Khóa luận Bước đầu khảo sát mật độ vi khuẩn cố định đạm và hàm lượng tinh dầu của rễ cỏ Vetiver (Vetiverria zizanioides L.)

6,0, nhiều loài Beijerinckia ngay ở pH = 3,0 vẫn phát triển đƣợc. Khi pH = 7,0 sự phát triển của Beijerinckia bị ức chế một cách rõ rệt (trong khi đó Azotobacter thƣờng không phát triển đƣợc ở pH thấp hơn 5,5 trừ một vài loài đặc biệt nhƣ Az. macrocytogenes hay Az. beijerinckia acidotolerans). Beijerinckia có thể phát triển đƣợc trong phạm vi nhiệt độ 16 - 37oC (đối với Azotobacter là 16 - 45oC). Chúng có khả năng giữ sức sống khá lâu ở 0oC hoặc các nhiệt độ thấp hơn nữa. Một số nghiên cứu cho biết thời kỳ tiềm phát (lag phase) là ngắn nhất khi nuôi cấy Beijerinckia ở nhiệt độ 30 - 35oC và ở pH = 4,5 - 5,3. Vi khuẩn thuộc giống Beijerinckia phân bố rộng rãi trong các đất vùng nhiệt đới. Ngƣời ta đã phát hiện thấy chúng ở Ấn Độ, ở Mã Lai (Malaysia), ở Indonesia, 28 ở Nhật Bản, ở Trung Quốc, ở Madagasca, ở Tanjania, ở Bắc Úc, ở Braxin, ở Bắc Phi và Nam Phi. Tại Việt Nam, một số tác giả đã phát hiện thấy sự tồn tại của Beijerinckia trong một mẫu đất của vùng Lào Cai, đáng chú ý là loài Beijerinckia này mang một số đặc tính khác với các loài Beijerinckia thông thƣờng. Nghiên cứu của J. H. Becking, 1961 cho biết trong số 155 mẫu đất thu thập ở Châu Âu chỉ có hai mẫu đƣợc phát hiện thấy có Beijerinckia, nhƣng trong số 53 mẫu đất thu thập ở Châu Phi có tới 30 mẫu có chứa Beijerinckia. Một số nghiên cứu cho biết sự tồn tại của Beijerinckia có thể đƣợc coi là một chỉ thị cho quá trình laterit hóa của đất. So với Azotobacter, Beijerinckia có nhu cầu nhỏ hơn nhiều đối với Mg (khoảng 20 lần nhỏ hơn) và đối với Mo (nồng độ Mo thích hợp nhất chỉ vào khoảng 0,004 - 0,034 mg/l). Beijerinckia có thể chịu đựng đƣợc các nồng độ cao của muối sắt (đến 2 g/l) và muối nhôm (đến 80 mg/l). Beijerinckia thƣờng phát triển trong lớp đất cầy (0 - 20 cm), nhƣng cũng có khi phát hiện thấy sự phát triển của Beijerinckia ở cả các lớp đất sâu hơn.Nhiều tác giả còn quan sát thấy lối sống biểu sinh (epiphyte) của Beijerinckia trên lá nhiều loại cây nhiệt đới. Ngoài ý nghĩa kinh tế do có khă năng cố định nitơ phân tử, Beijerinckia còn đáng chú ý cả ở chỗ chúng có thể tổng hợp ra một số chất hoạt động sinh học có tác dụng kích thích sự sinh trƣởng của cây trồng. 2.4 NƢỚC RỈ RÁC 2.4.1 Nguồn gốc  Định nghĩa Nƣớc rỉ rác từ các bãi chôn lấp có thể đƣợc định nghĩa là chất lỏng thấm qua các lớp chất thải rắn mang theo các chất hòa tan hoặc các chất lơ lửng. Trong hầu hết các bãi chôn lấp nƣớc rò rỉ bao gồm chất lỏng đi vào bãi chôn lấp từ các nguồn 29 bên ngoài, nhƣ nƣớc mƣa, nƣớc mặt, nƣớc ngầm và chất lỏng tạo thành trong quá trình phân hủy các chất thải.  Sự phát sinh Một trong những nguồn gây ô nhiễm lớn nhất đến môi trƣờng nƣớc (nƣớc ngầm và nƣớc mặt) là nƣớc rò rỉ. Nƣớc rò rỉ phát sinh khi chất lỏng tiếp xúc với chất thải rắn. Chất lỏng ở đây là nƣớc mƣa, nƣớc mặt, nƣớc ngầm, nƣớc chảy tràn và nƣớc từ quá trình phân hủy chất thải. Đây là hậu quả không thể tránh khỏi đối với các bãi chôn lấp chất thải, nhất là chất thải rắn sinh hoạt. Nƣớc thấm vào bãi chôn lấp đầu tiên sẽ bị hấp phụ bởi các chất thải rắn còn có khả năng hấp phụ tiếp, nhƣng khi chất thải đã bão hòa nƣớc, nƣớc thấm qua chất thải rò rỉ ra ngoài và lúc này mang theo các chất gây ô nhiễm trong quá trình phân hủy rác thải tại bãi chôn lấp. Nồng độ chất ô nhiễm trong nƣớc phụ thuộc vào khối lƣợng các chất thấm nƣớc trong chất thải rắn, thành phần các chất dễ hòa tan, độ dày của chất thải và tốc độ thấm, còn phải nói đến một số yếu tố ảnh hƣởng khác nhƣ diện tích bề mặt, thời gian tiếp xúc và pH. 2.4.2 Đặc điểm Các số liệu phân tích thành phần hóa học của nƣớc rò rỉ thay đổi rất lớn phụ thuộc vào tuổi của bãi chôn lấp và khí hậu tại thời điểm lấy mẫu. Cụ thể nhƣ sau: Nƣớc rò rỉ trong giai đoạn phân hủy lên men acid sẽ có giá trị pH thấp và nồng độ BOD, COD, chất dinh dƣỡng, kim loại nặng sẽ rất cao. Nƣớc rò rỉ trong giai đoạn phân hủy lên men methane, giá trị pH trong khoảng 6,5 - 7,0 và nồng độ BOD, COD, chất dinh dƣỡng, kim loại nặng thấp đi đáng kể vì hầu hết kim loại nặng hòa tan kém ở giá trị pH trung hòa. 30 Nếu bãi chôn lấp có sử dụng vôi để khử mùi, nƣớc rò rỉ sẽ có pH khá cao lên đến 8,5 - 9,0 và nồng độ các chất rắn hòa tan tăng đáng kể (15.000 - 20.000 mg/L). Nồng độ chất ô nhiễm của nƣớc rò rỉ cũng phụ thuộc rất lớn vào lƣợng nƣớc mƣa thấm vào bãi chôn lấp, lƣợng nƣớc mƣa càng lớn nồng độ chất ô nhiễm càng nhỏ. Bảng 2. 2 Thành phần nƣớc rỉ từ bãi chôn lấp Gò Cát STT Chỉ tiêu Đơn vị Nồng độ 1 pH - 7,8 - 8,6 2 COD mgO2/L 1127 - 1534 3 BOD mgO2/L 275 - 412 4 SS mg/L 244 - 4311 5 NH3 mg/L 890 - 1090 6 N tổng mg/L 1981 - 2695 7 P tổng mg/L 14,9 - 21,5 8 SO4 2- mg/L 159 9 Ca 2+ mg/L 2739 10 Fe tổng mg/L 27 12 Mg 2+ mg/L 687 13 Cu mg/L 4,0 14 Zn mg/L 93 15 Mn mg/L 32,17 16 Ni mg/L 2,211 17 Cr tổng mg/L 0,05 18 Cd mg/L 0,1 19 Pb mg/L 1,9 20 Coliform MNP/100ml 406*10 3 Nguồn: CENTEEMA, 08/2003 Qua bảng 2.2 cho thấy thành phần nƣớc rỉ rác rất đa dạng, chứa nhiều chất nguy hại có hàm lƣợng rất cao vƣợt qua ngƣỡng TCVN cho phép thải ra môi trƣờng. Gây tác động lan truyền ô nhiễm đến chất lƣợng nƣớc ngầm, nƣớc bề mặt. Tác hại trực tiếp và bao trùm lên đời sống của ngƣời dân đang sống xung quanh bãi chôn lấp này là mùi hôi, mầm mống của bệnh tật ảnh hƣởng lâu dài đến sức khỏe ngƣời dân. 31 Bên cạnh đó môi trƣờng đất tại bãi chôn lấp cũng bị ô nhiễm, do nƣớc rỉ rác ngấm vào đất làm thay đổi thành phần của đất, ảnh hƣởng đến việc tạo môi trƣờng xanh cho khu đất khi bãi chôn lấp đang vận hành và khi ngừng hoạt động. 2.4.3 Bãi chôn lấp Gò Cát  Vị Trí Bãi Chôn Lấp Bãi chôn lấp Gò Cát đƣợc xây dựng trên lô đất thuộc xã Bình Hƣng Hòa, huyện Bình Chánh, giáp ranh với huyện Hooc Môn và quận Tân Bình, có diện tích 25 ha. Phía Tây là quốc lộ 1A. Phía Bắc là vùng hồ đầm hoang, một phần diện tích đƣợc dân định cƣ cải tạo làm hồ nuôi cá. Phía Đông và Đông Bắc là kênh Nƣớc Đen với khu dân cƣ mới phát triển dọc bên kia bờ kênh. Phía Nam là đầm nƣớc khoảng 6 ha không canh tác có lục bình phủ kín toàn bộ bề mặt nƣớc.  