TÓM TẮT
BưỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LưỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHưƠNG PHÁP REAL-TIME PCR.
Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S
bằng phương pháp Real-Time PCR. Đánh giá khả năng định lượng và hiệu quả của
phương pháp. Định lượng một số mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp trên thị trường Tp
Hồ Chí Minh và phụ cận.
Đề tài đã có những kết quả sau:
Quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen:
- Bước 1: Ly trích DNA mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp. Quy trình đề nghị:
dung dịch phá màng tế bào: CTAB 2%; dung dịch biến tính protein:
phenol/chloroform; dung dịch tủa DNA: isopropanol.
- Bước 2: Sàng lọc bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị:
Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I.
Kết quả thí nghiệm sàng lọc: sản phẩm có promoter 35S cho vạch khuếch
đại có kích thước 123 bp với nhiệt độ nóng chảy 86-86,5oC.
- Bước 3: Định lượng mẫu bắp biến đổi gen có kết quả sàng lọc dương tính, dựa
trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với mẫu dò Taqman.
Kết quả đánh giá: phương pháp Real-Time PCR có khả năng phát hiện và
định lượng 1 copy gen đích trong mẫu thí nghiệm, định lượng chính xác
một mẫu có tỷ lệ phần trăm chuyển gen biết trước.
- Khảo sát một số mẫu sản phẩm cho thấy, trên thị trường Việt Nam có sản phẩm
chuyển gen ở các dạng thực phẩm và thức ăn khác nhau.
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ iii
TÓM TẮT iv
MỤC LỤC .vi
CHỮ VIẾT TẮT .xi
DANH MỤC HÌNH xii
DANH MỤC BẢNG xiv
PHẦN I: MỞ ĐẦU 1
1.Đặt vấn đề .1
2.Mục đích và yêu cầu 2
2.1.Mục đích .2
2.2.Yêu cầu .2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3
1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism) . 3
2. Quá trình tạo sinh vật GMO 3
2.1.Quá trình cơ bản .3
2.2.Promoter CaMV 35S 4
3.Ứng dụng và lợi ích của thực vật chuyển gen . 6
3.1.Ứng dụng 6
3.1.1. Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17] 6
3.1.2. Thực vật không sử dụng làm thực phẩm [17] . 7
3.2.Tác động có lợi của thực vật chuyển gen .8
4.Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới . 9
4.1.Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới 11
5.Ảnh hưởng bất lợi và dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen 12
5.1.Các rủi ro có thể gặp [34] .12
5.2.Tác động có hại 12
5.2.1. Môi trường 13
5.2.2. Sức khoẻ người tiêu dùng . 13
5.2.3. Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể 14
5.3.Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen .14
6. Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới 16
6.1.Quy định tại châu Âu [33]: .17
6.1.1. Nguyên tắc định lượng dựa trên DNA . 18
6.1.2. Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu . 19
6.1.2.1. Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen . 19
6.1.2.2. Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen . 19
7. Tình hình Việt Nam . 21
7.1.Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen 21
7.2.Vấn đề thương mại hóa và kiểm soát sinh vật biến đổi gen .21
8. Các phương pháp định lượng sản phẩm chuyển gen . 22
8.1.Phương pháp ELISA 23
8.2.Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] 23
8.3.Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR .24
8.3.1. Hóa chất định lượng . 24
8.3.1.1. SYBR Green I 25
8.3.1.2. Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) . 25
8.3.2. Công cụ phát hiện . 27
8.4.Nguyên tắc định lượng bằng kĩ thuật Real-time PCR 28
8.4.1. Quan hệ định lượng 28
8.4.2. Thiết kế thí nghiệm . 29
8.4.3. Phân tích dữ liệu Real-time PCR 30
8.4.4. Tính toán hàm lượng GMO 31
8.5.Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen
[9][44]32
8.6.Một số công trình nghiên cứu về phát hiện và định lượng GMO dựa trên
promoter 35S. .34
8.6.1. Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S . 34
8.6.2. Định lượng GMO đựa trên promoter 35S 35
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 36
1.Nội dung nghiên cứu 36
2.Điều kiện tiến hành thí nghiệm . 36
2.1.Địa điểm thực hiện thí nghiệm .36
2.2.Thời gian thực hiện .36
3.Tiến trình thí nghiệm: . 36
4.Vật liệu thí nghiệm . 37
5.Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA 38
5.1.Mục tiêu 38
5.2.Vật liệu .38
5.3.Phương pháp thực hiện .38
5.4.Phương pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích .41
6.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen . 41
6.1.Mục tiêu 41
6.2.Nguyên tắc 41
6.3.Vật liệu thí nghiệm .42
6.4.Trang thiết bị 42
6.5.Phương pháp thực hiện .43
6.5.1. Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR . 43
6.5.2. Chương trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại 43
6.5.3. Phát hiện sản phẩm khuếch đại . 44
6.5.4. Phân tích kết quả . 45
7.Thí nghiệm 3: Xác định phương pháp định lượng sản phẩm biến đổi gen 46
7.1.Mục tiêu 46
7.2.Nguyên tắc 46
7.3.Vật liệu thí nghiệm .46
7.4.Trang thiết bị 46
7.5.Phương pháp thực hiện .46
7.5.1. Bố trí thí nghiệm . 46
7.5.1.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng p35S 47
7.5.1.2. Đánh giá kết quả định lượng 48
7.5.2. Thành phần phản ứng PCR . 48
7.5.2.1. Đặc điểm 35S master mix 49
7.5.2.2. Đặc điểm SYBR Green I Supermix . 49
7.5.3. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR 49
7.5.4. Cài đặt phần mềm điều khiển . 50
7.5.5. Phân tích kết quả thí nghiệm 51
8.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR.
.54
8.1.Mục tiêu 54
8.2.Nguyên tắc 54
8.3.Vật liệu thí nghiệm .54
8.4.Trang thiết bị 54
8.5.Hóa chất 54
8.5.1. Đặc điểm 35S và corn-reference master mix . 55
8.5.2. Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference
calibration DNA standards) . 55
8.6.Phương pháp thực hiện .55
8.6.1. Bố trí thí nghiệm . 56
8.6.1.1. Độ nhạy phản ứng 56
8.6.1.2. Độ chính xác: 56
8.6.2. Thiết kế phản ứng định lượng 56
8.6.3. Thành phần phản ứng Real-Time PCR . 57
8.6.4. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR 57
8.6.5. Phân tích kết quả . 58
9.Ứng dụng phương pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trường58
9.1.Mục tiêu 58
9.2.Nguyên tắc 58
9.3.Vật liệu thí nghiệm .58
9.4.Trang thiết bị và hóa chất .58
9.5.Phương pháp thực hiện .59
9.5.1. Bố trí thí nghiệm . 59
9.5.2. Thiết kế phản ứng định lượng 59
9.5.3. Thành phần phản ứng và chương trình nhiệt thiết lập 59
9.5.4. Phân tích kết quả . 59
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .60
1.Khảo sát các quy trình ly trích DNA . 60
2.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen . 63
2.1.Phương pháp 1: PCR truyền thống .63
2.2.Phương pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green .65
3.Thí nghiệm 3: Xác định phương pháp định lượng GMO 71
3.1.Xây dựng đường chuẩn: .71
3.2.Đánh giá kết quả định lượng 74
4.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR
.76
4.1.Độ nhạy của phương pháp: .76
4.2.Độ chính xác của phương pháp 78
5.Thí nghiệm 5: Ứng dụng phương pháp định lượng Real-Time PCR . 79
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .85
1.Kết luận . 85
2.Đề nghị 86
TÀI LIỆU THAM KHẢO 87
PHỤ LỤC .92 .
BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR
129 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 2495 | Lượt tải: 3
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Bước đầu xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-Time PCR, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
pháp Real-Time PCR
Trong thí nghiệm này, mục tiêu của chúng tôi là đánh giá khả năng định lượng của phương
pháp Real-Time PCR với mẫu dò Taqman. Các kết quả thí nghiệm như sau:
Độ nhạy của phƣơng pháp:
Mẫu thí nghiệm: mẫu 1 copy gen đích.
