Khóa luận Công nghệ sản xuất nấm men bánh mì

ng môi trường sự trao đổi chất của tế bào bị vi phạm và có thể không thể tổng hợp được protein. Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amon và lưu huỳnh.Ở điều kiện hiếu khí (NH4)2SO4 sẽ hòa tan trong các hợp chất tương tự chất béo và tích tụ ở trong đó. Trong môi trường với hàm lượng lưu huỳnh nhỏ sẽ làm tăng sự nảy chồi của nấm men, nhưng ở nồng độ 1mg/l lưu huỳnh đã kiềm hãm quá trình này. Các ion kali, canxi, magie cũng cần có trong môi trường nuôi cấy. Thông thường ion kali được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc sunfat, còn ion Ca2+ và Mg2+ thường có đủ trong nước sinh hoạt. Song nước nếu giàu hai ion đó thường gọi là nước cứng, nếu để nước cứng nuôi cấy sẽ có ảnh hưởng và hiệu quả không tốt đến cả quá trình. Các nguyên tố vi lượng cũng rất cần để quá trình sinh lý trong tế bào nấm men được xảy ra bình thường. Các nguyên tố vi lượng là: Mn, Cu, Fe, Zn, Mo, Bo, Li, Rb, Ni, Co,… Các nguyên tố này chỉ cần một lượng rất nhỏ (vi lượng). Trong nước sinh hoạt thường có mặt các ion này. Khi pha chế môi trường ta có thể không cần bổ sung các muối của chúng, nhưng trong trường hợp đặc biệt nào đó sẽ bổ sung nguyên tố cần thiết ở dạng muối của chất nào đó vào môi trường. Bảng 1.2: Các chất khoáng cần thiết cho nấm men Chất khoáng Hàm lượng (g/l) K2HPO4 1 – 2 KH2PO4 1 – 2 MgSO4.7H2O 0,2 – 0,5 MgSO4.4H2O 0,02 – 0,1 FeSO4.7H2O 0,05 – 0,2 ZnSO4.7H2O 0,02 – 0,1 CuSO4.5H2O Na2SO4 0,01 – 0,02 CaCl2 0,02 – 0,05 Ÿ Vitamin và các chất sinh trưởng: Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các bazơ purin và pyrimidin. Những nhân tố sinh trưởng cơ bản của nấm men là các vitamin nhóm B: biotin (vitamin B7 hay H), acid pantotenic (B3), tiamin (B1), pyridoxine (B6)... Bảng 1.3: Chức năng của một số vitamin Vitamin Chức năng Biotin (H) Cacbonxyl hóa (cố định CO2) Vitamin B3 Oxi hóa pyruvat , trao đổi acid béo Vitamin B6 Trao đổi acid amin Vitamin B1 Chuyển hóa nhóm andehit (khử cacbonxyl pyruvat, oxi hóa acid α – keto) Bảng 1.4 Các chất sinh trưởng cần thiết cho nấm men : Chất sinh trưởng Hàm lượng (µg/ml) Inozit (B8) 5 Biotin (B7 hay H) 0,0001 B3 0,25 B1 1 B6 0,25 Acid nicotinic (B5 hay PP) 0,5 (Nguồn: Nấm men công nghệp – Lương Đức Phẩm) 1.2.3.8. Sinh trưởng và sinh sản của nấm men: p Sinh trưởng: Quá trình sinh trưởng của nấm men trải qua các pha: pha tiềm phục (pha lag), pha tăng trưởng (pha log), pha cân bằng và pha suy vong. Trong quá trình nuôi cấy nhằm đạt sinh khối tối đa ta cần rút ngắn pha lag. ŸPha lag (giai đoạn thích nghi): ở pha này nấm men chưa sinh sản do còn làm quen với môi trường, số lượng tế bào không tăng. ŸPha log là giai đoạn nấm men bắt đầu tăng trưởng về số lượng, tế bào bắt đầu nảy chồi mạnh và lên men. Mức độ phân chia cao nhất của nấm men tùy thuộc vào khả năng di truyền, nguồn gốc của môi trường và điều kiện cho chúng phát triển. ŸPha cân bằng: pha này được coi là pha cân bằng động của nấm men. Số lượng đạt cực đại và không thay đổi theo thời gian. ŸPha suy vong: Do các điều kiện bất lợi của môi trường như thiếu dinh dưỡng mà nấm men đi vào pha chết. Trong pha này số lượng quần thể giảm nhanh chóng do tế bào già bị chết và tự phân. Hình 1.8: Đường cong sinh trưởng của nấm men p Sinh sản: Nấm men có hai hình thức sinh sản: hữu tính (bằng bào tử) và vô tính (bằng nảy chồi hoặc phân cắt tế bào). Tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy tế bào nấm men sinh sản theo cách sinh sản vô tính hay hữu tính. Hình 1.9: Nảy chồi ở nấm men Saccharomyces cerevisiae chủ yếu sinh sản bằng hình thức nảy chồi.Các tế bào mẹ không chuyển trực tiếp các vật liệu vỏ sang tế bào con mà ở chổ các mấu chồi sẽ tổng hợp các vật liệu vỏ và tích tụ ở đây để chuyển sang cho tế bào con. Chỗ mấu chồi là các sẹo thường ở đầu cong nhất của tế bào (ở đó có thể tròn hoặc xoắn). 1.2.3.9. Vai trò của nấm men trong sản xuất bánh mì: Trong công nghệ sản xuất bánh mì, giai đoạn lên men bột mì đóng vai trò quyết định đến chất lượng bánh mì. Quá trình lên men được thực hiện bởi nấm men . Khi đó nấm men sẽ chuyển hóa đường có trong bột mì thành cồn và CO2 theo phương trình phản ứng sau: C6H12O6 nấm men 2C2H5OH + 2CO2 Chính CO2 sẽ là tác nhân làm bánh mì nở. Khi CO2 được tạo thành sẽ bị giữ lại trong các mạng gluten. Gluten trong bột mì là loại protein rất đặc biệt, chúng có tính chất đàn hồi và tạo mạng. Các protein khác không có đặc tính này. Khi nướng bánh mì ở nhiệt độ cao, CO2 sẽ làm tăng thể tích, mạng gluten sẽ căng ra và tạo thành những túi chứa CO2. Khi nhiệt cao hơn CO2 sẽ được thoát ra khỏi túi đó và tạo những lỗ xốp trong bánh, kết quả là bánh có độ xốp. Khả năng lên men càng mạnh, độ xốp của bánh càng nhiều, bánh càng nở và thể tích bánh càng tăng. Tuy nhiên không phải thể tích bánh lớn quyết định đến chất lượng của bánh mì. Mức độ tăng thể tích của bánh chỉ nói lên khả năng lên men bột mì của nấm men. Các nước sản xuất bánh mì có yêu cầu mức tăng thể tích rất khác nhau, điều này phụ thuộc vào thói quen khi sử dụng bánh mì của người dân ở các quốc gia. Trong sản xuất bánh mì hiện nay ở các nước châu Âu, người ta sử dụng ba dạng nấm men để làm nở bánh: Hình 1.10: Các sản phẩm nấm men bánh mì Ÿ Dạng nấm men lỏng Ÿ Dạng nấm men nhão (dạng paste) Ÿ Dạng nấm men khô p Nấm men dạng lỏng: Nấm men lỏng có ưu điểm là dễ sử dụng và có hoạt lực làm nở bánh rất cao. Tuy nhiên, nấm men lỏng cũng có nhược điểm rất lớn là khó bảo quản: thời gian sử dụng chỉ nằm trong giới hạn 24 giờ sau khi sản xuất. Chính vì thế, việc sản xuất và sử dụng nấm men dạng lỏng thường được tổ chức như một phân xưởng riêng trong những cơ sở sản xuất bánh mì mang tính chất tự cung tự cấp mà không mang tính chất thương phẩm bán trên thị trường. Nấm men lỏng là một dạng sản phẩm thu nhận được ngay sau khi quá trình lên men hiếu khí kết thúc. Người ta thu nhận dịch lên men có chứa sinh khối nấm men đang phát triển này để sản xuất bánh mì. khi sử dụng dịch nấm men này làm bánh mì, người ta thường phải sử dụng với khối lượng lớn (thường từ 1 – 10 % so với khối lượng bột sử dụng). Hiện nay nhiều cơ sở sản xuất bánh mì ở các nước châu Âu và châu Mỹ không sử dụng nấm men lỏng mà sử dụng chủ yếu nấm men dạng paste và dạng khô. p Nấm men dạng paste: Nấm men paste là khối nấm men thu được sau khi ly tâm nấm men lỏng. Nấm men paste thường có độ ẩm khoảng 70 – 75 % W. Nấm men paste thường có hoạt lực làm nở bánh kém hơn nấm men lỏng do quá trình ly tâm và thời gian kéo dài, nhiều tế bào nấm men bị chết. Nếu được bảo quản lạnh ở 4 – 70C ta có thể sử dụng nấm men paste trong khoảng 10 ngày. Ở Việt Nam, các cơ sở sản xuất bánh mì cũng thường sử dụng nấm men paste với liều lượng sử dụng khoảng 1 – 5 % tùy theo chất lượng nấm men. p Nấm men khô: Nấm men khô được sản xuất từ nấm men paste. Người ta sấy nấm men paste ở nhiệt độ < 400C hoặc sử dụng phương pháp sấy thăng hoa. Nấm men khô có độ ẩm < 10 %, thường có lực nở bột không cao nhưng có ưu điểm rất lớn là thời gian sử dụng rất lâu và dễ dàng vận chuyển. CHƯƠNG 2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT NẤM MEN BÁNH MÌ 2.1. Nguyên liệu dùng trong sản xuất nấm men bánh mì: Để sản xuất nấm men bánh mì chất lượng cao, người ta sử dụng các loại nguyên liệu sau: nước, nguồn hydratcacbon, hợp chất caramen, phức chất của phenol – Fe2+, melanoidin, melanin, nguồn phospho và nitơ, nguồn kali và magie. 2.1.1. Nước: Nước được xem là nguyên liệu chính trong quá trình sản xuất vì đây là công nghệ lên men chìm hiếu khí. Nước sử dụng trong sản xuất nấm men bánh mì là nước sử dụng trong sinh hoạt (nước máy). Trường hợp sử dụng nước giếng hoặc nước bề mặt khác, phải được xử lý để chất lượng các loại nước này đạt chất lượng nước dùng cho sinh hoạt. v Yêu cầu của nước: Ÿ Có độ cứng từ 4 – 80 (10 cứng tương đương 10 mg CaO / lít) Ÿ Không màu, không mùi, không vị Ÿ Các chất sau không được quá mức cho phép (mg / l): Cl- < 0,5; SO42- < 80; As < 0,05; Zn < 5; Cu < 3; FeO <3 Ÿ E.coli < 20 tế bào 2.1.2. Nguồn hydratcacbon: Hydratcacbon sử dụng trong sản xuất nấm men bánh mì là đường có trong rỉ mật (rỉ đường). Như vậy rỉ đường là nguyên liệu chính thứ hai dùng trong sản xuất nấm men bánh mì. Rỉ đường là một loại thứ phẩm của công nghiệp đường thu được ở công đoạn kết tinh đường. Có hai loại rỉ đường: rỉ đường mía và rỉ đường của củ cái đường. Ở nước ta chỉ có rỉ đường mía. Năm 2000, nước ta đã trồng được khoảng 10 – 12 triệu tấn mía và được đưa vào sản xuất đường. Như vây, ta có khoảng 350 đến 420 ngàn tấn rỉ đường. Thành phần của rỉ đường phụ thuộc vào giống mía, thổ nhưỡng, điều kiện canh tác và công nghệ sản xuất đường. Lượng chất khô trong rỉ đường là 70 – 75 % hoặc 80 – 85 %, phần còn lại là nước. Trong sản xuất nấm men bánh mì, ngoài hàm lượng đường ra, người ta còn quan tâm đến ba vấn đề có ảnh hưởng quyết định chất lượng nấm men bánh mì: Ÿ Hàm lượng biotin (vitamin H) Ÿ Hệ keo Ÿ Màu sẫm của rỉ đường Hình 2.1: Rỉ đường Biotin là một loại vitamin có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của nấm men. Đối với nấm men, biotin được coi như chất kích thích sinh trưởng rất tốt. Trong hai loại rỉ đường trên thì rỉ đường từ quá trình sản xuất đường mía có chứa lượng biotin cao hơn rất nhiều so với rỉ đường từ củ cải (nếu sử dụng rỉ đường củ cải để nuôi cấy phải bổ sung thêm biotin: 100 – 200 mg / 1 tấn nguyên liệu). Chính vì vậy nhiều nước không trồng được mía phải nhập rỉ đường từ mía và sau khi xử lý, người ta trộn hai loại rỉ đường lại với nhau để đảm bảo hàm lượng biotin cho sự phát triển của nấm men. Bảng 2.1: Thành phần hóa học của hai loại rỉ đường STT Thành phần Đơn vị tính Hàm lượng rỉ đường Củ cải Đường mía 1 Đường tổng số % 48 – 52 48 – 56 2 Chất hữu cơ khác % 12 – 17 9,0 – 12 3 Protein (N x 6.25) % 6.0 – 10 2 – 4 4 K % 2,0 – 7,0 1,5 – 5,0 5 Ca % 0,1 – 0,5 0,4 – 0,8 6 Mg % 0,09 0,06 7 P % 0,02 – 0,07 0,6 – 2,0 8 Biotin (vitamin H) mg/kg 0,02 – 0,15 1,0 – 3,0 9 Aciad patotenic (B3) mg/kg 50 – 110 15 – 55 10 Inozitol mg/kg 5000 – 8000 2500 – 6000 11 Thyamin mg/kg 1,3 1,8 (Nguồn: Công nghệ vi sinh tập 2 – Nguyễn Đức Lượng) Hàm lượng đường khá cao nên khi tiến hành lên men phải pha loãng tới nồng độ thích hợp cho sự phát triển của nấm men. Hệ keo có trong rỉ đường được hình thành bởi protein và pectin. Hệ keo thường tạo ra độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men. Nếu hệ keo không bị phá đi sẽ gây ra hiện tượng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém. Hiệu suất sinh khối thu nhận được rất thấp. Khó khăn thứ hai gặp trong quá trình sản xuất nếu rỉ đường không loại bỏ hết hệ keo nói trên là sản phẩm sinh khối nấm men thu được sẽ bị bám đầy các chất keo này, ta rất khó làm sạch sản phẩm. Màu sẫm có trong rỉ đường là màu được tạo ra trong quá trình chế biến đường. Màu này sẽ bám vào sinh khối nấm men và tạo cho nấm men có màu vàng thẫm. Màu này không phải là màu tự nhiên của nấm men. Do đó, trước khi sử dụng rỉ đường như là thành phần chứa trong môi trường nuôi cấy người ta phải loại bỏ các chất màu tồn tại trong rỉ đường. Các chất có trong rỉ đường bao gồm: - Hợp chất caramen: là hợp chất được tạo ra do sự mất nước của đường saccharose dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Khi pH của dung dịch đường ổn định, cường độ màu sẽ tỷ lệ thuận với nhiệt độ. - Phức chất của phenol – Fe+2: phức chất này có màu vàng xanh. Hợp chất này không bị loại hết trong giai đoạn làm sạch nước mía và tồn tại trong rỉ đường. Rỉ đường là chất dinh dưỡng khá lý tưởng cho các vi sinh vật vì vậy rất dễ bị nhiễm vi sinh vật lạ. Do đó chất lượng rỉ cũng rất dễ bị thay đổi theo thời gian bảo quản. 2.1.3. Nguồn phospho và nitơ: Trong sản xuất nấm men bánh mì người ta thường sử dụng urea như nguồn chứa nitơ và diamonphosphat (DAP) như nguồn chứa nitơ và phospho. Ngoài ra, có rất nhiều hợp chất vô cơ khác của phospho và nitơ đều có thể sử dụng để nuôi cấy nấm men bánh mì. Tuy nhiên, hai nguồn nitơ và diamonphosphat là những loại phân vô cơ được sử dụng nhiều trong nông nghiệp, dễ mua và rẻ hơn rất nhiều so với các chất khác nên chúng được sử dụng nhiều trong sản xuất nấm men bánh mì. Lượng DAP sử dụng là 0,15 – 0,3 %. Hình 2.2: Nguồn DAP và Urea Trước khi sử dụng DAP và urea, người ta thường hòa tan chúng trong nước. Urea dễ hòa tan nhưng lại làm giảm nhiệt độ nước, DAP rất khó hòa tan vì trong khi tạo ra DAP người ta có sử dụng một số chất phụ gia không tan. Ngoài DAP và ure như nguồn cung cấp nitơ người ta còn sử dụng các hóa chất có chứa nitơ như: (NH4)2SO4, NH4OH. Ngoài DAP được sử dụng như nguồn phospho ra, người ta còn sử dụng H3PO4, Ca(H2PO4)2. 