Điều Kiện Tự Nhiên  Gió Có hai hƣớng gió chính, mùa khô gió Đông - Đông Nam (gió chƣớng) và mùa mƣa gió Tây - Tây Nam, vận tốc trung bình 3 - 4 m/s. gió thƣờng thổi mạnh từ trƣa sang chiều. Gió chƣớng thƣờng thổi mạnh vào trƣa sang chiều. Gió chƣớng thổi mạnh làm gia tăng sự xâm nhập mặn vào sâu trong lục địa trong mùa khô và tăng mực nƣớc đỉnh triều lên vài cm. Ở TP.HCM ít có bão, thƣờng chỉ bị ảnh hƣởng của áp thấp nhiệt đới hay bão ở miền Trung gây mƣa lớn ở khu vực thành phố. Các số liệu theo dõi cho thấy trong thời gian quan trắc (100 năm) vị trí này không xảy ra lũ lụt.  Độ ẩm tƣơng đối Các tháng mùa mƣa độ ẩm khá cao, độ ẩm trung bình các tháng mùa mƣa vào khoảng 79 - 83%, cao nhất là các tháng 9, 10 khoảng 83%, trong đó các tháng có độ ẩm trung bình thấp nhất là tháng 1 và tháng 3 khoảng 67%.  Lƣợng mƣa Mùa mƣa chiếm khoảng 84% tổng lƣợng mƣa cả năm. Mƣa lớn tập trung vào tháng 6, 8, 11. lƣợng mƣa tháng cao nhất lên đến 466,6 mm (tháng 6). Mƣa ở thành phố Hồ Chí Minh mang tính mƣa rào nhiệt đới: mƣa đến nhanh và kết thúc cũng 32 nhanh, thƣờng một cơn mƣa không kéo dài đến 03 giờ nhƣng cƣờng độ mƣa khá lớn và dồn dập.  Điều kiện thủy văn Rạch Nƣớc Đen là nguồn tiếp nhận nƣớc thải từ trạm xử lý nƣớc rò rỉ của bãi chôn lấp này. Đây là một con rạch nối liền với hệ thống kênh đào 19 - 5 và kênh Tham Lƣơng ở phía Bắc chảy ra sông Sài Gòn, đoạn chảy ra phƣờng 15 Tân Bình và phía Nam nối với hệ thống sông Tân Hóa - Lò Gốm chảy vào rạch Cần Giuộc và sông chợ Đệm. Ngoài ra con rạch này cũng thông với nhiều hồ đầm trong địa bàn xã Bình Hƣng Hòa. Có thể thấy rạch Nƣớc Đen nằm ở giữa hai đầu của hai nhánh kênh thoát nƣớc thải của thành phố hay nói cách khác có thể xem nhƣ đây là thƣợng nguồn của hai nhánh kênh Tham Lƣơng và kênh Tân Hóa nên dòng chảy thay đổi theo thủy triều lên xuống đồng thời ở cả hai đầu rạch, do đó có sự tích tụ chất thải ở đoạn kênh này làm nƣớc bị ô nhiễm, đen kịt và có mùi hôi thối. Bảng 2. 3 Thành phần chất thải rắn của bãi chôn lấp Gò Cát STT Thành phần Khối lƣợng (%) 1 Thực phẩm 68,9 - 75,6 2 Nylon 12,6 - 45,4 3 Nhựa 1,0 - 8,0 4 Vải 1,5 - 13,3 5 Gỗ 2,5 - 4,5 6 Giấy 0,0 - 5,4 7 Thủy tinh 0,0 - 2,0 8 Kim loại 0,0 - 2,0 9 Da 0,0 - 1,0 10 Sành sứ 0,0 11 Carton 0,0 - 2,5 12 Lon đồ hộp 0,0 13 Cao su mềm 0,0 - 1,8 14 Mốp xốp 0,0 - 1,0 15 Bã sơn - 16 Mica - Nguồn: CENTEEMA, 08/2003 Thành phần chất thải rắn ảnh hƣởng đến thành phần và tính chất của nƣớc rỉ rác, vì bãi chôn lấp có thể đƣợc xem là nơi xảy ra nhiều phản ứng sinh hoá và hoá học, nên trong thời gian hoạt động, thành phần nƣớc rò rỉ có xu hƣớng tăng dần nồng độ các chất khó phân huỷ. Bên cạnh đó nƣớc ta là nƣớc nhiệt đới gió mùa với 33 lƣợng mƣa trung bình hàng năm khá lớn nên lƣợng nƣớc mƣa cũng ảnh hƣởng nhiều đến thành phần nƣớc rò rỉ. (Nguồn trích dẫn tài liệu: Báo cáo xử lý nƣớc rỉ rác của Sở KHCN, 2004). Bảng 2. 4 Các thông tin về nƣớc rỉ rác trên bãi chôn lấp rác Gò Cát tính đến ngày 19/06/2004 Lƣợng nƣớc rỉ rác (m 3 ) Lƣợng nƣớc đã xử lý (m 3) Lƣợng nƣớc còn tồn đọng (m3) 378.000 124.312 253.688 Hình 2. 3 Suối hình thành từ nƣớc rỉ rác 2.5 TINH DẦU TỪ CỎ VETIVER [2] 2.5.1 Bản chất của tinh dầu Tinh dầu là những hỗn hợp khác nhau của những chất bốc hơi nguồn thực vật (rất ít khi nguồn động vật), các chất này thƣờng có mùi thơm và thành phần hóa học, cấu tạo, tính chất, điểm chảy, điểm sôi, độ tan trong nƣớc hay trong các dung môi rất khác nhau, phần lớn không tan, chính xác là ít hay rất ít tan trong nƣớc. Các hợp phần của TD hòa tan lẫn nhau. Nếu một lƣợng TD nào đó là một khối đồng nhất (một pha) bắt đầu sôi ở một nhiệt độ phụ thuộc thành phần và tỷ lệ các hợp phần. 34 2.5.2 Các hợp phần của tinh dầu Phần lớn các hợp phần của TD có mùi thơm, một số có tính chất sinh lý đặc biệt. Giá trị của các hợp phần về từng mặt rất khác nhau, ví dụ có hợp phần là chất quyết định hƣơng vị chủ yếu của tinh dầu, có hợp phần không đƣa lại hƣơng vị chủ yếu nhƣng lại rất cần thiết để cố định (giữ) mùi thơm hay cần thiết cho sự hòa hợp mùi, làm tinh dầu có mùi rất tinh tế, nhiều khi các nƣớc hoa pha chế bằng cách trộn các hợp chất thơm thiên nhiên tổng hợp không sao đạt đƣợc; có hợp phần có rất ít mùi hay không có mùi, thậm chí có hợp phần lại có mùi làm hại hƣơng vị chung cần loại đi. Về mặt hóa học các hợp phần chủ yếu thuộc các loại hợp chất sau: các hydrocarbon (loại hợp phần ít giá trị nhất, nhiều khi ngƣời ta tìm cách loại ra), các rƣợu este (loại hợp chất rất phổ biến của các TD và là nguồn mùi thơm quan trọng), các phenol và ete của phenol (hai loại hợp phần quan trọng của một số TD, nguồn thơm quan trọng của chúng và là những hợp chất đƣợc dùng trong một số tổng hợp các mỹ phẩm), các aldehyt và các xeton (hai loại hợp phần cũng có nhiều trong TD và có vai trò quan trọng bậc nhất trong mùi thơm), ngoài ra còn có loại hợp chất khác nhƣ các acid tự do, các hợp chất nitơ…Trong mỗi TD có rất nhiều hợp phần khác nhau, nhƣng nhiều hợp phần có hàm lƣợng rất nhỏ. Mỗi loại TD có từ vài đến 10 - 20 hợp phần đáng kể về mặt hàm lƣợng hay về mặt giá trị sử dụng. Trong các mẫu khác nhau của cùng một loại TD (cùng tên) nhƣng có nguồn gốc khác nhau, thành phần và hàm lƣợng các hợp phần cũng không nhất thiết giống nhau. 2.5.3 Tinh dầu trong vật liệu thực vật Tinh dầu cũng nhƣ các chất nguồn thực vật khác đƣợc tạo thành trong quá trình sinh trƣởng của cây và tích tụ lại trong một hay một số bộ phận của cây (nhƣ hoa, lá, vỏ, rễ, thân…), phân bố không đồng đều. TD rất ít khi tự do ở bên ngoài (vì nếu có nó sẽ nhanh chóng bay hơi hết, không tích tụ lại đƣợc) mà thƣờng nằm ở các khoảng trống bên trong tế bào hay ở các túi, các hạch tinh dầu, ngăn cách với bên ngoài bằng một màng (còn gọi là tế bào có TD hay túi TD). Những túi TD có thể ở ngoài mặt hay nằm bên trong mô thực vật. Nếu túi nằm ngoài mặt mô mà màng 35 mỏng manh (nhƣ các lóng TD trên lá hay cánh hoa trong một số trƣờng hợp) thì màng này rất dễ vỡ ra và ngƣời ta dễ ngửi thấy mùi TD. Nhƣng thƣờng thì cần một tác động để làm vỡ túi nếu không TD bị giữ lại trong túi không khuếch tán ra đƣợc. Trong túi, TD lẫn với nƣớc, túi lại nằm trong mô thực vật có nƣớc, điều này ảnh hƣởng đến việc chƣng cất TD. 2.5.4 Các phương pháp lấy tinh dầu Muốn dùng TD, ngƣời ta tách nó ra khỏi vật liệu thực vật có chứa các túi TD bằng các biện pháp khác nhau thích hợp cho từng loại TD về mặt kỹ thuật và về mặt kinh tế. 2.5.4.1 Phương pháp ép vật liệu thực vật Trƣờng hợp chỉ cần ép vật liệu thực vật cũng đủ phá vỡ các màng cho TD chảy ra, mà hàm lƣợng TD trong vật liệu tƣơng đối lớn và TD có giá trị cao không cần thu hồi thì ngƣời ta dùng phƣơng pháp ép vì nó rẻ tiền, tuy nhiên ép thì không lấy kiệt TD và TD kéo theo cả những chất không bốc hơi nhƣ dầu béo, nhựa, nên sau đó phải làm sạch TD thu đƣợc. Phƣơng pháp này dùng để lấy TD từ vật liệu ở vỏ (nhƣ vỏ chanh). 