Khóa luận Đánh giá hàm lượng axit phytic ở một số giống lúa địa phương và một số giống lúa đột biến bằng phương pháp sinh hóa và microsatellite

g qua sự so sánh của các hệ thống gen trên sinh vật, phƣơng pháp đánh dấu phân tử cho phép khám phá và tìm ra sự đa dạng sinh học và tiến hóa của sinh vật (IAEA, Wienna, 2002). Chiến lƣợc chọn giống nhờ vào đánh dấu phân tử là phƣơng pháp tác động mạnh đến hiệu quả chọn giống. Các đánh dấu có kết quả kỹ thuật cao trên cơ sở PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm đánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu đƣợc thế giới ủng hộ từ năm 1995. Chọn giống trên cơ sở đánh dấu phân tử từ nguyên lý cơ bản là chứng minh, đánh dấu liên kết với gen nằm đúng vị trí (locus) trên nhiễm sắc thể và vị trí này phản ánh đƣợc đặc tính mong muốn. Các đánh dấu đƣợc chia thành hai nhóm: đánh dấu trên cơ sở PCR và đánh dấu thăm dò và lai DNA ( Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Các kỹ thuật đánh dấu phân tử nhƣ RFLP, AFLP, RAPD, SSR, ISSR, AFL, SCAR và STS cho phép chọn lọc trực tiếp nhiều tính trạng trên quần thể F2, quần thể cận giao, những dòng đơn bội kép và những dòng tái tổ hợp (IAEA, Wienna, 2002). Ứng dụng đánh dấu phân tử trên cây lúa (Oryza sativa L.) thành công trong chọn giống chống chịu một số sâu bệnh hại quan trọng nhƣ lập bản đồ gen kháng bệnh đạo ôn (Yu và ctv.,1991), gen kháng bệnh bạc lá (Mc couch, 1991), lập bản đồ gen kháng rầy nâu (Nguyễn Thị Lang và ctv., 2002), gen kháng sâu đục thân (Tan và ctv., 1993). Đánh dấu phân tử RFLP đã đƣợc ứng dụng để thiết lập bản đồ gen trên cây lúa. Bản đồ phủ trên 12 11 nhiễm sắc thể và có chiều dài tổng cộng 1389cM từ cặp lai IR34538 (Indica) và Bulu Dalam (Mc couch và ctv, 1998). Trong những thập niên qua, di truyền Menden đã và đang bƣớc vào thời đại mới, đƣợc gọi là hệ gen (Genomics), nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các gen. Những thông tin về chuỗi mã DNA đã đƣợc giải mã trên một số loài điển hình nhƣ lúa và Arapidopsis, nhƣng chức năng của các gen tìm thấy chƣa đƣợc biết nhiều. Việc tạo ra đột biến trên cây trồng kết hợp với đánh dấu phân tử đang đóng một vai trò quan trọng để giải quyết vấn đề trên, khi tác nhân gây đột biến làm thay đổi các tính trạng mang gen mục tiêu. Các đánh dấu ứng dụng hiện nay đƣợc xem nhƣ có hiệu quả đáng tin cậy là đánh dấu “siêu vệ tinh” hay còn gọi là SSR (simple sequence repeats) và đang đƣa vào ứng dụng rộng đánh dấu “các thể đa hình nucleotide đơn” hay SNP (Single nucleotid polymorphism) để xác định đột biến. 2.4. Nghiên cứu di truyền gen axit phytic thấp Kiểu gen và môi trƣờng là những nhân tố chính làm thay đổi tổng lƣợng photpho trong hạt.Trong tự nhiên các kiểu gen điều khiển sự thay đổi lƣợng photpho trong hạt chủ yếu là tăng hay giảm hàm lƣợng axit phytic mà các thành phần chứa photpho khác không thay đổi. Ngƣời ta đã tạo đƣợc một số gen lặn (lpa) làm giảm hàm lƣợng axit phytic bằng phƣơng pháp gây đột biến bằng hoá chất và phân lập gen này ở trên cây bắp và cây lúa mạch. Các gen này làm thay đổi rất lớn giữa các thành phần chứa photpho trong hạt nhƣ axit phytic, các inositol photphate khác và photphate tự do.Trong đó gen đột biến lpa1 làm giảm hàm lƣợng axit phytic bằng cách tự cân bằng sinh học trong phân tử với photphat tự do (tức là làm tăng hàm lƣợng photphat tự do). Gen này đƣợc xác định nằm trên chromosome 1S của cây bắp và trên chromosome 2H của cây lúa mạch. Tƣơng tự đối với gen lpa2 thì axit phytic giảm cùng với các dạng inositol photphate khác và làm tăng lên photphate tự do. Gen đột biến lpa2 đƣợc xác định nằm trên chromosome 1S của cây bắp và chromosome 2H của cây lúa. Nhƣ vậy cho đến 12 nay tất cả các gen đột biến cho hàm lƣợng axit phytic thấp đều làm tăng lƣợng photphate tự do. Đây chính là chỉ thị trong việc chọn lọc các dòng lúa đột biến có hàm lƣợng axit phytic thấp. Đột biến axit phytic thấp đƣợc tạo ra do các tác nhân đột biến trên các loài cây trồng nhƣ bắp, lúa gạo, lúa mạch và đậu nành ( Ras-mussen và Hatzack, 1998; Larson và ctv., 2000; Raboy và ctv., 2000; Wilcox và ctv., 2000) và đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu chọn giống di truyền (Raboy và ctv., 2001). Có hai loại đột biến ảnh hƣởng đến axit phytic thấp trên bắp là đột biến lpa1 làm giảm lƣợng axit phytic nhƣng không tích lũy inositol polyphotphate và đột biến lpa2 cũng làm giảm lƣợng axit phytic nhƣng hạt đột biến này tích lũy InsP3, InsP4 và InsP5 (Raboy và ctv., 2000). Dạng đột biến lpa2 ở ngô (Zea mays) xảy ra do sự đột biến ở gen inositol phosphate kinase. Gen inositol phosphate kinase ở ngô (ZmIpk) đƣợc xác định thông qua sự so sánh trình tự với gen Ins(1,3,4)P3 5/6-kinase ở ngƣời và Arabidopsis. Dạng mRNA của gen ZmIpK biểu hiện ở trong phôi, nơi mà hàm lƣợng axit phytic gia tăng ở hạt ngô. Phân tích Southern-blot, cloning, đọc trình tự gen ZmIpK từ dạng đột biến lpa2 cho thấy alen lpa2-1 đƣợc tạo ra do sự sắp xếp lại trình tự ở locus của gen ZmIpK và alen lpa2-2 đƣợc tạo ra do sự đột biến nucleotide làm xuất hiện một codon stop ở đầu N của gen ZmIpK. Và điều này cho thấy ZmIpK là một trong những enzym kinase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp axit phytic trong giai đoạn phát triển của hạt. Sinh tổng hợp axit phytic thấp trong hạt và sự xác định gen thông qua con đƣờng phân lập các nhân bản cDNA trên bắp. Các nhân bản này có chuỗi mã di truyền giống với nhiều inositol photphat kinase từ động vật và nấm men. Ứng dụng kỹ thuật bất hoạt chèn đoạn mã đột biến (Mutator insertion knockout) để điều tra chức năng của gen. Sau khi bất hoạt những gen này, hàm lƣợng axit phytic trong hạt sẽ giảm, hạt sẽ tích lũy myo-inositol, inositol photphat và photphat tự do. Trong sự phát triển của hạt, axit phytic đƣợc tổng hợp từ quá trình đƣờng phân (Gluco-6-P). Enzym Ins(3) P1 synthase (MIPS) xúc tác quá trình Glucose-6- photphate để tạo ra Ins(3) P1. 13 Phân tích clone MIPS ở cây yến mạch (Avena sativa) cho thấy clone này chứa 1936 bp (accession no. AB059557) mã hóa cho polypeptid có số lƣợng amino axit là 510 và có tính tƣơng đồng cao với nhiều loại cây trồng khác. Theo Yoshida và ctv. cho thấy độ tƣơng đồng amino axit giữa protein MIPS ở cây yến mạch với protein MIPS của các cây khác vào khoảng 77 đến 88% (Yoshida và ctv..1999, Hageman và ctv.. 2001). Protein MIPS có trọng lƣợng 56.13 kD. Phân tích bằng phƣơng pháp Northern blot cho thấy gen MIPS biểu hiện cao trong suốt giai đoạn đầu trƣởng thành của hạt và giảm hoạt động ở cuối giai đoạn trƣởng thành. Nồng độ axit phytic cũng tăng từ từ cùng với sự trƣởng thành của hạt. RNA của gen MIPS ít đƣợc phát hiện thấy ở hoa và không phát hiện đƣợc ở thân và lá. Nồng độ RNA MIPS cao nhất đƣợc phát hiện ở những hạt giai đoạn chƣa trƣởng thành của hạt và giảm từ từ theo quá trình phát triển của hạt. Hình 2.5. Phân tích bằng phƣơng pháp Northern-blot ở cây yến mạch. A: biểu hiện của gen MIPS ở hạt chƣa trƣởng thành (1), lá (2) và thân (3) sau 5 ngày trổ hoa. B: Biểu hiện gen MIPS ở hạt đang phát triển lúc 0, 5, 10, 15 và 25 ngày sau khi trổ hoa. (Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm) 14 Hình 2.6. Sự thay đổi nồng độ P tổng, axit phytic và và P vô cơ sau khi trổ hoa ở cây yến mạch. (Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm) Phân tích hàm lƣợng P tổng số, axit phytic cho thấy nồng độ P tổng số ở hoa là 3,51 mg/g trọng lƣợng khô (DW), và tăng từ từ với sự trƣởng thành của hạt (Hình 2.6). Nồng độ P tổng số ở hạt trƣởng thành đạt 10,15 mg/g trọng lƣợng khô lúc 65 ngày sau khi ra hoa (giai đoạn trƣởng thành đầy đủ ). Axit phytic bắt đầu tăng ở giai đoạn đầu và tăng nhanh cùng sự trƣởng thành của hạt với nồng độ 5,97 mg/g trọng lƣợng khô. Nồng độ P vô cơ là 1,58 mg/g trọng lƣợng khô ở hoa và tăng đến 3,3 mg/g trọng lƣợng khô sau 30 ngày trổ hoa, sau đó giảm nhanh cùng với sự tăng lên của axit phytic. Những hợp chất chứa P khác ngoại trừ axit phytic và axit vô cơ thì nồng độ tƣơng đƣơng với nồng độ P vô cơ ở giai đoạn phát triển ban đầu của hạt. Hợp chất P khác chứa P tế bào đƣợc định nghĩa là những hợp chất đƣờng có chứa P, trọng lƣợng phân tử thấp tham gia vào thành phần cấu tạo của màng tế bào. Những hợp chất này là những tiền chất quan trọng trong sinh tổng hợp axit phytic và inositol photphat. P đƣợc hấp thụ bởi cây trồng sẽ đƣợc chuyển trực tiếp vào hạt và đóng vai trò quan trọng cho việc tổng hợp những hợp chất hữu cơ chứa P ở giai đoạn đầu của quá trình trƣởng thành. Những kết quả nghiên cứu này cho thấy enzym MIPS biểu hiện mạnh trong hạt và đóng vai trò sinh tổng hợp axit phytic trong suốt quá trình phát triển của hạt. 15 2.5. Đánh dấu siêu vệ tinh (Microsatellite) Đánh dấu siêu vệ tinh hay SSR đƣợc ứng dụng thành công từ năm 1995 (Mc couch và ctv., 1996). Đó là tập hợp các đoạn chuỗi mã rất ngắn từ 2-10bp. Các đoạn này xuất hiện trên chuỗi mã DNA đƣợc lặp đi lặp lại nhất định, sắp xếp ngẫu nhiên, rất khác nhau đƣợc phân tán khắp nơi trên bộ gen động vật thực vật và con ngƣời (Gunter Kahl, 2001). Những chuỗi mã ngắn này có thể ở dạng lặp lại của hai, ba hay bốn nucleotid và đƣợc xắp xếp ngẫu nhiên trên một dãy của 5-50 bản sao (copy) chẳng hạn nhƣ (AT)29, (CAC)16 hay (GACA)32. SSR xuất hiện rất nhiều trên bộ gen thực vật và có mặt trung bình sau mỗi 6-7kb (Cardle và ctv., 2000). Các đoạn này đƣợc khuyếch đại trong phản ứng PCR nhờ vào mồi xuôi và mồi ngƣợc. Sản phẩm PCR chứa các alen SSR đƣợc tách rời thông qua điện di trên gel agarose hay gel acrylamide. SSR hữu ích trong việc thiết lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lý và bản đồ chuỗi mã cơ bản (Sequence-based) trên cây lúa. Ngoài ra SSR còn cung cấp cho nhà chọn giống và nhà di truyền công cụ đáng tin cậy và hiệu quả để liên kết sự khác biệt giữa kiểu gen và kiểu hình . 2.6. Quá trình sinh tổng hợp axit phytic Con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic có thể tóm tắt gồm 2 phần sau: sự cung cấp Ins và sự tổng hợp Ins polyphotphat sau đó. Nguồn tổng hợp vòng Ins duy nhất là enzym Ins(3) P1 synthase (MIPS). Enzym này chuyển Glc-6-P thành Ins(3) P1(Loewus và Murthy, 2000). Hoạt tính enzym Ins(3) P1synthase ở những hạt đang phát triển cung cấp Ins cũng nhƣ Ins(3)P1 (Yoshida và ctv., 1999) mà sau đó sẽ đƣợc chuyển thành axit phytic qua sự photphoryl hóa của hai hay nhiều enzym kinase (Biswas và ctv., 1978; Stephens và Irvine, 1990 ). Bƣớc photphoryl hóa Inositol đầu tiên đƣợc xúc tác bởi enzym Inositol kinase. Enzym này cũng xúc tác tạo ra Ins(3)P1 (English và ctv., 1966; Loewus và ctv., 1982). Con đƣờng tổng hợp axit phytic khởi đầu bằng cơ chất ban đầu là Ins, hoạt động của enzym Ins kinase và trải qua nhiều giai đoạn photphoryl hóa thông qua những hợp chất trung gian đã 16 đƣợc miêu tả lần đầu tiên thông qua những nghiên cứu ở nấm nha bào Dictyostelium discoideum (Stephens và Irvine, 1990) và những nghiên cứu sau này ở tập đoàn đơn bào Spirodela polyrhiza (Brearley và Hanke, 1996, 1996b. Con đƣờng sinh tổng hợp ở D. Discoideum tiến hành thông qua những hợp chất trung gian Ins(3) P1, Ins(3,6) P2, Ins(3,4,6) P3, Ins(1,3,4,6) P4, và Ins(1,3,4,5,6) P5. Con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic ở S. Polyrhiza tiến hành thông qua những hợp chất trung gian Ins(3) P1, Ins(3,4) P2, Ins(3,4,6) P3, Ins(3,4,5,6) P4, và Ins(1,3,4,5,6) P5. Những con đƣờng này có điểm chung ở những hợp chất trung gian đầu và cuối. Những Ins photphat này vẫn chƣa đƣợc biết với vai trò là những chất truyền tín hiệu thứ cấp. Sự tổng hợp axit phytic cũng có thể tiến hành một phần qua những con đƣờng liên quan đến những chất truyền tín hiệu bao gồm photphatidylinositol (PtdIns), những photphat trung gian và Ins(1,4,5)P3 (Bƣớc 6 và 7; Van der kayy và ctv., 1995; York và ctv., 1999). Ins photphat bị photphoryl hóa ở mức độ cao hơn axit phytic nhƣ là InsP7 và InsP8, là những hợp chất đƣợc ghi nhận là xảy ra phổ biến ở tế bào eukaryotic (steps 12 và 13; Mayr và ctv., 1992; Menniti và ctv., 1993; Stephens và ctv., 1993; Brearley và Hanke, 1996c; Safrany và ctv., 1999) Những nghiên cứu còn cho thấy (Biswas và ctv., 1978b; Phillippy và ctv., 1994; Brearley và Hanke, 1996b) Ins(1,3,4,5,6) P5 còn đóng vai trò là chất Ins photphat sau cùng trong con đƣờng tổng hợp axit phytic ở tế bào eukaryotic. 17 Hình 2.7. Sơ đồ con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic ở trong tế bào eukaryo: (1), D-Ins(3)-P1 (or L-Ins[1]-P1) synthase; (2), D-Ins 3-phosphatase (or L-Ins 1-phosphatase); (3), D-Ins 3-kinase (or L-Ins 1-kinase); (4), Ins P- or polyP kinases; (5), Ins (1,3,4,5,6) P5 2-kinase hay phytic acid-ADP phosphotransferase; (6), PtdIns synthase; (7), PtdIns và PtdIns P kinases, theo sau bởi PtdIns P-specific phospholipase C, và Ins P kinases; (8), D- Ins(1,2,3,4,5,6) P6 3-phosphatase; (9) D-Ins(1,2,4,5,6) P5 3-kinase; (10), D- Ins(1,2,3,4,5,6) P6 5-phosphatase; (11), D-Ins(1,2,3,4,6) P5 5-kinase; (12), pyrophosphate-forming Ins P6 kinases; (13), pyrophosphate-containing Ins PolyP-ADP -phosphotransferases. Nguồn: 18 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1 thánh 8 năm 2005 tại phòng phân tích sinh hóa và phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc Bộ Môn Di Truyền và Chọn Giống của Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, quận Ô Môn, TP. Cần Thơ. 3.2. Vật liệu Tên của các giống lúa trong thí nghiệm Bảng 3.1. Tên các giống lúa đƣợc phân tích Số thứ tự Tên giống 1 2 3 4 5 6 OM 1490 dạng bố mẹ OMCS 2000 dạng bố mẹ OM 1490 đột biến OMCS 2000 đột biến Lúa mùa Lúa cao sản 3.3. Nguồn gốc vật liệu Các quần thể lúa đột biến, lúa mùa và lúa cải tiến trên đƣợc lấy tại ngân hàng lúa của viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong đó: OMCS 2000, OM 1490, AS996, NTCĐ-5 đƣợc Bộ môn di truyền Viện Lúa Đồng Bằng sông Cửu Long phát triển bằng phƣơng pháp lai tạo và tạo biến dị soma. 19 OM CS2000 đƣợc phát triển từ cặp lai OM1738/MRC19399 và OM 1490 đƣợc phát triển từ cặp lai OM606/IR44592-62-1-3-3 . Đây là hai giống đƣợc chọn số dòng nhiều để đánh giá và phân tích hàm lƣợng axit phytic . Quần thể lúa đột biến OM1490 và OMCS2000 đƣợc tạo ra bằng việc gây đột biến bằng tia gamma với 5 Kr và phát triển thông qua chọn lọc ở các thế hệ M0 M1 , M2, M3 và M4.... AS996 đƣợc phát triển từ phƣơng pháp lai xa và cứu sống phôi mầm IR 64/ O. Rufipogon và đƣợc phóng xạ bằng tia gamma với 3Kr Nàng thơm Chợ Đào -5 đƣợc đột biến bằng tế bào soma và tiếp tục đƣợc đột biến với tia phóng xạ gamma với cƣờng độ 5 Kr . Qui trình phát triển dòng đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ( Lang 2004) OM O OM 606 x IR44592 – 62 – 1 – 3 – 3 OM 1490 M0 M1 M2 M3 M4 Tia Gamma với 5 Kr OM 1738 x MRC 19399 OMCS 2000 M0 M1 M2 M3 M4 Tia Gamma với 5 Kr 20 3.4. Dụng cụ và hóa chất 3.4.1. Dụng cụ Cối nghiền gạo Đĩa 96 giếng Pipetman các loại Máy thanh trùng (autoclave), máy Waterbath, lò vi sóng Tủ lạnh 40 và -200 C Cân Máy ly tâm Máy chạy PCR Máy điện di nằm ngang (Gibco BRL model 4001-Life technologies) Máy chụp hình gel bằng tia UV 3.4.2. Hóa chất 3.4.2.1. Hóa chất phân tích sinh hóa HCL, H2SO4, Amonium Molybdate, Axit Ascorbic, K2HPO4 của Trung Quốc. 3.4.2.2. Hóa chất phân tích phân tử Các hóa chất ly trích DNA bao gồm: Cloroform : isoamylalcohol (24:1), Isopropanol, Etanol 100% và 70%, Dung dịch đệm ly trích DNA (xem phụ lục), SDS, CTAB, NaCl, TE thuộc hãng Merck của Đức Các hóa chất trong chạy điện di: Agarose (Mỹ), Dung dịch TAX 50X và TBE 10X. Các hóa chất chạy PCR : Dung dịch stock của dNTPs (5mM), dung dịch stock của PCR buffer (10X) 21 3.5. Xác định lƣợng photpho trong hạt bằng phƣơng pháp sinh hoá Dùng phƣơng pháp tách chiết từng hạt theo Chen và ctv (1956) thực hiện trên đĩa vi độ chuẩn 96 giếng. 3.5.1. Phƣơng pháp thực hiện Chuẩn bị pha dung dịch Chen’s : Bảng 3.2. Thành phần các hóa chất trong dung dịch Chen’s Thể tích (theo tỷ lệ) Thành phần 1 1 1 2 6N H2SO4 2.5% Ammonium Molybdate 10% Axit Ascorbic H2O Chuẩn bị thang photpho chuẩn cho thí nghiệm 96 giếng. Thang photpho chuẩn này đƣợc thực hiện trên đĩa vi độ chuẩn 96 giếng và dùng để so sánh với mẫu phân tích của các dòng lúa khác. Ngoài ra cần lƣu ý là dung dịch Chen’s và thang Photpho chuẩn phải đƣợc pha mới từng ngày. Thang chuẩn Photpho đƣợc pha theo 5 mức sau: Bảng 3.3. Thang photpho chuẩn theo 5 mức Mức µl 1mM K2HPO4 µl HCl 0.4M µl H2O 1 2 3 4 5 0 5 15 30 45 10 10 10 10 10 90 85 75 60 45 22 3.5.2. Tiến hành phân tích Tiến hành bóc hạt lúa để lấy hạt gạo bên trong của các dòng thuộc các giống trên và cho vào từng gói có đánh dấu riêng biệt theo từng dòng.Trong đó bao gồm có 185 dòng OM 1490 đột biến, 165 dòng OMCS 2000 đột biến, 2 dòng bố mẹ của OM 1490 và OMCS 2000, 150 dòng thuộc giống lúa mùa và cao sản. Ngoài những giống trên còn có thêm các giống khác nhƣ lúa hoang, golden rice, huyết rồng, Lpa-1, Lpa-2, Xie Q. Zao dùng làm đối chứng trong phân tích. Những dòng này đã đƣợc đột biến thành công về tính trạng axit phytic thấp. Bƣớc 1: Lấy mỗi dòng 8 hạt, nghiền riêng từng hạt và cho từng hạt đã đƣợc nghiền vào từng giếng theo hàng dọc. Bƣớc 2: Cho vào mỗi giếng 200 µl HCL 0.4M và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 3: Trích từ mỗi giếng 10 µl sang giếng mới, sau đó thêm vào 90µl H2O vào mỗi giếng. Thêm vào 100µl dung dịch Chen’s vừa mới pha. Bƣớc 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 tiếng. Kết quả đƣợc so sánh với thang Photpho chuẩn. Hạt càng xanh đậm đƣợc đánh giá là hạt có hàm lƣợng axit phytic càng thấp nghĩa là khoáng vi lƣợng càng cao. Hình 3.1. Thang photpho chuẩn 23 3.6. Đánh giá kiểu gen qua chỉ thị phân tử. 3.6.1. Phân lập DNA từ mẫu lá lúa (Nguyễn Thị Lang, 2002 ) Lấy mẫu lá: Mô lá lúa non, khỏe đƣợc lấy trên từng cá thể riêng lẻ sau khi đã gieo đƣợc 10 ngày cho vào ống tube, ghi nhãn cẩn thận và đƣợc đặt trong thùng đá. Ly trích DNA: Ở đây DNA đƣợc ly trích theo phƣơng pháp CTAB. Có thể tiến hành ly trích DNA theo những phƣơng pháp khác đơn giản hơn, tuy nhiên phƣơng pháp này cho ra kết quả tinh sạch hơn. Giới thiệu phƣơng pháp CTAB 1.Cắt lá nhỏ và nghiền trên cối. 2.Thêm 660µl dung dịch ly trích. 3. Đặt vào đá 30 phút. 4.Thêm 40µl của 20 % SDS. Ủ trong water bath khoảng 10 phút ở nhiệt độ 65oC (nhớ phải lắc). 5. Thêm 100µl của 5M NaCl và trộn thật kỹ . 6.Thêm 100µl CTAB, trộn kỹ. 7. Ủ trong water bath khoảng10 phút ở nhiệt độ 65oC. 8. Chuyển mẫu vào tube mới (1,5ml or 2 ml)(có thể không chuyển). 9. Thêm 900µl cloroform : isoamyl alcohol = 24 :1 và ly tâm 12000 vòng trong 3 phút. 10.Chuyển supernatant vào một tube mới 2.0 và thêm vào 600ul isopropanol. 11. Ly tâm 5 phút (12000rpm) 12. Bỏ supernatant chỉ giữ lại pellet. Rữa cồn 70% trong 2 lần và phơi khô 13. Thêm 50 µl TE vào DNA và trữ ở nhiệt độ -200 C 24 Vai trò của một số chất ly trích 1. Chất phá vỡ màng tế bào : Màng tế bào cấu tạo là lớp lipid kép đƣợc phá vỡ bằng chất tẩy. Ví dụ: SDS (sodium dodecylsulfat, lauryl sulfat, 2- mercaptoethanol. Trong đó 2- mercaptoehanol có tác dụng phá màng mạnh. Trong dung môi chiết luôn hiện diện 2 chất là EDTA và Tris. EDTA: có tác dụng gắn chặt ion Mg++. Vì các enzym nuclease muốn hoạt động cần Mg++làm cofactor, do đó EDTA gắn chặt với Mg++ làm bất hoạt enzym này góp phần bảo vệ DNA. Tris: có tác dụng đệm rất hiệu quả giúp dung môi luôn giữ ở pH 8 vì ở pH đó DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng acid purin rất dễ bị loại thải. 2. Chất loại tạp ( protein, polysaccharid…): Để loại bỏ tạp chủ yếu là protein sử dụng tác nhân biến tính protein ( dung dịch chloroform : isoamyl alcohol = 24:1). 3. Chất tủa DNA: DNA đƣợc thu ở dạng cô đặc vừa bảo vệ chúng khỏi sự phân huỷ của enzym vừa hòa tan lại chúng với nồng độ mong muốn. Có 3 cách tủa: Tủa trong ethanol: đƣợc thực hiện trong điều kiện nồng độ muối cao, thể tích ehanol cao ( 2 – 2,5 lần thể tích mẫu ) ở nhiệt độ thấp ( - 20oC ). Trong điều kiện này hầu hết toàn bộ acid nucleic đƣợc tủa. Tủa trong isopropanol: không cần sự hiện diện của muối, thể tích isopropanol thấp ( 0,6 thể tích mẫu ). Các DNA trọng lƣợng phân tử thấp không bị tủa do đó có thể loại bỏ chúng khi tủa bằng isopropanol. Tủa bằng CTAB ( cetyltrimethylammonium bromid): 25 CTAB là 1 chất tẩy cation dƣơng. Việc kết hợp CTAB với DNA gồm 2 bƣớc: (1) chất tẩy là ion dƣơng nên sẽ bám lên phần điện tích âm của DNA ( do gốc PO-4 tạo ra). Tác động tĩnh điện của CTAB lên DNA làm giải phóng 1 ion Na +. Vì vậy với nồng độ muối Na thấp hơn 0,7 M thì CTAB kết hợp với DNA, phức này tan trong dung dịch nồng độ muối cao. Ở nồng độ muối cao hơn 0.7 M, CTAB sẽ tạo phức với protein và polysaccharid mà không tạo tủa với DNA. Do đó CTAB rất hữu dụng trong quá trình tinh khiết DNA từ những cơ quan có nhiều polysaccharid (vd: thực vật, vài vi khuẩn Gram (-)) . Có 2 cách sử dụng CTAB:  Để tủa DNA bộ gen: CTAB đƣợc thêm vào dịch trích DNA với nồng độ muối > 0,7 M. Sau khi loại bỏ phức CTAB/polysaccharid/ protein bằng CHCl3 và phenol, DNA đƣợc phục hồi từ phần dịch nổi bằng cách tủa với isopropanol hoặc ethanol.  Sau khi tủa DNA đƣợc thu nhận lại bằng cách ly tâm, cặn đƣợc rửa bằng ethanol 70% để loại bỏ dấu vết muối, CTAB, isopropanol là những chất có thể ức chế phản ứng SSR. 3.6.2. Kiểm tra chất lƣợng DNA DNA đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng cách điện di trên gel agarose 0.8 %.  Gel 0,8% trong dung dịch TAE 1X, đƣợc nấu để hòa tan agarose, để nguội đến nhiệt độ 650C. Đổ gel vào khay có gắn sẵn lƣợc tạo giếng trên gel.  Khi gel cứng, lấy lƣợc ra khỏi gel và đặt gel vào khay điện di trong dung dịch TAE 1X.  Lấy 8-10 l dung dịch DNA trộn với 2-4 l dung dịch lắng (Loading buffer) bơm vào giếng trên gel.  Nhuộm gel trong dung dịch có ethidum bromide 0,5% khoảng 10-20 phút.  Chụp gel dƣới tia UV và đánh giá dựa trên các vạch trắng xuất hiện: Nếu DNA có chất lƣợng thì giống vạch lamda phage chuẩn. Nếu DNA lẫn tạp và bị gãy sẽ thấy có vệt trắng kéo dài trên gel. 26 Hình 3.2. Kết quả DNA đã ly trích đƣợc kiểm tra chất lƣợng trên gel agarose 0,8% 3.6.3. Phân tích SSR Microsatellite là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản, thƣờng xảy ra một cách ngẫu nhiên trong hầu hết các genome thực vật. Marker SSR đƣợc viết tắt từ chữ simple sequence repeats. Do đó SSR có thể đƣợc khuyếch đại trong ống nghiệm bằng phƣơng pháp PCR với tính phát triển của primer theo miền của hai bên trên một locus. Kỹ thuật ứng dụng SSR rẽ tiền hơn kỹ thuật RFLP. Do đó các nhà nghiên cứu tiếp tục dùng SSR thiết kế bản đồ gen trong di truyền, chọn lọc giống bằng SSR, đa dạng hoá các vật liệu di truyền. Phản ứng PCR cho SSR Giống nhƣ phƣơng pháp RAPD, một phản ứng PCR cho SSR baogồm các thành phần sau: 1. Một dung dịch gọi là buffer, chứa Tris-HCl, KCL và MgCl2 2. Bốn deoxynucleotide (dNTPs) 3. Hai oligonucleotide primers 4. DNA 5. Một DNA polymerase Thể tích cần cho một PCR của SSR có thể là 15-50 l là đủ. DNA có thể ly trích từ nhiều phƣơng pháp khác nhau. Tuy nhiên trƣớc khi dùng DNA, điều quan trọng là nồng độ DNA về số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng phải đƣợc kiểm tra. Nồng độ dùng cho SSR từ 25-30ng/ l. Nếu nồng dộ quá cao, chúng ta phải pha loãng trƣớc khi sử dụng. 27 3.6.3.1. PCR dùng cho một phản ứng Bảng 3.4. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR Thành phần Pha dung dịch Thể tích ( l) Nồng độ sau cùng Ghi chú H2O 12,5 PCR buffer 10X 2 1X dNTP 1mM 2 100 M Primerforward 5 M 1 0,25 M Primer reverse 5 M 1 0,25 M Tag polymerse 5unit/ l 0,5 2,5unit DNA 25ng/ l 1 25ng/phản ứng Tuỳ theo nồng độ DNA 3.6.3.2. Phƣơng pháp tiến hành Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: 1.Các thành phần dung dịch dùng thƣờng đặt trong tủ lạnh –200C hoặc –800C. 2.Ghi nhãn cẩn thận trên ống nghiệm 0,5ml hoặc trên micro tap (một loại đặc biệt dùng để chạy PCR ) 3.Chuyển 1 l của mẫu DNA vào ống nghiệm. 4.Chuẩn bị pha dung dịch cocktail cho phản ứng PCR. 6.Dùng pipette lấy 19 l cho mỗi phản ứng trong ống nghiệm có chứa sẵn DNA. 7.Lấy một giọt dầu (mineral oil) phủ trên dung dịch. 28 8. Đặt ống nghiệm vào máy PCR, đậy nắp máy và khởi hành cho máy hoạt động. 9.Chu trình hoạt động của máy nhƣ sau: Bảng 3.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Chƣơng trình Kiểu Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian 1 94 0 C 5phút 2 Chu kỳ 94 0 C 1phút 550C 1phút 720C 2phút 35 3 72 0 C 5phút 4 4 0 C 10.Lấy mẫu ra khỏi máy,khi hoàn thành chu kỳ 11.Dự trữ ở nhiệt độ 4oC 12.Phân tích mẫu trên gel agarose 3% hay gel acrylamide 3.6.3.3. Phân tích mẫu trên gel Agarose Giống nhƣ các phƣơng pháp RAPD, STS. Agarose đƣợc nấu cho tan, với nồng độ 3%. Tùy theo thể tích của khung điện di mà tính toán số lƣợng agarose cho phù hợp. Các bƣớc thực hiện:  Cân 7,5g agarose cho vào bình tam giác thể tích 500ml.  Pha dung dịch TBE 1X  Cho 300ml TBE 1X vào bình tam giác và đun sôi đến thể tích 250ml 29 CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá tính trạng axit phytic thấp qua phản ứng sinh hóa 4.1.1. Quần thể lúa mùa và lúa cao sản Qua phân tích 20 cá thể thuộc quần thể lúa mùa, kết quả ghi nhận chỉ có giống nếp trung quốc (nếp tóc) và giống Tám Xoan biểu hiện tính trạng axit phytic thấp. Tuy nhiên mức biểu hiện thấp hơn mức 3 theo thang photpho chuẩn (Hình 4.1 và hình 4.2) Phân tích với 130 giống lúa cao sản để đánh giá hàm lƣợng axit phytic. Kết quả 6 giống có biểu hiện tính axit phytic thấp là OM 2490, OM 4498 , OM 2718 và OM 5731-5 , OM 5731-7, DS 2002. Hình 4.1. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị phosphate tự do (HIP) trên quần thể lúa địa phƣơng và lúa cao sản . Kết quả hình 4.1 cho thấy các cá thể OM 2490, OM 4498 , OM 2718 và OM 5731-5 , OM 5731-7 đều tạo phức màu xanh tƣơng đƣơng với giếng chuẩn thứ 3. Sự biểu hiện này đƣơng đối đồng nhất, tuy nhiên so với các giống đối chứng nhƣ lúa hoang thì sự biểu hiện màu này còn thấp hơn rất nhiều 30 Hình 4.2. Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do trên quần thể lúa mùa và lúa cao sản. Các cá thể đƣợc ghi nhận là có hàm lƣợng axit phytic thấp là Nếp Trung Quốc, DS 2002, OM 5731. Các cá thể làm đối chứng là : Lpa-1, Lpa-2, Xi Q. Zao, Lúa Hoang, Golden rice. Qua kết quả phân tích ở hình 4.2, cá thể nếp Trung Quốc có 1 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng mức 2 theo thang photpho chuẩn, 7 hạt còn lại biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 3. Cá thể OM 5731có 4 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng mức 3 và 4 hạt còn lại tƣơng đƣơng mức 2. Cá thể DS 2002 do phân tích lập lại 3 lần tuy nhiên nhìn chung mức biểu hiện nhƣ sau: 2 hạt thể hiện mức 2, còn 6 hạt còn lại thể hiện ở mức 3. 31 4.1.2. