Khóa luận Đánh giá đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium thu thập tại tỉnh Bình Phước và thị xã Bảo Lộc (tỉnh Lâm Đồng) bằng kỹ thuật RAPD

7 – 12 cm với 7 – 9 gân dọc. Cụm hoa mọc ở đỉnh, thân già không có lá dài 20 – 30 cm mang 5 – 10 hoa buông xuống. Hoa lớn dài 4 – 5 cm, màu vàng cam. Cánh môi hình chén, màu cam đậm với hai đốm lớn tròn màu đỏ. Long Nhãn: Lan sống phụ, mọc bụi, dày, cao đến 1m. Lá hình giáo, mỏng, tù ở gốc, thuôn nhọn ở đỉnh, dài 10 – 13 cm. Cụm hoa hình chùy trên thân có lá, mang 8 – 10 hoa lớn buông xuống. Hoa màu vàng nghệ, cánh môi lớn dạng trái xoan, khía rãnh mãnh, có đốm lớn màu đỏ đậm ở giữa. D. lindleyi Steudel D. thrysiflorum Reichb D. heterocarpumi D. fimbriatum 33 Hình 3.1 Các loài lan rừng giống Dendrobium nghiên cứu D. chrysotosum D. densiflorum Wall D. farmari Paxt D. primulinum Lindl D. moschatum 34  Cách thức lấy mẫu nhƣ sau : Chọn những lá tƣơi tốt, chỉ lấy lá non. Mỗi mẫu lấy 2 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh có ƣớp muối nhằm bảo quản độ tƣơi của lá. Những cây chọn lấy mẫu lá đƣợc cột dây nylon màu để đánh dấu. Mẫu lá đƣợc lấy tại vƣờn và đem về phòng thí nghiệm để ly trích DNA ngay. 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm  Các hoá chất dùng trong ly trích DNA Nitơ lỏng. Dung dịch EB (extraction buffer):  2% w/v CTAB  1,4M NaCl  100 mM Tris – HCl pH 8.0  20 mM EDTA  2% PVP  0,1% v/v β – mercaptoethanol TE buffer, bao gồm 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA (pH 8.0). Dung dịch phenol / chloroform / isoamylalcohol (PCI) tỉ lệ 25 : 24 : 1. Dung dịch isopropanol lạnh. Sodium acetate. Ethanol 70% và 100%. RNase.  Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR 5X PCR buffer (do công ty Promega cung cấp). 25 mM MgCl2 (do công ty Promega cung cấp). 10 mM dNTP’s (do công ty Promega và Biorad cung cấp). Taq DNA polymerase (do công ty Promega cung cấp). DNA mẫu (ly trích từ lá lan rừng giống Dendrobium). H2O cất 2 lần, siêu lọc, hấp khử trùng, chiếu UV. 35 RAPD Primer (do công ty Invitrogen cung cấp). Bảng 3.2 Danh sách các primer dùng trong nghiên cứu Primer Trình tự Tm ( 0 C) (Melting temperature) OPAC10 AGCAGCGAGG 34 OPAH13 TGAGTCCGCA 32 OPAF16 TCCCGGTGAG 32 OPB01 GTTTCGCTCC 32 OPB08 GTCCACAGGG 34 U109 TGTACGTGAC 32 U693 GACGAGACGG 34 T3 TCCACTCCTG 32 S1384 AGGACTGCTC 32 V20 CAGCATGGTC 30  Hóa chất dùng trong điện di Agarose. Dung dịch TAE 0,5X. Ladder 100 bp. Loading dye. Dung dịch nhuộm ethidium bromide. 3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm Chén sứ và chày giã (Đức). Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml (Mỹ). Cân phân tích 4 số (Ohaus – Mỹ). Máy hút và tủ cấy vô trùng (Anh Quốc). Pipet các loại (Nichiryo – Nhật). Găng tay. 36 Đầu tuýp các loại (Đức). Máy ly tâm lạnh (Hettich – Đức). Tủ cấy vô trùng. Máy PCR (Biorad – Thụy Điển). Máy điện di (Cosmo Bio Co. – Nhật). Máy chụp ảnh DNA (Biorad – Mỹ). Lò viba (Electrolux – Thụy Điển). Máy định ôn (Memmert – Đức). Tủ lạnh (Sanyo – Nhật). Máy chụp ảnh kỹ thuật số (Sony – Nhật) 3.3. Phƣơng pháp 3.3.1. Quy trình ly trích DNA tổng số DNA của lá lan đƣợc ly trích theo qui trình ly trích của Doyle và Doyle (1990), đã đƣợc tối ƣu bởi Trƣơng Minh Dũng, 2007 (kết quả chƣa công bố). Quy trình ly trích nhƣ sau: Bƣớc 1: Nghiền 0,5 g lá trong N2 lỏng. Bƣớc 2: Thêm 1 ml dung dịch EB đã ủ ở 650C, lắc cho đến khi hỗn hợp đồng nhất. Bƣớc 3: Ủ mẫu ở 650C trong 1 giờ. Bƣớc 4: Ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Bƣớc 5: Hút dịch nổi. Thêm 500 l hỗn hợp PCI. Lắc đều và ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Bƣớc 6: Hút dịch nổi. Lặp lại bƣớc 5. Bƣớc 7: Hút dịch nổi. Thêm 20 l muối sodium acetate 3M và 640 l ethanol 100%. Trộn đều và ủ mẫu ở -200C trong 1 giờ. Bƣớc 8: Thu tủa bằng cách ly tâm 5.000 vòng/phút trong 30 phút ỡ 40C. Bƣớc 9: Hòa tan tủa bằng cách thêm 300 l dung dịch TE 1X. Ủ mẫu ở 37 0Ctrong 1 giờ. 37 Bƣớc 10: Thêm 300 l dung dịch isopropanol lạnh, ủ mẫu qua đêm. Bƣớc 11: Thu tủa bằng cách ly tâm 5.000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C. Bƣớc 12: Đỗ bỏ dịch trong. Rửa tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 100%, ly tâm 5.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. Bƣớc 13: Lặp lại bƣớc 12. Bƣớc 14: Phơi khô tủa ở 370C trong khoảng 2 giờ. Bƣớc 15: Thêm 50 l dung dịch TE 1X và trữ mẫu ở -200C. 3.3.2. Kiểm tra định tính và định lƣợng DNA 3.3.2.1. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di DNA sau khi ly trích sẽ đƣợc định tính bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1 %. Dƣới tác dụng của điện trƣờng, do tích điện âm (do tính chất của nhóm phosphate) nên DNA di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ sát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh, do đó DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy ta có thể phân loại đƣợc các đoạn DNA trên gel agarose. Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA đƣợc phân ra tùy theo trọng lƣợng phân tử. Có thể quan sát chúng bằng mắt nhờ kỹ thuật nhuộm màu với ethidium bromide và chụp gel bằng tia UV. Cách tiến hành: Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5 X. Đun sôi bằng lò Viba ở bƣớc sóng 650 W cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến khoảng 600C. Đổ gel, chờ agarose đông. Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 l loading dye và 4 l DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 250 mA, thời gian 20 phút. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide 10mg/ml trong 20 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả. Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ phát sáng 38 dƣới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. 3.3.2.2. Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp đo OD (Optical Density) Các mẫu DNA li trích sau khi đã định tính bằng phƣơng pháp điện di, sẽ đƣợc kiểm tra độ tinh sạch và ƣớc lƣợng hàm lƣợng DNA bằng cách đo mật độ quang OD, với bƣớc sóng 260 nm và 280 nm bằng máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần. Hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức: Hàm lƣợng DNA (ng/µl) = [(62,9 x OD260nm) – (36 x OD280nm)] x 100 DNA đƣợc xem là sạch nếu tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,5 đến 2,2. Cách tiến hành: Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: Hút 20 l dung dịch DNA hòa tan với 1,8 ml TE 1X. Cho vào Curvette. Tiến hành đo OD. 3.3.3. Tối ƣu hóa các thành phần phản ứng PCR với marker RAPD Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành tối ƣu hóa phản ứng PCR dựa trên chƣơng trình nhiệt và các thành phần hóa chất chuẩn nhƣ sau: Bảng 3.3 Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 5 45 94 1/2 Ta 1/2 72 1 1 72 5 Hold 4 0 C (Đƣợc trích từ Nguyễn Thị Lang, 2002) 39 Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR Hóa chất Nồng độ sử dụng PCR buffer MgCl2 dNTP Primer Taq polymerase DNA mẫu H2O 1X 2 mM 0,2 mM 0,25 M 0,5U 30 ng Thêm vừa đủ 25 l (Đƣợc trích từ Nguyễn Thị Lang, 2002)  Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của số chu kỳ khuếch đại đến sản phẩm RAPD. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 2 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA. Bảng 3.5 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của số chu kỳ đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 5 1 94 4 37 94 1/2 45 94 1/2 36 1/2 36 1/2 72 1 72 1 1 72 5 1 72 5 Giữ ở 40C Giữ ở 40C Phƣơng pháp tiến hành: chọn ngẫu nhiên 1 mẫu DNA có chất lƣợng tốt, thực hiện phản ứng PCR với primer OPAC10 với nồng độ các thành phần phản ứng nhƣ bảng 3.4. Ở thí nghiệm này, chúng tôi chọn DNA của loài lan Thái Bình (Bảo Lộc) để thực hiện. 40 Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng, rõ của các băng khuếch đại trên gel điện di. Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR dùng trong thí nghiệm 1 Hóa chất Nồng độ sử dụng PCR buffer MgCl2 dNTP Primer Taq polymerase DNA mẫu H2O 1X 2 mM 0,2 mM 1 M 0,5U 30 ng Thêm vừa đủ 25 l  Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA. Bảng 3.7 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4 Nồng độ primer 1.2 M 1 M 0.8 M 0.6 M Phƣơng pháp tiến hành: Tiến hành chọn 1 mẫu DNA có chất lƣợng tốt (DNA của loài lan Long Nhãn ở Bảo Lộc) và primer OPAC10 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD. Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng, rõ của băng khuếch đại trên gel điện di.  Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD. 41 Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA. Bảng 3.8 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nồng độ Mg2+ 3 mM 2.5 mM 2 mM Phƣơng pháp tiến hành: Tiến hành chọn 1 mẫu DNA có chất lƣợng tốt (DNA của loài lan Thái Bình ở Bảo Lộc) và primer OPAC10 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD. Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng, rõ của băng khuếch đại trên gel điện di.  Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq polymerase đến sản phẩm RAPD. Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA Bảng 3.9 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nồng độ Taq 0.5 U 1 U 1.5 U Phƣơng pháp tiến hành: Tiến hành chọn 1 mẫu DNA có chất lƣợng tốt (DNA của loài lan Thái Bình ở Bảo Lộc) và primer OPAC10 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq polymerase đến sản phẩm RAPD. Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng, rõ của băng khuếch đại trên gel điện di.  Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu đến sản phẩm RAPD. Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA. 42 Bảng 3.10 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nồng độ DNA 10 ng 30 ng 50 ng Phƣơng pháp tiến hành: Tiến hành chọn 1 mẫu DNA có chất lƣợng tốt (DNA của loài lan Thái Bình ở Bảo Lộc) và primer OPAC10 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu đến sản phẩm RAPD. Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng, rõ của băng khuếch đại trên gel điện di.  Thí nghiệm 6: khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ dNTPs đến sản phẩm RAPD Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA. Bảng 3.11 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ dNTPs đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4 Nồng độ dNTPs 0.1 mM 0.2 mM 0.3 mM 0.4 mM Phƣơng pháp tiến hành: Tiến hành chọn 1 mẫu DNA có chất lƣợng tốt (DNA của loài lan Thái Bình) và primer OPAC10 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ dNTPs đến sản phẩm RAPD. Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng, rõ của băng khuếch đại trên gel điện di. 3.3.4. Thực hiện phản ứng PCR với marker RAPD Sau khi xác định quy trình tối ƣu cho phản ứng RAPD, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với marker RAPD với các mẫu lan nghiên cứu để đánh giá đa dạng di truyền của các loài lan rừng giống Dendrobium thu thập từ Bình Phƣớc và thị xã Bảo Lộc. 43 Sản phẩm RAPD đƣợc kiểm tra kích thƣớc bằng điện di trên gel agarose 2%, trong dung dịch đệm TAE 0.5X, dƣới hiệu điện thế 50V trong 70 phút. Sau đó, gel đƣợc ngâm trong dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml và các vạch DNA sẽ đƣợc quan sát dƣới tia UV. 3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS Phân tích đa dạng nguồn gen theo phần mềm NTSYSpc2.1 là chƣơng trình phần mềm do Rohlf (1992) thiết kế dùng để tìm kiếm và thành lập kiến trúc những dữ liệu có nhiều biến. NTSYS là hệ thống phân loại số trong nghiên cứu đa dạng quần thể ở mức độ DNA, dựa vào kết quả từ phƣơng pháp in dấu vân tay DNA (DNA fingerpringting). Từ kết quả phản ứng PCR với marker RAPD, tiến hành xác định mức độ đa hình của các loài lan rừng giống Dendrobium từ các vùng khác nhau bằng cách so sánh các phân đoạn DNA. Các phân đoạn đƣợc ghi nhận dựa trên sự có mặt hay không có mặt của chúng trên ảnh điện di. Nếu xuất hiện phân đoạn DNA thì kí hiệu là 1, không thì kí hiệu là 0. Các số liệu thu đƣợc sẽ đƣợc sử lý và phân tích trong chƣơng trình NTSYSpc 2.1 để tìm ra mối tƣơng quan giữa các đối tƣợng nghiên cứu thông qua hệ số tƣơng đồng di truyền và biểu đồ hình cây. Số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây dựng ma trận tƣơng đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Dice (1945). Sij=2a /(2a + b + c) ij: số băng giữa hai mẫu. a: số băng chung. b: Số băng chỉ xuất hiện ở i, không có ở j. c: Số băng chỉ xuất hiện ở j, không có ở i. Sij: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu i và j. Từ Sij ta tính đƣợc khoảng cách di truyền giữa i và j Dij= 1 – Sij 44 Cách nhập số liệu: Dữ liệu thu đƣợc từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excell theo những quy định chung. Nếu nhƣ sản phẩm có băng hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện diện băng. Sau khi nhập số liệu, ở hàng đầu tiên chúng ta ký hiệu là 1 (đối với ma trận hình chữ nhật), cột thứ hai ghi số hàng, cột thứ ba ghi số cột, và cột thứ tƣ ghi số 0 nếu không có số liệu thiếu. Sau đó, bản số liệu trong excell sẽ đƣợc dùng để xây dựng ma trận tƣơng đồng trong phần mềm NTSYSpc 2.1 3.3.6. Phân tích Bootstrap bằng phần mềm Winboot Winboot là một phần mềm đƣợc sử dụng để dựng bootstrap nhằm mục đích kiểm tra độ tin cậy của cây phát sinh loài (dendrogram) dựa trên phƣơng pháp UPGMA. Các thuật toán sử dụng trong Winboot cũng tƣơng tự nhƣ các thuật toán sử dụng trong phần mềm NTSYSpc2.1. Tuy nhiên, cây phát sinh loài đƣợc tạo thành bởi Winboot cho chúng ta biết đƣợc mức độ liên kết giữa các cá thể trong cùng giống nghiên cứu. Cách nhập số liệu trong Winboot nhƣ sau : Dữ liệu thu đƣợc từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excell theo những quy định chung. Nếu nhƣ sản phẩm có băng hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện diện băng. Số liệu đƣợc nhập theo hàng dọc, trong đó cột thứ nhất là số hàng tƣơng ứng với số mẫu nghiên cứu và cột thứ hai là số cột tƣơng ứng với số lƣợng sản phẩm thu đƣợc. Bản số liệu excell đƣợc lƣu dƣới dạng Text (Tab delimited) và tên file đƣợc lƣu với đuôi .Dat. Sau đó, bản số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây dựng ma trận tƣơng đồng và kết quả là sơ đồ cây phát sinh loài sẽ đƣợc tạo ra khi sử dụng phƣơng pháp UPGMA. 45 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Sản phẩm li trích DNA tổng số DNA là thông tin di truyền, là vật liệu quan trọng dùng trong các thao tác nghiên cứu về phân tử. Li trích DNA là một bƣớc khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Qui trình li trích DNA của Trƣơng Minh Dũng, 2007 đạt hiệu quả tốt vì DNA li trích có độ tinh khiết cao. Việc sử dụng phenol có tác dụng biến tính protein rất nhanh và hiệu quả. Dịch trích DNA chứa chất 2 – mercaptoethanol có khả năng khử các hợp chất phenol và phá vỡ thành tế bào rất mạnh. Thêm vào đó, sự có mặt của muối sodium acetate có khả năng làm biến tính enzyme phân hủy DNA. Mặt khác, bƣớc sử dụng phenol : chloroform : isoamylalcohol lặp lại 2 lần liên tiếp kết hợp với li tâm đã loại bỏ hết lƣợng protein và polysaccharide có trong mẫu. Do đó, DNA thu đƣợc rất tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy ra. Áp dụng quy trình li trích DNA của Trƣơng Minh Dũng , 2007, chúng tôi tiến hành ly trích 20 mẫu lan thu thập ở tỉnh Bình Phƣớc và thị xã Bảo Lộc để thực hiện phản ứng PCR với marker RAPD. Kết quả định lƣợng DNA bằng quang phổ kế cho thấy DNA của 20 mẫu đƣợc chọn có độ tinh sạch tƣơng đối cao với tỉ lệ OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,5 đến 2,2 và lƣợng DNA có trong mỗi mẫu đều lớn hơn 50 ng/µl. Trong 20 mẫu thu đƣợc có 60% số mẫu đạt DNA tinh sạch có tỉ lệ OD260nm/OD280nm > 1,8 và hàm lƣợng DNA trung bình ở mỗi mẫu là 220 ng/µl. Những mẫu có tỉ lệ OD và độ tinh sạch không cao nhƣ TT và TB (xem bảng 4.1), chúng tôi vẫn có thể chạy PCR đạt kết quả tốt bằng cách xử lý nhƣ sau: pha loãng mẫu 2 lần rồi li tâm ở 12000 vòng, trong 5 phút ở 4oC để lắng cặn xuống đáy ống, rồi nhẹ nhàng hút DNA ở khoảng giữa ống để thực hiện phản ứng PCR. Bƣớc pha loãng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất còn lẫn trong sản phẩm li trích sau cùng, bƣớc li tâm tiếp theo sẽ giúp thu đƣợc DNA tinh sạch với nồng độ thấp ở khoảng giữa ống và không bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống. 46 Hình 4.1 và Hình 4.2 cho thấy qui trình li trích DNA đạt hiệu quả tốt vì DNA li trích có độ tinh khiết cao, không có hiện tƣợng DNA bị đứt, gãy (gel bị smear) và lƣợng tạp bị loại bỏ gần nhƣ hoàn toàn. Hình 4.1 DNA tổng số của 10 loài lan rừng giống Dendrobium ở Bảo Lộc Chú thích: thứ tự các giếng (1 – 10): Kim Điệp, Vẩy Rồng, Long Tu, Giả Hạc, Thủy Tiên, Thủy Tiên Vàng, Thủy Tiên Trắng Vàng, Nhất Điểm Hoàng, Thái Bình, Long Nhãn.. Hình 4.2 DNA tổng số của 10 loài lan rừng giống Dendrobium ở Bình Phƣớc Chú thích: thứ tự các giếng (1 – 10): Kim Điệp, Vẩy Rồng, Long Tu, Giả Hạc, Thủy Tiên, Thủy Tiên Vàng, Thủy Tiên Trắng Vàng, Nhất Điểm Hoàng, Thái Bình, Long Nhãn.. 47 Bảng 4.1 OD của 20 mẫu dùng để thực hiện phản ứng PCR với marker RAPD Mẫu Tỉ lệ OD260/OD280 OD260 OD280 Nồng độ DNA (ng/µl) KĐ 1,67800 8,8309.10-2 5,2628.10-2 360 VR 1,62500 7,0719.10 -2 4,3519.10 -2 280 LT 1,74440 7,8892.10 -2 4,5226.10 -2 300 GH 1,85770 2,6543.10 -2 1,4288.10 -2 115 TT 1,5225 2,6094.10 -2 1,7878.10 -2 88 TV 1,65370 0,12571 7,6017.10 -2 500 TTV 1,65920 8,9845.10 -2 5,3966.10 -2 150 NĐH 1,82950 2,7328.10-2 1,4937.10-2 110 TB 1,58210 8,5102.10 -2 5,3812.10 -2 140 LN 1,75520 2,7552.10 -2 1,5511.10 -2 360 KĐ1 2,12290 4,7196.10-2 2,2232.10-2 200 VR1 2,06840 5,7723.10 -2 2,7907.10 -2 260 LT1 1,87620 5,3718.10 -2 2,8632.10 -2 230 GH1 2,53130 2,6097.10 -2 1,0310.10 -2 127 TT1 2,23570 3,7991.10 -2 1,6993.10 -2 226 TV1 1,94600 4,4865.10 -2 2,3055.10 -2 199 TTV1 1,97590 9,0024.10 -2 4,5561.10 -2 400 NĐH1 1,85120 2,5292.10-2 1,3662.10-2 100 TB1 1,91890 2,4959.10 -2 1,3007.10 -2 600 LN1 1,95050 7,9819.10 -2 4,0922.10 -2 350 Chú thích: Các mẫu có ký hiệu số “1” ở cuối là các mẫu lan có nguồn gốc từ Bình Phƣớc, các mẫu không có ký hiệu số “1” ở cuối là các mẫu lan có nguồn gốc từ Bảo Lộc. 48 Trong quá trình ly trích chúng tôi nhận thấy cần khắc phục những vấn đề sau: Sau khi cắt và cân mẫu xong, mẫu phải đƣợc giữ lạnh ngay trong N2 lỏng thì chất lƣợng DNA ly trích đƣợc là tốt nhất. Dịch trích EB khi bảo quản thƣờng có hiện tƣợng kết tủa (do có chứa CTAB) ảnh hƣởng đến kết quả li trích. Do đó, cần ủ dung dịch EB ở 650C trong 15 phút trƣớc khi sử dụng. Khi nghiền mẫu với N2 lỏng cần chú ý:  Nghiền mẫu cho đến khi thành bột mịn, nghiền đều tay, không nghiền quá mạnh để tránh làm đứt gãy DNA.  Khi nghiền xong phải cho mẫu vào eppendorf ngay để tránh hiện tƣợng mẫu bị tan chảy ảnh hƣởng đến kết quả li trích.  