2.5.4.2 Dùng một lỏng hay rắn để trích ly tinh dầu Trong một số trƣờng hợp, do điều kiện đặc biệt, ngƣời ta dùng một lỏng hay rắn để trích ly TD rồi sau đó tách TD ra khỏi lỏng hay rắn đó. Phƣơng pháp này có một số ƣu điểm đặc biệt, có khi bắt buộc phải dùng nó để lấy TD nhƣng phức tạp và đắt tiền nên ít dùng. Phƣơng pháp này chủ yếu dùng cho TD từ một số hoa (nhƣ hoa nhài, hoa hồng).  Phƣơng pháp trích ly bằng dung môi bốc hơi (ete, ete dầu hỏa, benzen, rƣợu) Nguyên tắc là cho vật liệu thực vật vào thiết bị chiết xuất ở nhiệt độ 60 - 80 oC với dung môi đã tinh chế (để không để mùi lại cho TD). Dung môi hòa tan TD và cả một ít sáp, chất màu, chất Albumin. Ngƣời ta cho dung dịch bay hơi ở nhiệt độ thấp thì thu đƣợc TD lẫn sáp, Albumin, chất màu…sau đó phải làm sạch. 36 Phƣơng pháp này đắt vì quá trình về thiết bị phức tạp, cần tay nghề cao của công nhân, giá dung môi lại đắt, nên chỉ dùng cho các vật liệu đắt tiền, cất bằng hơi nƣớc không đƣợc hay không tốt (nhƣ hoa Acacia, Mimosa, Violette, quả Vanille, rễ Iris, nhựa Benzoin…).  Phƣơng pháp trích ly bằng dung môi không bốc hơi Ngƣời ta ngâm vật liệu trong mỡ nóng chảy ở 80oC, để nguội 1 giờ, lại đun nóng chảy để tách bã vật liệu ra. Dung môi là mỡ, dầu olive, dầu pharaphine. Phƣơng pháp này trƣớc kia dùng nhiều cho hoa Acacia và một số hoa khác, nay ít đƣợc dùng hơn.  Phƣơng pháp trích ly bằng mỡ lạnh (ƣớp hoa) Có một số hoa (nhài, Tuberose) sau khi đã hái còn tiếp tục tạo ra TD một thời gian nữa nhƣng TD các hoa đó rất dễ bay hơi nên không thể chờ cho quá trình tạo TD hoàn thành mới lấy. Còn nếu cất ngay bằng hơi nƣớc hay nếu trích ly ngay bằng các phƣơng pháp khác thì cánh hoa bị chết, không tiếp tục tạo ra TD nữa. Để trích ly ngƣời ta dùng chất nào hấp thu ngay TD sẵn có và hấp phụ dần TD đƣợc tạo ra. Chất ấy là mỡ động vật (có thành phần phù hợp theo kinh nghiệm). Mỡ thực vật không dùng đƣợc vì nó gồm các hợp chất không no dễ bị hỏng. Mỡ khoáng vật hấp phụ kém, lại để mùi trong TD. Ngƣời ta đặt những cánh hoa dƣới những lớp mỡ và để một thời gian 24 giờ cho hoa tiếp tục tạo TD, và mỡ hấp phụ hết TD đó. Sau 24 giờ ngƣời ta thay các cánh hoa mới và phải thu hơi mỡ có hấp phụ TD dính vào các cánh hoa thải ra, cứ thế nhiều ngày (hơn 1 - 2 tháng) để mỡ tích tụ đƣợc nhiều TD. Mỡ lấy ra có thể dùng ngay trong công nghệ mỹ phẩm hoặc có thể dùng rƣợu để hòa tan TD và tiếp tục xử lý thêm. Phƣơng pháp này tốt, nó giữ đƣợc nguyên mùi của TD nhƣng phức tạp và đắt tiền, nên chỉ dùng cho các hoa cho TD có giá trị cao (nhƣ hoa hồng, các hoa tiếp tục tạo TD sau khi hái). 2.5.4.3 Phương pháp cất bằng hơi nước Phƣơng pháp phổ biến nhất và cũng dùng cho nhiều loại TD nhất, là phƣơng pháp cất bằng hơi nƣớc. Hơi nƣớc đƣợc đƣa qua khối vật liệu thực vật, tiếp xúc với TD làm TD bay hơi, hơi ấy đƣợc kéo theo lẫn với hơi nƣớc (ngƣời ta nói là hơi 37 nƣớc đƣợc bảo hòa hơi TD). Hỗn hợp hơi nƣớc và TD kéo theo nhƣ thế đƣợc đƣa sang bộ phận làm lạnh và ngƣng, ở đó nó ngƣng lại. Khối ngƣng đƣợc lắng, tách thành những lớp nƣớc và TD riêng không hòa tan vào nhau, vì hơi nƣớc kéo hơi TD đi nên ngƣời ta còn gọi là phƣơng pháp cắt kéo TD bằng hơi nƣớc. 2.5.5 Tinh dầu cỏ Vetiver [14,9,10] Tinh dầu từ cỏ Vetiver có mùi hƣơng ngọt ngào và dễ chịu, đã đƣợc sử dụng trong rất nhiều các sản phẩm của ngành công nghiệp hƣơng liệu. Hàm lƣợng TD ở bộ rễ nằm trong khoảng 2 - 2,5% tính theo trọng lƣợng khô của rễ và dùng để sản xuất ra loại nƣớc hoa Pure Vetiver với giá tới 880.000 đồng/125ml (Nguyễn Lân Dũng, 2005). Ngƣời ta thƣờng chƣng cất TD cỏ Vetiver từ bộ rễ hoặc cũng có thể chiết xuất TD từ lá của cỏ.  Chƣng cất từ lá: Lá đƣợc sử dụng phải còn tƣơi, sau đó phơi khô hoặc cắt nhỏ ra, cũng có thể đƣợc lên men trƣớc khi đƣa vào quy trình ly trích. Vật liệu đƣợc chuẩn bị xong sẽ cho vào thùng chứa 2/3 lƣợng nƣớc nóng với nắp đậy kín, đun ở nhiệt độ cao, trên 100oC trong một thời gian tƣơng đối dài. Nhiệt độ trên sẽ làm cho các hợp chất phức tạp trở nên không bền và sẽ bốc hơi cùng với các thành phần bay hơi khác. Thùng chứa vật liệu đƣợc nối với một thiết bị làm lạnh sẽ ngƣng tụ các thành phần bay hơi từ thùng chứa. Các thành phần bay hơi sau khi ngƣng tụ đƣợc chuyển vào một bể trong (có thể làm bằng kính), tại đây nƣớc chƣng cất và TD đƣợc thu nhận. Tinh dầu sẽ nổi lên trên và ta có thể thu nhận đƣợc bằng tay, số lƣợng TD đƣợc thu nhận nằm trong khoảng 2 - 3% lƣợng nƣớc chƣng cất. 38  Chƣng cất từ rễ: bộ rễ chứa hàm lƣợng TD lớn với nồng độ cao của các chất nhƣ bicylic và tricylic sesquiterpenes, hydrocarbon, alcohol và carboxylic acids. Thu lấy rễ, rửa sạch và phơi khô để giảm hàm lƣợng nƣớc. Cho vào thùng có chứa 2/3 lƣợng nƣớc tính theo trọng lƣợng. Chƣng cất giống nhƣ phƣơng pháp chƣng cất từ lá ở trên. Bảng 2. 