Khóa luận Đa dạng hóa các môi trường sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn acetobacter xylinum

oxydaz và Acetobacter melanogennum. Nhóm Mesoxydans gồm Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti và Acetobacter mesoxydans. Nhóm Oxydans gồm các loài không có khả năng tạo các hợp chất ceto: Acetobacter ascendans, Acetobacter ransens và Acetobacter lovaniens. Nhóm Peroxydans gồm Acetobacter pezoxydans, Acetobacter paradoxum không chứa catalase và không oxy hoá được glucose. [Đinh Thị Kim Nhung, 1996] 9 Bảng 2.2: Những khác biệt giữa các loài Acetobacter Đặc điểm tiên mao Chu mao Đỉnh mao Giống Acetobacter Glucono bacter Loài a ce ti xy li n u m m es o xy - d a n s lo va n i - en si s ra n ce s a sc en - d en s p er o xy - d a n s p a ra -d o xu m oxydans 1. Oxy hóa tiếp tục etanol thành CO2 và H2O + + + + + + + + - 2. Catalase + + + + + + - - + 3. Sinh trưởng trên môi trường Hoyer + - - + - - + - - 4. Chuyển hóa glucose thành acid gluconic + + + + + - - - + 5. Chuyển hóa glycerol thành dihydroxy – aceton + + + - - - - - + 6. Tổng hợp cellulose - + - - - - - - - 7. Tạo sắc tố nâu - - - - - - - - + [Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003] 2.2.2 Vi khuẩn Acetobacter xylinum Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic. Quá trình lên men acetic được coi là quá trình lên men dấm nhưng thực chất là một quá trình oxy hóa [Trần Phú Hòa, 1996]. A. xylinum là loài vi khuẩn tạo được BC nhiều nhất trong tự nhiên. Một tế bào A. xylinum có thể chuyển hoá 108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ [Brown và ctv, 1976]. 10 Theo khóa phân loại của Bergey, Acetobacter xylinum thuộc: Lớp : Schizomycetes Bộ : Pseudomonadales Bộ phụ : Pseudomonadiace Họ : Pseudomonadaceae Giống : Acetobacter [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004] 2.2.2.1 Đặc điểm hình thái Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, kích thước khoảng 2 m thay đổi tùy loài. Các tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động hoặc không, không sinh bào tử, Gram âm nhưng Gram của chúng có thể bị thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, vì vậy chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí. Khi phát triển trên môi trường nuôi cấy, các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy tạo thành váng nhăn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iod và acid sulfuric (do phản ứng của hemicellulose) [Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003]. Acetobacter xylinum có thể tích lũy 4,5% acid acetic, sinh trưởng ở pH thấp hơn 5. Acid acetic sinh ra do quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng sinh ra quá mức giới hạn cho phép sẽ ức chế lại chính hoạt động của chúng. Trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, A. xylinum dễ dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt: tế bào có thể phình to hoặc kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh [Trần Phú Hòa, 1996]. A. xylinum có khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần chung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 5 mm. Khi nuôi cấy trong môi trường thạch, lúc còn non, A. xylinum phát triển thành từng tế bào riêng lẻ, nhầy và trong suốt. Khi già, các tế bào dính với nhau thành từng cụm mọc theo đường cấy. 11 Trong môi trường lỏng, sau 24h nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 – 48h, hình thành một lớp trong và ngày càng dày [Lê Thị Khánh Vân, 1985]. Hình 2.3: Vi khuẩn Acetobacter xylinum [24; 31] 2.2.2.2 Đặc điểm sinh lí – sinh hoá Acetobacter xylinum là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, cho phản ứng catalase dương tính; có khả năng oxy hoá tiếp tục ethanol thành acid acetic CH3COOH, CO2 và H2O; chuyển hoá được glucose thành acid, glycerol thành dihydroxyaceton; tổng hợp được cellulose nhưng không có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer và không tạo sắc tố nâu [Nguyễn Lân Dũng, 1978]. Theo Hestrin (1947), pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 4,5 và nó không phát triển ở 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Bergey, nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là 25 – 300C. Còn theo Marcormide (1996) thì A. xylinum có thể phát triển ở pH từ 3 – 8, nhiệt độ là 12 – 350C và nồng độ ethanol lên đến 10% [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. Nguồn carbohydrate mà A. xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao là glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất sẽ thấp hơn khi sử dụng glycerol, lactose, sucrose, maltose; và hiệu suất bằng 0 nếu sử dụng sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol và acetat [Julian a. Ba, 1990 - dẫn liệu của Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003]. 12 2.2.2.3 Chức năng sinh lí của cellulose đối với Acetobacter xylinum Theo Costeron (1999), trong môi trường tự nhiên, vi khuẩn có khả năng tổng hợp các polysaccharid ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bảo vệ bao quanh tế bào, và màng BC là một ví dụ như thế. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm cho tế bào thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Một vài tác giả cho rằng cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum còn đóng vai trò tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose đuợc xúc tác bởi enzyme exo – hay endo – glucanase, sự hiện diện cả hai loại enzyme này được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài chủng A. xylinum. Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc và các vi sinh vật gây bệnh. Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào A. xylinum được bao bọc bởi BC sống sót sau 1giờ xử lí bằng tia cực tím. Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3% [theo Ross và ctv, 1993 - dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. 