2.1.4. Nguồn kali và magie: Trong sản xuất sinh khối nấm men, người ta sử dụng K2CO3 và KCl như những nguồn kali và MgSO4.7H2O hoặc MgCl2 như nguồn cung cấp magie. Hình 2.3: Magnesium sulphat 2.1.5. Không khí: Quá trình lên men tạo sinh khối nấm men là quá trình lên men hiếu khí. Do đó, cần phải cung cấp không khí cho quá trình lên men (bằng cách sục khí). Không khí sử dụng có thể có lẫn các vi sinh vật lạ gây hại cho quá trình lên men, vì vậy không khí cần phải được đưa qua thiết bị lọc trước khi cho vào thiết bị lên men. Trong quá trình sục khí, bọt tạo ra nhiều lớp ngăn cách không khí. Các chất phá bọt thường dùng là các chất dầu như: dầu dừa, dầu đậu nành, dầu hướng dương, dầu hạt cải, dầu cá không có mùi, dầu silicol 1 %. Các loại dầu phải đạt yêu cầu: hoạt tính phá bọt cao, mùi dễ chịu, màu sáng và không có tạp chất. 2.2. Vi sinh vật trong sản xuất nấm men bánh mì: Nấm men sử dụng trong sản xuất nấm men bánh mì thuộc giống Saccharomyces, loài Cerevisiae. Giống nấm men được phân lập từ các nguồn: nấm men bánh mì, nấm men rượu nếp, men cơm rượu, nấm men lên men nước trái cây, dịch trái cây lên men,... Nấm men sau khi phân lập phải cần có những tính chất sau: Ÿ Sinh sản nhanh Ÿ Chịu được trong môi trường rỉ đường Ÿ Có lực làm nở bột cao Ÿ Ít bị thay đổi trong bảo quản Ÿ Có khả năng lên men được đường saccharose, glucose, maltose Ÿ Hoạt lực enzyme zymase và maltase cao Ÿ Kích thước của tế bào phải tương đối lớn để có thể tách được nhờ những máy ly tâm đĩa bình thường và sinh khối ép được thành bánh có thể bẻ gãy được khi độ ẩm đạt 75 %... 2.3. Yêu cầu chất lượng (chỉ tiêu chất lượng) của sinh khối nấm men bánh mì: Nấm men dùng cho sản xuất bánh mì phải đảm bảo những yêu cầu sau: Ÿ Tế bào nấm men có kích thước lớn, đều, có khả năng phát triển mạnh và chịu được nhiệt độ cao Ÿ Có lực nở bột < 45 phút (giá trị này biểu thị thời gian cần thiết để làm nở 280 g bột với 160 ml dung dịch NaCl 2.5 % và lượng nấm men là 5 g) Ÿ Hoạt lực enzyme zymase < 45 phút (giá trị này được xác định khi cho nấm men (2,5 %) lên men 20 ml dung dịch đường 5 % giải phóng ra được 10 ml CO2) Ÿ Hoạt lực mantase < 70 phút (giá trị này biểu thị thời gian cần thiết để giải phóng 10 ml CO2 khi lên men 20 ml dung dịch 5 % mantose với hàm lượng nấm men 2,5 %) Ÿ Độ bền của nấm men > 72 giờ (xác định sự thay đổi thời gian làm nở bột của nấm men lúc ban đầu và sau một thời gian bảo quản nhất định. Nếu độ bền của nấm men cao thì sau 72 giờ bảo quản ở nhiệt độ 0 – 40C, thời gian làm nở bánh không được tăng quá 5 phút). 2.4. Công nghệ sản xuất: Rỉ đường Nấm men giống Nuôi cấy men giống Xử lý rỉ đường Nuôi cấy men thương phẩm Ly tâm tách rửa men Ép Định hình Sấy Bao gói Bảo quản nhiệt độ thường Men khô Đóng gói men ép Bảo quản lạnh Men ép Hình 2.4: Sơ đồ quy trình sản xuất nấm men bánh mì (Nguồn: Công nghệ vi sinh tập 2 – Nguyễn Đức Lượng) 2.5. Thuyết minh quy trình: 2.5.1. Chuẩn bị dung dịch rỉ đường: Rỉ đường trước khi pha môi trường nuôi nấm men cần được xử lý để loại bớt chất keo, chất lơ lững (huyền phù), chất màu và một số chất có hại cho sự tăng trưởng của nấm men. 2.5.1.1. Phương pháp hóa học: Người ta sử dụng acid sunfuric đậm đặc với lượng 3,5 kg cho một tấn rỉ đường. Khi cho H2SO4 vào rỉ đường, nó có khả năng đông tụ, kết tủa chất keo, đồng thời còn liên kết với muối của rỉ đường, cạnh tranh với acid hữu cơ, phân ly protein tạo ra acid hoạt động thích hợp cho sự sinh sản của nấm men. Có ba cách thực hiện: Ÿ Khi cho 3,5 kg H2SO4 vào một tấn rỉ đường, khuấy đều ở nhiệt độ thường trong 24 giờ sau đó ly tâm thu dịch trong. Ÿ Khi cho 3,5 kg H2SO4 vào một tấn rỉ đường, đun toàn bộ lên 850C và khuấy liên tục trong 6 giờ sau đó ly tâm thu dịch trong. Ÿ Cho H2SO4 vào một tấn rỉ đường cho đến khi pH của rỉ đường bằng 5, sau đó đun nóng đến 120 – 1250C / 1 phút để các chất vô cơ kết tủa, sau đó ly tâm thu dịch trong. Từ dịch rỉ đường đã được xử lý, đem pha chế thành các loại môi trường có nồng độ đường khác nhau. Đối với quá trình thu nhận sinh khối nấm men, dịch rỉ đường cần có nồng độ từ 2 – 4 %. Tuy nhiên, giá trị của rỉ đường trong quá trình nuôi nấm men thu nhận sinh khối không chỉ do lượng đường saccharose có trong rỉ đường mà còn do tác dụng của các loại muối khoáng, các chất kích thích sinh trưởng và các thành phần khác quyết định. 2.5.1.2. Phương pháp cơ học: Dùng các máy ly tâm đĩa (seperator) để tách cặn của rỉ đường. Phương pháp này có ưu điểm hơn phương pháp hóa học về phương diện kinh tế và thời gian, giảm thất thoát so với phương pháp hóa học từ 2 % xuống còn 0,14 %. Trước khi ly tâm phải pha loãng rỉ đường với nước theo tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, tùy thuộc vào thành phần muối canxi trong rỉ đường. Nếu hàm lượng muối canxi trong rỉ đường < 0,5 % thì pha loãng 1:1, nếu 0,6 % thì pha loãng 1:2, nếu lớn hơn 1 % thì pha loãng 1:4. 2.5.2. Nuôi cấy men giống: Ở nước ngoài, người ta thường dùng số lượng men mẹ lớn, bảo quản dưới dạng men sữa, có hàm lượng từ 300 – 700 g/l. Giai đoạn nuôi men giống được thực hiện trong điều kiện vô trùng, hệ thống nuôi nấm men kín, nguyên liệu được khử trùng trong nồi hấp áp suất. Nhân giống nấm men là quá trình làm tăng dịch nấm men giống sau mỗi chu kỳ nuôi. Cứ mỗi chu kỳ nuôi, lượng dịch nấm men giống tăng từ 5 – 10 lần dung dịch trước đó. Ta cứ tiến hành cho đến khi nào đạt được khối lượng nấm men giống cần thiết cho quá trình sản xuất. Trong quá trình nhân giống dùng nước amoniac để giữ pH, thổi khí liên tục. Điều kiện nuôi: Ÿ Môi trường dịch nha hay môi trường nước đường có 2 – 4 % đường, bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng Ÿ Môi trường phải được thanh trùng và làm nguội trước khi cho giống nấm men vào hay chuyển từ chu kỳ trước sang chu kỳ sau Ÿ Nhiệt độ lên men là 26 – 300C Ÿ pH dịch nuôi 4,0 – 4,5 Ÿ Thời gian nuôi từ 10 – 24 giờ Ÿ Nuôi trên máy lắc hay thổi khí vô trùng tùy theo dung tích bình nuôi cấy. Ta có thể tham khảo bảng tóm tắt sau: Bảng 2.2: Điều kiện nhân giống nấm men Các giai đoạn nhân giống Thể tích dịch nuôi cấy Điều kiện nuôi cấy Hiệu suất thu hồi (%) Nồng độ (%) Thời gian (giờ) Lưu lượng khí (m3/m3.h) Phòng thí nghiệm (3 – 5 cấp) 10ml – 10 lít 12 – 16 16 – 24 Lắc hoặc sục khí 1 - 2 8 – 10 Giống thuần khiết (2 – 4 cấp) 50 – 1500 lít 10 – 14 10 – 18 Không liên tục 5 - 10 15 – 20 Giống sản xuất (2-3 cấp) 5 – 15 m3 5 – 8 10 – 15 20 – 50 20 – 50 (Nguồn: Công nghệ vi sinh tập 2 – Nguyễn Đức Lượng) Yêu cầu về chất lượng không để nhiễm men dại hay vi khuẩn. Có thể đánh giá bằng các đặc điểm về hình thái và vài đặc điểm của một số cơ quan của tế bào khi nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi: Ÿ Tế bào đồng nhất, không bào không lớn Ÿ Nhuộm tế bào với xanh methylen. Nếu tế bào già, chết sẽ bắt màu từ xanh đến xanh đậm, tế bào trẻ không bắt màu. 2.5.3. Nuôi nấm men thương phẩm: Nuôi men thương phẩm là nuôi ở phân xưởng không cần phải vô trùng. Có nhiều nhà máy lắp đặt các nồi lên men kín hoặc hở, thông thường thể tích các nồi lên men là vài chục mét khối, có thể tới 500 m3. 