76
76
Chuẩn 1 Chuẩn 2
Chuẩn 3 Chuẩn 4
Mẫu 1 copy 1và 2
Hình 4.12:Đồ thị DNA quantification của mẫu 1 copy
Ghi chú :
Bảng 4.12: Kết quả định lƣợng mẫu 1 copy
Mẫu pha loãng
1 copy
Chu kỳ phát hiện
Kết quả thực tế
(copy)
Lần 1
Lần 2
36,22
35,96
1,21
1,38
Trung bình 36,09 1,25
Nhận xét :
- Các kết quả định lượng ở Bảng 4.13 cho thấy không có sự sai khác đáng kể giữa kết quả
định lượng thực tế với số lượng lý thuyết (1,25 copy so với 1 copy). Sự sai khác (0,21 và
0,38 copy) xảy ra có thể do thao tác của người thực hiện khi bơm hút mẫu.
- Các kết quả định lượng của 2 lần lặp lại khác nhau cũng cho thấy không có sai khác đáng
kể. Khác biệt này (0,17 copy) có thể cũng do nguyên nhân trên.
Như vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy phương pháp Real-Time PCR có thể cho phép định
lượng sự hiện diện của gen đích ở mức thấp nhất là 1 copy. Điều này chứng tỏ độ nhạy của phương
pháp là rất tốt.
Độ chính xác của phƣơng pháp
77
77
Bảng 4.13: Kết quả định lƣợng mẫu Bt 176 1%
Độ lặp lại
Chu kỳ phát hiện
Kết quả định lƣợng
(copy)
Tỷ lệ
chuyển
gen (%) Promoter
35S
Gen tham
chiếu
Promoter
35S
Gen tham
chiếu
Lần 1
Lần 2
32,59
28,56
28,93
24,51
200
124
20300
12500
0,985
0,992
Độ lệch 0,007
Nhận xét thí nghiệm định lượng mẫu bắp Bt 176 1%:
- Kết quả định lượng bắp chuyển gen Bt 176 1% (Bảng 4.14) khá tốt. Các kết quả này có sự
sai khác không đáng kể so với tỷ lệ phần trăm chuyển gen 1% của mẫu (sai lệch 0,015 % và
0,008 %). Sự sai lệch này là rất nhỏ và không đáng kể.
- Kết quả định lượng của 2 lần lặp lại cũng có sự khác biệt không đáng kể (sai lệch 0,007 %).
Sai lệch này rất thấp, chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt.
Như vậy, các kết quả ở thí nghiệm 4 đã chứng minh được độ nhạy và độ chính xác của phương
pháp Real-Time PCR:
- Định lượng được 1 copy gen đích trong mẫu thí nghiệm
- Xác định chính xác tỷ lệ phần trăm chuyển gen của một mẫu biết trước qua các lần lặp lại
khác nhau.
Hiệu quả của phương pháp đặc biệt quan trọng trong định lượng sản phẩm biến đổi gen, do các
quy định hiện nay về mức ngưỡng cho sự hiện diện thành phần biến đổi gen trong thực phẩm (đặc biệt
tại châu Âu) là rất thấp. Các mức ngưỡng được quy định hiện nay là 0,5 % và 0,9 % đòi hỏi phương
pháp định lượng phải có kết quả hết sức chính xác. Các kết quả thu nhận được đã chứng minh khả
năng áp dụng của phương pháp Real-Time PCR trong định lượng sản phẩm biến đổi gen.
5. Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng Real-Time PCR
78
78
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng đối tượng là các mẫu được sàng lọc dương tính với
promoter 35S ở thí nghiệm 2. Các mẫu này được lặp lại 2 lần trong cùng một lần thí nghiệm. Các kết
quả được phân tích trên đồ thị DNA quantification như sau.
Hình 4.13: Đồ thị định lƣợng p35S của các mẫu thí nghiệm
Ghi chú:
Hình 4.14: Đƣờng chuẩn phản ứng định lƣợng p35S
Ghi chú:
B1 B2 B4 B6
B7 B10 B11
Mẫu chuẩn
Mẫu chưa biết
79
79
Hình 4.15: Đồ thị định lƣợng gen tham chiếu của các mẫu thí nghiệm
Ghi chú:
Hình 4.16: Đƣờng chuẩn phản ứng định lƣợng gen tham chiếu
Ghi chú:
Bảng 4.14: Các thông số kết quả của thí nghiệm
Thí nghiệm định lƣợng
Thông số p35S
Gen tham
chiếu
Hệ số tƣơng quan (Correlation
Coefficient)
Hiệu quả PCR (PCR Efficiency) (%)
0,998
110,7
0,987
116,8
Bảng 4.15: Chu kỳ phát hiện của các mẫu thí nghiệm
B1 B2 B4 B6
B7 B10 B11
Mẫu chuẩn
Mẫu chưa biết
80
80
STT Tên và đặc điểm của mẫu
Kí
hiệu
Chu kỳ phát hiện
Promoter
35S
Gen tham
chiếu
1
2
3
4
5
6
7
Bắp giống 1
Bắp giống 2
Bắp giống 4
Bắp trái ăn tươi
Bột bắp nguyên liệu làm thức
ăn gia súc
Thức ăn gia súc 2
Bột ngũ cốc dinh dưỡng 1
B1
B2
B4
B6
B7
B10
B11
27.38
27.61
28.93
29.73
26.35
26.51
34.16
33.46
27.71
27.8
26.05
27.33
24.99
25.81
27.69
27.14
25.6
24.4
23.02
24.23
23.91
23.93
28.32
28.31
24.92
24.92
30.59
27.44
Từ các kết quả trên đây chúng tôi rút ra một số nhận xét sau :
- Nhìn trên đồ thị DNA Quantification ta thấy các mẫu đều dương tính rõ rệt, các đường cong
đồ thị đều vượt lên trên khá rõ so với chu kỳ ngưỡng.
- Hiệu quả của phản ứng : Phản ứng đạt hiệu quả cao với đường chuẩn được xây dựng chính
xác thể hiện qua các thông số như : hệ số tương quan của đường chuẩn đạt 0,998 (định
lượng p35S) và 0,987 (định lượng gen tham chiếu) cao hơn yêu cầu của nhà sản xuất (0,98);
hiệu quả PCR cũng đạt 110,7 % (định lượng p35S) và 116,8 % (định lượng gen tham
chiếu).
Bảng 4.16: Độ lệch tiêu chuẩn chu kỳ phát hiện của mẫu
(CT Standard Deviation)
Mẫu
Độ lệch tiêu chuẩn của
chu kỳ phát hiện
(CT Standard Deviation)
p35S Gen tham chiếu
81
81
B1
B2
B4
B6
B7
B10
B11
0.16
0.56
0.11
0.50
0.06
0.91
0.58
0.39
0.85
0.86
0.01
0.01
0.00
2.23
- Chu kỳ phát hiện của các mẫu thí nghiệm trong 2 lần lặp lại là xấp xỉ nhau. Điều này được
thể hiện ở Bảng 4.15 và 4.16 , độ lệch chuẩn của chu kỳ phát hiện là khá thấp, đặc biệt là
một số mẫu như B6, B7, B10.
- Tuy nhiên, nhìn trên đường chuẩn ở Hình 4.14 và 4.16, ta thấy một số mẫu có thể có kết
quả định lượng không chính xác do chúng vượt quá giá trị thấp nhất và cao nhất của các
mẫu chuẩn. Điều này có thể do sự ngoại nhiễm trong thao tác hay chất lượng DNA ly trích
gây ra.
Kết quả định lượng và tỷ lệ phần trăm chuyển gen trong các mẫu theo công thức bên dưới:
%GMO = (Số lƣợng trình tự gen chuyển nạp/Số lƣợng trình tự
gen đối chiếu) x 100
Bảng 4.17: Kết quả định lƣợng các mẫu thí nghiệm (2 lần lặp lại)
Kí hiệu mẫu
Kết quả định lƣợng (copy)
Tỷ lệ % chuyển
gen (%)
Giá trị trung bình (2 lần lặp lại)
p35S Gen tham chiếu
82
82
B1
B2
B4
B6
B7
B10
B11
5940
945
7880
33,3
4900
7240
17700
96100
4460
12900
9270
43500
4270
331
6.18
21.19
61.09
0.36
11.26
169.56
5347.43
Một số nhận xét được rút ra như sau:
Các mẫu đều có sự hiện diện của p35S trong mẫu. Điều này phù hợp với kết quả
sàng lọc ỏ thí nghiệm trước.
