Khóa luận Công nghệ sản xuất nước mắm lên men từ đậu nành

i, nhuộm trong vòng 5 – 7 phút à rửa vết bôi bằng dung dịch CuSO4 20%, rửa nước thấm khô à quan sát dưới kính hiển vi Đọc kết quả: Tế bào có màu sẫm còn vỏ nhày có màu nhạt ở xung quanh. 2.2 Các phản ứng sinh hóa xác định vi sinh vật 2.2.1 Thử nghiệm Catalase Nguyên tắc của thử nghiệm này nhằm xác định hiện diện của enzyme catalase của vi sinh vật. Cơ sở sinh hóa như sau: enzyme catalase hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật hiếu khí có hệ thống cytochrom. Những vi sinh vật kỵ khí như Clostridium có hệ thống peroxydase thay cho enzyme catalase. Tuy thế enzyme catalase hoạt động không chuyên biệt và chúng có thể can thiệp vào hoạt động của enzyme peroxidase. Phương pháp tiến hành thử nghiệm: Hóa chất sử dụng là H2O2 30%. Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối đặt lên lame, nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật, hoặc có thể thử trong ống thạch nghiêng và đĩa petri môi trường đặc, tương tự nhỏ 1 giọt H2O2 30% lên sinh khối của vi sinh vật. Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí, thử nghiệm (-) là không có hiện tượng sủi bọt. 2.2.2 Thử nghiệm khả năng sinh Indol Nguyên tắc: Phát hiện khả năng của vi khuẩn có thể tạo Indol trong môi trường trypton. Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolpyruvic, từ đó indol được hình thành thông qua quá trình khử amin, hình thành skatol (metyl indol) là quá trình khử carboxyl cùa acid indol acetic. Enzyme tryptophan xúc tác phản ứng khử amin của tryptophan và tách nhân thơm ra khỏi phân tử tryptophan hình thành indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng giữa phân từ này với thuốc thử chứa p-dimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB). Nhân pyrrol của indol chứa nhóm –CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ. Cơ sở sinh hóa của thử nghiệm như sau: Tryptophan là một aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo ra sản phẩm chứa gốc indol. Phương pháp tiến hành: Vi sinh vật thử nghiệm được nuôi trong môi trường canh trypton trong khoảng 24 - 48 giờ, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s hoặc thuốc thử Erhlich, quan sát màu vài phút. Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ cánh sen. Thử nghiệm (-) khi trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ. 2.2.3 Thử nghiệm Metyl Red Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sản xuất và duy trì các sản phẩm acid bên trong môi trường trong quá trình lên men glucose. Cơ sở sinh hóa :thử nghiệm Metyl red dựa trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị pH là metyl red để nhận biết lượng ion H+ có trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Hàm lượng hai chất này lại tùy thuộc vào con đường chuyển hóa của từng loại vi sinh vật. Đối với các vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy từ 18 – 24 giờ, các vi sinh vật này đều tạo acid trong môi trường khi chúng bắt đầu phát triển. Đối với các vi sinh vật cho phản ứng Metyl red âm tính thì ngay ban đầu một lượng acid hình thành trong môi trường nhưng kéo dài thời gian nuôi cấy à chuyển hóa các sản phẩm acid này thành acetoin do đó làm pH môi trường trung tính. Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường MRPV, ủ trong khoảng 2 – 5 ngày, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử metyl red được pha theo tỷ lệ 0.1g trong 300ml cồn và cho vào nước định mức 500ml. Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi môi trường chuyển sang màu đỏ. Thử nghiệm (-) khi môi trường không đổi màu. 2.2.4 Thử nghiệm Voges-Proskauer Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tính acetoin trong quá trình lên men glucose. Cơ sở sinh hóa: Thử nghiệm này nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Ở tế bào vi sinh vật, sự phân hủy glucose tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, từ đó có thể chia vi sinh vật thành 2 nhóm theo con đường chuyển hóa pyruvic khác nhau : nhóm trao đổi không tạo thành 2,3-butanediol như E.coli à thử nghiệm (-) ; và nhóm tạo 2,3-butanediol như Klebsiella à thử nghiệm (+). Tuy nhiên thử nghiệm này nhằm xác định acetoin – tiền chất của 2,3-butanediol, vì là tiền chất nên quá trình nuôi cấy tích lũy rất ít, để dễ dàng phát hiện quá trình nuôi cấy thử nghiệm được tiến hành trong điều kiện hiếu khí, sau đó phát hiện acetoin trong môi trường bằng thuốc thử α-naphtol trong môi trường kiềm mạnh được tạo ra bằng KOH 40%. Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường MRPV ủ ở nhiệt độ 370C trong 2 – 5 ngày, sau đó nhỏ 2 giọt KOH 40% và 6 giọt α-naphtol rồi quan sát sự xuất hiện màu. Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm (-) khi môi trường không đổi màu. 2.2.5 Thử nghiệm Citrate Nguyên tắc: Nhằm xác định vi si sinh vật sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất Cơ sở sinh hóa: Năng lượng cung cấp cho vi sinh vật khi trong môi trường không có nguồn nguyên liệu để sử dụng cho quá trình lên men hay tạo các sản phẩm lactic bằng cách sử dụng nguồn carbon duy nhất là citrate. Bước đầu tiên vi sinh vật tách citrate thành oxaloacetate và acetate, đây là hai sản phẩm trung gian cho quá trình đồng hóa citrate, còn sản phẩm nhận được của quá trình này phụ thuộc vào pH của môi trường. Nếu pH kiềm thì trong môi trường sẽ nhận được nhiều acetate và fomate, nếu pH acid thì sản phẩm tạo ra là lactatte, acetoin. Như vậy sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt khác các vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất thì có khả năng sử dụng muối amonium như là nguồn đạm duy nhất à sinh ra NH3 làm kiềm hóa môi trường. Trong môi trường thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất có chứa đạm ở dạng muối amonium sẽ làm tăng pH của môi trường thể hiện qua sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường. Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng trong thử nghiệm là Simmon citrate agar hay môi trường lỏng Koser. Cấy vi sinh vật lên môi trường thạch nghiêng Simmon citrate agar và ủ ở 370C trong 24 giờ lấy ra quán sát. Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang xanh dương. Thử nghiệm (-) là môi trường không đổi màu. 2.2.6 Thử nghiệm trên môi trường KIA/TSI Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn carbonhydrat có mặt trong môi trường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh gas. Cơ sở sinh hóa: Môi trường KIA là môi trường rắn chứa lactose 1%, glucose 1%, TSI tương tự nhưng chứa thêm sucrose 1%. Có 3 trường hợp xảy ra khi nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường KIA : - Chỉ lên men glucose, lên men cả hai loại đường và không lên men cả hai nguồn trên. Nếu vi sinh vật chỉ sử dụng glucose sau 24 giờ nuôi cấy làm phần nghiêng có pH kiềm vì sau khi sử dụng hết lượng glucose thì vi sinh vật sử dụng pepton trong môi trường làm giải phóng NH3 nên môi trường phần nghiêng có pH kiềm, ở phần sâu môi trường có sự lên men kỵ khí glucose các sản phẩm thu được là acid hữu cơ làm môi trường pH acid à do trong môi trường có chứa chất chỉ thị pH (thường là phenol red) thì phần nghiêng của môi trường sẽ có màu đỏ và phần sâu có màu vàng. - Nếu vi sinh vật sử dụng cà hai nguồn đường nên phần nghiêng và sâu đều có tính acid nên cả môi trường màu vàng. - Trong trường hợp cả hai nguồn carbon không được sử dụng thì nguồn pepton được sử dụng và làm môi trường pH kiềm nên cả môi trường có màu đỏ. Trong môi trường nếu có tạo thành H2S thì môi trường có màu đen , có sinh gas thì gas sẽ tích tụ làm vỡ thạch hoặc tạo thành các bọt khí bên trong. Đối với môi trường TSI thì các phản ứng xảy ra tương tự, tuy nhiên trong trường hợp cả phần nghiêng và phần sâu có hiện tượng acid là do một trong hai hoặc cả hai nguồn sucrose và lactose được sử dụng. Trong trường hợp này cần làm thêm các thử nghiệm trên môi trường lactose và sucrose. Phương pháp tiến hành: Cấy vi sinh vật trên môi trường thạch nghiêng TSI hoặc KIA ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ, sau đó quan sát sự đổi màu môi trường Đọc kết quả: Môi trường phần nghiêng màu đỏ, phần sâu màu vàng à sử dụng glucose; phần nghiêng và phần sâu màu vàng à không sử dụng các nguồn đường trên; phần nghiêng và sâu màu vàng à sử dụng các nguồn đường trên. 2.2.7 Thử nghiệm tính di động trên môi trường thạch mềm Nguyên tắc: Nhằm xác định vi sinh vật có khả năng di động hay không. Phương pháp tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật trong môi trường có bổ sung 0.5 – 0.6% agar, ủ ở 370C sau 24 – 48 giờ sau đó quan sát. Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi vi sinh vật mọc lan ra đường cấy và làm đục môi trường xung quang. Thử nghiệm (-) khi vi sinh vật chỉ mọc dọc theo đường cấy và môi trường vẫn trong. 2.2.8 Thử nghiệm Urease Nguyên tắc: Nhằm xác định vi sinh vật có khả năng phân hủy urea thành amonia và CO2 dưới sự xúc tác của enzyme urease do vi sinh vật tiết ra. Cơ sở sinh hóa: urea là một hợp chất carbamide rất dễ thủy giải, sự thủy giải của urea dưới sự xúc tác của urease sẽ giải phóng hai phân tử ammonia. Khi có cơ chất urea hiện diện trong môi trường, urease được tổng hợp và phóng thích ra môi trường bên ngoài tế bào xúc tác phản ứng thủy giải urea. Các sản phẩm sau phản ứng làm môi trường hóa kiềm và làm chuyển màu chất chỉ thị pH Phương pháp tiến hành: Cấy vi sinh vật vào môi trường urea có chứa chất chỉ thị là phenol red ủ ở 370C trong 12 – 18 giờ, sau đó quan sát sự đổi màu. Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi môi trường chuyển sang màu dỏ hồng. Thử nghiệm (-) khi môi trường không đổi màu. 2.3 Phương pháp phân lập giống Bacillus subtilis và xác định hoạt tính enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis. 2.3.1 Phân lập giống Giống Bacillus subtilis được phân lập từ nguồn natto của Nhật Bản và cỏ khô. Mẫu được cắt nhỏ cho vào bình tam giác, cho nước máy vào bình, đem đi đun sôi khoảng 15 phút. Sau đó đem đi ủ ở 370C trong vòng 48 giờ. Sau 48 giờ, ta sẽ thấy một lớp váng xám, nhăn xuất hiện trên bề mặt. Ta sẽ đem đi pha loãng đến độ pha loãng thích hợp, rồi cấy trang ra đĩa petri, đem ủ ở 370C trong 24 giờ để tạo ra các khuẩn lạc Bacillus subtilis riêng rẽ. Sau khi tạo được các khuẩn lạc riêng rẽ phải kiểm tra lại độ thuần của giống bằng cách pha giống với nước muối sinh lý dùng kỹ thuật cấy ria sau đó quan sát sự thuần khiết của khuẩn lạc cũng chính là sự thuần khiết của giống. Kiểm tra và chọn khuẩn lạc tốt đem đi cấy truyền vào ống thạch nghiêng để giữ giống. 2.3.2 Xác định hoạt tính enzyme protease Nguyên tắc Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease tren cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme protease. Hóa chất Dung dịch đệm phosphate - pH 7- 0,1M Dung dịch tyrosin chuẩn 1µmol/ml Dung dịch casein 1% Dung dịch TCA (trichloracetic acid) 5% Na2CO3 0,4M Thuốc thử folin (pha loãng 5 lần) Dung dịch NaOH 0,5N Dung dịch HCl 0,1M Cách tiến hành Dựng đường chuẩn tyrosin Số ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Tyrosin ( ml ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 HCl 0,1M ( ml ) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Na2CO3 0,4M ( ml ) 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử folin (ml) 1 1 1 1 1 1 Lắc đều, để ổn định dung dịch trong 20 phút ở 370C Đo hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660nm Mẫu đối chứng: Lấy dung dịch HCl 0,1M thay cho dung dịch tyrosin và tiến hành như trên. Xác định hoạt tính enzyme protease Chúng ta sẽ hút 1ml dung dịch cơ chất casein vào ống nghiệm và đem ủ ở 370C trong 10-15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme đã được pha loãng (10 lần) vào và lắc đều, rồi đem đi ủ ở 370C trong 60 phút. Sau đó cho vào hỗn hợp này 2ml dung dịch TCA, để ổn định dung dịch trong 25 phút, đem dung dịch đi lọc để loại tủa. Hút 1ml dịch lọc vào ống nghiệm khác và cho tiếp 5ml dung dịch Na2CO3 vào, thêm 1ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên ở 370C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh thì đem đi đo quang ở bước sóng 660nm. Mẫu đối chứng: Lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành như trên. Kết quả Hoạt tính của enzyme protease được tính dựa vào định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100µg Tyrosin trong 1ml dung dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính enzyme protease (DVHT/g) = (A – A0) * F * n * 1/100 A: Độ hấp thụ của mẫu A0: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng F: Lượng Tyrosin từ đường chuẩn n: Hệ số pha loãng của enzyme 2.3.3 Xác định hoạt tính enzyme amylase Nguyên tắc Hoạt tính enzyme amylase xác định theo phương pháp Smith và Roe (1996). Hoạt tính amylase biểu thị cho khả năng của amylase xúc tác thủy phân bột đến dextrin trong 1 phút ở 500C và được thể hiện bằng số đơn vị của enzyme đó trong 1g mẫu. Khi phản ứng phân hủy tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được phân hủy sẽ tạo phản ứng màu với iod và được đem đi đo quang. Hóa chất Dung dịch đệm phosphate 1/15M, pH 6.2 Dung dịch tinh bột 1% Dung dịch Lugol Dung dịch HCl 1N Dung dịch NaCl 3% Cách tiến hành ống chuẩn ống thử 1 ml nước cất 1 ml dung dịch enzyme các mẫu 1 ml dung dịch đệm 1 ml dung dịch đệm 1 ml tinh bột 1 ml tinh bột 0,5 ml NaCl 0,5 ml NaCl Tất cả đem ủ ở 500C trong 30 phút và sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml HCl để kìm hãm ngay sự hoạt động của enzyme. Sau đó nước cất vào mỗi ống nghiệm đến 10 ml. Cho tiếp vào mỗi ống 1 giọt Lugol. Đo OD ở bước song 595 nm. Kết quả UI = [(E0 – E1) * C * L] / (E0 * T) E0: Mật độ quang học của ống chuẩn E1: Mật độ quang học của ống thử C: Lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (10mg) L: Hệ số pha loãng T: Thời gian phản ứng (30 phút) 2.4 Nhân giống Nhân giống trên môi trường dịch sữa đậu nành bổ sung thêm các chất khoáng. Thành phần môi trường nhân giống như sau: Dịch sữa đậu nành 100ml Sacharose 3% K2HPO4 0,1% MgSO4 0,1% NH4NO3 0,1% NaCl 0,5% 2.5 Giữ giống Môi trường giữ giống là môi trường cao thịt-peptone. Thành phần môi trường như sau: Peptone 1g Meat extract 1g NaCl 0,5g Argar 2g Nước 100ml Hoặc cũng có thể giữ giống trên môi trường nước chiết đậu Thành phần môi trường như sau Dịch chiết đậu 100ml Sacharose 3g Agar 3g NaCl 0,5g Giữ giống bằng các phương pháp 2.3.1 Phương pháp cấy chuyền Sau khi giống đã mọc tốt, ta cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3 - 4 0C và sau đó cấy truyền định kỳ trên môi trường thạch nghiêng mới. Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường thạch với thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Để kéo dài thời gian bảo quản giống, ta nên phủ 1 lớp parafin trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó. 2.3.2 Bảo quản lạnh Giữ giống ở nhiệt độ 2-50C trong tủ lạnh. 2.6 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa sinh Xác định độ ẩm Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hết nước tự do có trong thực phẩm. Cân trọng lượng trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước trong thực phẩm. Cách tiến hành: Cân đĩa petri đã sấy khô Cân 10g mẫu đã chuẩn bị sẵn, cho vào đĩa petri Cho tất cả vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100 – 1050C, sấy khô cho đến trọng lượng không đổi ( thường là khoảng 6h ). Sấy xong đem làm nguội trong bình hút ẩm 25 – 30 phút, đem mẫu đi cân. Cho lại vào tủ sấy trong 30 phút, đem ra để nguội trong bình hút ẩm, cân lại cho đến khi trọng lượng mẫu không đổi. Kết quả giữa 2 lần cân liên tiếp không được cách nhau quá 0,5g. Tính kết quả: Độ ẩm = ( trọng lượng mẫu khô * 100 ) / trọng lượng mẫu tươi 2.6.2 Phương pháp xác định đạm tổng số Nguyên tắc: Hàm lượng protein thô được tính gián tiếp bằng cách xác định hàm lượng nitơ tổng. Trước tiên vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao với chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau: 2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2 Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine; carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O; còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch: 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4. Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,... chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO, MgO,... Giai đoạn chưng cất giải phóng NH3 : tạo môi trường kiềm đuổi nitơ ra khỏi dung dịch dưới dạng NH3. ( NH4 )2SO4 Na2SO4 + NH3 + H2O NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa H2SO4 0.1N. 2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1N H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O Hóa chất H2SO4 đậm đặc NaOH 40% H2SO4 0.1N chuẩn NaOH 0.1N chuẩn Thuốc thử Tasiro Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1) Tiến hành Vô cơ hóa mẫu Hút 1ml nước mắm cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hóa). Cho thêm chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch. Cất đạm Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ). Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm Sau khi cất đạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh là được. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa. - Chuẩn độ: Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử dụng. Tính kết quả Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2 V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ a số miligam nguyên liệu 1,42 hệ số ; cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42mg Nitơ 2.6.3 Định lượng nitơ acid amin bằng phương pháp chuẩn độ formol Nguyên tắc Các acid amin trong dung dịch nước thì trung tính, không những do hai nhóm chức acid -COOH và amin –NH2 trung hòa lẫn nhau, mà do cả hai nhóm chức ấy đều yếu, quá trình điện ly rất kém. Khi gặp formol, nhóm – NH2=CH2 mất tính chất kiềm, do đó tính chất acid của nhóm –COOH nỗi bật lên và có thể định lượng bằng NaOH với phenolphtalein làm chất chỉ thị màu. R-CH-COOH + OCH2 → R-CH-COOH + H2O l l NH2 N=CH2 Muối amoni ở dung dịch khi gặp formol cũng làm cho dung dịch trở thành acid, do hình thành hexantylen tertramin và HCl. 4NH4Cl + 6HCHO → (CH2)6N4 + 6H2O + 4HCl Do đó ta cũng định lượng bằng NaOH Hóa chất Dung dịch formol trung tính Dung dịch NaOH 0,1N và 0,05N Chỉ thị hỗn hợp: bromothymol xanh 0,04% và phenolphthalein 0,5% trong cồn theo tỉ lệ thể tích 5:4. Tiến hành Lấy 10ml nước mắm cho vào bình định mức 250ml, thêm nước cất tới ngấn, lắc đều. Lấy 10ml từ bình định mức ra erlen, cho 15 giọt chỉ thị vào, sau đó cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi dung dịch có màu phớt xanh thì cho tiếp 5 ml dung dịch formol trung tính (dung dịch chuyển sang màu vàng xanh), chuẩn độ bằng NaOH 0,05N đến khi dung dịch chuyển từ màu vàng xanh sang màu tím. Tiến hành xác định mẫu trắng, thay 10ml nước mắm pha loãng thành 10ml nước. Tính kết quả Namin = [(n1 – n2 ) x 0,0007 x 250 x 1000] / [10 x 10] g/l n1: Số ml NaOH dùng cho mẫu trắng n2: Số ml NaOH dùng cho mẫu thí nghiệm 2.6.4 Xác định hàm lượng nitơ amoniac Nguyên tắc Định lượng bằng cách kéo hơi nước đẩy muối amoni ra khỏi thể tự do bằng một chất kiềm không mạnh lắm để tránh ảnh hưởng tới thực phẩm. Dùng dung dịch acid sulfuric để hấp thụ amoniacsa và xác định lượng H2SO4 dư bằng dung dịch kiềm. 2NH4Cl + Mg(OH)2 → 2NH3 + 2H2O +MgCl2 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 Hóa chất Acid sulfuric 0,1N NaOH 25% Chỉ thị hỗn hợp Tiến hành Lấy 20ml acid sulfuric 0,1N và 0,5ml hỗn hợp chỉ thị vào cốc 500ml. Đặt cốc sao cho đầu ống sinh hàn của máy ngập hẳn vào dung dịch trong cốc. Lấy chính xác 5ml nước mắm cho vào máy cất, cho tiếp 2m dung dịch NaOH 25%, sau đó thêm nước cất vào cho đủ 50ml. Tiến hành chưng cất. Tính toán kết quả Nm = [(n1 – n2) x 0,0014 x 1000] / 5 g/l n1: Số ml H2SO4 cho vào bình chuần n2: Số ml NaOH dùng để chuẩn 2.6.5 Xác định muối NaCl Hóa chất Nitrat bạc 0,1N Chromat kali 10% Tiến hành Lấy ra 5ml cho vào bình tam giác 250ml, thêm nước cất cho đủ 100ml. thêm 1ml dung dịch chromat kali. Đem đi chuẩn độ bằng nitrat bạc 0,1N cho đến khi dung dịch có màu đỏ nâu. Tính toán kết quả NaCl = 29,25 x n g/l n: Số ml AgNO3 khi chuẩn độ 2.6.6 Xác định độ acid Hóa chất Dung dịch NaOH 0,1N Phenolphtalin 1% Cách tiến hành Lấy 10ml nước mắm cho vào bình định mức 250ml, thêm nước cất tới ngấn bình, lắc đều. Lấy ra 20ml từ bình định mức cho vào erlen 100ml, thêm nước cất cho đủ 50ml, cho vào bình 5 giọt phennolphtalin. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi dung dịch chuyển sang màu phớt hồng. Kết quả Hàm lượng acid (Ax) tính theo số ml NaOH 0,1N dùng để trung hòa 1ml mẫu, được tính theo công thức: Ax = (n * 250) / (10 * 20) g/l n: thể tích (ml) NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn mẫu thí nghiệm. 2.7 Phương pháp phân tích vi sinh vật 2.7.1 Tổng vi sinh vật hiếu khí Môi trường sử dụng Saline Peptone Water (SPW) Plate Count Agar (PCA) Quy trình phân tích Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã được hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi được đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu được có nồng độ pha loãng là 10-1 so với dung dịch ban đầu. Dịch mẫu đồng nhất được đem đi pha loãng theo dãy thập phân đến độ pha loãng cần thiết. Từ mỗi độ pha loãng, cấy 1ml lên đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ vào đĩa môi trường PCA đã được làm nguội đến 450C. Trộn đều dịch mẫu với môi trường, chờ đĩa thạch nguội thì lật ngược đĩa lại và đem đi ủ ở nhiệt độ 300C trong 72 giờ. Đếm các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ. Kết quả Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu được tính A = N/(n₁Vf ₁ + n₂Vf ₂ + … + niVfi) A: tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa n: số lượng đĩa cấy ở mỗi độ pha loãng V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa f: độ pha loãng tương ứng 2.7.2 Xác định tổng số Coliforms Môi trường sử dụng Saline Peptone Water (SPW) Tryptone Soya Argar (TSA) Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) Quy trình phân tích Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã được hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi được đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu được có nồng độ pha loãng là 10-1 so với dung dịch ban đầu. Dịch mẫu đồng nhất được đem đi pha loãng theo dãy thập phân đến độ pha loãng cần thiết. Từ mỗi độ pha loãng, cấy 1ml lên đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường TSA đã được đun chảy và làm nguội đến 450C. Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ để trộn đều dịch mẫu với môi trường, để yên trong 30 phút. Bổ sung vào mỗi đĩa khoảng 10 – 15 ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 450C lên trên môi trường TSA, chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau thời gian ủ, đếm các khuẩn lạc trên đĩa petri có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đường kính > 0,5mm. Chọn ít nhất 3 – 5 khuẩn lạc đặc trưng ở mỗi đĩa cấy sang các ống nghiệm chứa môi trường BGBL, đem ủ ở 370C ở 440C trong 24 giờ. Kết quả khẳng định là dương khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham. Kết quả A = (N / nvf ) * R N: tổng số khuẩn lạc đếm được n:số đĩa có số khuẩn lạc được chọn v: thề tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa f: độ pha loãng R: tỉ lệ khẳng định = tỉ lệ giữa số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL với tổng số khuẩn lạc 2.7.3 Escherichia coli Môi trường sử dụng Tryptone Soya Argar (TSA) Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) Môi trường EMB Canh Tryptone Canh MR – VP Thạch Simmon Citrate Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Methyl Red Thuốc thử α-naphtol 5% KOH 40% Quy trình phân tích Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã được hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi được đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu được có nồng độ pha loãng là 10-1 so với dung dịch ban đầu. Lấy 1ml mẫu cho vào 10 ml môi trường BGBL, ủ ở 440C trong 24 giờ. Chọn các ống sinh hơi (mẫu không sinh hơi được coi là âm tính E.coli) cấy chuyền sang môi trường EMB, ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau thời gian ủ, chọn các khuẩn lạc đặc trưng: tròn, lồi, đường kính < 0,5 mm, có ánh kim tím cấy chuyển sang môi trường TSA và ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đó cấy chuyển sang môi trường: 1 Tryptone, 2 MR – VP, 1 Simmons Citrate, ủ ở 370C trong 24 giờ. Cuối cùng dùng các thuốc để test thử nghiệm IMViC. Kết quả IMViC ++-- 2.7.4 Staphylococcus aureus Môi trường sử dụng Môi trường Baird Parker (BP) Tryptone Soya Argar (TSA) Huyết tương thỏ: được cố định bằng 0,1% EDTA hay sodium oxalate và phân phối 0,3 ml vào ống nghiệm