2.5.3.1 Nuôi nấm men thương phẩm theo chu kỳ: Trong giai đoạn nuôi và cấy cần phải lưu ý các vấn đề quan trọng sau: Ÿ Thành phần môi trường: Môi trường nuôi cấy nấm men thương phẩm thường không khác nhiều so với môi trường nuôi cấy trong quá trình nhân giống. Tuy nhiên, thành phần môi trường phải tuyệt đối ổn định để chất lượng nấm men đồng đều ở tất cả các mẻ nuôi trong suốt quá trình sản xuất và môi trường, nuôi cấy môi trường phải vô trùng. Lượng đường trong môi trường khoảng 2 – 3 %, không nên nhiều hơn và cũng không nên ít hơn. Nếu lượng đường cao sẽ vừa lãng phí và vừa tạo ra những sản phẩm trao đổi chất khác, gây ức chế ngược đến quá trình tạo sinh khối. Nếu lượng đường quá nhỏ sẽ không đủ nguồn cacbon cần thiết cho sự tạo sinh khối. pH môi trường khoảng 4,2 – 5,4. Không nên hạ thấp độ pH của môi trường xuống vì làm như vậy nấm men sẽ khó phát triển. Nếu pH cao quá vừa ức chế nấm men phát triển, vừa tạo điều kiện cho vi khuẩn nhiễm vào dung dịch nuôi và phát triển, cạnh tranh chất dinh dưỡng, làm giảm chất lượng nấm men. Ÿ Thiết bị nuôi nấm men vừa có dung tích thích hợp, vừa thuận lợi cho việc nạp môi trường, phá bọt cũng như thu nhận sản phẩm. Thiết bị phải được lắp đặt hợp lý hệ thống thổi khí, hệ thống cánh khuấy và tấm cản dòng chuyển động của môi trường để làm tăng quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Ÿ Việc cung cấp oxi cho quá trình tạo sinh khối rất cần thiết. Oxi là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae. Nấm men chỉ có thể sử dụng oxi ở dạng hòa tan trong môi trường lỏng. Lượng oxi hòa tan trong nước rất ít. Trong quá trình phát triển, nấm men sẽ nhận oxi hòa tan và như vậy lượng oxi hòa tan sẽ giảm, do đó cần phải cung cấp oxi từ bên ngoài thiết bị. Nấm men saccharomyces cerevisiae là loài vi sinh vật hiếu khí tùy tiện. Nếu chỉ thiếu oxi trong một thời gian ngắn, ngay lập tức chúng chuyển quá trình lên men hiếu khí sang quá trình lên men yếm khí. Như vậy lượng sinh khối sẽ tạo thành rất ít. Do đó, quá trình nuôi cấy nấm men thu nhận sinh khối bắt buộc phải được cung cấp oxi liên tục. Vì nấm men chỉ có thể sử dụng oxi ở dạng hòa tan nên trong thiết bị lên men người ta phải lắp đặt hệ thống phân phối khí và hệ thống cánh khuấy. Hệ thống phân phối khí trong nuôi cấy nấm men thường được lắp đặt ở dưới đáy thiết bị. Khi số vòng quay của cánh khuấy và tố độ thổi khí tăng thì độ hòa tan oxi vào dung dịch môi trường sẽ tăng theo. Đồng thời làm tăng sự xáo trộn môi trường, thúc đẩy quá trình trao đổi chất và sinh sản tăng nhanh. Tuy nhiên việc tăng tốc độ khuấy và tốc độ thổi khí chỉ đến một giới hạn nhất định. Nếu tốc độ của hai yếu tố này quá cao sẽ làm tăng nhanh hiện tượng tự phân của tế bào và bọt sẽ tạo ra nhiều. Vì việc cung cấp oxi cho những thiết bị nhỏ ở trong các phòng thí nghiệm thường rất khó khăn. Do đó người ta thường sử dụng máy lắc để làm tăng sự hòa tan của oxi vào môi trường. Độ hòa tan của oxi bị chi phối bởi nhiệt độ của môi trường. Khi nhiệt độ của môi trường tăng thì độ hòa tan của oxi sẽ giảm và ngược lại. Nếu trong quá trình lên men, nhiệt độ môi trường tăng nhanh (do quá trình hô hấp của vi sinh vật) thì ngay lập tức phải thổi khí mạnh để làm giảm nhiệt của môi trường. Nếu không làm hạ nhiệt, độ hòa tan của oxi sẽ giảm và năng suất sinh khối sẽ giảm. Trong trường hợp phải dùng những chất hoạt động bề mặt, chất phá bọt, hoặc một số chất chống nhiễm trùng, độ hòa tan của oxi cũng giảm. Nghiên cứu ảnh hưởng của oxi hòa tan đến sự phát triển của saccharomyces cereviae cho thấy: Năng suất sinh khối nấm men đạt cao nhất khi lượng oxi hòa tan tăng từ 0,5 – 1 milimol/lít/phút, nhưng khi lượng oxi hòa tan tăng đến 4 milimol/lít/phút sinh khối sẽ giảm. Điều đó cho thấy sự tăng oxi hòa tan không phải tỷ lệ thuận với sự tăng sinh khối. Hình 2.5: Ảnh hưởng của oxi hòa tan đến sự tăng sinh khối của saccharomyces cerevisiae (Nguồn: Công nghệ vi sinh tập 2 – Nguyễn Đức Lượng) Không khí trước khi đưa vào thiết bị lên men, phải được làm sạch khỏi vi sinh vật và các tạp chất. Hình 2.6: Máy lọc khí (theo F.G Walter . 1953) (Nguồn: Công nghệ vi sinh tập 2 – Nguyễn Đức Lượng) Hình 2.7: Đường cong sinh trưởng và nhu cầu oxi trong sản xuất nấm men bánh mì (Nguồn: Công nghệ vi sinh tập 2 – Nguyễn Đức Lượng) Nhu cầu oxi cho quá trình phát triển của nấm men không phải lúc nào cũng giống nhau. - Ở giai đoạn tiềm phát, nấm men cần có thời gian thích nghi với điều kiện mới. Giai đoạn này thường khoảng 0,5 – 1 giờ, cần cung cấp lượng không khí khoảng 50 m3/giờ/1m3 môi trường là đủ. - Ở giai đoạn tăng trưởng, nấm men tiến hành các quá trình trao đổi chất rất mạnh, khối lượng nấm men trong các thiết bị tăng rõ rệt. Giai đoạn này thường kéo dài khoảng 7 – 14 giờ và cũng là giai đoạn nấm men cần nhiều oxi nhất, do đó lượng oxi cung cấp phải gấp đôi giai đoạn đầu tiên, khoảng 80 – 100 m3/giờ/m3 môi trường. - Giai đoạn cân bằng, giai đoạn này có nhiều thay đổi quan trọng. Lượng tế bào mới sinh gần bằng lượng tế bào chết, các quá trình trao đổi chất giảm mạnh. Do đó nhu cầu oxi không nhiều, giai đoạn này kéo dài khoảng 1 – 2 giờ và ta phải giảm lượng không khí cấp vào môi trường, lượng không khí cấp vào cho giai đoạn này từ 20 – 50 m3/giờ/1m3 môi trường. Trong sản xuất nấm men bánh mì, người ta thường kết thúc quá trình nuôi nấm men ở giai đoạn tăng trưởng, bởi vì một trong