Một số mẫu có sự hiện diện p35S trong mẫu khá thấp (B6: 33,3 copy), một số mẫu
hiện diện p35S rất lớn (B11: 17700 copy, B4: 7880 copy). Điều này có lẽ do sự khác
biệt về nguồn gốc các sản phẩm trong mẫu
Độ lệch chuẩn chu kỳ phát hiện của các mẫu không lớn. Điều này chứng tỏ, kết quả
định lượng không có sự biến động lớn ở các lần lặp lại.
Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm chuyển gen 3 mẫu B1, B2, B4 (đều là hạt giống bắp)
cho thấy sự hiện diện rất chênh lệch số lượng p35S trong các giống bắp khác nhau.
Tuy nhiên, dựa trên cơ sở lý thuyết, chúng tôi cho rằng chỉ có mẫu B1 là có kết quả
định lượng đáng tin cậy.
Mẫu B6 có kết quả định lượng khá tin cậy, dựa trên các kết quả thu nhận được ở
Bảng 4.17, 4.18 và 4.19. Các kết quả này chứng tỏ sự hiện diện của sản phẩm biến
đổi gen trong bắp trái ăn tươi tại Tp Hồ Chí Minh và phụ cận.
Tương tự, kết quả định lượng ở mẫu B7 cũng khá tin cậy, dựa trên các kết quả thu
nhận được. Mẫu này có nguồn gốc từ các loại bắp được trồng từ giống B1, B2, B4 và
các giống khác, sau đó qua quá trình xay xát tạo nên. Điều này cũng chứng minh có
sự hiện diện của hạt giống bắp chuyển gen tại Việt Nam.
Hai mẫu B10 và B11 có kết quả định lượng p35S vượt quá kết quả định lượng gen
tham chiếu. Điều này có thể do các mẫu này là sản phẩm chế biến, được tạo thành từ
rất nhiều thành phần nguyên liệu khác nhau, nên có thể con số này là tổng số lượng
promoter 35S trong mẫu chứ không chỉ riêng từ bắp chuyển gen. Mặc khác, do bắp
83
83
chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong thành phần nguyên liệu nên số lượng gen tham chiếu
phát hiện được rất thấp. Điều này đã ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Đây cũng
chính là nhược điểm của phương pháp định lượng dựa trên promoter 35S.
Như vậy, từ các kết quả thu nhận được từ thí nghiệm 5, chúng tôi rút ra một số kết luận như
sau:
- Phương pháp Real-Time PCR với mẫu dò Taqman có thể được ứng dụng cho việc định
lượng các mẫu sản phẩm biến đổi gen tại Việt Nam. Các kết quả thu nhận được từ các mẫu
có nguồn gốc khác nhau, từ các mẫu thô (hạt bắp) đến các mẫu đã trải qua quá trình chế
biến phức tạp (bột ngũ cốc dinh dưỡng) chứng tỏ khả năng áp dụng rộng rãi trên nhiều đối
tượng của phương pháp Real-Time PCR.
- Các kết quả trong thí nghiệm này cùng với kết quả sàng lọc bằng phương pháp Real-Time
PCR (SYBR Green I) cũng cố thêm chứng minh về độ nhạy cao của phương pháp này. Mặc
dù các kết quả là khác biệt, chúng cho thấy phương pháp Real-Time PCR có thể cho phép
phát hiện và định lượng trình tự DNA trong các mẫu có nguồn gốc và chất lượng rất khác
nhau.
- Các sai lệch về kết quả định lượng trong thí nghiệm này có thể giải thích do một số nguyên
nhân như sau:
Sự ngoại nhiễm do môi trường thực hiện thí nghiệm cũng như thao tác của kĩ thuật
viên gây ra. Các sai sót này có thể do việc bơm hút mẫu, môi trường làm việc không
vô trùng, dụng cụ thí nghiệm chưa khử trùng kỹ lưỡng…điều này chứng tỏ độ nhạy
rất cao của phương pháp đồng thời đặt ra các yêu cầu về việc chuẩn hóa các phòng
thí nghiệm định lượng.
Chất lượng DNA ly trích. Các kết quả khác biệt có thể xảy ra ngay trong cùng một
mẫu do chất lượng DNA ly trích có thể không ổn định hay do thao tác khi bơm hút
mẫu của kĩ thuật viên. Điều này đặt ra yêu cầu về việc hoàn thiện hóa các quy trình
ly trích DNA chuẩn nhằm đảm bảo tốt nhất chất lượng của DNA, đối tương chính
của thí nghiệm này.
Như vậy, tuy phương pháp này đặt ra một số yêu cầu đối với đầu tư trang thiết bị, chuẩn hóa
phòng thí nghiệm, huấn luyện kĩ thuật viên, khả năng ứng dụng thành công phương pháp này tại nước
ta là rất hứa hẹn.
84
84
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
Vấn đề định lượng sản phẩm biến đổi gen tại Việt Nam còn khá mới mẻ. Trong phạm vi khóa
luận này, chúng tôi chỉ mới bước đầu nghiên cứu về tính khả thi của phương pháp Real-Time PCR
trong việc định lượng DNA. Từ các kết quả thu nhận được, chúng tôi có một số kết luận về quy trình
định lượng các sản phẩm biến đổi gen như sau:
- Bước 1: Ly trích DNA mẫu sản phẩm.
Phương pháp đề nghị: Quy trình 3 (quy trình biến đổi). Tác nhân biến tính màng là
CTAB, biến tính protein là phenol/chloroform, tủa bằng Isopropanol trong điều kiện
lạnh (4oC).
Khó khăn: Lượng DNA thu được chưa cao, một số mẫu không ly trích được DNA.
Giải pháp: Thử nghiệm các phương pháp mới, sử dụng bộ kit ly trích.
- Bước 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen dựa trên promoter 35S.
Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I.
Khó khăn: Xuất hiện hiện tượng mồi bắt cặp không đặc hiệu trong một số mẫu.
Giải pháp: Cần tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp.
- Bước 3: Định lượng các sản phẩm biến đổi gen có kết quả sàng lọc dương tính, dựa
trên promoter 35S.
Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với mẫu dò đặc hiệu Taqman với độ nhạy 1
copy gen đích trong mẫu thí nghiệm .
Khó khăn: Chỉ có thể định lượng tổng số thành phần chuyển gen trong các mẫu hỗn
hợp.
Giải pháp: Cần định lượng các trình tự đặc hiệu hơn cho từng loại sản phẩm.
Về việc ứng dụng phương pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trường, chúng tôi
có một số kết luận sau:
- Các mẫu đã sàng lọc và định lượng có sản phẩm biến đổi gen: 3 mẫu hạt giống bắp, 1
mẫu bắp trái ăn tươi, 1 mẫu bột bắp làm nguyên liệu thức ăn gia súc, 1 mẫu thức ăn gia súc,
1 mẫu bột ngũ cốc dinh dưỡng.
85
85
- Có hiện diện các sản phẩm chuyển gen là thực phẩm cho người như: bắp trái ăn tươi,
bột ngũ cốc dinh dưỡng. Chúng có thể bắt nguồn hay có chứa thành phần nguyên liệu có
nguồn gốc từ cây trồng biến đổi gen.
2. Đề nghị
Tuy nhiên, do giới hạn thời gian và điều kiện thí nghiệm, cũng như đây là nghiên cứu ban đầu
về phương pháp Real-Time PCR trong định lượng sản phẩm biến đổi gen, chúng tôi có một số đề nghị
sau:
- Khóa luận chưa kiểm chứng độ đặc hiệu của mồi tự thiết kế và trong bộ kit định lượng
p35S vì vậy, cần tiến hành một số phương pháp khẳng định lại sản phẩm khuếch đại DNA
là p35S như: dùng enzyme cắt giới hạn, giải trình tự gen.
- Các mẫu âm tính có thể là mẫu chuyển gen bằng các thành phần khác (promoter 35S
chỉ hiện diện trong 70 % tổng số cây trồng biến đổi gen trên thế giới), vì vậy cần mở rộng
nghiên cứu sang các trình tự khác, làm phong phú thêm khả năng phát hiện và định lượng
- Tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về định lượng sản phẩm biến đổi gen, tiến đến định
lượng các trình tự đặc hiệu của từng sản phẩm biến đổi gen, như: gen chuyển nạp, trình tự
nối promoter và gen chuyển nạp…nhằm khắc phục nhược điểm của phương pháp định
lượng dựa trên promoter 35S là chỉ có thể định lượng được tổng số thành phần biến đổi gen
trong các mẫu sản phẩm hỗn hợp.