nhỏ. Quy trình phân tích Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã được hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi được đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu được có nồng độ pha loãng là 10-1 so với dung dịch ban đầu. Lấy 1ml mẫu cho vào cho vào đĩa petri chứa môi trường BP có bổ sung egg yolk, cấy trang ra cho đều, ủ ở 370C trong 48 giờ. Chọn khuẩn lạc đặc trưng: tròn, lồi, có tâm đen và có quầng sáng bao quanh cấy chuyển lên môi trường TSA. Sau đó cấy vào ống nghiệm chứa huyết tương thỏ, ủ ở 370C. Theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ, nếu không có biểu hiện ngưng kết sẽ ủ tiếp đến 24 giờ. Kết quả S = N / nvf N: tổng số khuẩn lạc đếm được n:số đĩa có số khuẩn lạc được chọn v: thề tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa f: độ pha loãng 2.7.5 Xác định Salmonella Môi trường sử dụng Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone (RV) Xylose Lysine Desoxycholate (LXD) Tryptone Soya Argar (TSA) Triple Sugar Iron (TSI) Mannitol Phenol Red broth Urea broth Lysine Decarboxylase (LDC) Quy trình thực hiện Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã được hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi được đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu được có nồng độ pha loãng là 10-1 so với dung dịch ban đầu, ủ ở 370C trong 24 giờ. Lấy 0,1 ml cấy vào 10 ml môi trường RV, ủ ở 420C trong 24 giờ. Cấy chuyển sang môi trường XLD, ủ ở 370C trong 24 giờ. Khuẩn lạc đặc trưng: tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển màu đỏ. Cấy chuyển sang môi trường TSA, ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đó cấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: TSI, LDC, Urea broth, Mannitol phenol red broth, ủ ở 370C trong 24 giờ. Kết luận TSI: đỏ/ vàng/ H2S (+)/ gas Mannitol (+) Urea (-) LDC (+) 2.7.6 Shigella Môi trường sử dụng Canh Tryptose Soya Môi trường Tergitol – 7 Argar (T7A) Canh Gram Negative (GN) Thạch MacConkey (MAC) Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Lysine Desoxycholate broth (LD) Thạch Hektoen Enteric (HE) Thạch Deoxycholate Citrat Argar Mannitol Phenol Red broth (MPR) Dulcitol Phenol Red broth (DPR) Triple Sugar Iron (TSI) Thuốc thử oxidase Thuốc thử catalase Môi trường thử nghiệm tính di động Quy trình phân tích Lấy 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml canh Tryptone Soya lắc đều. Sauk hi đồng nhất mẫu, đo pH và chỉnh về pH 7 +-0,2, lấy nút bông đậy kín miệng bình và đem ủ ở 370C trong 20 giờ. Sau khi ủ, cấy 0,1 ml sang 10 ml canh GN, ủ ở 370C trong 20 giờ. Cấy dịch tăng sinh lên các môi trường thạch đĩa chọn lọc: T7A, XLD, HE, MAC, … . Biểu hiện của Shigella trên các môi trường phân lập khác nhau. Môi trường T7A: môi trường ban đầu đục như sữa có màu xanh hơi vàng nhạt. trên môi trường này thì khuẩn lạc Shigella có màu xanh nhạt. Môi trường MAC: khuẩn lạc có màu nâu đỏ, trong suốt. Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu đỏ, trong suốt. Môi trường Deoxycholate Citrat Argar: môi trường có màu đỏ cam, hơi đục, khuẩn lạc có màu đỏ nhạt. Môi trường HE: khuẩn lạc có màu xanh nhạt, trong suốt. Chọn các khuẩn lạc cấy sang môi trường BHI hoặc TSA, ủ ở 370C trong 20 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được cấy sang môi trường TSI, ủ ở 370C trong 24 giờ để thử nghiệm sinh hóa khẳng định. Kết quả Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả TSI: đỏ/ vàng/ H2S (-)/ gas (-) Oxydase (-) Không di động trong thạch mềm Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Shigella spp Simmon citrate (-) MR (+) Adonitol (-) Arginine decarboxylase (-) Lysine decarboxylase (-) Urease (-) Malonate (-) VP (-) Salicine (-) Xylose (-) Cellobiose (-) Dulcitol (-) Inositol (-) CHƯƠNG 3 QUY TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC MẮM LÊN MEN TỪ ĐẬU NÀNH 3.1 Bản chất của quá trình lên men nước mắm từ đậu nành 3.1.1Cơ sở sinh hóa của quá trình lên men Chúng ta lợi dụng hệ men của vi sinh vật phát triển trên nguyên liệu giàu đạm, để rồi chúng thủy phân protein có trong nguyên liệu thành các sản phầm như polypeptide, oligopeptide, acid amin. Trong quá trình sản xuất, chúng ta phải nuôi vi sinh vật trong điều thuận lợi cho vi sinh vật phát triển tốt để có nhiều enzyme thủy phân, năng suất thủy phân protein có trong nguyên liệu cao thì sẽ nâng cao năng suất, hạ giá thành sản phẩm và nâng cao chất lượng của nước chấm thành phẩm. Trong sản xuất nước mắm lên men từ đậu nành, ta dùng enzyme protease và proteinase của vi khuẩn bacillus để thủy phân protein của đậu nành thành acid amin. 3.1.2 Cơ chế của quá trình hình thành nước mắm khi lên men đậu nành Đậu nành đem trộn với nước muối theo tỷ lệ nhất định, lên men trong điều kiện thích hợp. Sau một thời gian sẽ hình thành một dung dịch acid amin và các chất khác. Bản chất của quá trình này chính là quá trình thủy phân protein trong đậu nành nhờ hệ enzyme protease và proteniase của vi khuẩn bacillus subtilis. Protein → polypeptide → peptid → acid amin Quá trình thủy phân protein đến các acid amin là 1 quá trình rất phức tạp. Sự tham gia của enzyme trong quá trình thủy phân theo cơ chế xúc tác E + S ES E + P với E là enzyme, S là cơ chất (protein), ES là hợp chất trung gian giữa enzyme và cơ chất, P là sản phẩm tạo thành. Sản phẩm chủ yếu của quá trình phân giải protein là amino acid và các peptid cấp thấp. Sự tạo thành và chuyển biến hợp chất ES qua 3 bước: Bước 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức chất enzyme protein, bước này xảy ra khá nhanh, liên kết không bền. Bước 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ các mối liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng. Khi đó phức ES đồng thời xảy ra hai quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn đến sự cực hóa của mối liên kết tham gia vào phản ứng và sự biến dạng hình học của nối liên kết đồng hóa trị trong phân tử protein cũng như trong tâm hoạt động của enzyme, quá trình thủy phân sẽ dễ dàng hơn. Bước 3: Giai đoạn tạo thành các amino acid và peptid, giải phóng enzyme. Ngoài ra, đường và chất béo cũng bị phân giải thành rượu và các acid hữu cơ. 3.2 Các hệ enzyme tham