2.3 Bacterial cellulose (BC) 2.3.1 Sơ lƣợc về lịch sử nghiên cứu sự hình thành BC Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum được nhà bác học Brown báo cáo lần đầu tiên vào năm 1886. Tuy nhiên đến nửa sau thế kỉ XX, các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu rộng rãi về BC. Năm 1943 – 1954, Hestrin và các cộng sự nghiên cứu về khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum, họ chứng minh rằng A. xylinum có thể sử dụng đường và O2 để tạo nên cellulose. Năm 1957, Next và Colvin chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng hợp trong môi trường có đường và ATP. Càng ngày, cấu trúc của BC càng được hiểu rõ theo tiến bộ của khoa học kĩ thuật. 13 Năm 1989, nhóm I.M. Saxena trường Đại học Texa thu nhận được enzyme cellulose synthase tinh sạch của A. xylinum. Enzyme này gồm 2 chuỗi polypeptid có trọng lượng phân tử là 83 và 93kD. Trong đó, tiểu phần 83kD liên quan đến quá trình sinh tổng hợp cellulose tinh khiết. Năm 1990, nhóm đã xác định được gen tổng hợp cellulose ở A. xylinum (dòng hoá và giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose). Ngày nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm về cấu trúc, cơ chế tổng hợp và ứng dụng của BC [Trương Thị Anh Đào, 2004]. 2.3.2 Cấu trúc của BC BC có cấu trúc hóa học tương tự như cấu trúc của cellulose thực vật (plant cellulose - PC), là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua cầu nối - 1,4 – glucan. Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der Waals. Qua nối hydro, các lớp đơn phân tử sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với chiều rộng 1,5 nm. Các tiền sợi này sẽ kết hợp với nhau tạo thành dải có kích thước từ 3 – 4 nm và chiều rộng 70 – 80 nm. Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dải là 3,2 x 133 nm; còn theo Brown và cộng sự (1976) thì là 4,1 x 177 nm. So với PC thì BC có độ polymer hóa cao hơn và kích thước nhỏ hơn, BC có độ polymer hóa từ 2000 – 6000, có trường hợp lên đến 16000 hay 20000. Trong khi đó, khả năng polymer hóa của PC chỉ từ 13000 – 14000 [dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. Hình 2.4: Cấu trúc BC và PC [26; 27] 14 Trong tự nhiên, cellulose kết tinh phổ biến ở dạng I và II. Cellulose I có thể chuyển thành cellulose II nhưng cellulose II thì không thể chuyển ngược lại thành cellulose I. Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy mà cellulose dạng nào chiếm ưu thế. Thông thường, dạng cellulose I được tổng hợp phổ biến hơn. Cellulose I: dài 0,05 – 0,1 m; được tổng hợp bởi đa số thực vật và vi khuẩn A. xylinum trong môi trường lên men tĩnh. Các chuỗi - 1,4 – glucan xếp song song với nhau theo một trục. Năm 1984, Atalla và V. Hart đã xác định được cấu trúc của cellulose I và cellulose I cấu tạo bởi glucose dạng hay . Cellulose II: được tổng hợp ở một số nấm mốc và vi khuẩn như Sarcinaventriculi. Là dạng sợi cellulose ổn định nhất về nhiệt động lực học, các chuỗi glucan xếp đối song nhau hay phân bố tự do. Cellulose II thường được tổng hợp trong môi trường nuôi cấy lắc. Khi đó BC tạo ra ở dạng huyền phù phân tán, các sợi cellulose thường uốn cong, đường kính khoảng 0,1 – 0,2 m [Trương Thị Anh Đào, 2003; Fumihiro Y., 1997]. 2.3.3 Đặc điểm của BC A.J. Brown (1986), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn A.xylinum tạo ra trên môi trường lên men và thấy có bản chất là hemicellulose. Hemicellulose là những polysaccharid không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính. Một số tính chất của BC: Độ tinh sạch: độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Độ bền cơ học: có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và hướng (đặc biệt là cellulose I) Tính hút nước: có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ học cao). [Trần Thị Diễm Chi, 2000]; [25]; [32] 15 2.3.4 Quá trình sinh tổng hợp BC từ vi khuẩn A. xylinum Khi nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B1, B2, B12… và các chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường. Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [Đinh Thị Kim Nhung, 1996] Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose như sau: các tế bào A. xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose [J. A. Bazon, 1984 - dẫn liệu của Đinh Thị Kim Nhung, 1996]. Hình 2.5: Con đƣờng dự đoán quá trình sinh tổng hợp cellulose trong tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004] Tương tự như các thực vật thượng đẳng, vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo và polysaccharid nội bào, lượng oligo và polysaccharid nội bào đạt tới 60% khối lượng khô tế bào, còn polysaccharid ngoại bào có thể vượt nhiều lần khối lượng của vi sinh vật. Thành tế bào cũng chứa một lượng lớn polysaccharid. Tất cả các oligo và 16 polysaccharid được tổng hợp bằng cách thêm một đơn vị monosaccharid vào chuỗi saccharid có trước. Đơn vị monosaccharid tham gia phản ứng dưới dạng nucleotid, monosaccharid được hoạt hóa thường là dẫn xuất của uridin – diphosphat (UDP – X) nhưng đôi khi là các nucleotid purin và pyrimidin khác. Sự tổng hợp diễn ra theo phản ứng chung sau: …X-X-X-X + UDP-X = …X-X-X-X-X + UDP n nhánh (n + 1) nhánh Trong trường hợp polysaccharid gồm 2 loại monosaccharid liên tiếp (X và Y) thì phản ứng chung xảy ra theo 2 bước sau: Bước 1: XYXYXYXY + UDP-X = XYXYXYXYX + UDP Bước 2: XYXYXYXYX + UDP-Y = XYXYXYXYXY + UDP Cơ chế của quá trình tổng hợp các loại polysaccharid phân nhánh hiện nay vẫn còn chưa rõ. Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưng tham gia của chúng vào chuỗi polysaccharid phụ thuộc vào các loại enzyme transferase [Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến, 1980]. Cellulose UDPG Glc UGP GHK G6PD (NAD) G1P G6P PGA G6PD PGI (NADP) Chu trình Pentose Frc F6P phosphate PTS FBD F1P FDP EMP TCA Hình 2.6: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose của A.xylinum PGM FHK 1PFK 17 Glc: glucose UDPG: uridin diphosphate glucose GHK: glucose hexokinase UGP:uridin glucose pyrophosphorylase G6PD: glucose – 6 – phosphate PGM: phosphoglucomutas G1P: glucose – 1 – phosphate G6P: glucose – 6 – phosphate PGI: phosphoglucose isomerase FHK: fructose hexokinase Frc: fructose F6P: fructose – 6 – phosphate PGA: phosphogluconic acid PTS: phosphotransfer system F1P: fructose – 1 – phosphate 1PFK: fructose – 1 phosphate kinase FDP:fructose – 1,6 – diphosphate dehydrogenase 2.3.5 Ứng dụng của BC Dựa vào những đặc tính ưu việt mà BC có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực: Thực phẩm: - Thức ăn tráng miệng (thạch dừa, cocktail, Kombucha, trà Manchurian…) - Các loại bánh snack, kẹo có năng lượng thấp - Chất làm đặc để bổ sung trong kem, dầu trộn salad - Màng bao thực phẩm, màng bảo quản trái cây - Chất ổn định thực phẩm Y tế: - Chất thay thế da tạm thời (da nhân tạo) - Bột cellulose ứng dụng làm tá dược trong bào chế viên nén - Băng gạc, băng trị phỏng Mỹ phẩm: - Ổn định kem dưỡng da - Chất làm se (astringent) - Chất làm đặc và làm chắc trong thuốc sơn móng tay Môi trường: - Làm miếng bọt để xử lí sạch các vết dầu tràn - Hấp thu và loại bỏ những nguyên vật liệu độc 18 Xăng dầu và than đá: - Phát hiện và thu hồi các mỏ khoáng, dầu Công nghiệp dệt: - Sợi nhân tạo cao cấp - Các loại lều, bạt, tã lót có thể vứt đi hay tái sử dụng Công nghiệp giấy: - Làm giấy cao cấp (có độ dai, độ bền cao, vì vậy ứng dụng làm giấy lưu trữ tài liệu, làm tiền, giấy vẽ…) Công nghiệp gỗ: - Ván mỏng nhân tạo (plywood laminate) - Chất tạo độ dai cho giấy, container Công nghiệp máy: - Chế tạo thân xe hơi, các thành tố cấu trúc máy bay, tên lửa… - Màng siêu âm thanh - Thiết bị siêu lọc nước - Màng thẩm thấu 2 chiều [Trần Thị ÁnhTuyết, 2004]; [32] 2.4 Thành phần nguyên liệu sử dụng trong sản xuất BC 2.4.1 Nƣớc dừa già Hiện nay tại Việt Nam và một số quốc gia, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất thạch dừa là nước dừa. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần hoá học trong nước dừa có khác nhau. Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau đó giảm dần). Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sorbitol. 19 Bảng 2.3: Lƣợng đƣờng khử và protein có trong nƣớc dừa vào các giai đoạn khác nhau [Angaido và ctv, 1985] Tuổi (tháng) Đƣờng khử tổng (g/100g) Protein (g/100ml) 4 5 6 7 8 9 10 2,20 2,25 2,39 2,56 2,63 2,89 2,79 0,140 0,210 0,262 0,356 0,504 0,512 0,512 Bergonia và ctv (1984) đã phân tích thành phần carbohydrate trong nước dừa bằng HPLC, thấy: Nồng độ tổng của sucrose, glucose, fructose 3,0 3 gr/100ml mannose, galactose 2.23gr/100ml mannitol 0.3gr/100ml  nồng độ đường tổng 5,15 gr/100ml Ngoài ra, trong nước dừa già còn chứa nhiều vitamin, acid amin, chất kích thích sinh trưởng… rất tốt đối với sự phát triển của A. xylinum. 20 Bảng 2.4: Thành phần hoá học của nƣớc dừa già [Anzaldo và ctv, 1985] Thành phần % khối lƣợng Tỷ trọng Chất rắn tổng số Đường tổng số Tro Dầu béo Protein Clorua pH Nước 1,02 4,71 2,56 0,46 0,74 0,55 0,17 5,60 90,81 Bảng 2.5: Hàm lƣợng vitamin và chất khoáng trong nƣớc dừa [ Vanderberlt, 1945; Trần Phú Hòa, 1996] Vitamin Hàm lƣợng ( g/ml) Khoáng vi lƣợng Hàm lƣợng ( g/ml) Acid ascorbic Acid nicotinic Acid pantothenic Acid folic Biotin Riboflavin Thiamine Pyridoxine 2200 – 3700 0,64 0,52 0,003 0,02 0,01 dạng vết (trace) dạng vết (trace) K Na Ca Mg Fe Cu S P 3,12 1,50 2,09 3,00 0,01 0,04 3,40 3,70 21 Bảng 2.6: Hàm lƣợng acid amin trong nƣớc dừa [Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003] Acid amin Hàm lƣợng (% khối lượng/amin tổng số) Acid amin Hàm lƣợng (% khối lượng/amin tổng số) Acid cysteric Acid aspartic Acid glutamic Xerin Glycerin Threonin Alanin 3,86 2,94 12,47 3,25 7,61 1,07 1,41 Histidin Lysin Arginin Prolin Valin Leucin Phenylalanin 7,86 11,23 3,40 8,57 1,28 3,85 0,18 Ngoài ra, trong nước dừa còn có một số chất kích thích sinh trưởng như 1,3 – diphenyl urea, hexitol, phyllococosine, ribosid, myo-imisitol, sorbitol, cylleinositol, zeatin … Hoạt tính chung của nước dừa là do tác dụng tổng hợp của từng loại hợp chất có trong nước dừa. Các chất này tương đối chịu nhiệt, vì vậy nước dừa còn phát huy được tác dụng tốt sau chế độ thanh trùng [Lê Thị Khánh Vân, 1985 - dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. 2.4.2 Nƣớc cốt dừa Có những vùng miền do đặc tính địa lí nên không có đủ nước dừa để sản xuất thạch dừa, và công việc vận chuyển nước dừa cũng gặp rất nhiều khó khăn, nhất là khi sản xuất với quy mô lớn. Vì vậy, người ta có thể sử dụng nước cốt vắt ra từ cơm dừa để làm môi trường lên men. Nước cốt dừa rất giàu chất béo, carbohydrate và protein. Các protein cơm dừa có giá trị dinh dưỡng cao, nhiều lysine, methionine và tryptophan. 22 Bảng 2.7: Thành phần hóa học của cơm dừa Thành phần (%) Hạch cơm dừa chƣa chín Hạch cơm dừa chín Độ ẩm Protein Chất béo Carbohydrate Xơ thô Tro 90,80 0,90 1,40 6,30 0,60 46,30 4,08 37,29 11,29 3,39 1,03 Bảng 2.8: Thành phần các vitamin trong nƣớc cốt dừa Vitamin Hàm lƣợng ( g/ml) Niacine Acid pantothenic Biotine Riboflavin Acid folic 0,64 0,52 0,02 0,01 0,003 [Subtahmanyan & Swammatha, 1969] Bảng 2.9: Thành phần hóa học của nƣớc cốt dừa Thành phần Hàm lƣợng (%) Theo Hagenmaire (1980) Theo Thampan (1975) Độ ẩm Chất béo Protein Tro Carbohydrate 56,3 33,4 4,1 1,2 5,0 52,0 38,0 3,5 0,9 5,6 23 Nước cốt dừa được vắt lần đầu tiên có pH = 6, vì vậy nó được xếp vào loại thực phẩm có nồng độ acid thấp. Dừa để vắt lấy nước cốt thì nên chín hoàn toàn (12 tháng), càng chín nẫu càng tốt. Lúc này, dừa đã phát triển tối đa, cho lượng nước ít, còn cơm dừa thì cứng và dày. 2.4.3 Nƣớc dứa Bảng 2.10: Thành phần hóa học của nƣớc dứa [33; 34] Thành phần Hàm lƣợng (tính trên 100g) Calories (kcal) Protein (g) Lipid (g) Glucid (g) CHO tổng (g) CHO xơ (g) Tro (mg) Nước (g) 47 – 54 0,4 – 0,7 0,0 – 0,3 11,6 – 13,7 12,39 0,4 – 0,54 0,29 – 0,4 85,3 – 86,5 Bảng 2.11: Hàm lƣợng vitamin và khoáng chất trong nƣớc dứa [28; 33; 34] Thành phần vitamin Hàm lƣợng (mg/100g) Thành phần