những yêu cầu quan trọng của nấm men bánh mì là số lượng tế bào nấm men sống phải chiếm đại đa số nên không thể đợi đến giai đoạn cân bằng mới tiến hành thu nhận sinh khối, làm như vậy nấm men thu được sẽ chứa rất nhiều tế bào già. Trong nuôi cấy nấm men bánh mì, người ta thường nuôi trong khoảng 8 – 16 giờ. Tối đa là 16 giờ. v Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy theo chu kỳ: Ÿ Tốn nhiều thời gian cho giai đoạn vệ sinh thiết bị và điều kiện sản xuất Ÿ Sinh khối nấm men thu nhận được bao gồm cả tế bào mới sinh trưởng, tế bào trưởng thành và tế bào già Ÿ Bị tác động mạnh bởi chất dinh dưỡng với hàm lượng khá cao ngay từ thời gian mới nuôi cấy. Để khắc phục nhược điểm thứ 2 và thứ 3. Người ta cải tiến bằng cách: 2.5.3.2. Nuôi cấy nấm men bánh mì theo chu kỳ có bổ sung dịch nuôi cấy: Phương pháp này giúp tế bào nấm men không phải chịu áp suất thẩm thấu cao ngay từ đầu. Cách bổ sung rỉ đường được tóm tắt như sau: Bảng 2.3: Bổ sung rỉ đường và các chất dinh dưỡng trong nuôi cấy theo chu kỳ Giờ nuôi cấy Rỉ đường (%) (NH4)2SO4 (%) (NH4)2HPO4 (%) H2O (m3) Thể tích dịch (m3) 0 5 10 10 5 0 – 1 4 - - - 27 1 – 2 4 15 15 2 27,5 2 – 3 5 15 15 6 30 3 – 4 6 15 15 6 37 4 – 5 7 15 15 7 51 5 – 6 8 15 15 8 59,5 6 – 7 10 15 15 9,5 70 7 – 8 12 - - - 70 8 – 9 13 - - - 70 9 – 10 14 - - - 70 10 – 11 12 - - - 70 11 – 12 ổn định - - - 70 Tổng số 2700kg 130kg 40kg 43,5kg 70m3 (Nguồn: Công nghệ vi sinh tập 2 – Nguyễn Đức Lượng) Ghi chú: - tỉ lệ phần trăm so với tổng số chất dinh dưỡng cho vào - Số lượng trên dùng cho thiết bị nuôi cấy là 100 m3, dung tích dịch nuôi là 70 m3 2.5.3.3. Nuôi cấy nấm men thương phẩm theo phương pháp liên tục: Để khắc phục cả ba nhược điểm của phương pháp nuôi cấy theo chu kỳ, người ta thực hiện phương pháp nuôi cấy liên tục. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là năng suất tăng và tế bào nấm men luôn luôn được đổi mới chất dinh dưỡng. Phương pháp nuôi cấy liên tục còn cho phép ta kiểm soát và điều khiển dễ dàng quá trình. Điều lưu ý là việc cung cấp oxi phải liên tục và có cùng một mức độ. Đây là điểm khác biệt giữa phương pháp liên tục và phương pháp theo chu kỳ. Mức độ cung cấp không khí trong phương pháp này là 80 – 100 m3/giờ/1m3 môi trường suốt quá trình nuôi cấy. 2.5.4. Quá trình lắng: Khi sản xuất nấm men bánh mì, người ta thường chú ý quá trình này vì quá trình này có ảnh hưởng rất lớn đến thành phẩm. Trong quá trình lắng, không còn chất dinh dưỡng trong môi trường, hệ enzyme trong tế bào nấm men chuyển từ quá trình hoạt động sinh tổng hợp sang quá trình trao đổi, chỉ nhằm duy trì những chức năng bình thường của tế bào. Trong giai đoạn này, có dạng tế bào con, tế bào trẻ vừa mới tạo chồi và tế bào trưởng thành. Tỷ số các dạng tế bào này khác nhau tùy thuộc vào quy trình kỹ thuật và môi trường hoạt động lúc đầu. Số tế bào trưởng thành càng cao, men thành phẩm càng giữ được tính chất của nó lâu hơn. Điều kiện lắng tốt nhất: Ÿ Giảm nhiệt độ đến 270C Ÿ Giảm lượng không khí 40 – 60 % so với giai đoạn nuôi chính Ÿ Thời gian lắng từ 1,5 – 2 giờ Lấy mẫu quan sát dưới kính hiển vi có thể đếm được số tế bào nảy chồi (6 – 8 %), sinh khối nấm men vào khoảng 5 – 10 %. 2.5.5. Thu nhận sinh khối men ép (ly tâm tách rửa men,ép, định hình): Dịch rỉ đường khi kết thúc lên men có khá nhiều tế bào nấm men còn lơ lửng trong dịch và một phần được lắng thành cặn xác men. Dịch bã là một hệ thống gồm các cấu tử phức tạp, gồm có nước (82 – 90 % theo khối lượng), chất khô (4 – 10 %) và rượu etylic với các chất bay hơi [5 – 8 % theo khối lượng (W) hoặc 6 – 10 % theo thể tích (V)]. Dịch này luôn luôn có một lượng CO2 hòa tan nhất định (1 – 1,5 % g/l), độ chua khoảng 0,5, pH (4,9 – 5,2). Chất khô trong dịch men gồm có tế bào nấm men, cặn bã của môi trường rỉ đường cùng với những chất hòa tan (đường không lên men, protein và chất khoáng…). Ngay sau khi kết thúc quá trình lên men, người ta phải thu nhận sinh khối nấm men ngay. Nếu để nấm men ở trong dịch nuôi cấy sẽ làm biến đổi chất lượng nấm men, trong đó hoạt tính zymase và maltase sẽ giảm rất mạnh. Để tách nấm men khỏi dung dịch lên men, người ta thường dùng phương pháp ly tâm. Người ta thường dùng máy ly tâm có số vòng quay 2000 – 5000 vòng / phút. Năng suất của máy ly tâm này là 35 – 80 m3/giờ. Nấm men thường có tỷ trọng lớn hơn dung dịch lên men (tỷ trọng của nấm men thường nằm trong khoảng 1,13 – 1,14, còn dịch nuôi cấy không chứa nấm men là 1,01 – 1,03). Do tỷ trọng của nấm men lớn hơn nên chịu lực ly tâm lớn hơn và bị đẩy nhanh xuống bề mặt dưới của đĩa. Từ đó sinh khối nấm men sẽ xuống vòng tròn của thùng quay và theo đường ống chuyển xuống thùng chứa nấm men. Nước sẽ bị đẩy về tâm và ra theo đường ống nước thải. Thiết bị ly tâm nấm men thường dùng được thiết kế riêng và có hệ thống nước lạnh để rửa nấm men trong suốt quá trình ly tâm. Người ta phải sử dụng nước Hình 2.8: Sơ đồ công nghệ tách men bằng seperator (Nguồn: Nấm men công nghiệp – Lương Đức Phẩm) lạnh 20C để tránh hiện tượng mất hoạt tính enzyme của nấm men, nếu rửa nước ở nhiệt độ thường sẽ làm tăng thời gian ly tâm có thể ảnh hưởng không tốt đến chất lượng nấm men. Trong khi nuôi nếu có sự cố về kỹ thuật như nhiệt độ tăng, không đủ chất khoáng thì sau ly tâm hòa tế bào vào nước lạnh 20C kết hợp với xử lý: Ÿ Chlotetracylin – hydroclodrid 5g/m3 trong hơn 30 phút Ÿ Acid sorbic 1kg/m3 trong 30 phút Ÿ KH2PO4 (8,5 – 20kg/m3) từ 1 – 15 phút Những chất này một phần hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây nhiễm, đồng thời có tác dụng dương trên hoạt tính sinh sản của nấm men. Quá trình tách và rửa nấm men được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp đó được được tóm tắt như sau: Ÿ Khi nhận nấm men, người ta rửa nấm men trong một thiết bị có hệ thống cấp nước lạnh liên tục và tách nấm men liên tục trong máy ly tâm. Phương pháp này thường được thực hiện ở những cơ sở sản xuất nhỏ. Ÿ Rửa nấm men trong hệ thống gồm hai thiết bị bằng phương pháp hòa tan gián đoạn. Phương pháp này có ba giai đoạn: - Tách nấm men khỏi dịch - Tách nấm men từ nước rửa 1 và 2 - Ly tâm lần lần các phần trên Ÿ Tách nấm men bằng cách ly tâm ba lần. Sau mỗi lần ly tâm mật độ nấm men sẽ cao hơn trong sinh khối thu được. Bảng 2.4: Mật độ nấm men sau mỗi