- Tiến hành nghiên cứu và khảo sát trên số lượng mẫu lớn, các chủng loại mẫu khác
nhau để có tổng kết về tình hình sản phẩm biến đổi gen tại Việt Nam.
86
86
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bùi Lan Anh, 2004. Khảo sát qui trình biến nạp gen trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.
cv Samsun). Khóa luận cử nhân khoa học, ĐH Khoa Học Tự Nhiên, Tp Hồ Chí Minh, Việt
Nam, trang 5-12, 16-19.
2. Lê Thanh Bình, 2004. Quản lý an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen và sản phẩm của
chúng. Hội nghị National Workshop on Risk Assessment of GM Crops-VN, tháng 10 năm 2004,
42 slide.
3. Clive James, 2004. Tình trạng cây trồng chuyển gen/cây trồng công nghệ sinh học được trồng
và mua bán trên toàn thế giới trong năm 2004. Báo cáo đánh giá. ISAAA, Mỹ, 14 trang.
4. Cơ quan dịch vụ quốc tế về tiếp thu các ứng dụng Công nghệ sinh học trong nông nghiệp
(ISAAA), 2005. Cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu gần đạt mức tăng trưởng kỉ lục.
ISAAA, Mỹ. 2 trang.
5. Bùi Văn Lệ, 2004. Sinh vật biến đổi gen: Thực trạng và giải pháp. Báo cáo chuyên đề, ĐH
Khoa Học Tự Nhiên, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam, 55 slides.
6. La Tuấn Nghĩa, 2004. Bài phát biểu giới thiệu. Hội nghị National Workshop on Risk
Assessment of GM Crops-VN, tháng 10 năm 2004, 5 trang.
7. Nguyễn Hồng Minh Ngọc, 2004. Hoàn thiện phương pháp chuẩn đoán nông sản chuyển gen
dựa trên kỹ thuật PCR. Khóa luận Kỹ sư Nông nghiệp, Khoa Nông học, ĐH Nông Lâm Tp Hồ
Chí Minh, 56 trang.
8. Nguyễn Thái Thủy, 2004. PCR và Real-Time PCR. Bài giảng ĐH Nông Lâm, Tp Hồ Chí
Minh, Việt Nam, 110 slides.
9. Phạm Thị Anh Thư, 2004. “Giới thiệu về sinh vật chuyển đổi gen (GMOs)”. Hội thảo, Hội các
phòng thí nghiệm Việt Nam (VINATEST), Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam.
Anh văn
10. Agrifood Awareness Australia Limited, 2004. Global GM Food Labelling Laws. Biotech
Bulletin 8. Agrifood Awareness Australia Limited, 7 pages.
11. Applied Biosystems. Real-Time PCR Vs. Traditional PCR. Tutorial, Applied Biosystems,
USA, 15 pages
12. Benbrook C., 2003. Impacts of Genetically Engineered Crops on Pesticide Use in the United
States: The First Eight Years. BioTech InfoNet, Technical Paper Number 6, USA, 46 pages.
87
87
13. Bio-Rad, 2005. GMO Testing in Food and Feed: Extraction, Detection and Quantification.
Bio-Rad, American, 8 pages.
14. Bio-Rad, 2005. MyiQ™ Single-Color Real-Time PCR Detection System. Instruction manual,
catalog number 170-9740. Bio-Rad, USA, 133 pages.
15. Bio-Rad. Biotechnology Explorer™ GMO Investigator™ Kit. Bio-Rad, USA, 79 pages.
16. Carolina Roa-Rodríguez, 2003. Promoters used to regulate gene expression. Cambia
Intellectual Property Resource, Australia, p. 1-24, 55-65.
17. Choi Yang Do, Cheong Jong-Joo, 2004. The Current Status of GMOs Development. Crop
Functional Genomics Center, School of Agricultural Biotechnology, Seoul National
University, p 3, 7-17.
18. Clive James, 2004. Biotech crop Countries and Mega-Countries, 2004. ISAAA, USA.
19. Clive James, 2004. Global Adoption rates (%) for pricipal Biotech Crops (Million Hectares).
ISAAA, USA.
20. Clive James, 2004. Global Area of Biotech Crops Million Hectares (1996 to 2004). ISAAA,
USA.
21. Clive James, 2005. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2004. ISAAA, 12
pages.
22. Council For Biotechnology Information, 2002. Benefits of Plant Biotechnology. Council For
Biotechnology Information. 54 slides.
23. EEA (European Environment Agency), 1999. Genetically modified organisms. Environment in
the European Union at the turn of the century. Environmental assessment report No 2: 245-
261. EEA (European Environment Agency), EU.
24. Eyquem F., 2004. Quantitative Detection of Roundup Ready Soybean by ELISA. The Analysis
Of Food Samples For The Presence Of Genetically Modified Organisms (Querci M., Van den
Eede G., Jermini M.). European Commission Joint Research Center, EU. 21 pages.
25. Francisco Xavier Moreano Guerra, 2005. Development of techniques for the quantification of
DNA from genetically modified organisms in processed foods. Doctor thesis, Technology
University of Munich, Germany. 124 pages.
26. Friends of the Earth International, 2003. Biosafety Protocol ratification provides new measures
to guard against genetically modified organisms. Fact sheet, Friends of the Earth International,
3 pages.
27. Friends of the Earth, 2004. Genetically Modified Crops: a decade of failure [1994 - 2004].
Issue 105. Friends of the Earth International, 52 pages.
88
88
28. Gaskell George et at., 2000. Biotechnology and the European public. Nature Biotechnology 18:
935-938. Nature, American.
29. GeneScan. Calibration DNA Standards for 35S Corn DNA Quantification. Standard Lot
#0220502. GeneScan, Germany, 1 page.
30. GeneScan. GMOQuant 35S Screen Corn Kit. Protocol for use of Product cat. No. 5121200610.
GeneScan, Germany, 3 pages.
31. ISAAA. Does the 35S Promoter, which is viral in origin, have any potential to induce new
viruses?. ISAAA, USA, 21 slides.
32. Karudapuram Surekha, and Batey David. Detection of Genetically Modified Soybean in
Processed Foods Using Real-Time Quantitative PCR with SYBR Green I Dye on the DNA
Engine Opticon® 2 System. Application Note Vol.2, No.6, MJ Research, Inc., South San
Francisco, CA, USA, 4 pages.
33. Querci M., Maretti M., Mazzara M., 2004. Qualitative Detection of Mon810, Bt-176 Maize ang
Roundup Ready Soybean by PCR. The Analysis Of Food Samples For The Presence Of
Genetically Modified Organisms (Querci M., Van den Eede G., Jermini M.). European
Commission Joint Research Center, EU. p. 12.
34. Querci M., Mazzara M., 2004. Characteristics of the Qualitative PCR Systems Described in the
Manual. The Analysis Of Food Samples For The Presence Of Genetically Modified Organisms
(Querci M., Van den Eede G., Jermini M.). European Commission Joint Research Center, EU.
p. 4.
35. Querci M., Van den Eede G., Jermini M., 2004. Overview, General Introduction on Genetically
Modified Organisms (GMOs), EU legislation. The Analysis Of Food Samples For The
Presence Of Genetically Modified Organisms (Querci M., Van den Eede G., Jermini M.).
European Commission Joint Research Center, EU. p. 3-12, Annex 1.
36. Rogers S.O. and Bendich A.J, 1988. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular
Biology Manual A6, p.1-10.
37. Soil Association, 2004. GM Food: Scientific Evidence of Health Risks. Information sheet, Soil
Association, England, 3 pages.
38. Somma M., 2004. Extraction and Purification of DNA. The Analysis Of Food Samples For The
Presence Of Genetically Modified Organisms (Querci M., Van den Eede G., Jermini M.).
European Commission Joint Research Center, EU. p. 3-16.
39. The European Commission DG Joint Research Centre, 2000. Validation of analytical methods
for the identification and determination of genetically modified organisms (GMOs) in food and
food ingredients. Final Report, The European Commission DG Joint Research Centre, p. 9-12.