khoáng Hàm lƣợng (mg/100g) - Caroten Thiamin Riboflavin Niacin Acid ascorbic 32 – 42 0,06 – 0,08 0,03 – 0,04 0,2 – 0,3 17 – 61 Na K Ca P Fe 1 – 2 113 – 146 7 – 18 7 – 12 0,37 – 0,5 24 Bảng 2.12: Hàm lƣợng acid amin trong nƣớc dứa [36] Amino acid Hàm lƣợng (% khối lƣợng/amin tổng số) Amino acid Hàm lƣợng (% khối lƣợng/amin tổng số) Alanine Arginine Asparagine Aspartic acid Cystein Glutamine Glutamic acid Glycerin Histidin Isoleucine 5,60 2,06 7,96 7,96 0,88 3,54 5,31 8,26 0,88 4,42 Leucine Lysine Methionine Phenyl alanine Proline Serine Threonine Tryptophan Tyrosine Valine 5,60 6,49 3,54 5,31 3,83 6,19 5,31 4,42 7,37 5,01 25 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: đề tài được tiến hành từ 03/2005 đến 08/2005. Địa điểm: đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Công nghệ thực phẩm, trường ĐH Nông Lâm TP.HCM 3.2 Vật liệu – hoá chất – trang thiết bị 3.2.1 Vật liệu 3.2.1.1 Nguồn giống Giống vi khuẩn Acetobacter xylinum do phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ thực phẩm cung cấp 3.2.1.2 Nguyên liệu - Nước dừa: lấy từ trái dừa già - Nước cốt dừa: vắt từ cơm dừa, sau đó pha loãng theo các tỷ lệ - Nước dứa: ép lấy nước cốt dứa từ phần cùi dứa, sau đó pha loãng theo các tỷ lệ khác nhau 3.2.2 Hoá chất - Nhóm hoá chất bổ sung vào môi trường: DAP (diamonium phosphate) SA (sulphate amon) Saccharose Agar Acid acetic Cao nấm men - Hoá chất nhuộm Gram 26 3.2.3 Trang thiết bị Một số trang thiết bị và dụng cụ của phòng thí nghiệm vi sinh: nồi hấp autoclave, tủ cấy vô trùng, kính hiển vi, tủ sấy, cân điện tử, các dụng cụ thủy tinh, hộp nhựa… 3.3 Môi trƣờng dinh dƣỡng 3.3.1 Môi trƣờng I: môi trường hoạt hóa Nước dừa già 1lít Saccharose 50g SA 8g DAP 2g Cao nấm men 10g Acid acetic 5ml 3.3.2 Môi trƣờng II: môi trường nhân giống và giữ giống Nước dừa già 1lít Saccharose 20g SA 8g DAP 2g Acid acetic 12ml Chế độ khử trùng của môi trường hoạt hóa và môi trường nhân giống là 1210C, 1atm, 15 phút. Acid acetic được bổ sung sau khi nấu sôi môi trường. 3.3.3 Môi trƣờng thí nghiệm - Môi trường III: môi trường nước cốt dừa - Môi trường IV: môi trường nước dứa 27 3.4 Nội dung và phƣơng pháp thí nghiệm 3.4.1 Thuần khiết giống và nhân giống đã thuần khiết Mục đích thí nghiệm: tạo ra đủ giống thuần khiết cung cấp cho quá trình lên men. Phương pháp: Từ giống chai sẵn có ở phòng thí nghiệm, tiến hành phân lập lại trên môi trường thạch đĩa (công thức môi trường I + 2 % agar). Tìm các khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn A. xylinum, cấy chuyền nhiều lần để thu được khuẩn lạc thuần khiết (quan sát đại thể). Sau khi có khuẩn lạc thuần khiết, tiến hành nhuộm Gram, quan sát ở vật kính X100 nhằm quan sát hình thái và cách sắp xếp tế bào (quan sát vi thể). Sơ đồ nhân giống: Giống thuần khiết  Nhân giống cấp 1 5% thể tích Nhân giống cấp 2 (Trong môi trường (môi trường II (môi trường II trong thạch đĩa) trong ống nghiệm) chai nước biển) 3.4.2 So sánh hiệu quả hoạt hóa giống bằng môi trƣờng I và môi trƣờng I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Mục đích thí nghiệm: đánh giá xem môi trường nào giúp hoạt hóa giống tốt hơn Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại. Nghiệm thức NT1 NT2 Trọng lƣợng BC thô (g) NT1: theo thành phần môi trường I NT2: môi trường I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Dung dịch Skeggs & Wright: MgSO4.7H2O 40g MnSO4.4H2O 2g FeCl3 0,4g HClđ 1ml H2O đến 1lít Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) sau 8 ngày lên men ở nhiệt độ phòng. 28 3.4.3 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc cốt dừa Mục đích thí nghiệm: tìm hiểu sự tương tác giữa các thành phần bổ sung (đường, khoáng) vào môi trường lên men đến trọng lượng BC thô, từ đó suy ra công thức tối ưu nhất cho việc sản xuất BC trên môi trường nước cốt dừa. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 4 yếu tố với 2 lần lặp lại Yếu tố Tỉ lệ cơm dừa/nƣớc (g/ml) DAP (%) SA (%) Sacccharose (%) Nồng độ 1/10 1/20 1/30 0,2 0,4 0,6 0,6 0,8 1,0 2 4 6 MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) 1 10 0,2 0,6 2 28 20 0,2 0,6 2 55 30 0,2 0,6 2 2 10 0,2 0,6 4 29 20 0,2 0,6 4 56 30 0,2 0,6 4 3 10 0,2 0,6 6 30 20 0,2 0,6 6 57 30 0,2 0,6 6 4 10 0,2 0,8 2 31 20 0,2 0,8 2 58 30 0,2 0,8 2 5 10 0,2 0,8 4 32 20 0,2 0,8 4 59 30 0,2 0,8 4 6 10 0,2 0,8 6 33 20 0,2 0,8 6 60 30 0,2 0,8 6 7 10 0,2 1 2 34 20 0,2 1 2 61 30 0,2 1 2 8 10 0,2 1 4 35 20 0,2 1 4 62 30 0,2 1 4 9 10 0,2 1 6 36 20 0,2 1 6 63 30 0,2 1 6 10 10 0,4 0,6 2 37 20 0,4 0,6 2 64 30 0,4 0,6 2 11 10 0,4 0,6 4 38 20 0,4 0,6 4 65 30 0,4 0,6 4 12 10 0,4 0,6 6 39 20 0,4 0,6 6 66 30 0,4 0,6 6 13 10 0,4 0,8 2 40 20 0,4 0,8 2 67 30 0,4 0,8 2 14 10 0,4 0,8 4 41 20 0,4 0,8 4 68 30 0,4 0,8 4 15 10 0,4 0,8 6 42 20 0,4 0,8 6 69 30 0,4 0,8 6 16 10 0,4 1 2 43 20 0,4 1 2 70 30 0,4 1 2 17 10 0,4 1 4 44 20 0,4 1 4 71 30 0,4 1 4 18 10 0,4 1 6 45 20 0,4 1 6 72 30 0,4 1 6 19 10 0,6 0,6 2 46 20 0,6 0,6 2 73 30 0,6 0,6 2 20 10 0,6 0,6 4 47 20 0,6 0,6 4 74 30 0,6 0,6 4 21 10 0,6 0,6 6 48 20 0,6 0,6 6 75 30 0,6 0,6 6 22 10 0,6 0,8 2 49 20 0,6 0,8 2 76 30 0,6 0,8 2 23 10 0,6 0,8 4 50 20 0,6 0,8 4 77 30 0,6 0,8 4 24 10 0,6 0,8 6 51 20 0,6 0,8 6 78 30 0,6 0,8 6 25 10 0,6 1 2 52 20 0,6 1 2 79 30 0,6 1 2 26 10 0,6 1 4 53 20 0,6 1 4 80 30 0,6 1 4 27 10 0,6 1 6 54 20 0,6 1 6 81 30 0,6 1 6 29 Ghi chú: MT: môi trường TLPL: tỷ lệ pha loãng Sac : saccharose Đối chứng là môi trường II. Tỷ lệ giống cấp 2 cấy vào môi trường là 10%. Hàm lượng acid acetic là 1,2 %. Thời gian lên men là 8 ngày ở nhiệt độ phòng. Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) 3.4.4 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc dứa Mục đích thí nghiệm: tìm công thức tối ưu nhất cho việc sản xuất BC trên môi trường nước dứa. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 4 yếu tố với 2 lần lặp lại Yếu tố Tỉ lệ nƣớc dứa/nƣớc (g/ml) DAP (%) SA (%) Saccharose (%) Nồng độ 1/10 1/20 1/30 0,2 0,4 0,6 0,6 0,8 1,0 2 4 6 MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) 1 10 0,2 0,6 2 28 20 0,2 0,6 2 55 30 0,2 0,6 2 2 10 0,2 0,6 4 29 20 0,2 0,6 4 56 30 0,2 0,6 4 3 10 0,2 0,6 6 30 20 0,2 0,6 6 57 30 0,2 0,6 6 4 10 0,2 0,8 2 31 20 0,2 0,8 2 58 30 0,2 0,8 2 5 10 0,2 0,8 4 32 20 0,2 0,8 4 59 30 0,2 0,8 4 6 10 0,2 0,8 6 33 20 0,2 0,8 6 60 30 0,2 0,8 6 7 10 0,2 1 2 34 20 0,2 1 2 61 30 0,2 1 2 8 10 0,2 1 4 35 20 0,2 1 4 62 30 0,2 1 4 9 10 0,2 1 6 36 20 0,2 1 6 63 30 0,2 1 6 10 10 0,4 0,6 2 37 20 0,4 0,6 2 64 30 0,4 0,6 2 11 10 0,4 0,6 4 38 20 0,4 0,6 4 65 30 0,4 0,6 4 12 10 0,4 0,6 6 39 20 0,4 0,6 6 66 30 0,4 0,6 6 13 10 0,4 0,8 2 40 20 0,4 0,8 2 67 30 0,4 0,8 2 14 10 0,4 0,8 4 41 20 0,4 0,8 4 68 30 0,4 0,8 4 15 10 0,4 0,8 6 42 20 0,4 0,8 6 69 30 0,4 0,8 6 16 10 0,4 1 2 43 20 0,4 1 2 70 30 0,4 1 2 30 17 10 0,4 1 4 44 20 0,4 1 4 71 30 0,4 1 4 18 10 0,4 1 6 45 20 0,4 1 6 72 30 0,4 1 6 19 10 0,6 0,6 2 46 20 0,6 0,6 2 73 30 0,6 0,6 2 20 10 0,6 0,6 4 47 20 0,6 0,6 4 74 30 0,6 0,6 4 21 10 0,6 0,6 6 48 20 0,6 0,6 6 75 30 0,6 0,6 6 22 10 0,6 0,8 2 49 20 0,6 0,8 2 76 30 0,6 0,8 2 23 10 0,6 0,8 4 50 20 0,6 0,8 4 77 30 0,6 0,8 4 24 10 0,6 0,8 6 51 20 0,6 0,8 6 78 30 0,6 0,8 6 25 10 0,6 1 2 52 20 0,6 1 2 79 30 0,6 1 2 26 10 0,6 1 4 53 20 0,6 1 4 80 30 0,6 1 4 27 10 0,6 1 6 54 20 0,6 1 6 81 30 0,6 1 6 Ghi chú: MT: môi trường TLPL: tỷ lệ pha loãng Sac : saccharose Đối chứng là môi trường II. Tỷ lệ giống cấp 2 cấy vào môi trường là 10 %. Hàm lượng acid acetic là 1,2 %. Thời gian lên men là 8 ngày ở nhiệt độ phòng. Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) 3.4.5 So sánh sinh khối BC thô thu hoạch từ môi trƣờng nƣớc dừa, nƣớc cốt dừa và nƣớc dứa. Mục đích thí nghiệm: so sánh khả năng tạo sinh khối BC thô từ các môi trường thay thế với môi trường nước dừa già truyền thống để ứng dụng sản xuất ở quy mô rộng rãi hơn, công nghiệp hơn. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại Nghiệm thức NT1 NT2 ĐC Trọng lƣợng BC thô (g) NT1: môi trường nước cốt dừa theo kết quả mục 3.4.3 NT2: môi trường nước dứa theo kết quả mục 3.4.4 ĐC : môi trường nước dừa theo thành phần môi trường II Tỷ lệ giống cấy vào môi trường: 10 % Hàm lượng acid acetic: 1,2 % 31 Thời gian lên men: 8 ngày ở nhiệt độ phòng Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) 3.4.6 Khảo sát ảnh hƣởng của các loại acid đến quá trình lên men tạo BC Mục đích thí nghiệm: đa dạng hóa các loại acid bổ sung để lên men tạo BC. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại Nghiệm thức NT 1 NT 2 NT 3 Trọng lƣợng BC thô (g) NT1: bổ sung HCl đến pH = 4,5 NT2: bổ sung H2SO4 đến pH = 4,5 ĐC : bổ sung acid acetic đến pH = 4,5 Các thành phần khác cố định theo môi trường II. Tỷ lệ giống cấy vào môi trường là 10%, lên men 8 ngày ở nhiệt độ phòng. Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) 3.4.7 Các phƣơng pháp đánh giá 3.4.7.1 Xử lí thống kê Từ trọng lượng BC thô thu hoạch được sau các thí nghiệm, tiến hành xử lí thống kê bằng phần mềm Stagraphic 7.0. 3.4.7.2 So sánh giá trị kinh tế giữa các môi trƣờng lên men sản xuất BC Sau khi tìm được công thức tối ưu để lên men sản xuất thạch dừa trên các môi trường thay thế, tiến hành so sánh giá trị kinh tế của các loại nguyên liệu làm môi trường lên men theo những tỷ lệ pha loãng thích hợp với môi trường lên men truyền thống là nước dừa già. Đơn vị tính là trên 100 lít môi trường. 32 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thuần khiết giống và nhân giống đã thuần khiết Từ giống chai A. xylinum ở phòng thí nghiệm, tiến hành phân lập lại trên môi trường thạch đĩa. Kết quả quan sát đại thể và vi thể như sau: 4.1.1 Quan sát đại thể Sau khi phân lập, mỗi tế bào tách riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc. Các khuẩn lạc có dạng tròn lồi, nhầy và trơn bóng, rìa mép khuẩn lạc nhẵn, màu trắng trong hơi đục. Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt 2-5 mm . 4.1.2 Quan sát vi thể Sau khi chọn khuẩn lạc điển hình, tiến hành nhuộm Gram, quan sát tế bào vi khuẩn ở vật kính X100 dưới giọt dầu cerde thu được kết quả như sau: Bảng 4.1: Kết quả quan sát vi thể Acetobacter xylinum Chỉ tiêu Kết quả Hình dạng Kích thước Nhuộm Gram Hình que, xếp riêng lẻ hoặc thành chuỗi dài 2– 4 m Gram âm (G-) 33 Hình 4.1: Quan sát đại thể và vi thể vi khuẩn A. xylinum Hình 4.2: Giống A. xylinum cấp I và cấp II Như vậy từ giống chai sẵn có chúng tôi đã thuần khuyết được giống A. xylinum và tiến hành giữ giống trong môi trường lỏng (môi trường II) 4.2 So sánh hiệu quả hoạt hoá giống bằng môi trƣờng I và môi trƣờng I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Giống giữ vai trò quyết định đến năng suất lên men. Vì vậy, hoạt hóa giống sau một thời gian dài bảo quản là công việc hết sức quan trọng. Môi trường hoạt hóa sao cho tiện dụng, rẻ, đem lại hiệu quả cao là vấn đề đặt ra. 34 Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.2 và hình 4.3 Bảng 4.2: So sánh sinh khối BC thô giữa môi trƣờng I và môi trƣờng I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Môi trƣờng Môi trƣờng 1 Môi trƣờng I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Trung bình trọng lượng BC thô (g) 111,4 114,2 Hình 4.3: Biểu đồ so sánh trọng lƣợng BC thô giữa 2 môi trƣờng Qua bảng kết quả 4.2 và hình 4.3 chúng tôi thấy sinh khối BC thô tạo ra bởi vi khuẩn A. xylinum sau quá trình hoạt hóa bởi 2 loại môi trường là tương đương nhau, không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê (trắc nghiệm F, độ tin cậy 95 % - phụ lục 1). Việc bổ sung thêm dung dịch Skeggs & Wright là nhằm cung cấp thêm các loại muối khoáng, các thành phần vô cơ để kích thích sự phát triển của A. xylinum. Nhưng kết quả cho thấy rằng không có sự gia tăng đáng kể về trọng lượng BC. Có nghĩa là lượng khoáng chất trong nước dừa (môi trường I) đã đủ cho sự sinh trưởng và phát triển của A. xylinum, không cần phải bổ sung thêm, giúp tiết kiệm chi phí sản xuất. 111.4 114.2 0 50 100 150 NT1 NT2 Nghiệm