gia vào quá trình thủy phân α-Amylase: Là một enzyme ngoại bào tạo ra mantose, dextrin, mantotriose. Nó cắt đứt nối đôi α-1-4-glucocide. Protease: Là một nhóm enzyme phân giải protein (protease, peptidase, proteinase,..) mà phần lớn là được tế bào tiết ra ngoài môi trường và hoạt động bên ngoài môi trường. Các protein được phân giải ngoài tế bào nhờ các enzyme ngoại để tạo thành polypeptide và olygopeptide và sau đó phân giải thành các amino acid. 3.3 Ưu và nhược điểm của quá trình lên men Ưu điểm: Thiết bị đơn giản Không dùng hóa chất trong sản xuất Không tổn hao acid amin trong sản xuất Nhược điểm: Hiệu suất thủy phân không cao Thời gian và quy trình sản xuất kéo dài hơn phương pháp hóa giải. 3.4 Sơ đồ quy trình sản xuất nước mắm lên men từ đậu nành Nước muối Đậu nành Ngâm Rửa, tách vỏ Hấp chín Làm nguội Rang chín sơ Phối trộn Lên men ủ Trích ly lần 1 Nước 1 Bã Trích ly lần 2 Nước 2 Phối chế Lọc tinh Thanh trùng Vô chai Gạo mì Giống Sản phẩm nước mắm chay Bã Nước muối 3.5 Thuyết minh quy trình Nguyên liệu Đậu nành là nguyên liệu chính trong sản xuất nước mắm lên men từ đậu nành, nó quyết định tỷ lệ thu hồi protein và chất lượng sản phẩm. Do đó trong sản xuất, đậu nành phải được lựa chọn đúng tiêu chuẩn: Hạt chín về mặt sinh học, loại bỏ những hạt non. Chúng ta phải chọn những hạt to, đều, không có vết bệnh, không dị dạng, màu sắc vỏ và rốn hạt đặc trưng của giống đậu nành, khô, sạch, không sâu mọt, không có mùi hôi. Độ ẩm của hạt thấp, khoảng 10-13%. Vỏ hạt màu nâu vàng nhạt, tránh sử dụng những hạt có vỏ màu xanh vì hợp chất chlorophyll có trong vỏ hạt hay trong lá mầm sẽ tạo vị đắng và chuyển thành hợp chất phytophytin (màu nâu) trong quá trình chế biến. Hạt nứt không quá 5% khối lượng, hạt hư không quá 2% khối lượng, hạt xanh không quá 2%. Tạp chất không quá 3% khối lượng. Giai đoạn ngâm hạt Đây là quá trình lên men tự nhiên khá phức tạp và nó quyết định mùi vị đặc trưng của sản phẩm, pH nước = 5.5 có tác dụng phù hợp với quá trình xúc tác và chuyển hóa của hỗn hợp enzyme amilase và protease và một số enzyme khác khi lên men. Ngâm hạt nhằm mục đích làm cho hạt đậu hút nước và trương lên. Khi đó các phân tử nước có tính lưỡng cực sẽ tác động lên các phân tử protein, lipid, glucid và xenlulose. Các phân tử nước sẽ tiếp tục tác động và làm phá vỡ liên kết các phân tử trong hạt đậu và chuyển chúng sang dịch thể keo linh động nằm trong các tế bào hạt đậu. Đồng thời làm giảm hàm lượng oligosaccharide (raffinose, stachyose), và tiêu diệt một phần vi sinh vật. Có 3 yếu tố ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình ngâm hạt là thời gian ngâm, lượng nước ngâm và nhiệt độ của nước ngâm. Thời gian ngâm: Nhiệt độ ngoài trời từ 15 – 250C, ngâm trong 5 – 6 giờ. Nhiệt độ ngoài trời từ 25 – 300C, ngâm trong 3 – 4 giờ. Kết thúc giai đoạn ngâm, độ ẩm của hạt đậu đạt 55 – 65% là tốt nhất. Nếu thời gian ngâm đậu quá dài sẽ tổn thất chất dinh dưỡng, hạt dễ bị thối và chua. Nhiệt độ của nước ngâm: Nếu ngâm ở nhiệt độ cao, tốc độ trương của hạt nhanh nhưng độ trương của hạt lại nhỏ, thì các thành phần trong hạt đậu chỉ ở trạng thái keo đông chứ không phải dịch thể keo nên sẽ khó hòa tan. Nhiệt độ nước ngâm tốt nhất dùng để ngâm là 20 – 250C. Lượng nước ngâm: tỷ lệ ngâm tốt nhất là 1đậu : 2 nước. Lượng nước ngâm này sẽ giúp độ trương của hạt đạt tương đối cao, độ chua thấp (khoảng 2,23g acid acetic trong 100g đậu nành) và sự tổn hao chất khô nhỏ (chỉ 0,6g trong 100g đậu nành). Trong quá trình ngâm đậu phải thường xuyên thay nước nhiều lần để tránh đậu bị chua do quá trình lên men lactic làm cho lượng acid latic tích tụ nhiều. Rửa, tách vỏ Quá trình này nhằm mục đích là loại bỏ các tạp chất bẩn có trong đậu nành hay bám trên bề mặt vỏ đậu nành như: đá, đất, bụi, hạt cỏ, đồng thời loại bỏ được một số vi sinh vật bám trên vỏ. Thu được triệt để hàm lượng protein trong quá trình lên men vì loại được sự ngăn cản của lớp cỏ, loại bỏ được mùi đậu, vị đắng và các chất gây ảnh hưởng xấu đến màu của sản phẩm có trong vỏ, làm tăng chất lượng của sản phẩm sau này. Cho đậu sau khi ngâm vào thau nước sạch, vừa rửa vừa tách lớp vỏ. Lớp đậu nành sau khi tách sẽ nổi trên mặt nước, ta dùng tay hay rổ nhỏ hớt bỏ lớp vỏ ra ngoài. Phối chế nguyên liệu và trộn nước Ta phối trộn theo tỉ lệ 90% đậu và 10% gạo mì Hấp chín Mục đích của việc hấp chín nguyên liệu là làm cho nguyên liệu trở thành một loại môi trường thích hợp với sự phát triển của vi khuẩn. Vì protein sau khi hấp một phần sẽ biến tính thành protein có tính hòa tan, còn tinh bột bị hồ hóa biến thành đường. Những chất đó đều là những chất dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn. Protein biến tính 1 lần do đó các chất gây vẩn đục trong quá trình lên men sẽ bị phân giải vì vậy sản phẩm sau này có pha loãng và gia nhiệt cũng không gây ra hiện tượng vẩn đục. Tiêu diệt vi sinh vật bám trên nguyên liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển. Trong quá trình hấp cần chú ý tới nhiệt độ hấp và thời gian hấp. Nhiệt độ hấp là 1000C, hấp trong khoảng 3giờ, thấy hạt đậu chuyển màu hơi nâu là được không nên để quá đậm màu. Quá trình ướp muối Mục đích là ngừng sự phát triển của vi khuẩn, chuẩn bị cho giai đoạn lên men. Ta pha dung dịch muối từ 20 – 220Be, có nghĩa là pha khoảng 265 – 300g muối trong một lít nước. Quá trình ủ Đây là quá trình lên men. Lên men là giai đoạn rất quan trọng, giai đoạn này quyết định chất lượng của sản phẩm. Nếu lên men không đúng kỹ thuật thì nước chấm thu được sẽ không đạt yêu cầu, hiệu suất thu hồi nguyên liệu thấp (đạm amin trong dung dịch thấp), giá thành sản phẩm cao. Trong giai đoạn này, các enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis tiết ra sẽ tham gia vào các phản ứng sinh hóa để tiến hành thuỷ phân cơ chất protein trong nguyên liệu đậu nành thành chủ yếu là các amino acid (thực hiện bởi protease), đồng thời các sản phẩm khác cũng hình thành trong giai đoạn này để tạo sản phẩm nước mắm có hương vị đặc trưng riêng. Hương vị này do 4 nhóm chính tạo nên: các amino acid và NH3, các sản phẩm thủy phân protein, các acid béo và methylacetone. Trích ly sản phẩm Trích ly lần thứ 1: ta được nước mắm đậm màu, ngọt, chiếm