89
89
40. Viljoen, C.D., Botha, G.M. and Chetty, L. GMO testing: A prerequisite for Identity
Preservation of non-GM crops. GMO Testing Facility, Department of Plant Science,
University of the Free State, 6 pages.
41. Vu Duc Quang, 2004. Current Status of GM crops and GM-derived products in Vietnam.
National Workshop on Risk Assessment of GM Crops-VN, Oct 2004, 40 slides.
42. Weighardt F., 2004. Quantitative PCR for the Detection of GMOs. The Analysis Of Food
Samples For The Presence Of Genetically Modified Organisms (Querci M., Van den Eede G.,
Jermini M.). European Commission Joint Research Center, EU. p. 3-18.
Web
43. AgriQuality GMO Services – Quantification.
44. Arne Holst-Jensen, 2001. 2.2 DNA-based methods. CHAPTER 2 GMO detection methods and
validation. A review, with notes on future needs and directions. National Veterinary Institute,
NORWAY
ng%20PCR%20review.htm
45. Food and Feed Safety. Community register of GM Food & Feed.
46. Genetic Transcription and Regulation and Control.
47. Harrison Richard. Sequence Detection Systems: Principles of Real-Time PCR and Taqman
Systems, PE Biosustems, Australia and New Zealand.
48. Real-Time PCR. 2004.
90
90
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Đệm trích 1.
- Tris/HCl 0,05 mol/l
- EDTA 0,05 mol/l
- SDS 30 g/l
- Chỉnh pH = 8 bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M.
- Hấp tiệt trùng.
- Giữ 4oC sử dụng trong 6 tháng.
Phụ lục 2: Đệm trích CTAB 2%
- CTAB 20 g/l
- NaCl 1,4 mol/l
- Tris/HCl 0,1 mol/l
- EDTA 0,02 mol/l
- Chỉnh pH = 8 bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M.
- Hấp tiệt trùng.
- Giữ 4oC sử dụng trong 6 tháng.
Phụ lục 3: Dung dịch CTAB tủa.
- CTAB 5 g/l
- NaCl 0,04 mol/l
- Chỉnh pH = 8 bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M.
- Hấp tiệt trùng.
- Giữ 4oC sử dụng trong 6 tháng.
Phụ lục 4: Dung dịch RNase A.
- RNase A 10 mg/ml
- Hòa tan trong nước cất siêu sạch.
- Giữ -20oC, chỉ nên sử dụng một lần sau khi rã đông.
Phụ lục 5: Dung dịch NaCl 1,2 M.
- NaCl 1,2 mol/l
- Hòa tan trong nước cất siêu sạch.
- Hấp tiệt trùng.
- Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
91
91
Phụ lục 6: Dung dịch ethanol 70%.
- C2H5OH 70 %.
Phụ lục 7: Potassium acetate 3 M, pH 5,2
- Potassium acetate 3 mol/l
- Hòa tan trong nước siêu sạch.
- Hấp tiệt trùng
- Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Phụ lục 8: Kết quả đo OD các quy trình ly trích
Kết quả thí nghiệm lần 1:
Quy trình Thông số Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4
1 OD260nm/OD280nm 1.524 1.88 1.305 1.679
Nồng độ DNA (µg) 1.824 1.416 1.683 1.923
2 OD260nm/OD280nm 1.888 1.678 1.825 1.731
Nồng độ DNA (µg) 6.06 3.135 5.787 3.276
3 OD260nm/OD280nm 1.84 2.08 1.68 1.8
Nồng độ DNA (µg) 10.626 8.769 15.237 10.284
Kết quả thí nghiệm lần 2:
Quy trình Thông số Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4
1 OD260nm/OD280nm 1.254 1.73 1.872 1.847
Nồng độ DNA (µg) 2.208 1.017 1.539 1.191
2 OD260nm/OD280nm 1.848 1.875 1.696 1.594
Nồng độ DNA (µg) 7.674 6.756 5.856 4.389
3 OD260nm/OD280nm 1.86 1.78 2.1 1.96
Nồng độ DNA (µg) 13.155 11.559 11.205 10.803
92
92
Kết quả thí nghiệm lần 3:
Quy trình Thông số Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4
1 OD260nm/OD280nm 1.815 1.509 1.667 1.864
Nồng độ DNA (µg) 1.503 2.286 2.691 1.73
2 OD260nm/OD280nm 1.245 1.208 1.755 1.697
Nồng độ DNA (µg) 4.134 5.022 3.375 5.0505
3 OD260nm/OD280nm 1.81 1.84 1.79 1.82
Nồng độ DNA (µg) 10.767 10.911 11.268 11.352
93
93
Phụ lục 9: Kết quả phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I
Đợt 1:
PCR Quantification with Melt Curve Report
PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data
Current Date: 25-Aug-05 06:24 PM
Data generated on: 28-Jul-05 at 12:47 PM.
Optical data file name: Data 28-Jul-05 1247-SYBR Green 35S-GMO.odm
Plate Setup file used: SYBR-Green 35S.psm
Protocol file used: SYBR Green-35S.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 03:00
Cycle 2: ( 50X)
Step 1: 95.0ºC for 00:25
Step 2: 62.0ºC for 00:30
Step 3: 72.0ºC for 00:45
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 72.0ºC for 07:00
Cycle 4: ( 80X)
Step 1: 55.0ºC for 00:10
Increase setpoint temperature after cycle 2 by 0.5ºC
Melt curve data collection and analysis enabled.
Cycle 5: ( 1X)
Step 1: 4.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for SYBR-490
94
94
Data Analysis Parameters
Calculated threshold using the maximum curvature approach is 20.0.
Per-well baseline cycles have been determined automatically.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
PCR Quantification Spreadsheet Data for SYBR-490
Well Identifier Ct Setpoint
D02 Bt-176 1% 27.56
D10 N/A
Melt Curve Graph for SYBR-490
Melt Curve Analysis Parameters
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Threshold for automatic peak detection is set at 1.00.
Melt Curve Analysis Spreadsheet Data for SYBR-490
Well Well Identifier Peak ID Melt Temp Beg. Temp End Temp Peak Descriptor
D2 Bt-176 1% D2.1 86.5 80.5 91.5
D2.2 77.0 74.5 80.0
D2.3 73.0 72.5 74.0
D2.4 70.0 69.5 72.5
D2.5 68.0 66.5 69.0
D2.6 64.5 57.0 66.0
D10 D10.1 60.0 55.0 62.0
95
95
Đợt 2:
PCR Quantification with Melt Curve Report
PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data
Current Date: 25-Aug-05 06:29 PM
Data generated on: 05-Aug-05 at 03:35 PM.
Optical data file name: Data 05-Aug-05 1505 SYBR Green -dot 5-3.odm
Plate Setup file used: SYBR Green 35S dot 5 5-8-0518.psm
Protocol file used: SYBR Green-35S-2.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 01:30
Cycle 2: ( 50X)
Step 1: 95.0ºC for 00:25
Step 2: 62.0ºC for 00:30
Step 3: 72.0ºC for 00:45
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 72.0ºC for 07:00
Cycle 4: ( 80X)
Step 1: 55.0ºC for 00:10
Increase setpoint temperature after cycle 2 by 0.5ºC
Melt curve data collection and analysis enabled.
Cycle 5: ( 1X)
Step 1: 15.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for SYBR-490
Data Analysis Parameters
96
96
Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 68.8.
User selected baseline cycles are 2 to 10.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
PCR Quantification Spreadsheet Data for SYBR-490
Well Identifier Ct Setpoint
D02 B1 20.62
F07 B10 24.04
D06 B11 41.04
D04 B2 16.96
B04 B3 N/A
D10 B4 22.22
B06 B5 N/A
F03 B6 21.15
F05 B7 22.22
F09 B9 N/A
Melt Curve Graph for SYBR-490
Melt Curve Analysis Parameters
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Threshold for automatic peak detection is set at 1.00.