Dịch trích EB phải cho vào eppendorf có chứa mẫu ngay khi lấy ra khỏi N2 lỏng. Sau khi thêm phenol : chloroform : isoamylalcohol (25 : 24 : 1) vào phải lắc đều và li tâm ngay, nếu để lâu DNA sẽ bị gãy. Khi chuyển lấy dịch trong, cần cẩn thận tránh lấy phạm vào phần tạp phía dƣới, nếu không độ tinh sạch sẽ không cao. Khi phơi khô cặn cần lƣu ý, nếu để quá khô sẽ làm hỏng DNA, nếu còn ethanol sẽ ảnh hƣởng xấu đến DNA trong quá trình bảo quản và phản ứng PCR. 4.2. Hoàn thiện quy trình PCR với marker RAPD  Ảnh hƣởng của số chu kỳ khuếch đại đến sản phẩm RAPD Hình 4.3 cho thấy sản phẩm RAPD ở cả hai nghiệm thức đều rất mờ cho thấy số chu kỳ khuếch đại không ảnh huởng nhiều đến sản phẩm RAPD. Nguyên nhân làm cho sản phẩm khuếch đại ít là do thành phần phản ứng RAPD chƣa phù hợp. Vì vậy, chúng tôi quyết định giữ nguyên số chu kỳ khuếch đại là 45 chu kỳ và tiến hành tối ƣu hóa các thành phần phản ứng RAPD. 49 Hình 4.3 Khảo sát ảnh hƣởng của số chu kỳ Chú thích: 1, 2, 3: số lần lặp lại của mỗi nghiệm thức; TB: loài lan Thái Bình (Bảo Lộc).  Ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD Primers là yếu tố ảnh hƣởng mạnh nhất đến sự thành công hay thất bại của phản ứng PCR. Hình 4.4 cho thấy, cả bốn nghiệm thức đều cho sản phẩm RAPD, trong đó nghiệm thức 4 cho sản phẩm RAPD với số lƣợng băng nhiều và rõ nhất. Các nghiệm thức còn lại cho sản phẩm không đồng đều, điều này có thể do thao tác PCR chƣa tốt. Theo nhƣ kết quả khảo sát, chúng tôi chọn nồng độ primer tối ƣu cho phản ứng RAPD là 0,6 µM nhằm đảm bảo hiệu quả về kinh tế. Hình 4.4 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer Chú thích: 1, 2, 3: số lần lặp lại của mỗi nghiệm thức; TB: loài lan Long Nhãn (Bảo Lộc). 50  Ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD Nồng độ Mg2+ cũng là một trong những nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến phản ứng PCR. Hình 4.5 cho thấy, cả ba nghiệm thức đều cho sản phẩm RAPD, trong đó nghiệm thức 3 cho sản phẩm RAPD với số lƣợng băng nhiều và rõ nhất. Các nghiệm thức còn lại cho sản phẩm không đồng đều, điều này có thể do thao tác PCR chƣa tốt. Vì vậy, chúng tôi chọn nồng độ Mg2+ tối ƣu cho phản ứng RAPD là 2 mM nhằm đảm bảo hiệu quả kinh tế. Hình 4.5 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Mg2+  Ảnh hƣởng của nồng độ Taq polymerase đến sản phẩm RAPD Nồng độ Taq quá thấp sẽ không đủ lƣợng enzyme để xúc tác tạo sản phẩm nhƣ mong muốn. Ngƣợc lại, nồng độ Taq quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm không chuyên tính, gây sai lệch kết quả. Qua kết quả khảo sát, chúng tôi nhận thấy nghiệm thức 1 cho sản phẩm RAPD hơi mờ, trong khi sản phẩm RAPD ở nghiệm thức 3 lại chứa nhiều tạp. Vì vậy, chúng tôi chọn nồng độ Taq tối ƣu cho phản ứng RAPD là 1U. Hình 4.6 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq polymerase 51  Ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu đến sản phẩm RAPD Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ DNA mẫu ở 3 nghiệm thức không ảnh hƣởng nhiều đến phản ứng RAPD. Chúng tôi nhận thấy nồng độ DNA mẫu 50 ng/µl là tối ƣu cho phản ứng ứng RAPD. Hình 4.7 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu  Ảnh hƣởng của nồng độ dNTPs đến sản phẩm RAPD Trong phản ứng PCR, mối tƣơng quan giữa nồng độ Mg2+, dNTPs và Taq đóng vai trò rất quan trọng. Ở nghiệm thức 3, 4 tƣơng ứng với nồng độ dNTPs là 0,3 mM và 0,4 mM (xem hình 4.8), sản phẩm PCR là rất ít. Đặc biệt, ở nghiệm thức 4 sản phẩm khuếch đại không xuất hiện. Điều này xảy ra là do khi sử dụng dNTPs ở nồng độ cao sẽ làm mất đi một lƣợng lớn Mg2+ tự do mà Mg2+ đóng vai trò là cofactor cho Taq polymerase hoạt động nên khi Taq polymerase hoat động kém hiệu quả cũng có nghĩa là sản phẩm PCR sẽ giảm đi. Nếu sử dụng dNTPs với nồng độ quá cao thì sẽ không có sản phẩm khuếch đại. Kết quả khảo sát cho thấy nghiệm thức với nồng độ dNTPs là 0,2 mM là tối ƣu cho phản ứng RAPD. Hình 4.8 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ dNTPs 52 Sau khi tối ƣu hóa phản ứng PCR với marker RAPD, chúng tôi đƣa ra thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng và chƣơng trình nhiệt tối ƣu nhƣ sau: Bảng 4.2 Nồng độ tối ƣu của các thành phần trong phản ứng PCR Hóa chất Nồng độ sử dụng PCR buffer MgCl2 dNTP Primer Taq polymerase DNA mẫu H2O 1X 2 mM 0,2 mM 0,6 M 1U 50 ng Thêm vừa đủ 25 l Bảng 4.3 Chƣơng trình nhiệt tối ƣu cho phản ứng PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 5 45 94 30 Ta 30 72 1 1 72 5 Hold 4 0 C 4.3. Đánh giá đa dạng di truyền của 10 loài lan rừng giống Dendrobium tại tỉnh Bình Phƣớc và thị xã Bảo Lộc 4.3.1. Sản phẩm PCR với marker RAPD Để phát hiện sự đa hình của 10 loài lan rừng giống Dendrobium đã thu thập, 10 primer đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR theo quy trình đã tối ƣu ở trên. Sản phẩm RAPD của những primer này đƣợc quan sát dựa theo kết quả điện di trên gel. Mỗi giếng đại diện cho một loài, mỗi băng hiện diện với một kích thƣớc phân tử xác định bởi vì nó là kết quả của sự tăng bội của một sợi đơn DNA gốc. Các đoạn DNA 53 có cùng trọng lƣợng phân tử sẽ di chuyển với cùng khoảng cách trên gel. Sự đa dạng di truyền phân tử đƣợc chỉ ra bởi sự khác biệt của các băng DNA hình thành. Chúng tôi nhận thấy, trong số 10 primer sử dụng chỉ có 6 primer cho sản phẩm RAPD (OPAC10, OPB01, S1384, OPB08, U693, OPAH13) trên tất cả các loài lan khảo sát, các primer còn lại hoặc không cho sản phẩm ở tất cả các loài (V20, T3) hoặc chỉ cho sản phẩm ở một hay hai loài (U109, OPAF16). Cả 6 primer đƣợc chọn đều cho sản phẩm khuếch đại tốt, các băng rõ, băng đa hình nhiều. Tổng cộng có 57 băng đƣợc tạo ra, trong đó có 55 băng đa hình chiếm tỉ lệ 96,5% và 2 băng đồng hình chiếm tỉ lệ 3,5%. Trung bình có 9,1 băng đa hình/primer. Sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc từ 180 – 3000 bp. Dựa vào sự khác biệt giữa các băng thể hiện trên gel điện di ta có thể xác định đƣợc sự khác nhau giữa các loài lan về mặt di truyền. Bảng 4.4 Danh sách các primer đƣợc sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền của 10 loài lan rừng giống Dendrobium Primer Tổng số băng Số băng đa hình Kích thƣớc (bp) OPAC10 14 14 180 – 3000 OPB01 7 7 400 – 1700 OPB08 10 10 300 – 1500 OPAH13 10 9 290 – 1500 S1384 10 10 290 – 1500 U693 6 5 490 – 1000 Quan sát kết quả điện di cho thấy ngoài những băng rõ còn có những băng mờ hoặc khó nhận diện. Điều này có thể do đặc điểm di truyền của DNA mẫu làm hạn chế khả năng bắt cặp của primer, làm giảm số lƣợng sản phẩm PCR. Nguyên nhân khác có thể do thao tác PCR chƣa tốt, điều kiện PCR chƣa thật sự phù hợp, hóa chất PCR kém chất lƣợng. Trong trƣờng hợp này để các băng rõ hơn có thể phải thay đổi nhiều yếu tố trong phản ứng PCR và có thể kết quả cũng sẽ mất đi một vài băng đã có. Trong điều kiện khóa luận chúng tôi chƣa khảo sát thật sâu vấn đề này 54 nên kết quả thu đƣợc còn một số băng chƣa rõ nếu nhìn bằng mắt thƣờng. Một nguyên nhân khác nữa có thể do thời gian nhuộm ethidium bromide ít hay chất lƣợng ethidium bromide kém. Ngoài ra, còn có một số băng tách không rõ có thể do quá trình điện di các băng có kích thƣớc gần bằng nhau nên việc phân tách của chúng trên gel không thật sự rõ ràng, bên cạnh đó còn có hiện tƣợng các băng di chuyển không đều, có thể do điện cực của buồng điện di bị cong hay do đổ gel đổ chƣa tốt. Những trƣờng hợp này nên thực hiện lại phản ứng PCR hay chạy điện di lại, cho lƣợng mẫu nhiều hơn và chỉnh sửa máy điện di để thu đƣợc kết quả tốt hơn.  