lần ly tâm Số lần ly tâm Sinh khối (g/l) Chưa ly tâm 30 – 40 Ly tâm lần 1 100 – 120 Ly tâm lần 2 300 – 400 Ly tâm lần 3 500 – 600 (Nguồn: Công nghệ vi sinh tập 2 – Nguyễn Đức Lượng) Nấm men sau khi ly tâm gọi là nấm men dạng nhão (nấm men paste), còn chứa rất nhiều nước ở dạng tự do. Hàm lượng nước có nhiều trong sinh khối này sẽ làm giảm chất lượng nấm men. Do đó, người ta phải ép sinh khối này. Người ta thường dùng máy ép khung bản để ép sinh khối nấm men. Cấu tạo của máy này như sau: Các tấm bằng gang có rãnh thoát nước được gắn chặt vào trụ bằng sắt. Giữa hai tấm gang có một khung, trên khung để tấm vải lọc. Các tấm được kẹp chặt bởi tấm đầu và tấm cuối. Tấm sau cùng bị kẹp chặt. Tấm phía trước có thể xê dịch ra trước hoặc về sau được. Máy lọc ép khung bản thường có hình vuông hoặc hình chữ nhật. Kích thước các tấm là 300 – 1000 mm. Nấm men sau khi ép có độ ẩm khoảng 70 – 75 % (W). Nếu men quá khô cần thêm 10 % nước theo khối lượng rồi mới định hình. Sau khi ép người ta định hình chúng theo yêu cầu của thị trường, khi định hình nên thêm 0,1 % dầu thực vật và thực hiện ở nhiệt độ 10 – 150C. Việc định hình thường được thực hiện bằng máy định hình. Các máy này thường có công suất như sau: - 1400 kg/giờ, sau đó cắt miếng có trọng lượng mỗi miếng 1kg - 900 kg/giờ, sau đó cắt miếng có trọng lượng mỗi miếng 500g - 500 kg/giờ, sau đó cắt miếng có trọng lượng mỗi miếng 100g Sau khi cắt miếng, nấm men được băng tải chuyển sang bộ phận đóng gói di động . Máy đóng gói có khả năng đóng 75 – 80 gói (loại 100g)/phút hoặc 40 gói (loại 1000g)/phút. Thời gian đóng gói không quá 3 giờ để tránh nấm men bị mất phẩm chất. 2.5.6. Bảo quản men ép: Sau khi đóng gói, nấm men được chuyển đến phòng lạnh 0 – 40C, độ ẩm không khí phải duy trì ở 82 – 96 % (W), thời gian bảo quản được trên 12 ngày. 2.5.7. Thu nhận nấm men dạng khô: Vì lý do men ép có độ ẩm khoảng 70 – 75 % nên ở, nhiệt độ bình thường tương đối dễ mất hoạt tính. Vì vậy, không nên vận chuyển ở khoảng cách xa, cũng như giữ nhiệt độ thường trong thời gian dài. Để khắc phục những nhược điểm này, từ nấm men dạng paste người ta đem sấy để thu được nấm men dạng khô. Nấm men dạng khô thường có độ ẩm 10 % thì rất khó bảo quản. Quá trình sấy trải qua ba giai đoạn: Ÿ Tách nước tự do trong nấm men paste còn khoảng 50 – 52 % (W). Trong giai đoạn này nước mất rất nhanh. Nhiệt độ sấy < 400C (khoảng 380C). Nước trong tế bào nấm men ở dạng liên kết hấp phụ và thẩm thấu, dạng hấp phụ ở trong thể keo của tế bào chất và khó bị bay hơi. Nếu mất nước ở dạng này thường ở các tế bào chết (hoặc bị phá vở vỏ và màng), do vậy không nên sấy men tới độ ẩm nhỏ hơn 8 %. Ÿ Tách nước tự do và một phần nước liên kết. Giai đoạn này thường rất dài. Cuối giai đoạn này hàm lượng ẩm chỉ còn 16 – 20 %. Ÿ Tách nước liên kết trong tế bào đến độ ẩm cuối cùng dưới 10 % (W). Thời gian này cũng rất dài. Để giảm bớt thời gian sấy sinh khối, nấm men thường được tạo hình sợi hay hạt. Hiện nay, người ta còn dùng máy sấy thăng hoa để sản xuất nấm men khô. Tại một số cơ sở sản xuất, người ta trộn nấm men với dung dịch muối (NaCl) để làm tăng nhanh quá trình thoát ẩm và tăng khả năng chịu nhiệt của nấm men. Hình 2.9: Sơ đồ hế thống sấy thăng hoa tuần hoàn (Nguồn: Sản xuất sinh khối nấm men bánh mì – Nhóm báo cáo lên men – GVHD: PGS – TS Lê Văn Việt Mẫn) 2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối nấm men: 2.6.1. Nhiệt độ: Một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm men là nhiệt độ. Đối với quá trình sinh trưởng của nấm men, nhiệt độ thích hợp vào khoảng 28 – 300C. Trên 430C và dưới 280C sự sinh sản của nấm men bị chậm hay ngừng lại, nếu lên men ở nhiệt độ cao cũng làm cho các vi khuẩn tạp nhiễm phát triển nhanh, cạnh tranh nguồn dinh dưỡng với nấm men làm ảnh hưởng đến chất lượng thành phẩm sinh khối thu được. Giữa nhiệt độ và độ hiếu khí có quan hệ chặt chẽ với nhau. Nấm men thường sinh trưởng mạnh mẽ ở khoảng thời gian đầu của quá trình lên men (sau pha tiềm phát). Trong thời gian này dịch lên men có một lượng oxi hòa tan và nhiệt độ 25 – 300C rất thích hợp cho nấm men sinh trưởng, khi nhiệt độ thấp hiệu ứng này là rất thấp (sinh trưởng yếu). Hoạt tính hô hấp của nấm men bị giảm khi nhiệt độ xuống thấp. Cường độ hô hấp của nấm men ở 50C có thể chỉ bằng 1/5 so với ở nhiệt độ 300C. 2.6.2. Oxi hòa tan – độ hiếu khí và nồng độ khuấy trộn: Độ hiếu khí được thể hiện bằng lượng oxi (O2) hòa tan trong môi trường, đơn vị tính là mg O2 / 1 lít môi trường. Cần chú ý một điều là ở nhiệt độ càng cao lượng oxi hòa tan trong dịch càng thấp. Oxi hòa tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinh sản của nấm men và tạo điều kiện cho tế bào nấm men hô hấp. Trong trường hợp môi trường có khuấy trộn và thổi khí làm cho bọt khí càng phân tán nhỏ và đều hơn. Do đó, tế bào nấm men càng được tiếp xúc với chất dinh dưỡng và oxi tốt hơn. Bình thường oxi hòa tan tối đa trong nước đến 9 (mg / lít). Nếu nồng độ giảm xuống còn 1 (mg / lít) nấm men sẽ ngừng sinh sản. Thời gian đầu nấm men sinh trưởng mạnh nhờ có lượng oxi của không khí hòa tan vào dịch lên men. Nếu lượng giống tiếp vào môi trường ít, người ta phải thổi khí (với điều kiện khí đã được lọc sạch bụi và tạp khuẩn) để cho giống nấm men sinh trưởng. Thời gian sinh trưởng ở giai đoạn đầu lên men có cường độ hô hấp khá mạnh. Theo Louis Pasteur thì nấm men cần có oxi để sinh sản và phát triển, sự có mặt của oxi trong môi trường cao sẽ giúp kéo dài phase sinh trưởng của nấm men (phù hợp với mục đích sản xuất thu sinh khối nấm men). Trong quá trình nuôi nấm men cần giữ cho dịch men liên tục bão hòa oxi hòa tan. Ngừng cung cấp oxi trong 15 giây sẽ gây nên tác dụng âm trên hoạt động sống của nấm men. Kích thước của thiết bị nuôi cấy nấm men là tiền đề cần thiết, ảnh hưởng gián tiếp lên sự tăng trưởng của nấm men, vì chiều cao cột dung dịch môi trường càng cao thì thời gian khí bơm vào đạt đến bề mặt lâu hơn và sự hấp thụ oxi được thúc đẩy khi nhiệt độ tăng gần thích hợp cho hoạt tính men. Chiều cao cột dung dịch môi trường ít nhất là 3m mới có thể đảm bảo hiệu suất thành phẩm. 2.6.3. pH của môi trường: pH của môi trường lên men hay môi trường nuôi cấy vi sinh vật nói chung có ảnh hưởng tới đời sống vi sinh vật rất lớn. Mỗi chủng vi sinh vật hay mỗi nhóm vi sinh vật có khoảng pH thích ứng hay tối thích hợp cho sinh trưởng và phát triển. Độ pH tốt nhất cho sự tăng trưởng của saccharomyces cerevisiae khoảng (4,5 – 5,5), pH = 4 thì tốc độ tích lũy sinh khối giảm. Nếu pH = 3,5 hay pH = 3 sẽ làm sự sinh sản của nấm men bị ngừng lại. Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme tham gia vào sự tổng hợp protein, tạo vitamin đều tùy thuộc vào độ pH, pH ngoài khoảng (4,5 – 5,5) làm chất lượng nấm men giảm đi. 2.6.4. Rượu etylic: Rượu etylic được nấm men tạo ra và tích tụ trong môi trường, nếu hàm lượng rượu cao sẽ làm cho nấm men sinh trưởng chậm dần và đến nồng độ nào đó sẽ làm cho nấm men giảm hoạt tính, thậm chí có thể làm ngừng hẳn sự phát triển của nấm men (có thể khắc phục bằng cách hạn chế sự có mặt của CO2 trong môi trường). 2.6.5. Ảnh hưởng của các chất hóa học: Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất nấm men bánh mì là rỉ đường, amoniumsunphat, DAP, MgSO4, acid sunfuric. Trong các hóa chất này đôi khi có sự hiện diện của những chất làm ức chế sự tăng trưởng của tế bào nấm men. Bảng 2.5: Ảnh hưởng của một số chất hóa học lên sự tăng trưởng của tế bào nấm men Chất Nồng độ làm nấm men chậm hay ngừng phát triển (%) Nồng độ chất làm nấm men chết (%) SO2 0,0025 NaF 0,002 HNO3 0,0005 0,004 HCHO 0,001 0,9 Caramen 0,1 CH3COOH 0,02 HCOOH 0,17 3 C2(OOH)2 0,001 0,34 H2SO4 0,39 1,3 H3PO4 0,30 2 HCl 0,14 0,72 C2H5OH 12 25 (Nguồn: Sản xuất sinh khối nấm men bánh mì – Nhóm báo cáo lên men – GVHD: PGS – TS Lê Văn Việt Mẫn) 2.6.6. Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường: Tốc độ tăng trưởng của tế bào nấm men phụ thuộc vào sự hấp thụ chất dinh dưỡng, trong giới hạn áp suất thẩm thấu của môi trường và nồng độ tế bào. Áp suất thẩm thấu của môi trường tăng khi hàm lượng chất khô như saccharose hay chất hoạt động thẩm thấu như NaCl nhiều. Hiện nay, các nhà máy sản xuất nấm men bánh mì ở nước ngoài thường nuôi nấm men trong môi trường có nồng độ saccharose lên đến 5 – 6 % để cải tiến chất lượng men ép và làm men khô. 2.7. Một số thiết bị cần thiết trong quá trình sản xuất: 2.7.1. Thiết bị thanh trùng môi trường: Hiện nay phương pháp thanh trùng trong công nghệ vi sinh là dùng hơi nước quá nhiệt do nồi hơi cung cấp. Trong lên men từng mẻ các thiết bị sau khi làm vệ sinh được khử trùng bằng hơi nước nóng tới 120 – 1300C, sau đó mới cho môi trường lỏng vào các nồi lên men khử trùng môi trường cùng với cả hệ thống cùng với cả hệ thống khuấy và các đoạn đường ống, van tiếp cận. Việc gia nhiệt cao có thể dẫn đến sự phá huỷ các thành phần dinh dưỡng mẫn cảm với nhiệt và caramen hoá các nguồn đường cũng như xảy ra các phản ứng melanoid giữa đường với aminoacidhoặc các vitamin bị phá hỏng. Những thành phần mẫn cảm với nhiệt có khi phải khử trùng riêng, sau đó mới trộn lẫn hoặc khử trùng theo phương pháp khác như lọc qua phin vô trùng. Ngoài cách khử trùng theo phương pháp hơi nước gián đoạn này, người ta còn dùng phương pháp khửtrùng bằng hơi liên tục bằng cách cho môi trường chảy qua thiết bị khử trùng chuyên dùng ở nhiệt độ 1400C trong vài phút. Ở đây ta sử dụng phương pháp thanh trùng bản mỏng. Ÿ Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình nhân giống và lên men Ÿ Biến đổi: - Vật lý: nhiệt độ tăng - Sinh học: tiêu diệt vi sinh vật nhiễm Ÿ Thông số công nghệ: - Nhiệt độ: 60 – 750C - Thời gian: 10 phút Ÿ Thiết bị thanh trùng bản mỏng Hình 2.10: Thiết bị thanh trùng bản mỏng (Nguồn: Sản xuất sinh khối nấm men bánh mì – Nhóm báo cáo lên men – GVHD: PGS – TS Lê Văn Việt Mẫn) 2.7.2. Thiết bị lên men: Thiết bị nuôi nấm men vừa có dung tích thích hợp, vừa thuận lợi cho việc nạp môi trường, phá bọt cũng như thu nhận sản phẩm. Thiết bị phải được lắp đặt hợp lý hệ thống thổi khí, hệ thống bọt cũng như thu nhận sản phẩm. Thiết bị phải được lắp đặt hợp lý hệ thống thổi khí, hệ thống cánh khuấy và tấm cản dòng chuyển động của môi trường để làm tăng quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Hình 2.11: Thiết bị lên men (Nguồn: Sản xuất sinh khối nấm men bánh mì – Nhóm báo cáo lên men – GVHD: PGS – TS Lê Văn Việt Mẫn) 2.7.3. Thiết bị ly tâm: Hình 2.12: Máy ly tâm (Nguồn: Sản xuất sinh khối nấm men bánh mì – Nhóm báo cáo lên men – GVHD: PGS – TS Lê Văn Việt Mẫn) Ÿ Mục đích: Dùng bơm bơm dịch men vào máy ly tâm để loại môi trường còn lại Ÿ Các biến đổi: thay đổi thành phần tạp chất bám trên men Ÿ Thông số công nghệ: - Nhiệt độ nước rửa: 20C - Thời gian: không quá 2 giờ - Tốc độ quay: 1000 rpm Ÿ Thiết bị: máy ly tâm 2.7.4. Thiết bị lọc: Ÿ Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình định hình Ÿ Biến đổi: - Vật lý: khối lượng riêng tăng, nhiệt độ tăng - Sinh học: có thể nhiễm vi sinh vật Ÿ Thông số công nghệ: độ ẩm sau quá trình lọc đạt 40 % Ÿ Thiết bị: máy lọc thùng quay. Người ta cũng có thể tráng một lớp bột khoai mì ở thành trong thiết bị, tác dụng của nó là để giữ lại và thu hồi sinh khối tốt hơn. Hình 2.13: Máy lọc thùng quay (Nguồn: Sản xuất sinh khối nấm men bánh mì – Nhóm báo cáo lên men – GVHD: PGS – TS Lê Văn Việt Mẫn) 2.8. Các vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình nuôi cấy nấm men: Trong sản xuất thu sinh khối nấm men bánh mì thường có thể bị nhiễm vi khuẩn, nấm men dại và nấm mốc. Sự xuất hiện các vi sinh vật sinh acid như vi khuẩn lactic (đa số là các vi khuẩn lactic dị hình), các vi khuẩn acetic và đặc biệt là vi khuẩn butyric thường có ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm men một cách rõ rệt. Do sự tạo thành acid butyric của Clostridium trong men ép mà xuất hiện mùi khó chịu. Trong việc nuôi cấy nấm men cần ngăn chặn sự xuất hiện của các loài nấm men khác như: Torula, Candida,… Chúng thường phát triển rất nhanh và lấn át saccharomyces cerevisiae. Các loài nấm men kể trên thường khó ép và làm giảm đáng kể năng lực lên men của men ép. Oidium lactis Serratia marcescens Hình 2.14: Các vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình nuôi cấy Hàng loạt vi sinh vật xâm nhập vào men ép và gây nên các hiện tượng hư hỏng. Nguy hiểm nhất là Oidium lactis thường gây cho men ép có mùi ủng. Các nấm khác như penicillium tạo nên đám màu lục trên men ép, Aspergillus tạo nên các đám màu vàng nhạt tới màu xám, Mucor và Fusarium tạo các vết vàng và đỏ trên men ép. Dematium pullulans tạo nên các vệt màu nâu bẩn, các vi khuẩn acetic tạo nên những vùng ố trên bề mặt, Serratia marcescens tạo nên các vệt đỏ trên men ép. Leuconstoc mesenteroides thường gây ra hiện tượng kéo sợi của bánh mì khi chúng có mặt với số lượng lớn trong nấm men. Có thể ngăn ngừa hiện tượng này bằng cách bổ sung acid propionic. 