khoảng 60 – 80% lượng đạm có trong nước mắm. Trích ly lần thứ 2: sau khi trích ly lần thứ 1, bã vẫn còn lưu lại 1 lượng nước chấm, vì vậy ta cho thêm nước muối từ 15 – 180Be vào ngâm khoảng 12 – 16 giờ rồi lại tiến hành trích ly lần 2. Trích ly lần thứ 3: để tận dụng nguyên liệu một cách triệt để, bã sau khi trích ly lần 2 xong vẫn còn chứa một ít muối và nước mắm, chúng ta sẽ cho nước không pha muối vào ngâm khoảng 6 giờ rồi tiến hành trích ly lần 3. Nước mắm trích ly lần này có độ đạm thấp. Để có sản phẩm nước chấm đa dạng, người ta có thể tiến hành phối chế các loại dịch trích ly 1, 2 và 3 theo tỉ lệ thích hợp trên cơ sở độ đạm cần đạt cho mỗi loại nước chấm. Thanh trùng sản phẩm Mục đích tiêu diệt vi sinh vật giúp kéo dài thời gian bảo quản. Nhiệt độ thanh trùng khoảng 60 – 700C, thời gian từ 1 giờ 30 phút đến 2 giờ để không ảnh hưởng đến chất lượng của nước mắm. 3.6 Các sự cố xảy ra trong quá trình lên men và phương pháp xử lý Nguyên liệu sau khi hấp bị khô quá hoặc nhão quá. Yêu cầu độ ẩm của nguyên liệu sau khi hấp là khoảng 45 – 50%. Khi lượng nước trộn vào quá ít hoặc khi trong quá trình hấp, nấp nồi bị hở, hơi nước thoát ra ngoài nhiều làm cho nguyên liệu bị khô, có thể trộn thêm nước sôi với lượng 0,1 – 0,2% so với khối lượng nguyên liệu. Trường hợp quá nhiều nước làm cho nguyên liệu bị nhão thì ta phải tải mỏng nguyên liệu cho bay bớt hơi nước hoặc trộn thêm một ít bột mì rang. Nguyên liệu hấp chín không đều Khi trộn nước vào nguyên liệu, trộn không đều. Để giải quyết vấn đề này, ta trộn thêm nước vào nguyên liệu rồi hấp lại khoảng 30 – 45 phút và cho phần nguyên liệu sống nhiều xuống đáy nồi hấp. Bị nhiễm mốc Khâu nhân giống không đảm bảo vệ sinh nên dễ bị nhiễm mốc. Nếu nhiễm mốc ở mức độ thấp (< 30%), thường thì bị nhiễm mốc bề mặt, khi đó ta chỉ cần tách lớp mốc bề mặt ra, và xịt cồn xung quanh dụng cụ nuôi cấy vi khuẩn. Nếu mà nhiễm mốc quá nhiều thì nuôi giống mới. Chượp bốc mùi chua Chua do mặn đầu: do lượng muối lúc đầu quá nhiều, muối chưa kịp ngấm đều vào hạt đậu làm hạt đậu bị nhạt muối, xảy ra quá trình phân giải sinh ra nhiều acid phức tạp như: glucose bị phân giải yếm khí tạo acid lactic. Các chất béo bị phân hủy tạo thành glycerin và acid béo hoặc chất đạm khử amin thành acid béo. Chua vì nhạt đầu: đậu nành nhạt muối không đủ sức kiềm hãm sự phát triển của vi sinh vật, phân giải tạo nhiều acid bay hơi phức tạp làm phát sinh mùi chua, nhanh chóng chuyển sang hư thối. Cách phòng chữa: cần phải cho muối đều và đủ. Dùng rượu để chuyển các acid sang dạng ester có mùi thơm, hoặc trung hòa bằng NaHCO3. Dùng thính để hấp phụ mùi. Chua vì mặn đầu thì cho thêm nước vào, trộn đều. Chua vì nhạt đầu thì thêm muối, trộn đều. Chượp thối Chượp thối có màu nâu đen và có mùi hôi thối. Nguyên nhân chủ yếu là do muối quá nhạt, khi đó các vi sinh vật hoạt động phân hủy các acid amin thành các sản vật cấp thấp làm cho chượp thối. Trptophan Indol, skatol Cystein NH3, H2S Cần xử lý nguyên liệu cho tốt, tránh để nước mưa vào. Dụng cụ chế biến phải sạch sẽ, không để chượp nơi ẩm thấp, dơ bẩn. Cần áp dụng đúng kỹ thuật chế biến. Có thể trộn với chượp khác và đem đi nấu. Chượp bị nước mưa vào thì nên cho thêm muối. 3.7 Phương pháp thí nghiệm 3.7.1Mục đích thí nghiệm Khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng muối, lượng giống, nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân protein. Nhằm mục đích là tìm ra nhiệt độ, lượng muối và lượng giống tối ưu khi lên men để tạo ra sản phẩm nước mắm có chất lượng và có giá trị cảm quan tốt đối với người tiêu dùng. 3.7.2 Phương pháp thí nghiệm Nhân tố thí nghiệm Nhân tố Ký hiệu Mức độ 1 Mức độ 2 Mức độ 3 Mức độ 4 Lượng giống G 1 2 3 4 Nồng độ muối M 15 20 25 Nhiệt độ T 47 Bố trí thí nghiệm G1M1T G2M1T G3M1T G4M1T G1M2T G2M2T G3M2T G4M2T G1M3T G2M3T G3M3T G4M3T 3.8 Thiết bị dùng trong sản xuất Nồi hấp đậu Việc lựa chọn thiết bị để thực hiện hấp đậu phụ thuộc vào năng suất sản xuất, mức năng lượng tiêu thụ năng lượng, tỉ lệ hao hụt các chất dinh dưỡng hòa tan trong nước. Các loại máy hấp: Máy hấp bằng hơi hình giếng: Loại này có cấu trúc đơn giản, chỉ là 1 thùng đựng bằng kim loại, có khi bằng gỗ. Bên trong thùng có ống phun hơi trực tiếp. Thiết bị này làm việc gián đoạn. Nồi hấp hai vỏ: Nồi có vỏ trong làm bằng thép không rỉ hay bằng đồng, có loại thì bên trong tráng men, có cánh khuấy, có tay quay để đổ sản phẩm ra, nắp hở. Máy hấp bằng hơi kiểu trục vít: Loại máy này được phun hơi nước trực tiếp và có thể được đun nóng gián tiếp, nguyên liệu được vận chuyển bằng trục vít. Máy hấp kiểu băng tải: Thiết bị này làm việc liên tục ở áp suất khí quyển. Loại máy này có cấu tạo rất khác nhau với băng tải làm nhiệm vụ vận chuyển nguyên liệu, các miếng tôn, lưới sắt, gáo đựng nguyên liệu gắn trên hai dây xích chuyển động. Quá trình hấp được thực hiện ngay trên băng tải nhờ việc chuyển động của băng tải ngang qua phòng kín có ống phun hơi hoặc qua thùng kim loại có chứa nước. Vận tốc chuyển động của băng tải nhỏ, khoảng từ 0,01 đến 0,05 m/s, tương ứng với thời gian hấp cần thiết. Thiết bị hấp IQB: Thiết bị này bao gồm một băng tải kiểu cổ ngỗng A vận chuyển nguyên liệu đến bộ phận gia nhệt B. Băng tải này được thiết kế nằm trong thân máy kín để giảm lượng nhiệt hao phí do thoát ra môi trường xung quanh. Nguyên liệu được trải thành lớp đơn và được nâng nhiệt trong bộ phận gia nhiệt B nhờ hơi nước bão hòa, sau đó dồn thành lớp dày và giữ nhiệt đó trong băng tải C. Công đoạn cuối cùng là làm nguội được thực hiện ở bộ phận D nhờ không khí lạnh kết hợp nước phun dạng sương mù. Sử dụng thiết bị này giúp giảm đáng kể lượng hao hụt nguyên liệu do bay hơi, nguyên liệu đạt được mục đích xử lý nhiệt mà ít bị giảm chất lượng. Bồn lên men, ủ Thùng gỗ: Đậu được lên men và ủ trong những thùng gỗ lớn, có thể chứa được từ 600 – 1200 kg đậu. Gỗ dùng để làm thùng phải sử dụng những loại gỗ tốt. Gỗ được xẻ thành những tấm dày từ 3 – 4 cm, ngâm nước, phơi nắng 2 – 3 tháng cho hết chất nhựa cây và gỗ không bị cong sau này. Sau đó các tấm ván được khép khít chặt vào nhau và trét nhựa cho đừng rò rỉ. Ở chỗ giáp giữa đáy thùng với thành thùng người ta đắp lù. 3.9 Đánh giá chất lượng