5 Thành phần tinh dầu từ rễ cỏ Vetiver Thành phần Phần trăm (%) terpinen-4-ol 3,75 5-epiprezizane 0,71 khusimene 0,66 -muurolene 1,14 khusimone 1,49 calacorene 0,94 -humulene 2,37 -longipinene 4,20 -selinene 1,43 -selinene 4,63 -cadinene 4,72 valencene 2,30 calarene,-gurjunene 9,84 -amorphene 2,07 epizizanal 3,33 3-epizizanol 2,97 khusimol 12,71 Iso-khusimol 0,57 Valerenol 3,93 -vetivone 1,62 -vetivone 2,02 (Giống cỏ Sri Lanka) 2.5.6 Tác dụng của tinh dầu từ cỏ Vetiver [17]  Hƣơng liệu: TD đƣợc sử dụng để sản xuất xà phòng, nƣớc thơm, chất khử mùi, nƣớc hoa, mỹ phẩm…  Kiểm soát côn trùng: sử dụng TD có thể bảo vệ quần áo khỏi sâu, bƣớm, bảo vệ đầu trƣớc chấy và giƣờng nệm khỏi rệp, xua đuổi ruồi và gián… 39  Tác dụng dƣợc lý: có tác dụng hoặc đƣợc sử dụng làm thành phần trong một số thuốc điều trị: thuốc phá thai, trị mụn trứng cá, trị bệnh thiếu máu, chứng viêm khớp, bệnh hen, bệnh tim, tiêu chảy, điều kinh, mất ngủ, động kinh, bệnh thấp khớp, viêm màng phổi, bong gân…Ngoài ra, còn một số tác dụng rất đặc biệt nhƣ kích thích hƣng phấn, làm thuốc bổ cho cơ thể, trị cúm, giúp tiêu hóa, giảm đau, tẩy trùng, pha trà thƣ giãn tinh thần,… 2.5.7 Nhu cầu về tinh dầu hương liệu Theo số liệu thống kê, năm 2003 Việt Nam xuất khẩu đƣợc 852.000 USD tinh dầu - hƣơng liệu và 2.875.000 USD mỹ phẩm chế biến tổng hợp từ tinh dầu - hƣơng liệu các loại nhƣng đã nhập khẩu trở lại với giá trị tƣơng ứng là 1.750.000 và 152.386.000 USD. Nhu cầu về tinh dầu và hƣơng liệu - mỹ phẩm trên thế giới tăng nhanh do nhu cầu ngƣời dân ngày càng có xu hƣớng quay trở về dùng những hợp chất tự nhiên trong hƣơng liệu - mỹ phẩm, thực phẩm. Trung Quốc và Ấn Độ là 2 quốc gia có sản lƣợng và xuất khẩu tinh dầu - hƣơng liệu lớn nhất thế giới nhƣng hiện nay cũng phải nhập thêm tinh dầu vì đã xây dựng những nhà máy sản xuất đơn hƣơng và mỹ phẩm lớn để đáp ứng yêu cầu sử dụng trong nƣớc và xuất khẩu. Hƣơng liệu sử dụng cho mỹ phẩm và thực phẩm hàm chứa trong tinh dầu các loại nhƣ: bạc hà, hƣơng nhu, bạch đàn, húng quế, hoắc hƣơng, quế, hồi, sả các loại... Ngoài ra, còn có những loại hiếm hoi nhƣ xá xí, hƣơng lau, tràm trà, trầm hƣơng. Đây là nguồn nguyên liệu cơ bản để tổng hợp ra nhiều hợp chất tự nhiên quan trọng cho công nghiệp hƣơng liệu - mỹ phẩm. Các hãng dƣợc phẩm trên thế giới ngày càng có nhu cầu nhiều loại tinh dầu chứa các chất chƣa đƣợc tổng hợp nhân tạo nhƣ citronellal, geraniol, citral... Các nghiên cứu cho thấy, những nguyên liệu này đều đang có trong các loại cây cỏ thực vật phong phú của Việt Nam. Cả nƣớc có đến 300 loài cây tinh dầu đã đƣợc thu thập, trong đó có đến 50 loài cây đã đƣợc trồng mang tính sản xuất hàng hóa. (Nguồn: VnExpress, 12/2004). 40 2.6 CÁC NGHIÊN CỨU KHOA HỌC LIÊN QUAN 2.6.1 Các nghiên cứu trong nước [3,4,5,12] Hiện tại ở Việt Nam chƣa có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng ứng dụng của cỏ Vetiver trong xử lý ô nhiễm nƣớc rỉ rác. Các nghiên cứu về nƣớc rỉ rác chủ yếu tập trung vào các biện pháp xử lý theo hệ thống máy móc, thiết bị để giảm thiểu sự ô nhiễm do nƣớc rỉ rác từ các bãi chôn lấp gây ra. Cỏ Vetiver đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trên 40 tỉnh thành của cả nƣớc, mang lại nhiều lợi ích trong các lĩnh vực: bảo vệ đất chống xói mòn, hấp thụ các kim loại độc trong đất, xử lý các nguồn nƣớc gây ô nhiễm,…Công nghệ cỏ Vetiver vừa mang lại hiệu quả cao, vừa không tốn kém thực sự là một thuận lợi trong tình hình nƣớc ta không thể đầu tƣ nhiều vào các hạng mục công trình hiện đại để giải quyết vấn nạn ô nhiễm. Với các vùng nông thôn thì khả năng ứng dụng là rất lớn bởi những ích lợi thiết thực mà nó mang lại. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về công dụng của cỏ Vetiver mà tôi xin dẫn ra đây một vài ví dụ (xử lý nƣớc ô nhiễm) nhằm làm rõ thêm cái nhìn về một loại cỏ đa năng: Xử lý ô nhiễm từ nƣớc thải trong chăn nuôi Nƣớc từ kênh Nhiêu Lộc - Thị Nghè Nƣớc từ nhà máy chế biến mủ cao su Nƣớc thải sinh hoạt từ cƣ xá Về vi khuẩn cố định đạm, chủ yếu là mối quan tâm đến vi khuẩn cộng sinh với các loài thực vật thuộc bộ đậu, còn nhƣ vi khuẩn Azotobacter thì chỉ khai thác làm chế phẩm vi sinh bổ sung cho đất (Azotobacterin). Cho đến nay các nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm sồng tự do Beijerinckia vẫn còn rất hạn chế, tuy nhiên đã có công trình nghiên cứu về vi khuẩn này trên cây mía hứa hẹn một sự quan tâm mới đến tiềm năng của các vi khuẩn này (Lê Văn Tri và Vũ Thị Minh Đức, 2005). 2.6.2 Các nghiên cứu trên thế giới [11,13,16] Cỏ Vetiver đã đƣợc ứng dụng rất sớm, từ nhiều thế kỷ trƣớc ở Ấn Độ. Cho đến nay đã phát triển mạnh mẽ, có mặt ở nhiều nƣớc trên thế giới. Sự ra đời của 41 Mạng Lƣới Vetiver Quốc Tế (The Vetiver Network) đã cho thấy mối quan tâm của nhiều quốc gia đến lợi ích của công nghệ xanh này. Ngƣời ta đã phân lập đƣợc khoảng 17 loài liên quan đến vi khuẩn cố định đạm từ rễ của cỏ Vetiver (Vetiverria zizanioides) ở hai tỉnh Chiangmai và Chiangrai của Thailand. Tất cả những loài này đều đƣợc phân loại dựa trên những đặc điểm hóa sinh, hình thái học và sinh lý học. Một vài loài có những đặc điểm tƣơng tự nhƣ Azotobacter spp., Beijerinckia spp. and Azospirillum spp. Nhiều thí nghiệm đã phát hiện ra rằng khi nhiễm vi khuẩn cố định đạm sẽ làm tăng cƣờng sự sinh trƣởng và phát triển của cỏ Vetiver so với nhóm đối chứng sử dụng chất điều hòa sinh trƣởng (IAA, gibberellic acid hoặc IBA), và nhóm không nhiễm vi khuẩn. Cỏ Vetiver khi nhiễm vi khuẩn có khuynh hƣớng kích thích sự đẻ nhánh của sợi rễ và làm tăng trọng lƣợng khô. Việc sử dụng thực vật để giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng, trong đó bao gồm sự ô nhiễm từ nƣớc rỉ rác đã đƣợc nghiên cứu ở nhiều nƣớc trên thế giới (Đức, Thái Lan, Thụy Sỹ, Bồ Đào Nha, Đan Mạch, Trung Quốc,…). Nghiên cứu về bãi chôn lấp rác tại thành phố Guangzhou-Trung Quốc đã sử dụng cỏ Vetiver để xử lý nƣớc rác tại hai đầu của hệ thống xử lý nƣớc rỉ rác ngay tại bãi chôn lấp này đem lại hiệu quả cao, loại bỏ đƣợc nhiều chất độc hại cho môi trƣờng. 42 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THÍ NGHIỆM Mô hình thí nghiệm đƣợc tiến hành từ 04/2007 đến 07/2007 tại khu vƣờn thực nghiệm thuộc Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao KHCN, ĐH Nông Lâm Tp.HCM. Chọn và dƣỡng cỏ trong dung dịch dinh dƣỡng từ ngày 25/04/2007. Bố trí thí nghiệm, trồng thủy canh cỏ trong nƣớc rỉ rác lấy từ bãi chôn lấp Gò Cát, Tp.HCM từ 03/06/2007 và theo dõi thí nghiệm đến 14/07/2007. Khảo sát hàm lƣợng tinh dầu theo quy trình công nghệ của Công ty TNHH Công nghệ hóa học, Tân Sơn Nhì, Tân Phú, Tp.Hồ Chí Minh từ 25/07/2007 đến 17/08/2007. 