2.9. Các phương pháp bảo quản men giống: Men giống cần bảo quản và giữ được khả năng sống, cũng như hoạt lực ở các tủ giống có những điều kiện thích hợp. Các phương pháp bảo quản được áp dụng nhằm giữ các đặc tính nuôi cấy, hình thái và hoạt lực không biến đổi về cơ bản. Một số phương pháp giữ men giống như sau: 2.9.1. Phương pháp giữ giống thuần khiết trên môi trường thạch nghiêng: Ÿ Giữ giống thuần khiết trên môi trường thạch nghiêng, cấy chuyền sau 12 – 24 ngày sau khi đã hoạt hóa sơ bộ trên môi trường lỏng. Ÿ Môi trường thạch nghiêng: nước malt đường hóa (có 12 % chất khô) - 49,5 %, rỉ đường đã được xử lý (có 6 – 8 % chất khô) - 49,5 %, dịch men tự phân (khoảng 9 % chất khô) - 1 % và thạch 2 %. Ÿ Môi trường lỏng: để hoạt hóa nấm men người ta dùng dịch malt không có houblon, có hàm lượng chất khô 12 %. Nếu không cấy chuyền và hoạt hóa kịp thời thì hoạt lực maltase và khả năng thích nghi với rỉ đường có thể bị giảm hoặc trên bề mặt thạch các tế bào nấm men sinh bào tử rồi kết hợp với nhau làm thay đổi tính chất của giống. 2.9.2. Phương pháp giữ giống trong dung dịch saccharose 30 %: Giữ tế bào men trong dịch sacchasose 30 % được chuẩn bị từ đường với nước máy. Dịch đường được cho vào bình và thanh trùng. Sau đó cấy giống từ ống thạch nghiêng đã nuôi hai ngày bằng que cấy và giữ ở nhiệt độ bình thường. Trong điều kiện này nấm men hầu như, không lên men. Đây là phương pháp giữ nấm men ở trạng thái tiềm sinh độc đáo và nếu dịch đường không bị khô cạn thì có thể giữ được 6 – 12 tháng mà không phải cấy chuyền. Khi sử dụng có thể dùng que cấy hoặc pipet vô trùng lấy dịch giống cấy chuyền vào môi trường lỏng để hoạt hóa (giới thiệu ở phương pháp thứ nhất). Sau 24 – 36 giờ giữ ở nhiệt độ 300C trong dịch đường lên men tiến hành cấy chuyền tiếp sang môi trường thạch hoặc các môi trường nhân giống. 2.9.3. Phương pháp giữ giống dưới lớp dầu vaselin hoặc paraffin: Bảo quản giống dưới lớp dầu vaselin hoặc paraffin. Giống cấy trên môi trường thạch nghiêng 2 – 3 ngày được đổ phủ lên bề mặt một lớp vaselin vô trùng. Lớp dầu khoáng này giữ cho môi trường thạch khỏi bị khô và làm giảm các quá trình trao đổi chất. Phương pháp này có thể giữ men giống được 6 tháng tới 2 năm, những đặc tính hóa sinh và hình thái không bị thay đổi, tốc độ sinh sản của nấm men thậm chí còn tăng lên. Người ta thường dùng dầu vaselin có tỷ trọng (0,8 – 0,9) đã được đun nóng ở 1500C để đuổi nước có trong dầu rồi hấp thanh trùng. Lớp dầu trên bề mặt môi trường không quá 1 cm. Ống giống có vaselin có thể để ở nhiệt độ trong phòng, nhưng tốt hơn cả là giữ ở 4 – 60C. 2.9.4. Phương pháp giữ giống ở điều kiện đông khô: Giữ giống ở điều kiện đông khô. Dịch huyền phù giống được đựng trong ống nghiệm – ampul ở trạng thái đông lạnh (- 400C), sấy khô dưới điều kiện lạnh và chân không cao tới độ ẩm còn 1,5 – 2,6 %. Sau đó gắn miệng ampul dưới chân không và vô trùng. Bảo quản các ampul giống ở nhiệt độ trong phòng hoặc ở nhiệt độ lạnh. Thời gian bảo quản tới 3 năm không phải cấy chuyền. CHƯƠNG 3 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 3.1. Kết luận: Quy trình sản xuất nấm men bánh mì thường không khác nhau nhiều về nguyên lý điều hành, tuy nhiên lại có những điểm khác nhau lớn như về môi trường nuôi cấy, về điều kiện lên men và về quá trình thu nhận sản phẩm,… Nhằm để tận dụng nguồn phế phẩm của ngành công nghiệp đường, việc sản xuất nấm men bánh mì với nguyên liệu rỉ đường hiện nay rất đang phổ biến và đã được đưa vào sản xuất với quy mô công nghiệp nhằm tạo ra nguồn sản phẩm lớn để đáp ứng với nhu cầu của ngành sản xuất bánh mì. 3.2. Kiến nghị: Do nấm men bánh mì có vai trò quan trọng và quyết định đến chất lượng bánh mì thành phẩm, nên tại Việt Nam nhu cầu về men bánh mì ngày càng tăng và hiện đang ở mức khá cao: khoảng 4 – 5 tấn / ngày. Trong khi đó chỉ có 15 cơ sở đang sản xuất men bánh mì chủ yếu là các cơ sở tư nhân với trang thiết bị còn thô sơ, quy trình công nghệ còn lạc hậu. Do vậy, việc sản xuất men bánh mì còn nhiều nhược điểm, trong đó phải kể đến như: hiệu suất men thấp, chất lượng không ổn định, bảo quản phức tạp và tốn kém. TÀI LIỆU THAM KHẢO § TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: 1. Lương Đức Phẩm (2009). Nấm men công nghiệp, nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội 2. Nguyễn Đức Lượng (2006). Công nghệ vi sinh, tập 2, nhà xuất bản đại học quốc gia tp. Hồ Chí Minh 3. Nguyễn Hoài Hương (2010). Công nghệ lên men 4. Nguyễn Lân Dũng. Giáo trình vi sinh vật học ( 5. Biền Văn Minh. Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp ( 6. Đoàn Thị Tuyết Lê. Giáo trình giới thiệu về công nghệ lên men ( 7. Phạm Minh Nhựt. Giáo trình vi sinh ứng dụng 7. SVTH: Lê Thành Huynh, Lê Minh Hải, Huỳnh Hữu Trị (2010). Công nghệ sản xuất men nở bột mì, Báo cáo thi cuối kỳ, Trường đại học kỹ thuật công nghệ TP. HCM PHỤ LỤC A. CÁC CHỈ TIÊU: Ÿ Chỉ tiêu hóa học: Các chất Thành phần (% chất khô) Cacbon 49,8 CaO 12,4 Nitro 6,7 Hydro 3,54 P2O5 2,34 K2O 0,04 SO3 0,42 MgO 0,38 Fe2O3 0,035 SiO 0,09 (Nguồn: Sản xuất sinh khối nấm men bánh mì – Nhóm báo cáo lên men – GVHD: PGS – TS Lê Văn Việt Mẫn) Ÿ Chỉ tiêu vi sinh: (Nguồn: Sản xuất sinh khối nấm men bánh mì – Nhóm báo cáo lên men – GVHD: PGS – TS Lê Văn Việt Mẫn) - Coliforms: <1000 cfu/g men khô - Escherichia coli: < 10 cfu/g men khô - Staphylococcus aureus: <10 cfu / g men khô - Salmonella: abs trong 25g men khô B. CÁC MÔI TRƯỜNG PHỔ BIẾN TRONG NUÔI CẤY NẤM MEN: Ÿ Môi trường sabouraud: Thành phần Khối lượng Pepton 20 g Glucose 40 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml Ÿ Môi trường PDA (potato – Dextrose – Agar): Thành phần Khối lượng Dịch khoai tây 500 g Dextrose 20 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml Ÿ Môi trường Hansen: Thành phần Khối lượng Saccharose hoặc maltose 50 g Pepton 10 g KH2PO4 3 g MgSO4 3 – 5 g Agar 20 g Nước cất 1000 ml