sản phẩm nước mắm chay 3.9.1Chỉ tiêu cảm quan về sản phẩm nước mắm lên men từ đậu nành Màu sắc: vàng nhạt, vàng, vàng nâu, vàng nâu đậm Độ trong: trong sánh, trong, không vẩn đục Mùi: thơm đặc trưng, không có mùi lạ Vị:ngọt của đạm, không mặn đắng 3.9.2 Chỉ tiêu vi sinh vât Chỉ tiêu vi sinh vật trong sản phẩm nước mắm lên men từ đậu nành: Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1ml không lớn hơn 2.104. Coliform, số khuẩn lạc trong 1ml không được lớn hơn 10. Echerichia coli, số khuẩn lạc trong 1ml không được có. Salmonella, Shigella, số khuẩn lạc trong 25ml không được có. Staphylococcus aureus, số khuẩn lạc trong 1ml không được có. 3.9.3 Giá trị dinh dưỡng Chất đạm chiếm thành phần chủ yếu và quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm. Gồm ba loại đạm: Đạm tổng số: là tổng lượng nitơ có trong nước mắm (g/l), quyết định phân hạng của nước mắm. Đạm amin: tổng lượng đạm nằm dưới dạng amino acid (g/l), quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm. Đạm amon: đạm amon càng nhiều thì nước mắm càng kém chất lượng. Ngoài ra, nước mắm lên men từ đậu nành còn chứa đầy đủ các amino acid, đặc biệt là các amino acid không thay thế: valin, leucin, alanin…Các thành phần khác có kích thước lớn như tripeptid, dipeptid, chính những thành phần trung gian này làm cho nước mắm dễ bị hư hỏng do hoạt động của vi sinh vật. 3.9.4Chỉ tiêu hóa học của sản phẩm nước mắm lên men từ đậu nành Chỉ tiêu Mức chất lượng Đặc biệt Thượng hạng Loại 1 Loại 2 Haøm löôïng nitô toaøn phaàn, tính baèng g/l khoâng nhoû hôn : 25 20 15 10 Haøm löôïng Nitô axit amin, tính baèng %so vôùi Nitô toaøn phaàn, khoâng nhoû hôn : 46 45 40 34 Haøm löôïng Nitô amoâniac, tính baèng %so vôùi Nitô toaøn phaàn 25 26 30 35 Haøm löôïng axit, tính baèng g/l theo Acid axetic, khoâng nhoû hôn 6,5 6 4 3 Haøm löôïng muoái Natriclorua, tính baèng g/l trong khoaûng : 260 - 285 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ 4.1 Kết quả nhuộm Gram của Bacillus subtilis Hình 4.1 Kết quả nhuộm Gram của Bacillus subtilis 4.2 Kết quả nhuộm bào tử của Bacillus subtilis Hình 4.2 Kết quả nhuộm bào tử của Bacillus subtilis 4.3 Xác định hoạt tính enzyme protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Giờ 8 12 24 36 48 60 72 84 96 UI/ml 14.13 16,63 17,76 19,38 21,09 23,33 25,46 22,18 18,84 4.4 Xác định hoạt tính amylase của vi khuẩn Bacillus subtilis Giờ 8 12 24 36 48 60 72 84 96 UI/ml 12,24 13,42 13,68 14,83 15,67 16,16 17,18 15,47 14,88 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis Nhiệt độ (0C) UI/ml 30 0,55 37 0,85 47 1,16 57 0,97 67 0,29 77 0,18 Nhận xét: Qua 96 giờ khảo sát cho thấy, enzyme protease và amylase của vi khuẩn Bacillus subtilis hoạt động theo xu hướng tăng dần và đều hoạt động mạnh nhất ở 72 giờ. Từ 84 giờ trở đi thì hoạt tính của enzyme protease và amylase đều giảm dần. Qua khảo sát cho thấy, enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis hoạt động tốt ở khoảng nhiệt độ 47 – 500C. Nhiệt độ cao 550C thì hoạt động của enzyme giảm đáng kể. 4.6 Hàm lượng muối có trong nước mắm NaCl = 29,25 x 9 = 263,25 g/l 9: Số ml AgNO3 khi chuẩn độ 4.7 Bảo quản sản phẩm Dụng cụ phải sạch sẽ, giữ nơi thoáng mát. Nhờ vào hàm lượng muối và hàm lượng đạm cao, tạo áp suất thẩm thấu lớn vì thế ức chế hoạt động của vi sinh vật, do đó ta có thể bảo quản được nước mắm trong thời gian dài. 4.8 Kết quả hàm lượng acid amin (g/l) trong từng mẫu thí nghiệm Nghiệm thức Thời gian lên men 7 ngày 10 ngày 20 ngày 30 ngày 40 ngày G1M1T 2,12 4,69 5,76 8,38 7,65 G1M2T 3,66 5,58 8,12 11,15 9,33 G1M3T 3,18 5,45 8,07 10,76 9.10 G2M1T 3,71 5,89 8,50 11,07 10,04 G2M2T 4,03 6,17 9,34 11,34 10,14 G2M3T 3,95 6,03 9,27 11,11 10,01 G3M1T 4,05 6,15 9,46 11,45 10,13 G3M2T 5,37 7,29 10,53 11,66 9,75 G3M3T 4,34 6,10 10,25 11,52 10,5 G4M1T 2,81 3,98 6,15 8,35 5,88 G4M2T 3,23 4,06 8,39 9,25 6,56 G4M3T 3,11 3,65 7,29 7,55 6,06 4.9 Kết quả hàm lượng ammoniac (g/l) trong từng mẫu thí nghiệm Nghiệm thức Thời gian lên men 7 ngày 10 ngày 20 ngày 30 ngày 40 ngày G1M1T 1,27 1,10 1,25 1,37 1,47 G1M2T 1,48 1,22 1,36 1,15 1,05 G1M3T 1,32 1,41 1,24 1,20 1,12 G2M1T 1,09 1,16 1,25 1,32 1,22 G2M2T 1,28 1,15 1,05 1,46 1,35 G2M3T 1,10 1,17 1,29 1,34 1,27 G3M1T 1,03 1,11 1,22 1,36 1,22 G3M2T 1,07 1,13 1,19 1,18 1,28 G3M3T 1,10 1,13 1,20 1,31 1,25 G4M1T 1,36 1,58 1,37 1,34 1,26 G4M2T 1,95 1,73 1,87 1,36 1,41 G4M3T 1,41 1,87 1,92 1,56 1,47 Nhận xét: Qua kết quả thí nghiệm, dựa vào biểu đồ cho ta thấy nghiệm thức G3M2T là điều kiện thí nghiệm tối ưu nhất vì với nghiệm thức này, hàm lượng acid amin đạt cao nhất và cũng đạt yêu cầu tiêu chuẩn của nước mắm thành phẩm. Hàm lượng ammoniac thì thay đổi không đáng kể và hàm lượng thấp, nước mắm đạt chất lượng theo tiêu chuẩn của nước mắm thành phẩm. 4.6 Hàm lượng acid amin trong từng mẫu thí nghiệm 4.7 Hàm lượng ammoniac trong từng mẫu thí nghiệm KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Qua kết quả thí nghiệm, khảo sát các điều kiện lên men và giai đoạn lên men kết thúc có thể rút ra được những kết luận như sau: Lượng giống sử dụng sản xuất nước mắm lên men từ đậu nành là 3% Nồng độ muối sử dụng trong lên men là 20%. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là 470C. Thời gian kết thúc quá trình lên men là từ 30 – 35 ngày, khi đó hàm lượng đạm amin được sinh ra nhiều nhất. Sau 40 ngày thì hàm lượng đạm đã bắt đầu giảm. Thời gian bảo quản sản phẩm khoảng 150 ngày. Đề nghị Sản phẩm nước mắm lên men từ đậu nành đã có mặt trên thị trường Việt Nam nhưng chỉ là ở dạng nước mắm pha tỏi ớt, chứ không có nước mắm nguyên chất để mà giúp người tiêu dùng có thể làm nhiều món ăn khác nhau. Do thời gian nghiên cứu có hạn, thiết bị và phương tiện thí nghiệm còn nhiều hạn chế nên sản phẩm nước mắm lên men từ đậu nành chưa được nghiên cứu hoàn chỉnh. Vì vậy để góp phần nâng cao giá trị sản phẩm, tạo điều kiện cho sản phẩm ngày càng quen thuộc với người tiêu dùng Việt Nam, chúng tôi đề nghị sản phẩm cần được nghiên cứu thêm: Nghiên cứu giải quyết hương vị của nước mắm sao cho hợp khẩu vị của người tiêu dùng. Phương pháp sản xuất nước mắm lên men từ đậu nành trên qui mô công nghiệp hiện đại và khả năng phát triển sản phẩm.