thức Tr ọn g lư ợn g BC (g ) 35 4.3 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc cốt dừa Bảng 4.3: Kết quả sinh khối BC thô thu đƣợc từ các môi trƣờng (g) Qua bảng kết quả 4.3 và qua xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F, xác suất p << 0.05 (phụ lục 2), chúng tôi thấy rằng cả 4 yếu tố tỷ lệ pha loãng, DAP, SA và saccharose đều có tương tác với nhau. Công thức môi trường số 21, 24, 27 cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với các công thức môi trường khác, khác biệt này là rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học. Tuy nhiên, khác biệt về trọng lượng BC thô giữa 3 môi trường 21, 24 và 27 không có ý nghĩa về mặt thống kê (độ tin cậy 95%). Tỷ lệ cơm dừa/nước = 1/10 cho trọng lượng BC cao nhất, khác biệt này có ý nghĩa thống kê so với các tỷ lệ pha loãng 1/20 và 1/30. MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB 1 81.7 97.1 89.4 28 72.2 70.5 71.4 55 63 62.6 62.8 2 89.5 95.1 92.3 29 78.9 79.2 79.1 56 72.2 68.2 70.2 3 90.1 91.3 90.7 30 77.3 75.3 76.3 57 65.4 64.5 65 4 91.2 90 90.6 31 88.4 85 86.7 58 82 85.6 83.8 5 93.5 95.3 94.4 32 86.5 85 85.8 59 83.1 78.5 80.8 6 91.0 91 91 33 77.5 80.4 79 60 70 68.4 69.2 7 100 97.8 98.9 34 88.2 90.1 89.2 61 63.6 62.2 62.9 8 92.6 93.2 92.9 35 81 82.3 81.7 62 70.1 69.5 69.8 9 90.8 90.1 90.5 36 83 82 82.5 63 80.2 80.5 80.4 10 88.8 85 86.9 37 74.4 75.2 74.8 64 62.3 60 61.2 11 97.1 88.9 93 38 81.2 85 83.1 65 66.6 65.2 65.9 12 98 90.5 94.3 39 88 90.1 89.1 66 80.1 83 81.6 13 101.3 90.1 95.7 40 70.7 80.7 75.7 67 85 91 88 14 98.1 88.9 93.5 41 88 80.2 84.1 68 75.4 78.5 77 15 96.3 86.9 91.6 42 91 90 90.5 69 79.9 87 83.4 16 95.2 90.7 93 43 78.5 82 80.3 70 87.5 90 89 17 96.1 92.4 94.3 44 93 90.3 91.7 71 90 92.3 91.1 18 97.4 95.6 96.5 45 92 95 93.5 72 93.1 95 94 19 97 94.6 95.8 46 88.8 90 89.4 73 73.5 79.1 76.3 20 96.7 97 96.8 47 86 90.1 88 74 75 75.4 75.2 21 126.4 117.8 122.1 48 86.6 88.2 87.4 75 75 77.7 76.4 22 95.6 96.2 95.9 49 78.9 80 79.5 76 80.9 80.6 80.8 23 92.1 90.5 91.3 50 85.6 86 85.8 77 90.2 91.9 91 24 117.8 120.4 119.1 51 97 95.1 96 78 83 86 84.5 25 95.5 95 95.3 52 108 98.8 103.4 79 88 89.2 88.6 26 109.8 100 104.9 53 101.1 100.2 100.7 80 90.7 96 93.3 27 116.4 115.6 116 54 100.2 99.8 100 81 84 85.4 84.7 36 Hàm lượng DAP = 0,6 % cho trọng lượng BC cao nhất, khác biệt này có ý nghĩa thống kê so với các tỷ lệ 0,2 và 0,4 %. Hàm lượng phosphate này là cần thiết để A. xylinum phát triển tạo cellulose. Nếu xét riêng từng yếu tố thì hàm lượng SA = 1% cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với hàm lượng SA = 0,6 % và 0,8 %. Nhưng do cả 4 yếu tố có tương tác với nhau nên hàm lượng SA = 0,6 % cũng tạo ra một lượng BC tương đương với khi dùng 0,8 % hay 1% SA. Như vậy, để có hiệu quả kinh tế trong sản xuất, chúng tôi đề nghị chọn SA = 0,6 % làm công thức lên men. Từ sự tương tác 4 yếu tố, chúng tôi nhận thấy rằng hàm lượng đường = 6 % cho trọng lượng BC cao nhất. Công thức tối ưu để sản xuất BC trên môi trường nước cốt dừa được trình bày trong bảng 4.4 Bảng 4.4: Công thức tối ƣu để sản xuất BC trên môi trƣờng nƣớc cốt dừa Yếu tố Tỷ lệ cơm dừa/nƣớc (g/ml) DAP (%) SA (%) Saccharose (%) Nồng độ 1/10 0,6 0,6 6 Như vậy, với công thức trên, ta có thể sản xuất BC từ môi trường nước cốt dừa thay cho môi trường nước dừa già truyền thống. Điều này sẽ hạn chế được những khó khăn, tốn kém của việc vận chuyển nước dừa khi sản xuất BC ở những vùng miền không có nguyên liệu là nước dừa già. 37 4.4 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc dứa Bảng 4.5 : Kết quả trọng lƣợng BC thô thu đƣợc từ các môi trƣờng (g) MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB 1 89.5 75 82.3 28 103.3 100 101.7 55 86.3 85.3 85.8 2 98.8 109.3 104 29 65.4 65 65.2 56 70.1 69.1 69.6 3 78.7 86 82.3 30 70.5 62 66.3 57 96.5 95.1 95.8 4 89 92 90.5 31 75.6 72.6 74.1 58 104 95 99.5 5 77.7 92.5 85.1 32 72.1 72.1 72.1 59 74.2 74 74.1 6 94.5 99 97 33 82.5 82.5 82.5 60 77.8 77.8 77.8 7 84.5 88 86.3 34 98 100 99 61 87.5 70.3 78.9 8 80 99 89.5 35 70.5 70.2 70.35 62 78.6 87.5 83 9 91.5 103 97.3 36 75.2 65.6 70.4 63 74.5 75.2 75 10 68.2 77 72.6 37 70.1 70.1 70.1 64 69.1 65 67 11 64.5 74.5 69.5 38 69.5 66.6 68 65 75.6 74.5 75 12 79.7 81 80.3 39 67.7 74.5 71.1 66 80.5 72.6 76.5 13 86.2 116 101.1 40 90.7 79.4 85 67 78.5 73.2 76 14 90.3 99 95 41 88.9 95.1 92 68 89.1 89.9 89.5 15 80.1 92.2 86.2 42 93.2 90 91.6 69 86.2 90 88.1 16 91.7 76 84 43 102.4 72.3 87.4 70 84.4 84.5 84.5 17 85.5 80 82.8 44 74.5 60.1 67.3 71 94.6 104.6 99.6 18 84.2 71 77.6 45 82.5 72.8 77.7 72 77.6 73.7 75.7 19 95.2 92.6 93.9 46 93.1 78.8 86 73 93 76.1 84.6 20 104 103 103.5 47 86.6 79.4 83 74 91.1 91.1 91.1 21 88.4 91.2 89.8 48 81.2 81.2 81.2 75 91.2 71.2 81.2 22 118.6 115 116.8 49 108.2 77.5 93 76 112.3 108 110 23 92.1 91.5 91.8 50 97.7 84 91 77 101.5 103 102.3 24 98 104 101 51 97.1 97.1 97.1 78 116.2 106.2 111.2 25 100.3 88 94.2 52 107.4 96.8 102.1 79 104.3 104.3 104.3 26 99.2 88.2 93.7 53 99.1 97.8 98.5 80 103.7 103 103.7 27 109.8 92 100.9 54 93.7 93.7 93.7 81 100.7 95 98 Qua bảng kết quả 4.5 và qua xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F, xác suất p < 0,05 (phụ lục 3), chúng tôi nhận thấy rằng cả 4 yếu tố tỷ lệ pha loãng, DAP, SA và saccharose có tương tác với nhau. Công thức môi trường số 22 và 78 cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với các công thức môi trường khác. Khác biệt này rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học. Công thức tối ưu cho việc sản xuất thạch dừa trên môi trường nước dứa được trình bày trong bảng 4.6 38 Bảng 4.6 : Công thức tối ƣu để sản xuất thạch dừa trên môi trƣờng nƣớc dứa Công thức môi trƣờng Tỷ lệ dứa/nƣớc (g/ml) DAP (%) SA (%) Saccharose (%) 22 78 1/10 1/30 0,6 0,6 0,8 0,8 2 6 Ở công thức môi trường 22, khi ta pha loãng theo tỷ lệ dứa / nước = 1/10 thì lượng đường có trong nước dứa còn khá đủ để lên men tạo BC. Vì vậy ta chỉ cần bổ sung thêm 2 % saccharose để tạo công thức tối ưu cho lên men sản xuất BC. Đối với công thức môi trường 78, tỷ lệ dứa / nước = 1/30, nghĩa là pha loãng 30 lần, lượng saccharose có trong nước dứa sẽ giảm đi, vì thế cần phải bổ sung thêm đường. Lúc này hàm lượng saccharose phải là 6 % mới đảm bảo đủ cho quá trình lên men. Như vậy, ứng dụng vào thực tế, tùy thuộc tình hình, điều kiện và quy mô sản xuất mà ta chọn pha môi trường theo công thức 22 hay 78. 