh dưỡng, phân bón cây trồng để tạo ra sản phẩm đa chức năng giúp cây trồng vừa phòng chống được bệnh vừa kích thích tăng trưởng. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của chủng nấm T40. Khảo sát hoạt tính của chủng nấm T40 trong các điều kiện bảo quản để chọn ra điều kiện tối ưu cho việc bảo quan chế phẩm. Phân lập và tuyển chọn thêm một số chủng Trichoderma trong tự nhiên để làm phong phú nguồn gen Trichoderma trong nghiên cứu quản lý bệnh hại cây trồng. Chủng T40 đối kháng mạnh với nấm Fusarium sp. và nấm Phytophthora gây bệnh cây trồng. Khả năng nhân sinh khối của chủng T40 cao hơn so với chủng T14. Sấy nấm Trichoderma ở điều kiện nhiệt độ 400C trong 12h cho tỷ lệ sống sót của bào tử đạt từ 70 – 80%. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Định Lượng (1982). Vi nấm. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. Viện sinh học nhiệt đới, tuyển tập công trình nghiên cứu của viện sinh học nhiệt đới. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, (1997). Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. NXB Nông Nghiệp Tp.HCM. Nguyễn Lân Dũng, (1981). Sử dụng vi sinh vật trong phòng trừ sâu hại cây trồng. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. PGS.TS Nguyễn Văn Uyển, (2005). Các biện pháp sinh học trong phòng chống sâu bệnh hại cây trông trong nông nghiệp. NXB Nông Nghiệp. Đỗ Tấn Dũng và ctv, (2001). Đặc tính sinh học và khả năng phòng chống một số bệnh nấm hại rễ cây trồng cạn của nấm đối kháng Trichoderma viride. Tạp chí Bảo Vệ Thực Vật 4. Võ Thị Thu Oanh, (1999). Bệnh cây chuyên khoa. NXB Nông Nghiệp. Trần Thị Thuần, (1998). Hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh hại cây trồng. Tạp chí Bảo Vệ Thực Vật 5. Trần Thị Thuần (1999). Phương pháp sản xuất và sử dụng nấm Trichoderma để phòng trừ hại cây trồng. Tạp chí Bảo Vệ Thực Vật 4.