Primer OPAC10 Trong số 6 primer cho sản phẩm RAPD thì primer OPAC10 là primer cho sản phẩm trên tất cả các loài lan rừng giống Dendrobium khảo sát với số luợng băng nhiều nhất. Sản phẩm khuếch đại đƣợc tạo ra đối với primer này là 14 băng, tất cả đều là băng đa hình, không xuất hiện băng đồng hình nào. Băng đa hình xuất hiện với kích thƣớc từ 180 – 3000 bp, trong đó băng đa hình 3000 bp chỉ xuất hiện ở các loài Vẩy Rồng, Thủy Tiên, Thủy Tiên Vàng, Thủy Tiên Trắng Vàng và băng đa hình 180 bp chỉ xuất hiện ở loài Thủy Tiên Trắng Vàng (xem hình 4.9). Kết quả trên cho thấy, có sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài lan này (trong phạm vi nghiên cứu này). (a) 3000 bp 1000 bp 180 bp 55 (b) Hình 4.9 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 của 10 mẫu lan thu thập ở Bảo Lộc (hình a) và Bình Phƣớc (hình b) Chú thích: L : thang chuẩn. Thứ tự các giếng (1 – 10): Kim Điệp, Vẩy Rồng, Long Tu, Giả Hạc, Thủy Tiên, Thủy Tiên Vàng, Thủy Tiên Trắng Vàng, Nhất Điểm Hoàng, Thái Bình, Long Nhãn. Trong 20 mẫu lan nghiên cứu thì có 18 mẫu xuất hiện băng đa hình 1000 bp, chiếm tỉ lệ 90% số mẫu khảo sát nhƣng băng này không xuất hiện ở loài lan Long Tu (giếng số 3 trên gel) ở cả Bảo Lộc và Bình Phƣớc. Tuy nhiên, băng 1000 bp xuất hiện không đồng nhất, giữa các mẫu còn có sự chênh lệch. Điều này có thể do bản chất trọng lƣợng phân tử của băng nhƣng cũng có thể do quá trình điện di làm sai lệch các băng (điện di không thẳng). Băng 1000 bp có thể là băng đặc biệt để phân biệt giống lan rừng Dendrobium với các giống lan khác trong họ Orchidaceae (trong phạm vi nghiên cứu này). Do đó, nên tách băng này ra để giải trình tự nhằm giải đáp cho sự chênh lệch đó và phục vụ cho công tác phân biệt, chọn giống.  Primer OPB01 Hình 4.10 cho thấy sản phẩm khuếch đại đƣợc tạo ra bởi primer OPB01 là 7 băng với kích thƣớc từ 400 – 1700 bp. Cả 7 băng đều đa hình. Đây là primer cho số lƣợng băng thấp nhƣng lại có sự phân nhóm rất rõ, trong đó băng đa hình 1700 bp chỉ xuất hiện ở các loài lan Long Tu, Giả Hạc, Nhất Điểm Hoàng, Thái Bình, Long Nhãn còn băng đa hình 1200 bp chỉ xuất hiện ở các loài lan Vẩy Rồng, Thủy Tiên, Thủy Tiên Vàng, Thủy Tiên Trắng Vàng (ở cả Bảo Lộc và Bình Phƣớc). Có thể hai 3000 bp 1000 bp 180 bp 56 băng đa hình này là chỉ thị đặc trƣng cho các loài lan trên. Vì vậy, nên tách băng này ra để giải trình tự nhằm phục vụ cho công tác phân biệt và chọn giống lan. (a) (b) Hình 4.10 Sản phẩm PCR với primer OPB01 của 10 mẫu lan thu thập ở Bảo Lộc (hình a) và Bình Phƣớc (hình b)  Primer S1384 Quan sát hình 4.11.a và hình 4.11.b chúng tôi nhận thấy, với primer S1384 sản phẩm khuếch đại tạo ra có 10 băng kích thƣớc từ 290 – 1500 bp. Cả 10 băng đều đa hình. 1700 bp 1200 bp 1700 bp 1200 bp 1 2 3 4 5 6 7 9 10 8 L 57 (a) (b) Hình 4.11 Sản phẩm PCR với primer S1384 của 10 mẫu lan thu thập ở Bảo Lộc (hình a) và Bình Phƣớc (hình b) Trong 20 mẫu lan nghiên cứu thì có 18 mẫu xuất hiện băng 650 bp, chiếm tỉ lệ 90% số mẫu khảo sát nhƣng băng này không xuất hiện ở loài lan Giả Hạc (giếng số 4 trên gel) ở cả Bảo Lộc và Bình Phƣớc. Tuy nhiên băng 650 bp xuất hiện không đồng nhất, giữa các mẫu còn có sự chênh lệch. Điều này có thể do bản chất trọng lƣợng phân tử của băng nhƣng cũng có thể do quá trình điện di làm sai lệch các băng (điện di không thẳng). Băng 650 bp có thể là băng đặc biệt để phân biệt giống lan rừng Dendrobium với các giống lan khác trong họ Orchidaceae (trong phạm vi nghiên cứu này). Do đó, nên tách băng này ra để giải trình tự nhằm giải đáp cho sự chênh lệch đó và phục vụ cho công tác phân biệt, chọn giống lan. Ngoài ra, primer OPB08 tạo ra 10 sản phẩm đa hình có kích thƣớc từ 300 – 1500 bp, với primer U693 là 5 sản phẩm đa hình có kích thƣớc từ 490 – 1000 bp và 650 bp 650 bp 58 primer OPAH13 tạo ra 9 sản phẩm đa hình có kích thƣớc từ 290 – 1500 bp (xem phụ lục I). Điều này cũng cho thấy sự khác biệt về di truyền giữa các loài lan rừng giống Dendrobium khảo sát. Đặc biệt, primer U693 và primer OPAH13 đều tạo ra 1 băng đồng hình có kích thƣớc 350 bp. Băng đồng hình 350 bp xuất hiện ổn định, có thể tiếp tục nghiên cứu để tìm ra mối quan hệ của chúng với các tính trạng có liên quan, đồng thời đây có thể là băng đặc biệt dùng để phân biệt giống lan Dendrobium với các giống lan khác thuộc họ Orchidaceae. 4.3.2. Phân tích nhóm của 10 loài lan rừng giống Dendrobium dựa trên dữ liệu RAPD Những dữ liệu thu thập từ việc mã hoá sản phẩm PCR theo quy tắc có băng ghi 1 và không có băng ghi 0 sẽ đƣợc dùng để tạo ra ma trận khoảng cách của 10 loài lan rừng giống Dendrobium với việc sử dụng chỉ số Dice similarity coefficient, từ đó xây dựng sơ đồ hình cây và sơ đồ phân bố nhóm biểu diễn mối quan hệ về di truyền giữa chúng thông qua phần mềm NTSYSpc 2.1. Bên cạnh đó, để kiểm tra độ tin cậy của việc phân nhóm ở trên, chúng tôi tiến hành phân tích bootstrap với 1000 lần lặp lại bằng cách dùng phần mềm Winboot. Bảng 4.5 Hệ số tƣơng đồng di truyền của các loài lan rừng giống Dendrobium khảo sát KĐ1 VR1 LT1 GH1 TT1 TV1 TTV1 NĐH1 TB1 LN1 KĐ1 1.00 VR1 0.51 1.00 LT1 0.39 0.47 1.00 GH1 0.52 0.60 0.71 1.00 TT1 0.45 0.61 0.42 0.51 1.00 TV1 0.41 0.55 0.47 0.65 0.50 1.00 TTV1 0.35 0.55 0.57 0.60 0.50 0.65 1.00 NĐH1 0.57 0.46 0.62 0.56 0.35 0.41 0.46 1.00 TB1 0.47 0.51 0.48 0.61 0.57 0.51 0.51 0.47 1.00 LN1 0.51 0.45 0.33 0.46 0.44 0.50 0.45 0.60 0.61 1.00 59 KĐ VR LT GH TT TV TTV NĐH TB LN KĐ 1.00 VR 0.44 1.00 LT 0.50 0.53 1.00 GH 0.54 0.59 0.76 1.00 TT 0.54 0.59 0.59 0.64 1.00 TV 0.45 0.63 0.45 0.51 0.72 1.00 TTV 0.37 0.63 0.54 0.55 0.72 0.77 1.00 NĐH 0.43 0.41 0.54 0.51 0.51 0.58 0.58 1.00 TB 0.41 0.43 0.53 0.50 0.50 0.57 0.53 0.89 1.00 LN 0.39 0.46 0.61 0.53 0.44 0.42 0.42 0.57 0.68 1.00 KĐ1 0.62 0.36 0.48 0.50 0.40 0.34 0.39 0.41 0.39 0.35 VR1 0.39 0.71 0.47 0.53 0.66 0.71 0.66 0.40 0.46 0.40 LT1 0.50 0.48 0.68 0.63 0.51 0.50 0.50 0.50 0.48 0.47 GH1 0.44 0.52 0.66 0.75 0.62 0.57 0.66 0.53 0.52 0.51 TT1 0.33 0.62 0.42 0.48 0.48 0.52 0.63 0.40 0.46 0.38 TV1 0.34 0.41 0.38 0.44 0.62 0.57 0.61 0.48 0.46 0.50 TTV1 0.39 0.56 0.47 0.48 0.66 0.66 0.66 0.40 0.34 0.35 NĐH1 0.53 0.33 0.48 0.54 0.37 0.53 0.44 0.57 0.56 0.46 TB1 0.40 0.42 0.68 0.63 0.54 0.48 0.43 0.50 0.56 0.51 LN1 0.39 0.30 0.47 0.53 0.44 0.47 0.42 0.57 0.51 0.40 Kết quả phân tích NTSYS cho thấy mức tƣơng đồng gen cao nhất giữa 2 loài lan Nhất Điểm Hoàng và Thái Bình (0,89) chứng tỏ 2 loài lan này có cùng nguồn gốc (Bảo Lộc) và đứng rất gần nhau trong cây phát sinh loài. Trong khi đó, mức tƣơng đồng gen thấp nhất giữa 2 loài lan Vẩy Rồng và Long Nhãn 1 (0,30) chứng tỏ hai loài lan này không cùng nguồn gốc và đứng rất xa nhau trong cây phát sinh loài (bảng 4.5). 60 Hình 4.12 Cây phân nhóm di truyền giữa 10 loài lan rừng giống Dendrobium thu thập tại tỉnh Bình Phƣớc và thị xã Bảo Lộc Sơ đồ cây phát sinh loài hình 4.12 cho thấy nếu xét mức độ tƣơng đồng di truyền của 10 loài lan rừng giống Dendrobium ở 0,55 thì sẽ chia thành ba nhóm với mức độ tƣơng đồng di truyền biến thiên trong khoảng từ 0,55 – 0,66. Ba nhóm này bao gồm hai nhóm chính (nhóm 1 và 2) và một nhóm phụ (nhóm 3). Ngoài ra, các loài lan Vẩy Rồng (Bảo Lộc), Vẩy Rồng (Bình Phƣớc), Thái Bình (Bình Phƣớc) và Long Nhãn (Bình Phƣớc) không phân nhóm mà chúng nằm rải rác trên cây phát sinh loài. Điều này cho thấy các loài lan rừng giống Dendrobium khảo sát có sự đa dạng cao về mặt di truyền. Việc phân nhóm nhƣ vậy hoàn toàn phù hợp với đồ thị phân bố nhóm ở hình 4.13. 1 2 3 62,1% 46,8% 36,1% 46,8% 47,7% 25,8% 55,4% 98,6% 61 Hình 4.13 Đồ thị phân bố nhóm dựa trên dữ liệu RAPD Dim-1 -0.47 -0.23 0.01 0.25 0.49 Dim-2 -0.63 -0.33 -0.03 0.27 0.57 KD VR LT GH TT TV TTV NDH TB LN KD1 VR1 LT1 GH1 TT1 TV1 TTV1 NDH1 TB1 LN1 Nhóm 1 Nhóm 3 Nhóm 2 62 Hình 4.12 cho thấy loài lan Kim Điệp (Bảo Lộc) và Kim Điệp (Bình Phƣớc) nằm cùng một nhánh trên cây phát sinh loài chứng tỏ sự khác nhau về địa lý không ảnh hƣởng nhiều đến kiểu gen của loài lan này. Tuy nhiên, do có mức độ tƣơng đồng di truyền khá thấp (0,62) nên giữa chúng vẫn có sự khác biệt nhất định về di truyền, chứng tỏ sự đa dạng về nguồn gen đã xảy ra trong cùng một loài (trong phạm vi nghiên cứu này). Kết quả phân tích boostrap cho thấy mức độ liên kết giữa chúng trên cây phát sinh loài là 62,1% (xem hình 4.12), chứng tỏ kết quả phân nhóm của loài lan này là đáng tin cậy. Trong khi đó, hai loài lan Thái Bình (Bình Phƣớc) và Long Nhãn (Bình Phƣớc) mặc dù khác loài nhƣng chúng lại nằm cùng nhánh trên cây phát sinh với mức độ tƣơng đồng di truyền là 0,61. Đây có thể là kết quả của một hay nhiều đột biến xảy ra giữa hai loài lan này làm cho chúng trở nên gần nhau về di truyền. Bên cạnh đó, hai loài lan Thái Bình (Bảo Lộc) và Long Nhãn (Bảo Lộc) mặc dù đứng khác nhánh nhƣng lại nằm chung nhóm 3 trên cây phát sinh với mức độ tƣơng đồng di truyền là 0,68 (xem bảng 4.5) nghĩa là giữa chúng có sự giống nhau về di truyền. Nhƣ vậy, qua phân tích kết quả trên, chúng tôi nhận thấy sự khác biệt về vùng địa lý đã ảnh hƣởng lớn đến kiểu gen của hai loài lan Thái Bình và Long Nhãn, nghĩa là giữa chúng có sự đa dạng lớn về nguồn gen khi đem trồng ở những vùng khác nhau. Vì vậy, phải tiếp tục nghiên cứu sự giống nhau và khác nhau giữa hai loài lan này nhằm xác định đƣợc các tính trạng có tốt phục vụ cho công tác chọn, tạo giống lan. Nhóm một gồm các loài lan thuộc nhóm Callista. Trong đó, loài lan Thủy Tiên (Bình Phƣớc) có sự khác biệt về di truyền so với các loài lan còn lại trong nhóm có mức độ tƣơng đồng di truyền thấp (0,55). Hình 4.12 cho thấy loài lan Vẩy Rồng (Bảo Lộc) và Vẩy Rồng (Bình Phƣớc) nằm chung một nhánh trên cây phát sinh loài với mức tƣơng đồng di truyền cao (0,72) nghĩa là sự khác nhau về vùng địa lý không ảnh hƣởng đến kiểu gen của loài lan này. Ngoài ra, các loài lan còn lại trong nhóm một gồm Thủy Tiên (Bảo Lộc), Thủy Tiên (Bình Phƣớc), Thủy Tiên Vàng (Bảo Lộc), Thủy Tiên Vàng (Bình Phƣớc), Thủy Tiên Trắng Vàng (Bảo Lộc) và Thủy Tiên Trắng Vàng (Bình Phƣớc) đều nằm khác nhánh nhau trên cây phát 63 sinh với mức tƣơng đồng gen giữa chúng khá thấp (xem bảng 4.5) chứng tỏ nguồn gen có sự đa dạng. Kết quả phân tích boostrap cho thấy, mức độ liên kết giữa các loài lan trong nhóm một là rất thấp (xem hình 4.12). Điều này xảy ra là do số lƣợng primer nghiên cứu ít (6 primer) nên số băng tạo ra không đủ để gia tăng mức độ tin cậy. Qua phân tích nhóm một, chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt lớn về di truyền giữa các loài lan có cùng nguồn gốc và cùng loài, chứng tỏ các loài lan nhóm một có sự đa dạng lớn về nguồn gen. Đây sẽ là yếu tố quan trọng góp phần vào công tác chọn giống nhằm hạn chế việc chọn những giống ít có sự khác biệt di truyền. Nhóm hai gồm có các loài lan thuộc nhóm Dendrobium trong đó loài Nhất Điểm Hoàng (Bình Phƣớc) có sự khác biệt di truyền cao với các loài lan còn lại trong nhóm với hệ số tƣơng đồng thấp (khoảng 0,56). Nhóm hai còn cho thấy sự gần nhau về di truyền giữa loài lan Long Tu (Bảo Lộc) và Giả Hạc (Bảo Lộc); Long Tu (Bình Phƣớc) và Giả Hạc (Bình Phƣớc) mặc dù chúng khác loài nhau, với mức tƣơng đồng gen lần lƣợt là 0,76 và 0,71 nghĩa là nguồn gen có sự đa dạng. Nhóm ba gồm các loài lan có nguồn gốc từ Bảo Lộc: Nhất Điểm Hoàng, Thái Bình, Long Nhãn, trong đó hệ số tƣơng đồng gen giữa Nhất Điểm Hoàng và Thái Bình là rất cao (0,89) chứng tỏ chúng rất gần nhau về di truyền. Trong khi đó hệ số tƣơng đồng gen giữa hai loài lan này ở Bình Phƣớc là rất thấp (0,47). Điều này có thể là do sự đột biến đã xảy ra dẫn đến sự khác nhau về di truyền giữa hai loài lan này. Tuy nhiên, do số lƣợng primer nghiên cứu ít nên vẫn chƣa xác định đƣợc mức độ tin cậy của nhận định trên, bên cạnh đó việc lấy mẫu cá thể cũng là một trong những yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phân tích. Tóm lại, với 6 marker RAPD sử dụng, 10 loài lan rừng giống Dendrobium thu thập tại tỉnh Bình Phƣớc và thị xã Bảo Lộc đƣợc phân thành 3 nhóm với khoảng cách di truyền giữa các loài lan có sự dao động lớn chứng tỏ có sự đa dạng cao về mặt di truyền. Qua phân nhóm, các loài lan thuộc các nhóm khác nhau có thể đƣợc sử dụng để làm vật liệu lai tạo trong chọn giống, cụ thể các loài lan thuộc nhóm 1, 64 2, có thể lai tạo với các loài lan nhóm 3 sẽ tạo ra những quần thể đa dạng về nguồn gen bởi vì những nhóm có khoảng cách di truyền càng xa nhau thì khả năng tạo ra con lai có nhiều tính trạng càng cao. 65 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu đƣợc, chúng tôi đƣa ra một số kết luận sau: Tối ƣu hóa thành công các thành phần của phản ứng PCR với marker RAPD: Số chu kỳ nhiệt thích hợp nhất cho phản ứng PCR là 45 chu kỳ; nồng độ primer: 0,6 µM; nồng độ Mg2+: 2 mM; nồng độ Taq: 1U; nồng độ DNA mẫu: 50 ng/µl; nồng độ dNTPs: 0,2 mM. Trong tổng số 10 primer tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền thì có 6 primer (OPAC10, OPB01, S1384, OPB08, U693, OPAH13) cho sản phẩm khuếch đại trên tất cả các loài lan rừng giống Dendrobium khảo sát. Tổng cộng có 57 băng đƣợc tạo ra, trong đó có 55 băng đa hình chiếm tỉ lệ 96,5% và 2 băng đồng hình chiếm tỉ lệ 3,5%. Trung bình có 9,1 băng đa hình/primer. Sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc từ 180 – 3000 bp. Với 6 marker RAPD sử dụng, nếu xét mức độ tƣơng đồng di truyền của 10 loài lan rừng giống Dendrobium ở 0,55 thì sẽ chia thành ba nhóm với mức độ tƣơng đồng di truyền biến thiên trong khoảng từ 0,55 – 0,66. Ba nhóm này bao gồm hai nhóm chính (nhóm 1 và 2) và một nhóm phụ (nhóm 3). Ngoài ra, các loài lan Vẩy Rồng (Bảo Lộc), Vẩy Rồng (Bình Phƣớc), Thái Bình (Bình Phƣớc) và Long Nhãn (Bình Phƣớc) không phân nhóm mà chúng nằm rải rác trên cây phát sinh loài. Điều này cho thấy các loài lan rừng giống Dendrobium khảo sát có sự đa dạng cao về mặt di truyền. 5.2. Đề nghị Tiếp tục khảo sát thêm nhiều primer và nhiều mẫu hơn nữa để có đƣợc kết quả chính xác hơn, tạo cơ sở cho việc xây dựng hoàn chỉnh sơ đồ cây phát sinh loài đối với giống lan Dendrobium. Tiếp tục ứng dụng marker RAPD trên nhiều giống lan khác để nghiên cứu sự đa dạng di truyền và nhận diện giống. 66 Kết hợp phân nhóm di truyền dựa vào kết quả RAPD với việc phân nhóm di truyền dựa các cơ sở khác nhƣ: kiểu hình, SSR, AFLP để có những nhận định chính xác và độ tin cậy cao hơn trong công tác tuyển chọn và lai tạo giống mới. Xây dựng các định hƣớng về kiểm tra, quản lý và bảo vệ nguồn gen các giống lan sẵn có trong nƣớc. 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 2. Dƣơng Ngọc Bích Quyên, 2000. Khảo sát các yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự nhân giống invitro cây lan Cymbidium. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông Học, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. 4. Huỳnh Chấn Khôn, 2006. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây tiêu (Piper nigrum L.) tại thị xã Bà Rịa thuộc tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Lê Thị Thanh Tuyền, 2005. Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng marker phân tử. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 6. Lê Trọng Cúc, 2002. Đa dạng sinh học và bảo tồn thiên nhiên. Nhà xuất bản ĐHQG Hà Nội. 7. Lƣu Chấn Long, 2002. Trồng Và thưởng thức lan nghệ thuật. Nhà xuất bản Đà Nẵng. 8. Nguyễn Nghĩa Thìn, 2005. Đa dạng sinh học và tài nguyên di truyền thực vật. Nhà xuất bản ĐHQG Hà Nội. 9. Nguyễn Thị Hồng Nhật, 2004. Nhân giống invitro cây lan Dendrobium bằng phương pháp nuôi cấy chồi đơn và giả hành. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông Học, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 10. Nguyễn Thị Phƣơng Dung, 2005. Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng Cacao (Theobroma Cacao L.) bằng kỹ thuật Microsatellite. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 11. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 68 12. Phạm Hoàng Hộ, 1990. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản trẻ Tp. Hồ Chí Minh. 13. Trần Hợp, 1993. Phong lan có hương thơm. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật. 14. Trần Quang Hoàng, 2005. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy invitro của hai giống lan Dendrobium và Cymbidium. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 15. Trần Văn Bảo, 2002. Kỹ thuật nuôi trồng phong lan. Nhà xuất bản trẻ. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 16. Averyanov L. V., 2004. Biogeography of orchids in Easterm Indochina. VNU. Journal of Science, Nat., Sci., and Tech., T.XX, No 4. 17. Chen T. C., Lin T. J., Kuo Y. L., and Wu W. L., 2003. Genetic fingerprinting of orchids by molecular markers. The Eighteenth Joint Annual Conference of Biomedical Sciences. 22-23 March, 2003. Taipei, Taiwan. Abstract book: 89. 18. Dan Thai Vo, 2006. Revealing genetic diversity in tea grown in Vietnam by using simple sequence repeat (SSR) makers. Doctoral thesis. 19. DING Xiao-yu, XU Luo-san, WANG Zhen-tao, et al, 2002. Molecular authenticationof Dendrobium chrysanthum from its allied species of Dendrobium[J]. China J Chin Mater Med,27(6):407-411. 20. Ge Ding, Xiao-Yu Ding, Jie shen, Feng Tang, Dong-Yang Liu, Jia He, Xue- Xia Li, Bi-Hai Chu, 2005. Genetic diversity and molecular authentication of wild population of Dendrobium officinate by RAPD.40:1028-32 21. Hugh G. Griffin., and Annette M. Griffin., 2000. PCR Technology Current Innovations. The Cromwell press, UK. 22. James Rohlf F., 2000. NTSYSpc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Department of Ecology and Evolution State University of New York. 23. McPherson M. J., and Moller S. G., 2000. PCR. The Cromwell press, UK. 69 24. Yue G. H., Lam-Chan L. T., and Hong Y., 2006. Development of simple sequence repeat (SSR) markers and their use in identification of Dendrobium varieties. Molecular Ecology Notes. CÁC TRANG WEB 25. 26. 27. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sản phẩm PCR với marker RAPD  Primer OPB08 (a) (a) (b) Sản phẩm PCR với primer OPB08 của 10 mẫu lan thu thập ở Bảo Lộc (hình a) và Bình Phƣớc (hình b) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 L  Primer U693 (a) (b) Sản phẩm PCR với primer U693 của 10 mẫu lan thu thập ở Bảo Lộc (hình a) và Bình Phƣớc (hình b) Chú thích: hình b chụp bằng máy kỹ thuật số. 1 2 3 4 5 L 6 7 8 9 10 350 bp 1 2 3 4 5 6 L 7 7 8 9 10 350 bp  Primer OPAH13 (a) (b) Sản phẩm PCR với primer OPAH13 của 10 mẫu lan thu thập ở Bảo Lộc (hình a) và Bình Phƣớc (hình b) Chú thích: hình a chụp bằng máy kỹ thuật số. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L 350 bp 350 bp Phụ lục 2: Bảng mã hóa số liệu kết quả RAPD  Primer OPAC10 kích thƣớc (bp) Mẫu 3000 1400 1200 1000 900 750 700 650 600 500 450 350 250 180 KĐ 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 VR 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 LT 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 GH 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 TT 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 TV 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 TTV 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 NĐH 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 TB 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 LN 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 KĐ1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 VR1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 LT1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 GH1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 TT1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 TV1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 TTV1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 NĐH1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 TB1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 LN1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0  Primer S1384 kích thƣớc (bp) Mẫu 1500 1100 1000 900 800 650 550 450 400 290 KĐ 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 VR 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 LT 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 GH 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 TT 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 TV 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 TTV 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 NĐH 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 TB 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 LN 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 KĐ1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 VR1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 LT1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 GH1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 TT1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 TV1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 TTV1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 NĐH1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 TB1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 LN1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0  Primer OPB08 kích thƣớc (bp) Mẫu 1500 1300 1200 1000 900 650 600 500 400 300 KĐ 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 VR 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 LT 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 GH 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 TT 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 TV 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 TTV 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 NĐH 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 TB 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 LN 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 KĐ1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 VR1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 LT1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 GH1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 TT1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 TV1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 TTV1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 NĐH1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 TB1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 LN1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0  Primer OPB01 kích thƣớc (bp) Mẫu 1700 1200 1000 800 600 500 400 KĐ 0 0 1 1 1 1 1 VR 0 1 0 0 0 0 0 LT 1 0 0 0 1 0 0 GH 1 0 0 0 1 0 0 TT 0 1 0 0 0 1 0 TV 0 1 0 0 0 0 0 TTV 0 1 0 0 0 0 0 NĐH 1 0 0 0 1 0 0 TB 1 0 0 0 0 0 0 LN 1 0 0 0 0 0 0 KĐ1 0 0 1 1 1 1 0 VR1 0 1 0 0 0 0 0 LT1 1 0 0 0 1 0 0 GH1 1 0 0 0 0 0 0 TT1 0 1 1 0 0 0 0 TV1 0 1 0 0 0 0 0 TTV1 0 1 0 0 0 0 0 NĐH1 1 0 0 0 1 0 0 TB1 1 0 0 0 0 0 0 LN1 1 0 1 0 1 0 0  Primer U693 kích thƣớc (bp) Mẫu 1000 900 750 650 490 350 KĐ 0 0 0 1 1 1 VR 0 1 1 1 1 1 LT 1 1 1 1 1 1 GH 1 1 1 1 1 1 TT 1 0 1 1 1 1 TV 0 1 0 1 0 1 TTV 0 1 0 1 1 1 NĐH 0 0 0 1 1 1 TB 0 0 0 1 1 1 LN 1 0 0 1 1 1 KĐ1 0 0 1 1 0 1 VR1 0 1 1 1 0 1 LT1 0 0 1 1 0 1 GH1 0 1 1 1 0 1 TT1 0 1 0 1 0 1 TV1 1 0 0 0 0 1 TTV1 1 0 0 0 0 1 NĐH1 0 0 0 1 0 1 TB1 1 1 0 1 0 1 LN1 1 1 0 0 0 1  Primer OPAH13 kích thƣớc (bp) Mẫu 1500 1400 1300 900 800 600 500 400 350 290 KĐ 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 VR 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 LT 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 GH 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 TT 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 TV 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 TTV 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 NĐH 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 TB 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 LN 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 KĐ1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 VR1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 LT1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 GH1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 TT1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 TV1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 TTV1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 NĐH1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 TB1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 LN1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0