Melt Curve Analysis Spreadsheet Data for SYBR-490
Well Well Identifier Peak ID Melt Temp Beg. Temp End Temp Peak Descriptor
B4 B3 B4.1 62.5 60.5 68.0
B4.2 59.0 55.5 60.5
B6 B5 B6.1 91.5 89.5 93.5
B6.2 86.0 85.5 88.0
B6.3 83.0 77.5 85.5
B6.4 75.0 74.0 77.0
B6.5 71.0 69.0 73.0
B6.6 67.5 66.5 68.5
B6.7 64.0 62.5 66.0
B6.8 60.5 56.0 62.0
D2 B1 D2.1 86.5 78.0 91.5
D2.2 69.0 67.5 70.0
D2.3 66.5 64.5 67.0
D2.4 62.5 62.0 63.5
D2.5 59.5 56.5 61.0
D4 B2 D4.1 93.5 90.0 94.5
D4.2 86.5 82.5 89.5
97
97
D4.3 81.5 78.5 82.0
D4.4 74.0 73.0 77.0
D4.5 71.0 69.5 72.0
D4.6 67.0 65.0 69.0
D4.7 62.0 60.0 62.5
D6 B11 D6.1 92.5 92.0 94.5
D6.2 86.0 81.0 91.0
D6.3 79.0 76.0 80.0
D6.4 73.5 73.0 75.5
D6.5 71.0 69.5 72.0
D6.6 68.0 67.0 69.0
D6.7 65.0 61.0 66.5
D6.8 59.5 56.5 60.5
D10 B4 D10.1 86.5 82.0 91.0
D10.2 79.0 77.0 81.5
D10.3 72.0 70.0 73.5
D10.4 67.0 65.5 69.0
D10.5 64.5 61.0 65.0
D10.6 60.0 57.0 61.0
F3 B6 F3.1 86.0 82.0 89.5
F3.2 79.5 77.5 81.5
F3.3 73.5 71.5 75.5
F3.4 69.0 65.5 70.5
F3.5 63.0 62.0 65.0
F3.6 59.5 55.0 60.5
F5 B7 F5.1 86.0 79.0 92.5
F5.2 77.0 75.0 77.5
F5.3 72.0 71.0 74.5
F5.4 65.0 62.5 69.0
F5.5 59.5 55.5 62.0
F7 B10 F7.1 86.0 77.5 90.0
F7.2 72.5 71.0 74.5
F7.3 67.5 66.0 70.5
F7.4 63.5 62.0 65.5
F7.5 60.5 56.5 61.5
F9 B9 F9.1 83.0 81.0 90.0
F9.2 78.0 76.0 80.5
F9.3 74.0 73.5 75.0
F9.4 72.0 70.0 73.0
F9.5 66.5 64.0 68.5
F9.6 62.0 55.0 63.5
98
98
Đợt 3:
PCR Standard Curve Report
with PCR Amp Cycle Graph
PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data
Current Date: 29-Aug-05 04:11 PM
Data generated on: 17-Aug-05 at 03:21 PM.
Optical data file name: Data 17-Aug-05 1520 SYBR Dot 6-2-bao cao.odm
Plate Setup file used: SYBR Green I dot 6 17-7-0522.psm
Protocol file used: SYBR Green-35S-2.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 01:30
Cycle 2: ( 50X)
Step 1: 95.0ºC for 00:25
Step 2: 62.0ºC for 00:30
Step 3: 72.0ºC for 00:45
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 72.0ºC for 07:00
Cycle 4: ( 80X)
Step 1: 55.0ºC for 00:10
Increase setpoint temperature after cycle 2 by 0.5ºC
Melt curve data collection and analysis enabled.
Cycle 5: ( 1X)
Step 1: 15.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for SYBR-490
99
99
Standard Curve Graph for SYBR-490
Data Analysis Parameters
Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 18.2.
User selected baseline cycles are 2 to 24.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Standard Curve Spreadsheet Data for SYBR-490 Units: copy number
Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD
Point
B02 Standard ST 35S 1 22.99 3.709 5.12E+03 5.12E+03 N/A 22.99 N/A
B03 Standard ST 35S 2 24.32 2.806 6.40E+02 6.40E+02 N/A 24.32 N/A
B04 Standard ST 35S 3 25.26 1.903 8.00E+01 8.00E+01 N/A 25.26 N/A
D02 Unknown Mau 1 copy 2 27.58 0.106 1.28E+00 8.88E+00 1.08E+01 26.88 9.86E-01
F02 Unknown Mau 1 copy 2 26.18 1.217 1.65E+01 8.88E+00 1.08E+01 26.88 9.86E-01
Melt Curve Graph for SYBR-490
100
100
Melt Curve Analysis Parameters
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Threshold for automatic peak detection is set at 1.00.
Melt Curve Analysis Spreadsheet Data for SYBR-490
Well Well Identifier Peak ID Melt Temp Beg. Temp End Temp Peak Descriptor
B2 ST 35S B2.1 86.0 80.0 90.0
B2.2 74.5 74.0 76.5
B2.3 73.0 70.5 73.5
B2.4 68.0 66.5 70.0
B2.5 65.0 64.0 66.0
B2.6 58.5 55.0 63.5
B3 ST 35S B3.1 86.0 76.0 89.5
B3.2 73.5 73.0 75.5
B3.3 69.5 68.5 72.5
B3.4 65.5 64.0 68.0
B3.5 58.5 55.0 61.5
B4 ST 35S B4.1 86.5 79.0 91.0
B4.2 77.0 75.0 78.5
B4.3 71.5 70.0 74.5
B4.4 68.0 66.5 69.5
B4.5 64.5 61.5 65.5
B4.6 59.0 56.5 61.0
D2 mau 1 copy D2.1 86.5 77.5 91.0
D2.2 75.0 73.0 76.0
D2.3 71.5 70.5 72.5
D2.4 67.0 66.0 69.5
D2.5 58.5 55.5 61.0
F2 mau 1 copy F2.1 85.5 76.0 90.0
F2.2 73.5 70.5 75.5
F2.3 68.0 67.0 70.0
F2.4 65.0 64.5 66.5
F2.5 62.5 61.5 64.0
F2.6 58.5 56.5 61.0
101
101
Phụ lục 10: Kết quả chạy phản ứng Real-Time PCR với mẫu dò Taqman
Đợt 1: Đƣờng chuẩn p35S
PCR Standard Curve Report
with PCR Amp Cycle Graph
PCR Base Line Subtracted Data
Current Date: 20-Aug-05 06:17 PM
Data generated on: 22-Jul-05 at 06:15 PM.
Optical data file name: Data 22-Jul-05 1815-Truong-35S-dot 1-sua2.odm
Plate Setup file used: GMO-35S.psm
Protocol file used: GMO-35S.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 10:00
Cycle 2: ( 45X)
Step 1: 95.0ºC for 00:15
Step 2: 60.0ºC for 01:00
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 4.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
Standard Curve Graph for FAM-490
102
102
Data Analysis Parameters
Calculated threshold using the maximum correlation coefficient approach is 33.9.
User selected baseline cycles are 2 to 20.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number
Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD
Point
E02 Standard Stan Corn-Ref 5 26.83 3.709 5.12E+03 5.12E+03 N/A 26.83 N/A
E04 Standard Stan Corn-Ref 6 30.04 2.806 6.40E+02 6.40E+02 N/A 30.04 N/A
E06 Standard Stan Corn-Ref 7 33.07 1.903 8.00E+01 8.00E+01 N/A 33.07 N/A
Đợt 2: Định lƣợng bắp chuyển gen Bt 176 1% (lần 1)
Promoter 35S:
PCR Standard Curve Report
with PCR Amp Cycle Graph
PCR Base Line Subtracted Data
Current Date: 19-Aug-05 12:01 PM
Data generated on: 22-Jul-05 at 06:15 PM.
Optical data file name: Data 22-Jul-05 1815-Truong-35S-dot 1-sua2.odm
Plate Setup file used: GMO-35S.psm
Protocol file used: GMO-35S.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
Cycle 1: ( 1X)
103
103
Step 1: 95.0ºC for 10:00
Cycle 2: ( 45X)
Step 1: 95.0ºC for 00:15
Step 2: 60.0ºC for 01:00
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 4.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
Standard Curve Graph for FAM-490
Data Analysis Parameters
Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 67.5.