4.5 So sánh sinh khối BC thô thu hoạch từ môi trƣờng nƣớc dừa, nƣớc cốt dừa và nƣớc dứa Sinh khối BC thô thu hoạch từ các môi trường nước dừa (công thức môi trường II), nước cốt dừa (theo công thức tối ưu mục 4.3) và nước dứa (công thức tối ưu mục 4.4) được trình bày trong bảng 4.7 và hình 4.4 Bảng 4.7: Sinh khối BC thô thu hoạch từ các môi trƣờng sản xuất khác nhau Môi trƣờng Nƣớc dừa Nƣớc cốt dừa Nƣớc dứa Trung bình trọng lƣợng BC thô (g) 140 141 135 39 Hình 4.4: Biểu đồ so sánh sinh khối BC thô giữa 3 loại môi trƣờng Qua bảng kết quả 4.7 chúng tôi nhận thấy sinh khối BC tạo ra từ các loại môi trường là tương đương nhau. Và qua xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F, độ tin cậy 95% (phụ lục 4) càng thấy rõ rằng không có sự khác biệt ý nghĩa về phương diện thống kê học giữa trọng lượng BC được tạo ra từ 3 loại môi trường. Như vậy, khả năng tạo sinh khối BC của 2 môi trường thay thế (môi trường nước cốt dừa và môi trường nước dứa) là tương đương với môi trường truyền thống (môi trường nước dừa già). Về mặt chất lượng, qua đánh giá cảm quan sơ bộ thấy kết quả như sau: Bảng 4.8: Kết quả cảm quan BC thô thu hoạch từ 3 loại môi trƣờng Các tính chất Môi trƣờng Nƣớc dừa già Nƣớc cốt dừa Nƣớc dứa Màu sắc Cấu trúc Trắng đục Chặt, mịn, không tách lớp Trắng ngà Hơi chặt, mịn, không tách lớp Trắng ngà Rất chặt, mịn, không tách lớp Qua bảng kết quả 4.8, chúng tôi thấy rằng màu sắc BC sản xuất từ nước dừa có màu trắng đẹp hơn, nhưng màu trắng ngà của BC thô có thể mất hoặc giảm đi rất nhiều 135 141140 0 50 100 150 nước dừa nước cốt dừa nước dứa Môi trường Tr ọn g lư ợn g B C (g ) 40 sau quá trình ngâm và rửa kĩ. Còn về cấu trúc, BC sản xuất từ nước dứa có cấu trúc chặt chẽ hơn, BC sản xuất từ môi trường nước cốt dừa thì kém chặt hơn, nhưng ở cả 2 môi trường thay thế không có sự khác biệt lắm so với BC sản xuất từ nước dừa. Nhìn chung, màu sắc và cấu trúc của BC thô không ảnh hưởng mạnh đến chất lượng cảm quan của sản phẩm sau này. Điều này được trình bày cụ thể trong phần ứng dụng của BC. Vì vậy, môi trường nước cốt dừa và nước dứa hoàn toàn có khả năng thay thế nước dừa già để sản xuất BC ở quy mô công nghiệp. Hình 4.5: Sản phẩm BC thô thu hoạch từ 3 môi trƣờng 4.6 Khảo sát ảnh hƣởng của các loại acid đến quá trình lên men tạo BC Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.9 và hình 4.6 Bảng 4.9: So sánh sinh khối BC thô tạo ra khi thay đổi acid bổ sung đến pH = 4,5 Loại acid bổ sung CH3COOH HCl H2SO4 Trung bình trọng lƣợng BC thô (g) 139,3 135,7 136,3 41 Acid bổ sung (để đạt pH = 4,5) Hình 4.6: Biểu đồ so sánh trọng lƣợng BC thô khi thay đổi acid bổ sung đến pH = 4,5 Qua bảng số liệu 4.9 và kết quả xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F và LSD (phụ lục 5), chúng tôi thấy không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê giữa trọng lượng BC thô được tạo ra từ các môi trường bổ sung các loại acid khác nhau. Từ đây có thể kết luận rằng vai trò của acid acetic chỉ là chất điều chỉnh pH, tạo ra môi trường acid để lên men, chứ không đóng vai trò là chất cung cấp năng lượng cho A. xylinum phát triển. Như vậy, trong sản xuất công nghiệp, ta có thể thay thế acid acetic bằng các loại acid vô cơ khác như HCl, H2SO4 để tiện dụng hơn, kinh tế hơn. 4.7 So sánh giá trị kinh tế của các loại môi trƣờng lên men sản xuất BC Đa dạng hóa các loại môi trường lên men nhằm đem lại sự tiện dụng, đa dạng, tránh phụ thuộc nguồn nguyên liệu nhưng đồng thời phải tính đến giá thành của các nguyên liệu sản xuất. 136.3135.7139.3 0 50 100 150 Tr ọn g lư ợn g BC (g ) CH3COOH H2SO4 HCl 42 Bảng 4.10: So sánh giá thành các loại nguyên liệu tính trên 100 lít môi trƣờng sản xuất BC Môi trƣờng nƣớc dừa Thành phần Nước dừa DAP (0,2%) SA (0,8%) Saccharose (2%) Đơn vị (đ/kg) 1000 16.000 6.000 8.000 Số lƣợng (kg) 100 0,2 0,8 2 Thành tiền 100.000 3200 4800 16.000 Tổng tiền (đ) 124.000 Môi trƣờng nƣớc cốt dừa Thành phần Cơm dừa DAP (0,6 %) SA (0,6 %) Saccharose (6%) Đơn vị (đ/kg) 8000 16.000 6.000 8.000 Số lƣợng (kg) 10 0,6 0,6 6 Thành tiền 80.000 9600 3600 48.000 Tổng tiền (đ) 141.200 Môi trƣờng nƣớc dứa (Theo công thức môi trƣờng 22) Thành phần Dứa DAP (0,6 %) SA (0,8 %) Saccharose (2%) Đơn vị (đ/kg) 2000 16.000 6.000 8.000 Số lƣợng (kg) 10 0,6 0,8 2 Thành tiền 20.000 9600 4800 16.000 Tổng tiền (đ) 50.400 Môi trƣờng nƣớc dứa (Theo công thức môi trƣờng 78) Thành phần Dứa DAP (0,6 %) SA (0,8 %) Saccharose (6%) Đơn vị (đ/kg) 2000 16.000 6.000 8.000 Số lƣợng (kg) 3,3 0,6 0,8 6 Thành tiền 6600 9600 4800 48.000 Tổng tiền (đ) 69.000 43 Qua bảng số liệu 4.10, chúng tôi nhận thấy môi trường nước cốt dừa có giá thành cao hơn so với môi trường nước dừa già truyền thống, tuy nhiên chúng tôi vẫn khuyến khích sử dụng nước cốt dừa làm môi trường thay thế vì tính tiện dụng của môi trường này. Việc vận chuyển cơm dừa sẽ dễ dàng và đơn giản hơn rất nhiều so với vận chuyển nước dừa, nhất là khi vận chuyển với số lượng lớn để ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Đối với môi trường nước dứa, do tận dụng được dứa phụ liệu từ các quy trình sản xuất thực phẩm khác, nhất là cùi dứa từ các cơ sở sản xuất dứa đóng hộp, nên giá thành thấp hơn rất nhiều so với môi trường nước dừa già truyền thống. Như vậy, việc sử dụng các loại môi trường thay thế sẽ giúp khắc phục phần nào những khó khăn của việc dùng nước dừa già làm nguyên liệu sản xuất BC ở quy mô công nghiệp như khu vực, điều kiện địa lí, thời vụ, công tác vận chuyển, giá thành… Ta có thể tiến hành sản xuất BC trên các môi trường thay thế này nhằm đem lại sự đa dạng trong sản xuất, tránh lệ thuộc nguồn nguyên liệu, lại vừa tiết kiệm chi phí sản xuất, đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn. 44 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian tiến hành đề tài, chúng tôi đã thu được các kết quả và rút ra một số kết luận như sau: - Thuần khiết giống A. xylinum từ giống chai sẵn có, giữ giống trên môi trường thạch nghiêng là công đoạn cần thiết để tránh hiện tượng thoái hóa giống, giúp phục hồi giống nhanh sau thời gian dài bảo quản. - Thành phần môi trường nước cốt dừa có tỷ lệ pha loãng là 10 lần (cơm dừa / nước = 1/10); hàm lượng DAP 0,6 %; SA 0,6 %; saccharose 6 % là thích hợp nhất cho lên men sản xuất BC. - Công thức thích hợp nhất cho lên men sản xuất BC trên môi trường nước dứa: Tỷ lệ dứa / nước = 1/10, DAP 0,6 %; SA 0,8 %; saccharose 2 % Hay: Tỷ lệ dứa / nước = 1/30; DAP 0,6 %; SA 0,8 % và saccharose 6% - Nước cốt dừa và nước dứa có khả năng thay thế nước dừa già làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất BC từ A. xylinum. - Có thể dùng các loại acid khác thay thế acid acetic để điều chỉnh pH đến 4,5 làm môi trường lên men. Các acid vô cơ khác (HCl, H2SO4) rẻ hơn sẽ giúp tiết kiệm chi phí sản xuất. 5.2 Đề nghị Do giới hạn về thời gian và điều kiện thí nghiệm nên đề tài còn nhiều hạn chế. Nếu được tiếp tục nghiên cứu với điều kiện tốt hơn, chúng tôi xin đề nghị một số ý kiến sau: - Tiến hành các thí nghiệm trên ở quy mô lớn hơn. - Lặp lại thí nghiệm nhiều lần hơn để kiểm chứng các kết quả thu được. - Nghiên cứu xác định công thức sản xuất BC trên một số môi trường khác: nước mía, nước chiết bã men bia, rỉ đường… để mở rộng nguồn nguyên liệu. - Nghiên cứu thêm nhiều sản phẩm khác để đa dạng hóa ứng dụng của BC. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Trần Thị Diễm Chi, 2000. Khảo sát quy trình nuôi cấy và một số ứng dụng của A. xylinum trong y dược. Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, ĐH Y Dược TPHCM. 2. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến, 1975. Vi sinh học, tập 1. NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội. 3. Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1976. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2. NXB Khoa học và kĩ thuật Hà Nội. 4. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến, 1980. Vi sinh học, tập 2. NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội. 5. Trương Thị Anh Đào, 2003. Tối ưu hoá một số môi trường nuôi cấy Acetobacter xylinum để sản xuất BC. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học, ĐH Khoa học tự nhiên TPHCM. 6. Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003. Sản xuất BC trên môi trường nước mía và nước chiết bã men bia - Một số ứng dụng của BC trong công nghệ thực phẩm. Khóa luận tốt nghiệp khoa Công nghệ thực phẩm, ĐH Nông Lâm TPHCM. 7. Vương Thị Việt Hoa, 2000. Giáo trình thực tập Vi sinh thực phẩm. Trường ĐH Nông Lâm TPHCM. 8. Trần Phú Hòa, 1996. Nghiên cứu về thạch dừa. Khóa luận tốt nghiệp khoa Công nghệ hoá học và dầu khí, ĐH Bách Khoa TPHCM. 9. Đinh Thị Kim Nhung, 1996. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter và ứng dụng chúng trong lên men acetic theo phương pháp chìm. Luận án Phó tiến sĩ khoa học sinh học, Hà Nội. 10. Lương Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh vật. NXB Nông nghiệp Hà Nội 46 11. Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003. Phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Acetobacter để ứng dụng lên men dấm. Khóa luận tốt nghiệp khoa Công nghệ thực phẩm ĐH Nông Lâm TPHCM. 12. Trần Thị Ánh Tuyết, 2004. Bước đầu cố định enzyme amylase trên chất mang cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose). Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sinh học, ĐH Khoa Học Tự Nhiên TPHCM. 13. Lê Thị Khánh Vân và ctv. Sản xuất thạch dừa từ nước dừa. Tạp chí tháng 07/85. Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 14. Anzaldo et al, 1985. Co _ water as in intravenous fluid. Phi. J. coco strudies 10 (1): 31 – 34 15. Africa TK., 1944. The production of Nata from co. water. Unitas 22: 60 – 100 16. Bergonia et al, 1984. High performance liquid chromatographic analysis of carbohydrates in co. water. Proc. Second ASEAN workshop on Food Analytical Techniques Surabaya, Indonesia 203 – 24. 17. Brown et al, 1976. Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 73 (12): 4565 – 4569 18. C. S. Pederson, 1995. Microbiology of food fermentation. 19. Fumihiro Yoshinagha et al, 1997. Research Progess in production of bacterial cellulose by aeration and agitation culture and its applications as a new industrial material. Biosci. Biotech. Biochim 20. J. A. Bazon, J. C. Velasco, 1984. Coconut production and unilisation Coconut water. Pp. 291 - 305. 21. Julian a. Ba, 1990. Coconut as food. Philippines Coconut research and development. Quenzon city. 22. Sanger PC., 1987. Nata de Coco, a profitable cottage industry DCRDF Professional chair lecture, institute of food science and technology. College of Agriculture university of Phils. 23. Vanderbelt J., 1945. Nutritive value of co. nature. 156: 174 – 175. 47 TÀI LIỆU INTERNET 24. www. webcom. com / ~ sease/ kombucha / roche. html 25. www. botany. utexas. edu / facstaff / facpages / mbrown / aceto. htm 26. www. res. titech. acid amin.jp /~ junkan/ english/ cellulose 27. www. res. titech. ac. jp /~ junkan/ english/ cellulose 28. www. tabledescalories. com / uk / index 29. www. HappyHerbalist. com 30. www. visualsunlimited. com 31. www. botany. utexas. edu/…/ movies / movies.htm 32. www. botany. utexas. edu/ facstaff / facpages / mbrown / position 1. htm 33. http:// businessafrica. net/ africabiz/ arvol1/ is44front. php 34. http:// food. oregonstate. edu/ a / pine. html 35. home. wanadoo. nl/…/ bacteriologiehandboek. htm 36. www. sdsc. edu / pb / edu / pharm207 / 7 / pineapple. html