3.2 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.2.1 Thí nghiệm 1 Gồm có 3 nghiệm thức, đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các nghiệm thức này đƣợc phân biệt bởi nồng độ của nƣớc rỉ rác sử dụng để thực hiện thí nghiệm trồng thủy canh cỏ (mỗi nghiệm thức này có số tép cỏ nhƣ nhau là 4 tép, chiều cao thân 80 - 130 cm, độ dài rễ 35 - 50 cm, đƣợc cố định trên các giá đỡ là tấm xốp dày 5 cm, đƣờng kính của tấm xốp là 26 cm). Bố trí cụ thể nhƣ sau:  Nghiệm thức 1: Gồm 4 tép cỏ to, khỏe đƣợc cố định trên một giá đỡ là những tấm xốp (kích thƣớc nhƣ mô tả ở trên) trồng thủy canh vào xô nhựa 25 lít có chứa 20 lít nƣớc rỉ rác đã pha loãng 80% (2 lít nƣớc thải/10 lít ). 43  Nghiệm thức 2 : Tƣơng tự nhƣ nghiệm thức 1 nhƣng với nƣớc rỉ rác đƣợc pha loãng 40% (4 lít nƣớc thải/10 lít).  Nghiệm thức 3 : Tƣơng tự nhƣ nghiệm thức 1 nhƣng với nƣớc rỉ rác đƣợc pha loãng 60% (6 lít nƣớc thải/10 lít). 3.2.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát mật độ vi khuẩn cố định đạm từ các nốt sần trên bề mặt rễ cỏ Vetiver của thí nghiệm 1 và rễ trong hai mô hình trồng cỏ:  Mô hình trồng cỏ 1: Gồm 6 tép cỏ to, sau giai đoạn dƣỡng cỏ đƣợc trồng ngoài đất thành một hàng, mỗi tép cách nhau 50 cm. Các tép cỏ này trƣớc khi đƣợc đem đi trồng có các chỉ số về độ dài thân và rễ tƣơng tự nhƣ các tép cỏ trong các nghiệm thức 1, 2, 3.  Mô hình trồng cỏ 2: Gồm 20 bụi cỏ Vetiver trên 2 năm tuổi đƣợc lựa chọn một cách ngẫu nhiên ở ngoài đồng, tiến hành đào lấy bộ rễ để khảo sát khả năng hình thành nốt sần trên rễ. 3.2.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát hàm lƣợng tinh dầu bằng cách thu rễ cỏ Vetiver trên 2 năm tuổi để chiết xuất tinh dầu. 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Thí nghiệm 1 Phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong đề tài này là phƣơng pháp trồng thủy canh cỏ Vetiver trong dung dịch cố định để theo dõi các chỉ tiêu đánh giá về khả năng tạo nốt sần trên rễ cỏ và sự sinh trƣởng của cỏ trong nƣớc rỉ rác. 3.3.1.1 Giai đoạn tiền thí nghiệm Cỏ Vetiver đang mọc ở ngoài đồng (trên 1 năm tuổi) đƣợc chọn làm thí nghiệm. Tách bụi to thành những tép nhỏ, chú ý nên chọn nhũng tép to sau đó cắt 44 rễ, thao tác cắt rễ phải đảm bảo yêu cầu nhanh để đảm bảo độ ẩm cho phần rễ còn lại, rễ đƣợc cắt sao cho phần đƣợc cắt cách gốc rễ khoảng 1 cm. Sau khi chọn đƣợc những tép cỏ đảm bảo yêu cầu thì tiến hành cố định cỏ trên các giá đỡ là các tấm xốp có gắn lƣới sắt nhỏ và trồng vào trong các xô nhựa có chứa dung dịch dinh dƣỡng Knop. Trong giai đoạn dƣỡng cỏ này dung dịch dinh dƣỡng Knop cần đƣợc bổ sung liên tục sao cho mực nƣớc luôn cao ngang cổ rễ và tránh xảy ra hiện tƣợng phát sinh rong rêu vì tình trạng dƣ thừa dinh dƣỡng. Bảng 3. 1 Thành phần dung dịch Knop STT Công thức hóa học Khối lƣợng 1 KNO3 250 mg/l 2 Ca(NO3)2. 4H2O 1000 mg/l 3 MgSO4. 7H2O 250 mg/l 4 KH2PO4 250 mg/l 3.3.1.2 Giai đoạn thí nghiệm Sau thời gian dƣỡng cỏ trong dung dịch dinh dƣỡng, cỏ Vetiver đƣợc đƣa vào trồng thủy canh trong nƣớc rỉ rác lấy từ bãi chôn lấp rác Gò Cát. Các chỉ tiêu theo dõi: Khả năng sing trƣởng của cỏ Vetiver thông qua các số liệu: chiều cao thân, độ dài rễ, số chồi mới trong quá trình thí nghiệm. Sự xuất hiện của nốt sần trên hệ rễ của cỏ Vetiver.  Quá trình thí nghiệm tiến hành qua các bƣớc sau: Xô nhựa 25 lít (9 xô) đƣợc chôn xuống đất sao cho phần miệng xô cách mặt đất một khoảng 20 cm và đƣợc che chắn bởi khung nhà có mái che bằng nhựa polyethylen trong. Lấy 80 lít nƣớc rỉ rác từ bãi chôn lấp rác Gò Cát, pha loãng theo các nồng độ rồi chứa trong các xô theo nghiệm thức. Cỏ Vetiver sau giai đoạn dƣỡng và đƣợc cố định trên các giá thể thì tiến hành trồng thủy canh trong các xô thí nghiệm. Trong suốt quá trình thí nghiệm không bổ sung thêm nƣớc thải. 45 3.3.2 Thí nghiệm 2 Thực hiện nuôi cấy vi khuẩn từ các nốt sần trên bề mặt rễ cỏ Vetiver trong hai mô hình trồng cỏ và mẫu rễ của thí nghiệm 1. 3.3.2.1 Mẫu  Yêu cầu của mẫu: Mẫu đƣợc sử dụng là rễ lấy từ cỏ Vetiver. Mẫu phải đảm bảo có chứa các nốt sần và mẫu phải còn nguyên vẹn, không bị dập nát. Nốt sần là những khối tròn nhỏ hiện diện trên bề mặt của rễ.  Phƣơng pháp lấy mẫu: Dụng cụ dùng để lấy rễ bao gồm: cuốc, kéo, bao nylon sạch để đựng mẫu. Tiến hành lấy mẫu vào buổi sáng để đảm bảo độ ẩm cho mẫu. Rửa sạch toàn bộ rễ trƣớc khi cắt nhỏ mẫu rễ. Để có thể lấy đƣợc rễ trồng ngoài đất, trƣớc hết ta chọn một bụi cỏ và dùng liềm hoặc kéo cắt hết thân cỏ sao cho chiều cao của bụi cỏ chỉ còn khoảng 20 cm. Sau đó, dùng cuốc đào xung quanh bụi cỏ thành một đƣờng tròn, sâu khoảng 30 - 50 cm và chỉ thực hiện việc nhổ bụi cỏ khi không còn nhiều rễ bám chặt vào đất. 3.3.2.2 Điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ: thao tác ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ nuôi cấy là 30oC. Bảo đảm các dụng cụ và thao tác không làm lây nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài vào môi trƣờng nuôi cấy. Chuẩn bị sẵn dung dịch pha loãng trƣớc khi thí nghiệm: dung dịch Saline Peptone Water (SPW) gồm: 8.5 gam NaCl + 1.0 gam peptone + 1000 ml nƣớc cất. Pha 1 lít và hấp thanh trùng trƣớc khi sử dụng, sau đó phân phối 9 ml/ống nghiệm vô trùng. Thời gian nuôi cấy: 5 - 10 ngày. 46 3.3.2.3 Môi trường nuôi cấy [20]  Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Azotobacter Bảng 3. 2 Môi trƣờng Ashby’s Glucose Agar Thành phần Số lƣợng (g/l) Agar 15.0 CaCO3 5.0 K2HPO4 0.2 Glucose 20.0 MgSO4 0.2 K2SO4 0.1 NaCl 0.2  Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Beijerinckia Mặc dù ít đƣợc nghiên cứu nhƣng cũng đã có một số tác giả sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng thạch cho kết quả tốt. Bảng 3. 3 Môi trƣờng Beijerinckia medium Thành phần Số lƣợng (g/l) Agar 15.0 K2HPO4 0.2 FeCl3 0.1 MgSO4 0.5 K3PO4 0.8 Na2Mo4. 2H2O 0.005 Sucrose 20.0 3.3.2.4 Quy trình nuôi cấy Quy trình nuôi cấy vi khuẩn đƣợc xây dựng dựa trên phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt và định lƣợng tổng số vi sinh vật hiếu khí (Nguồn: Giáo trình Kiểm phẩm, Bộ môn CNSH, trƣờng ĐH Nông Lâm, Tp.HCM). 47 Hình 3. 1 Quy trình nuôi cấy vi khuẩn  Tổng số vi khuẩn (CFU/g): A = N/ (n1 x V1 x f1 +…+ ni x Vi x fi) Với:  A: số lƣợng vi khuẩn trong 1g mẫu.  N: tất cả các khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa đã chọn.  ni: số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i Chọn mẫu rễ có chứa nốt sần, rửa sạch và cắt nhỏ Cân lấy 5 g mẫu rễ chứa nốt sần Đồng nhất mẫu với dung dịch SPW (5 g mẫu + 95 g SPW) Pha loãng tạo dung dịch 10-2, 10-3 Cấy 0,1 ml dung dịch mẫu đã pha loãng vào đĩa petri chứa môi trƣờng nuôi cấy. Cấy các độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa Dùng que cấy trải mẫu đều khắp môi trƣờng Ủ đĩa petri trong tủ ấm ở 300C trong 5 - 10 ngày Đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa. Chọn các đĩa có khoảng 25 - 250 khuẩn lạc/đĩa để dễ tính kết quả 48  V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong 1 đĩa.  fi: độ pha loãng tƣơng ứng. Đối với việc phân lập vi khuẩn trong mẫu nƣớc thải ta cũng thực hiện tƣơng tự nhƣ quy trình nuôi cấy trên (Hình 3.1). Tiến hành lấy mẫu nƣớc cần xác định cho vào ống nghiệm, sau đó pha loãng và nuôi cấy. 3.3.3 Thí nghiệm 3 Để khảo sát hàm lƣợng tinh dầu trong rễ cỏ Veiver, chúng tôi đã áp dụng theo quy trình công nghệ mới nhất tại Việt Nam, đang đƣợc triển khai tại Công ty TNHH Công nghệ hóa học, Tân Sơn Nhì, Tân Phú, Tp.HCM. Quy trình này không giống các biện pháp kỹ thuật truyền thống dùng để chiết xuất tinh dầu hiện vẫn còn đang sử dụng. Cơ chế chung của quy trình này là sử dụng khí CO2 tạo áp suất lớn bằng cách nén khí để phá vỡ tế bào, giải phóng tinh dầu ra ngoài. Mức độ ổn định và hiệu suất cao đã đƣợc ghi nhận theo một nghiên cứu đang tiến hành tại một công ty chuyên về Y - Dƣợc phẩm ở tỉnh Tây Ninh. Nghiên cứu cho biết sự thay đổi hàm lƣợng tinh dầu trên một loại nguyên liệu chủ yếu do sự khác biệt về độ ẩm và dạng ban đầu của nguyên liệu. Thông thƣờng, độ ẩm yêu cầu của nguyên liệu vào khoảng 7 - 10 %. Cho đến nay quy trình này đã chiết xuất khoảng 20 loại tinh dầu có nguồn gốc khác nhau (nhƣ gừng, quế, trầm hƣơng,…). Mô hình của quy trình chiết xuất này có thể đƣợc hình dung một cách khái quát nhƣ sau: Hình 3. 2 Mô hình quy trình chiết xuất tinh dầu Bể chứa Máy bơm khí B ìn h k h í C O 2 Sản phẩm 49 Quy trình này bao gồm 3 thiết bị chính là bình chứa khí CO2, máy bơm khí và thiết bị chiết xuất. Dung tích của bể chứa vào khoảng 2 lít. Các bƣớc cơ bản để thực hiện quy trình: Cho nguyên liệu vào bể chứa Xả khí CO2 vào bể chứa đạt áp suất 70 kg/cm 2 Sử dụng máy bơm để bơm khí vào bể chứa Tổng áp suất cần thiết là 110 kg/cm2 Giữ nguyên (ngâm) trong thời gian 15 - 20 phút Thu tinh dầu ở đầu ra sản phẩm. Thời gian ngâm và số lần lặp lại có thể tùy thuộc vào ngƣời sử dụng. Sau khi chiết xuất ta có thể thu hồi khí CO2 vào bình chứa. Quy trình này thƣờng dùng để chiết xuất tinh dầu từ nguồn nguyên liệu với số lƣợng ít, chúng tôi tạm gọi là quy trình 1 bể, thích hợp với quy mô nhỏ nhƣ ở phòng thí nghiệm hay các đơn vị nghiên cứu khoa học, sử dụng cho mục đích khảo sát hàm lƣợng tinh dầu từ các nguồn nguyên liệu khác nhau. Hình 3. 3 Mô hình chiết xuất 2 bể Với quy trình 2 bể này (đang sử dụng tại Công ty CP Y - Dƣợc phẩm Vimedimex, Trảng Bàng, Tây Ninh) ta có thể sử dụng cho mục đích chiết xuất tinh dầu với số lƣợng lớn, vì ở mỗi bể số lƣợng nguyên liệu tối thiểu phải đạt là 10 kg. 50 Quy trình 2 bể này giống quy trình 1 bể ở chỗ lƣợng khí CO2 sử dụng bằng nhau và đƣợc thu hồi lại. Lƣợng khí CO2 đƣợc dịch chuyển qua lại giữa 2 bể trong quá trình chiết xuất thông qua các van. Thông thƣờng, tổng số lần chiết xuất đối với một lần chạy là 4 lần, nghĩa là thực hiện chiết xuất tinh dầu 2 lần/bể trƣớc khi thu hồi CO2 và kết thúc quy trình. 3.4 VẬT LIỆU Khung nhà bằng tre và mái che bằng nhựa polyethylen trong. Tấm xốp (dày 5 cm) làm giá đỡ, vật liệu nổi. Xô nhựa 25 lít dùng để đựng nƣớc rỉ rác (9 xô), dụng cụ đo thể tích nƣớc. Cỏ Vetiver đƣợc cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và Chuyển giao KHCN, ĐH Nông Lâm Tp.HCM. Nƣớc rỉ rác đƣợc lấy tại bãi chôn lấp rác Gò Cát, trƣớc khi lấy mẫu nƣớc dụng cụ lấy mẫu và bình đựng nƣớc rỉ rác phải tráng qua với nƣớc thải 3 lần, lấy ở độ sâu từ 20 - 30 cm, đồng thời không gây ra bọt khí trong bình đựng nƣớc thải. 3.5 THIẾT BỊ PHÕNG THÍ NGHIỆM Cân điện tử Nồi hấp môi trƣờng Tủ ấm Máy vortex Đầu tip Tủ lạnh Đèn cồn Que trãi tam giác Đĩa petri Ống nghiệm Bình tam giác. Micropipette 3.6 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel 2003 51 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 THÍ NGHIỆM 1 Về cảm quan, sau thời gian 15 ngày thì nƣớc rỉ rác trong nghiệm thức 1 đã không còn mùi hôi. Trong các nghiệm thức còn lại (nghiệm thức 2 và 3) xảy ra hiện tƣợng cỏ héo và chết dần, đến ngày thứ 24 mới không còn mùi hôi từ nƣớc rỉ rác.  Nghiệm thức 1: Sau 7 ngày trồng trong nƣớc rỉ rác bộ rễ của cỏ không phát triển tiếp mà chết dần, thay vào đó là sự phát triển của rễ mới. Chiều dài của lá cũng không tăng bởi hiện tƣợng lá úa và héo vàng. Hình 4. 1 Chiều cao thân và độ dài rễ cỏ của NT1 a) sau 7 ngày; b) sau 42 ngày a b a b 52 Cho đến khi kết thúc quá trình thí nghiệm chỉ có một vài lá lấy lại màu xanh hoàn toàn, sự phát sinh chồi không ghi nhận đƣợc qua thí nghiệm. Sự phát triển của rễ không diễn ra liên tục mà tăng hoặc giảm theo số lƣợng và sự phát triển của rễ mới cùng với sự chết đi của các rễ mới hình thành trƣớc đó. Ở giai đoạn cuối của quá trình thí nghiệm số lƣợng và chiều dài của rễ đạt mức cao nhất. Ở nghiệm thức 1, khả năng sinh trƣởng và phát triển của cỏ đã trực tiếp làm cho chất lƣợng nƣớc thải đƣợc cải thiện đáng kể. Chúng tôi ghi nhận sự thay đổi này thông qua màu sắc của nƣớc và số lƣợng chất lắng trong nƣớc thải. Hình 4. 2 Nƣớc rỉ rác trƣớc và sau thí nghiệm của NT1  Nghiệm thức 2: Hình 4. 3 Chiều cao thân cỏ NT2 a) sau 7 ngày; b) sau 42 ngày a b 53 Ở nghiệm thức này sau 7 ngày không thấy xuất hiện rễ mới, thân và lá chƣa chuyển hoàn toàn sang màu vàng héo. Sau 21 ngày cỏ chết hoàn toàn, bộ rễ cỏ bị thối và mục rã trong nƣớc thải.  Nghiệm thức 3: Tƣơng tự nhƣ nghiệm thức 2 nhƣng sau 14 ngày cỏ đã chết hoàn toàn. Hình 4. 4 Chiều cao thân cỏ của NT3 a) sau 7 ngày; b) sau 42 ngày 1 7 14 21 28 35 42 0 10 20 30 40 50 độ d ài rễ (c m ) ngày thứ NT1 NT2 NT3 Hình 4. 5 Biểu đồ sự phát triển của rễ qua các NT b a 54 Bảng 4. 1 Sự phát triển độ dài rễ của các NT trong quá trình thí nghiệm (cm) Ngày NT 1 7 14 21 28 35 42 1 40 4 7 5 9 10 14 2 46 - - 0 0 0 0 3 48 - 0 0 0 0 0 Bảng 4. 2 Sự thay đổi màu sắc lá của các NT trong quá trình thí nghiệm Ngày NT 1 7 14 21 28 35 42 1 xanh vàng vàng vàng xanh xanh xanh 2 xanh vàng vàng khô khô khô khô 3 xanh vàng khô khô khô khô khô  Biện luận: Sự sinh trƣởng và phát triển của cỏ Vetiver trong các nồng độ pha loãng của nƣớc rỉ rác bị ngừng lại là do tình trạng cỏ bị sốc khi chuyển từ môi trƣờng đang giàu chất dinh dƣỡng sang môi trƣờng có nhiều chất độc hại. Rễ mới đƣợc sinh ra và phát triển cho thấy sự thích nghi của cỏ đối với nƣớc rỉ rác. Sự phát triển không đều của rễ trong thời gian thực hiện thí nghiệm có thể do bởi cỏ đƣợc trồng với mật độ thấp nên khả năng thích nghi của cỏ chƣa đạt đƣợc mức cao nhất. Khả năng thích nghi của cỏ đƣợc thấy rõ ở giai đoạn cuối của quá trình thí nghiệm, không còn rễ bị chết và số lƣợng nhánh phát sinh từ rễ tăng lên nhanh chóng. 4.2 THÍ NGHIỆM 2 Ngoài hai nghiệm thức 2 và 3 không có sự sinh trƣởng và phát triển của cỏ thì ở nghiệm thức 1 chúng tôi không nhận thấy sự xuất hiện nốt sần trên bề mặt của rễ. 55  Mô hình trồng cỏ 1: Ở mô hình trồng cỏ 1 sự sinh trƣởng và phát triển của cỏ là rất tốt, tuy nhiên kết thúc quá trình thí nghiệm vẫn không ghi nhận đƣợc sự có mặt của nốt sần trên bề mặt rễ cỏ Vetiver.  Mô hình trồng cỏ 2 : Hình 4. 6 Mô hình trồng cỏ 1 và 2 Qua quá trình khảo sát trên mô hình trồng cỏ 2 chúng tôi cho rằng khả năng hình thành nốt sần trên rễ cỏ Vetiver là không tồn tại. Do đó, mục tiêu tìm hiểu mật độ vi khuẩn cố định đạm trên các nốt sần vẫn chƣa đem đến một số liệu mang ý nghĩa cụ thể nào. Bảng 4. 3 So sánh sự khác nhau giữa hai mô hình trồng cỏ Mô hình Chiều cao thân (cm) Độ dài rễ (cm) Sự hiện diện nốt sần 1 120 34 0 2 136 42 0 Mặc dù có sự khác biệt rất lớn giữa hai mô hình trồng cỏ nhƣng kết quả khảo sát sự hiện diện của nốt sần là giống nhau. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn từ mẫu rễ trong quá trình thí nghiệm không cho thấy sự hiện diện của hai loại vi khuẩn cố định đạm Azotobacter spp. và Beijerinckia spp. 56 Bảng 4. 4 Sự hiện diện của nốt sần trên bề mặt rễ cỏ qua các NT Nghiệm thức 1 2 3 Sự hiện diện của nốt sần 0 0 0  Biện luận: Nhƣ vậy, câu hỏi đƣợc đặt ra là có hay không có sự tồn tại của nốt sần trên rễ cỏ Vetiver. Thực sự câu hỏi này vẫn chƣa thể trả lời một cách chắc chắn, cần có thêm nhiều nghiên cứu bổ sung khác, tuy nhiên theo nghiên cứu và cơ sở lý thuyết tôi cho rằng khả năng hình thành nốt sần trên rễ cỏ Vetiver là có tồn tại. Theo Giáo sƣ Nguyễn Lân Dũng (Vi sinh vật học, 1965) vi khuẩn Azotobacter và Beijerinckia là những vi khuẩn sống tự do trong đất nên không có khả năng tạo ra nốt sần. Mặt khác, một số nghiên cứu ở nƣớc ngoài ([15,18]) chỉ ra rằng các loại vi khuẩn trên không chỉ hiện diện trên bề mặt rễ mà còn tồn tại trong các khoảng gian bào của tế bào rễ; do đó chúng tôi nghĩ đến khả năng ở một mật độ nhất định nào đó các vi khuẩn này có thể tạo thành các nốt sần hay các khối u trên bề mặt rễ cỏ. Vấn đề cần đƣợc giải quyết là với một mật độ nào thì có sự xuất hiện của nốt sần. Chúng tôi cho rằng các loại vi khuẩn trên tuy tồn tại trong các khoảng gian bào của tế bào rễ nhƣng không đủ khả năng tạo thành nốt sần, vì nhƣ ta đã biết rễ cỏ Vetiver chứa hàm lƣợng tinh dầu khá cao đồng thời tinh dầu từ cỏ này còn có tác dụng nhƣ một chất diệt khuẩn. Vì vậy, khả năng hình thành nốt sần trên rễ cỏ Vetiver đƣợc ghi nhận trong đề tài này là không có. 4.3 THÍ NGHIỆM 3 Khối lƣợng vật liệu ban đầu đƣợc sử dụng có trọng lƣợng 1 kg, sau khi chiết xuất theo quy trình công nghệ, sản phẩm đƣợc thu nhận vào một ống eppendoff. Thể tích của sản phẩm thu đƣợc: 0,44 ml. Tinh dầu cỏ Vetiver có màu nâu vàng. Hàm lƣợng tinh dầu tính theo phần trăm: 0,04%. So sánh hàm lƣợng tinh dầu đƣợc chiết xuất từ các quy trình khác nhau: 57 CO: quy trình chiết xuất sử dụng khí CO2. S.D: quy trình chƣng cất tinh dầu bằng hơi nƣớc (Steam Distillation). H.D: quy trình chƣng cất lỏng (Hydrodistillation). LT: hàm lƣợng tinh dầu theo lý thuyết. Bảng 4. 5 Hàm lƣợng tinh dầu theo các quy trình chiết xuất Nguồn Phƣơng pháp Hàm lƣợng (%) Thí nghiệm 3 CO 0,04 Parameters of Vetiver Oil Distillation, 1999 S.D 0,23 Parameters of Vetiver Oil Distillation, 1999 H.D 0,28 Nguyễn Lân Dũng, 2005 LT 2 0.04 0.23 0.28 2 0 0.5 1 1.5 2 2.5 CO S.D H.D LT hà m lư ợn g tin h dầ u (% ) Hình 4. 7 Biểu đồ so sánh hàm lƣợng tinh dầu qua các quy trình Thông qua biểu đồ trên ta có thể thấy hàm lƣợng tinh dầu chiết xuất theo quy trình sử dụng khí CO2 cho ra sản phẩm thấp hơn rất nhiều so với các phƣơng pháp khác. 58 Theo quy trình chƣng cất tinh dầu bằng hơi nƣớc, khoảng biến động của hàm lƣợng tinh dầu rất lớn. Số liệu trong hình 4.8 đƣợc lấy từ cùng một nguồn, nhƣng trong nhiều tài liệu khác hàm lƣợng tinh dầu lại ở mức cao hơn. Có thể dao động trong khoảng 0,15 - 0,29% (trọng lƣợng khô) hoặc 0,3 - 1%, hoặc ở một giá trị khác nhƣ 0,5 - 4%. Nhƣ vậy, số liệu là rất khác nhau, do đó cần có một nghiên cứu cụ thể và chính xác. Ngay cả trong một quy trình chiết xuất cũng cho thấy sự khác biệt giữa hàm lƣợng các loại tinh dầu đã đƣợc chiết xuất. Bảng 4. 6 Hàm lƣợng tinh dầu chiết xuất của các cơ chất theo quy trình CO Cơ chất Hàm lƣợng (%) Rễ cỏ Vetiver 0,04 Gừng 0,3 Nghệ 0,2 0.04 0.3 0.2 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Vetiver Gừng Nghệ hà m lư ợn g tin h dầ u (% ) Hình 4. 8 Biểu đồ hàm lƣợng các loại tinh dầu đã chiết xuất theo CO Để giải thích cho sự khác biệt về hàm lƣợng tinh dầu trong 2 biểu đồ trên, chúng tôi xin đƣa ra các nguyên nhân sau: Khối lƣợng nguyên liệu đầu vào là quá ít, không đủ để thực hiện ở quy mô lớn hơn nhằm giảm bớt tỷ lệ hao hụt của sản phẩm. 59 Không đảm bảo đƣợc số lần lặp lại cần thiết để có thể đƣa ra một số liệu khoa học. Vì vậy, việc khảo sát hàm lƣợng tinh dầu từ rễ cỏ Vetiver trong đề tài này chỉ dừng lại ở việc bƣớc đầu đánh giá hàm lƣợng tinh dầu có trong rễ cỏ. Nhƣng có thể khẳng định rằng rễ cỏ Vetiver chứa hàm lƣợng tinh dầu ở mức cao, cần có kế hoạch và thiết bị khai thác hiệu quả để nâng cao giá trị kinh tế. Hình 4. 9 Tinh dầu Vetiver sau khi chiết xuất 60 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Cỏ Vetiver trồng thủy canh trong nƣớc rỉ rác có khả năng sống và phát triển tốt ở nồng độ pha loãng 80%. Sự xuất hiện của nốt sần trên rễ cỏ Vetiver không đƣợc ghi nhận trong quá trình thực hiện đề tài. Hàm lƣợng tinh dầu thu đƣợc khi áp dụng quy trình chiết xuất sử dụng khí CO2 là 0,04%. Với mật độ trồng cỏ 170 tép cỏ/1m2 quá trình sinh trƣởng và phát triển của cỏ diễn ra chậm, do đó sự phục hồi và tăng trƣởng của lá cũng nhƣ sự phát sinh của chồi không xảy ra liên tục. Mặt khác, sự phát triển của rễ có lúc bị gián đoạn nhƣng nhìn chung sức sống của cỏ là rất mạnh mẽ, chịu dựng rất tốt với môi trƣờng nƣớc thải chứa nhiều thành phần gây ô nhiễm. 5.2 ĐỀ NGHỊ Để khả năng xử lý nƣớc thải của cỏ Vetiver đạt hiệu quả cao, trƣớc khi đƣa cỏ vào quy trình xử lý cần dƣỡng cỏ trong dung dịch dinh dƣỡng Knop giúp cỏ tăng khả năng hút chất dinh dƣỡng và các chất hữu cơ khác, đồng thời khi áp dụng trên mô hình lớn cần thay cỏ theo định kỳ để chất lƣợng nƣớc đƣợc xử lý theo hiệu quả mong muốn. Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm cho thấy khả năng sử dụng cỏ Vetiver theo phƣơng pháp thủy canh để xử lý nguồn ô nhiễm từ nƣớc rỉ rác. Tuy nhiên cần có nghiên cứu cụ thể hơn về mật độ trồng cỏ thích hợp để hiệu quả xử lý là cao nhất cũng nhƣ xây dựng đƣợc mô hình áp dụng trong thực tế. 61 Khả năng xử lý ô nhiễm từ nƣớc rỉ rác của cỏ Vetiver mang lại hiệu quả cao, cần đƣợc nghiên cứu ở quy mô rộng hơn và ghi nhận đƣợc sự thay đổi của các thông số liên quan đến nƣớc thải. Sự hình thành của nốt sần trên rễ cỏ Vetiver tuy không ghi nhận đƣợc nhƣng có thể nghiên cứu thêm theo một hƣớng khác, sau khi dƣỡng cỏ trong dung dịch Knop chúng ta có thể gây nhiễm cho bộ rễ bằng cách ngâm chúng vào trong dung dịch có chứa vi khuẩn Azotobavter spp. và vi khuẩn Beijerinckia spp. để theo dõi mật độ của hai vi khuẩn này trong các khoảng gian bào của tế bào rễ, từ đó khảo sát khả năng hình thành nốt sần khi đem cỏ trồng ngoài đất. Nghiên cứu các giống cỏ Vetiver chứa ít hoặc không chứa tinh dầu, để ghi nhận khả năng hình thành nốt sần trên rễ cũng nhƣ tác động của hàm lƣợng tinh dầu từ rễ cỏ đến vi khuẩn Azotobacter spp. và Beijerinckia spp. Định lƣợng hàm lƣợng tinh dầu trong rễ cỏ Vetiver bằng các phƣơng pháp khác nhau, và xác định đƣợc thành phần các chất trong tinh dầu của cỏ Vetiverria zizanioides L. tại Việt Nam. 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Lân Dũng. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, Hà Nội, Việt Nam. Tập II. Trang 354 – 371. 2. Phạm Động Điện, 2006. Chƣng cất tinh dầu bằng hơi nƣớc. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội, Việt Nam. 75 trang. 3. Dƣơng Thành Lam, 2005. Thử nghiệm cỏ Vetiver (Vetiveria zizanioides L.) trong xử lý nƣớc thải sinh hoạt từ ký túc xá sinh viên. Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao KHCN Đại học Nông Lâm, Tp.Hồ Chí Minh, Việt Nam. 4. Lê Nguyễn, 2006. Ảnh hƣởng của mật độ trồng đến sinh trƣởng và khả năng xử lý nƣớc của cỏ Vetiver (Vetiverria zizanioides L.) trồng trong nƣớc kênh Nhiêu Lộc - Thị Nghè. Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao KHCN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Nguyễn Nguyên Thắng, 2006. Khảo sát ảnh hƣởng của chế phẩm sinh học Enchoice và Sanjiban trong quá trình xử lý nƣớc rỉ rác tại bãi chôn lấp rác Phƣớc Hiệp, Củ Chi. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 55 trang. 6. Trƣờng Đại học Cần Thơ. Giáo trình vi sinh vật đất (Chƣơng 5). 19 trang. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 7. K. K. Aggarwal, Aparbal Singh, A. P. Kahol and Man Singh, 1999. Parameters of Vetiver Oil Distillation. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. Volume 6. Issue 2. ISSN 1049 - 6475. 8. Benjar Chutintrasri, Somnuk Promdaeng and Teeranud Romphophak. Extraction and analysis of volatile compounds and post harvest treatment of Ya Prak Hin roots. Scientific Equipment Center, Kasetsart University Research and Development Institute, Thailand. 63 9. Narong Chomchalow, 2001. The ultilization of Vetiver as medicinal and aromatic plants. Office of the Royal Development Projects Board, Thailand. 27 pages. 10. Stephen V. Dowthwaite and Samjamjaras Rajani. Vetiver: Perfumers’ liquid gold. Thai - China Flavours and Fragrances Co. Ltd. Bangkok. 3 pages. 11. Xia Hanping, Ao Huixiu, Liu Shizhong and He Daoquan. A preliminary study on Vetiver’s purification for garbage leachate. South China Institute of Botany, Academia Sinica, Guangzhou 510650, China. 12. Tri Levan and Duc Vuthiminh; 2005. Preliminary results of isolation of nitrogen fixing bacteria in sugar-cane (Saccharum officinarum L.). VietNam Information for Science and Technology Advance. Vol 43. - No 1. - p. 93-97. -(vie). -ISSN 0866-708X. 13. A. Muthusankaranarayanan, U. Solaiappan and S. Senthivel. Planting techniques for Vetiver slips in rainfed Vertisols. Regional Research Station, Agricultural University, Arnppukkottan 626107, Tamilnadu, India. 14. Ngwainmbi Simon, 2000. Utilization of Vetiver grass roots for medicinal and other purposes. Cameroon Vetiver Network (CAVN). 15. Settha Siripin. Microbiology associated with the Vetiver plant. Maejo University, Chiang Mai, Thailand. 3 pages 16. Sinkangam, B. Siripin, S. Teeratorn and A. Pintarak; 1999. Evaluation of plant growth regulators and effect of nitrogen fixing bacteria on growth of vetiver grass. The 37 th Kasetsart University Annual Conference, 3 - 5 February, 1999: 40 - 44, Thailand. 4 pages. 17. Sirinan Thubthimthed, Krittiya Thisayakorn, Ubon Rerk-am, Sinn Tangstirapakdee and Taweesak Suntorntanasat. Vetiver oil and its sedative effect. Thailand Institute of Scientific and Technological Research (TISTR, Bangkok, Thailand). 3 pages 64 18. Office of The Royal Development Projects Board in cooperation with Fund Donated by The Heineken Breweries Co.ltd, 19 - 30 November 2000. The Vetiver System. Bangkok, Thailand. 139 pages. TRANG WEB 19. 20. 21. 22. 23.