User selected baseline cycles are 2 to 20.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number
Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD
Point
E02 Standard Stan Corn-Ref 5 27.88 3.709 5.12E+03 5.12E+03 N/A 27.88 N/A
E04 Standard Stan Corn-Ref 6 31.35 2.806 6.40E+02 6.40E+02 N/A 31.35 N/A
E06 Standard Stan Corn-Ref 7 34.25 1.903 8.00E+01 8.00E+01 N/A 34.25 N/A
E08 Standard Stan Corn-Ref 8 36.22 1.000 1.00E+01 1.00E+01 N/A 36.22 N/A
E11 Unknown Bt 10 32.59 2.302 2.00E+02 2.00E+02 N/A 32.59 N/A
104
104
Gen tham chiếu:
PCR Standard Curve Report
with PCR Amp Cycle Graph
PCR Base Line Subtracted Data
Current Date: 19-Aug-05 12:05 PM
Data generated on: 22-Jul-05 at 06:15 PM.
Optical data file name: Data 22-Jul-05 1815-Truong-35S-dot 1-sua2.odm
Plate Setup file used: GMO-35S.psm
Protocol file used: GMO-35S.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 10:00
Cycle 2: ( 45X)
Step 1: 95.0ºC for 00:15
Step 2: 60.0ºC for 01:00
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 4.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
Standard Curve Graph for FAM-490
105
105
Data Analysis Parameters
Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 67.5.
User selected baseline cycles are 2 to 20.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number
Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD
Point
B02 Standard Stan Corn-Ref 1 28.29 4.612 4.10E+04 4.10E+04 N/A 28.29 N/A
B04 Standard Stan Corn-Ref 2 30.26 3.709 5.12E+03 5.12E+03 N/A 30.26 N/A
B06 Standard Stan Corn-Ref 3 32.97 2.806 6.40E+02 6.40E+02 N/A 32.97 N/A
B08 Standard Stan Corn-Ref 4 35.43 1.903 8.00E+01 8.00E+01 N/A 35.43 N/A
B11 Unknown Bt 9 28.93 4.308 2.03E+04 2.03E+04 N/A 28.93 N/A
Đợt 3: Định lƣợng bắp chuyển gen Bt 176 1% (lần 2)
Promoter 35S:
PCR Standard Curve Report
with PCR Amp Cycle Graph
PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data
Current Date: 19-Aug-05 12:17 PM
Data generated on: 16-Aug-05 at 04:58 PM.
Optical data file name: Data 16-Aug-05 1658 taqman dot 3-35S -Bt176.odm
Plate Setup file used: 35S TAQMAN DOT 3.psm
Protocol file used: GMO-35S.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 10:00
Cycle 2: ( 45X)
Step 1: 95.0ºC for 00:15
Step 2: 60.0ºC for 01:00
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 4.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
106
106
Standard Curve Graph for FAM-490
Data Analysis Parameters
Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 21.8.
Per-well baseline cycles have been determined automatically.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number
Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD
Point
E02 Standard ST 35S 5 23.85 3.709 5.12E+03 5.12E+03 N/A 23.85 N/A
E03 Standard ST 35S 6 26.55 2.806 6.40E+02 6.40E+02 N/A 26.55 N/A
E04 Standard ST 35S 7 29.13 1.903 8.00E+01 8.00E+01 N/A 29.13 N/A
E05 Standard ST 35S 8 31.67 1.000 1.00E+01 1.00E+01 N/A 31.67 N/A
F02 Unknown Bt 19 28.56 2.092 1.24E+02 1.24E+02 N/A 28.56 N/A
Gen tham chiếu:
PCR Standard Curve Report
with PCR Amp Cycle Graph
PCR Base Line Subtracted Data
Current Date: 19-Aug-05 12:22 PM
Data generated on: 16-Aug-05 at 04:58 PM.
Optical data file name: Data 16-Aug-05 1658 taqman dot 3-DC Bt 176.odm
Plate Setup file used: 35S TAQMAN DOT 3.psm
Protocol file used: GMO-35S.tmo
Sample volume: 25.00 ul
107
107
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 10:00
Cycle 2: ( 45X)
Step 1: 95.0ºC for 00:15
Step 2: 60.0ºC for 01:00
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 4.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
Standard Curve Graph for FAM-490
Data Analysis Parameters
Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 21.2.
User selected baseline cycles are 2 to 20.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number
Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD
Point
B02 Standard ST CR 1 23.31 4.612 4.10E+04 4.10E+04 N/A 23.31 N/A
B03 Standard ST CR 2 25.71 3.709 5.12E+03 5.12E+03 N/A 25.71 N/A
B04 Standard ST CR 3 27.04 2.806 6.40E+02 6.40E+02 N/A 27.04 N/A
108
108
B05 Standard ST CR 4 30.64 1.903 8.00E+01 8.00E+01 N/A 30.64 N/A
C02 Unknown Bt 3 24.51 4.097 1.25E+04 1.25E+04 N/A 24.51 N/A
Đợt 4: Độ nhạy của phản ứng
PCR Standard Curve Report
with PCR Amp Cycle Graph
PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data
Current Date: 30-Aug-05 06:46 AM
Data generated on: 22-Jul-05 at 06:15 PM.
Optical data file name: Data 22-Jul-05 1815-Truong-35S-dot 1-do nhay.odm
Plate Setup file used: GMO-35S.psm
Protocol file used: GMO-35S.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 10:00
Cycle 2: ( 45X)
Step 1: 95.0ºC for 00:15
Step 2: 60.0ºC for 01:00
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 4.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
Standard Curve Graph for FAM-490
109
109
Data Analysis Parameters
Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 13.7.
User selected baseline cycles are 2 to 24.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number
Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD
Point
E02 Standard Stan Corn-Ref 5 25.73 3.709 5.12E+03 5.12E+03 N/A 25.73 N/A
E04 Standard Stan Corn-Ref 6 28.57 2.806 6.40E+02 6.40E+02 N/A 28.57 N/A
E06 Standard Stan Corn-Ref 7 31.65 1.903 8.00E+01 8.00E+01 N/A 31.65 N/A
E08 Standard Stan Corn-Ref 8 33.12 1.000 1.00E+01 1.00E+01 N/A 33.12 N/A
F08 Unknown Mau 1 copy 4 36.22 0.047 1.11E+00 1.25E+00 1.91E-01 36.09 1.87E-01
F10 Unknown Mau 1 copy 4 35.96 0.141 1.38E+00 1.25E+00 1.91E-01 36.09 1.87E-01
Đợt 5: Định lƣợng các mẫu thí nghiệm (lần 1)
Promoter 35S:
PCR Standard Curve Report
with PCR Amp Cycle Graph
PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data
Current Date: 11-Aug-05 03:43 PM
Data generated on: 22-Jul-05 at 06:15 PM.
Optical data file name: Data 22-Jul-05 1815-Truong-35S-dot 1-sua.odm
Plate Setup file used: GMO-35S.psm
Protocol file used: GMO-35S.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
110
110
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 10:00
Cycle 2: ( 45X)
Step 1: 95.0ºC for 00:15
Step 2: 60.0ºC for 01:00
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 4.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
Standard Curve Graph for FAM-490
Data Analysis Parameters
Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 52.2.
User selected baseline cycles are 2 to 24.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number
Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD
Point
E02 Standard Stan Corn-Ref 5 27.43 3.709 5.12E+03 5.12E+03 N/A 27.43 N/A
E04 Standard Stan Corn-Ref 6 30.76 2.806 6.40E+02 6.40E+02 N/A 30.76 N/A
E06 Standard Stan Corn-Ref 7 33.65 1.903 8.00E+01 8.00E+01 N/A 33.65 N/A
E08 Standard Stan Corn-Ref 8 35.89 1.000 1.00E+01 1.00E+01 N/A 35.89 N/A
F02 Unknown B1 5 27.38 3.808 6.42E+03 5.94E+03 6.84E+02 27.49 1.57E-01
F04 Unknown B1 5 27.61 3.737 5.46E+03 5.94E+03 6.84E+02 27.49 1.57E-01
F06 Unknown B2 6 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
F08 Unknown B2 6 29.96 2.985 9.65E+02 9.65E+02 N/A 29.96 N/A
G02 Unknown B7 7 27.71 3.704 5.06E+03 4.90E+03 2.23E+02 27.75 6.18E-02
G04 Unknown B7 7 27.80 3.676 4.75E+03 4.90E+03 2.23E+02 27.75 6.18E-02
111
111
Gen tham chiếu:
PCR Standard Curve Report
with PCR Amp Cycle Graph
PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data
Current Date: 11-Aug-05 04:02 PM
Data generated on: 22-Jul-05 at 06:15 PM.
Optical data file name: Data 22-Jul-05 1815-Truong-35S-dot 1-2.odm
Plate Setup file used: GMO-35S.psm
Protocol file used: GMO-35S.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 10:00
Cycle 2: ( 45X)
Step 1: 95.0ºC for 00:15
Step 2: 60.0ºC for 01:00
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 4.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
Standard Curve Graph for FAM-490
112
112
Data Analysis Parameters
Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 72.9.
User selected baseline cycles are 2 to 20.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number
Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD
Point
B02 Standard Stan Corn-Ref 1 28.55 4.612 4.10E+04 4.10E+04 N/A 28.55 N/A
B04 Standard Stan Corn-Ref 2 30.62 3.709 5.12E+03 5.12E+03 N/A 30.62 N/A
B06 Standard Stan Corn-Ref 3 33.22 2.806 6.40E+02 6.40E+02 N/A 33.22 N/A
B08 Standard Stan Corn-Ref 4 35.84 1.903 8.00E+01 8.00E+01 N/A 35.84 N/A
C02 Unknown B1 1 27.69 4.870 7.42E+04 9.61E+04 3.09E+04 27.42 3.86E-01
C04 Unknown B1 1 27.14 5.072 1.18E+05 9.61E+04 3.09E+04 27.42 3.86E-01
C06 Unknown B2 2 37.03 1.420 2.63E+01 8.38E+01 8.13E+01 36.04 1.40E+00
C08 Unknown B2 2 35.06 2.150 1.41E+02 8.38E+01 8.13E+01 36.04 1.40E+00
D02 Unknown B7 3 28.32 4.636 4.32E+04 4.35E+04 3.33E+02 28.32 9.02E-03
D04 Unknown B7 3 28.31 4.640 4.37E+04 4.35E+04 3.33E+02 28.32 9.02E-03
Đợt 6: Định lƣợng các mẫu thí nghiệm (lần 2)
Promoter 35S:
PCR Standard Curve Report
with PCR Amp Cycle Graph
PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data
Current Date: 11-Aug-05 05:04 PM
Data generated on: 03-Aug-05 at 09:21 PM.
Optical data file name: Data 03-Aug-05 2121 TAQMAN DOT 2-35S-MAU.odm
Plate Setup file used: Taqman 35S dot 2 3-8-05.psm
Protocol file used: GMO-35S.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
113
113
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 10:00
Cycle 2: ( 45X)
Step 1: 95.0ºC for 00:15
Step 2: 60.0ºC for 01:00
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 4.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
Standard Curve Graph for FAM-490
Data Analysis Parameters
Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 65.7.
User selected baseline cycles are 2 to 20.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number
Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD
Point
E02 Standard St 35S 5-8 5 26.77 3.709 5.12E+03 5.12E+03 N/A 26.77 N/A
E04 Standard St 35S 5-8 6 30.13 2.806 6.40E+02 6.40E+02 N/A 30.13 N/A
E06 Standard St 35S 5-8 7 32.62 1.903 8.00E+01 8.00E+01 N/A 32.62 N/A
E08 Standard St 35S 5-8 8 35.24 1.000 1.00E+01 1.00E+01 N/A 35.24 N/A
F02 Unknown B4 8 26.35 3.920 8.32E+03 7.88E+03 6.32E+02 26.43 1.08E-01
F03 Unknown B4 8 26.51 3.871 7.43E+03 7.88E+03 6.32E+02 26.43 1.08E-01
F04 Unknown B1 9 26.60 3.842 6.95E+03 8.16E+03 1.71E+03 26.39 2.84E-01
F05 Unknown B1 9 26.19 3.972 9.38E+03 8.16E+03 1.71E+03 26.39 2.84E-01
F06 Unknown B2 10 28.93 3.085 1.22E+03 9.45E+02 3.85E+02 29.33 5.63E-01
F07 Unknown B2 10 29.73 2.828 6.73E+02 9.45E+02 3.85E+02 29.33 5.63E-01
F08 Unknown B6 11 34.16 1.395 2.48E+01 3.33E+01 1.20E+01 33.81 4.95E-01
F09 Unknown B6 11 33.46 1.622 4.18E+01 3.33E+01 1.20E+01 33.81 4.95E-01
114
114
F10 Unknown B7 12 27.36 3.594 3.93E+03 4.16E+03 3.22E+02 27.29 1.04E-01
F11 Unknown B7 12 27.21 3.642 4.39E+03 4.16E+03 3.22E+02 27.29 1.04E-01
G02 Unknown B10 13 26.05 4.019 1.05E+04 7.24E+03 4.56E+03 26.69 9.09E-01
G03 Unknown B10 13 27.33 3.603 4.01E+03 7.24E+03 4.56E+03 26.69 9.09E-01
G04 Unknown B11 14 24.99 4.362 2.30E+04 1.77E+04 7.47E+03 25.40 5.83E-01
G05 Unknown B11 14 25.81 4.095 1.25E+04 1.77E+04 7.47E+03 25.40 5.83E-01
Gen tham chiếu:
PCR Standard Curve Report
with PCR Amp Cycle Graph
PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data
Current Date: 20-Aug-05 03:17 PM
Data generated on: 03-Aug-05 at 09:21 PM.
Optical data file name: Data 03-Aug-05 2121 TAQMAN DOT 2-GEN DC.odm
Plate Setup file used: Taqman 35S dot 2 3-8-05.psm
Protocol file used: GMO-35S.tmo
Sample volume: 25.00 ul
Hot Start? No
Well factor collection: Experimental Plate
Comments
Protocol
Cycle 1: ( 1X)
Step 1: 95.0ºC for 10:00
Cycle 2: ( 45X)
Step 1: 95.0ºC for 00:15
Step 2: 60.0ºC for 01:00
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3: ( 1X)
Step 1: 4.0ºC HOLD
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
115
115
Standard Curve Graph for FAM-490
Data Analysis Parameters
Calculated threshold using the maximum correlation coefficient approach is 14.3.
User selected baseline cycles are 2 to 19.
Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle.
Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off.
Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number
Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD
Point
B02 Standard St CR 1-4 1 22.19 4.612 4.10E+04 4.10E+04 N/A 22.19 N/A
B04 Standard St CR 1-4 2 24.81 3.709 5.12E+03 5.12E+03 N/A 24.81 N/A
B06 Standard St CR 1-4 3 26.55 2.806 6.40E+02 6.40E+02 N/A 26.55 N/A
B08 Standard St CR 1-4 4 30.57 1.903 8.00E+01 8.00E+01 N/A 30.57 N/A
C02 Unknown B4 1 23.02 4.268 1.85E+04 1.29E+04 7.98E+03 23.63 8.57E-01
C03 Unknown B4 1 24.23 3.861 7.26E+03 1.29E+04 7.98E+03 23.63 8.57E-01
C04 Unknown B1 2 25.69 3.371 2.35E+03 2.59E+03 3.40E+02 25.57 1.70E-01
C05 Unknown B1 2 25.45 3.452 2.83E+03 2.59E+03 3.40E+02 25.57 1.70E-01
C06 Unknown B2 3 25.60 3.403 2.53E+03 4.46E+03 2.73E+03 25.00 8.47E-01
C07 Unknown B2 3 24.40 3.806 6.40E+03 4.46E+03 2.73E+03 25.00 8.47E-01
C08 Unknown B6 4 23.91 3.970 9.33E+03 9.27E+03 7.56E+01 23.92 1.05E-02
C09 Unknown B6 4 23.93 3.965 9.22E+03 9.27E+03 7.56E+01 23.92 1.05E-02
C10 Unknown B7 5 22.55 4.426 2.67E+04 1.52E+04 1.62E+04 23.82 1.79E+00
C11 Unknown B7 5 25.09 3.575 3.76E+03 1.52E+04 1.62E+04 23.82 1.79E+00
D02 Unknown B10 6 24.92 3.630 4.26E+03 4.27E+03 1.07E+01 24.92 3.23E-03
D03 Unknown B10 6 24.92 3.631 4.28E+03 4.27E+03 1.07E+01 24.92 3.23E-03
D04 Unknown B11 7 30.59 1.726 5.32E+01 3.31E+02 3.93E+02 29.01 2.23E+00
D05 Unknown B11 7 27.44 2.785 6.09E+02 3.31E+02 3.93E+02 29.01 2.23E+00
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- Khoa luan tot nghiep NGUYEN HUU TRUONG.pdf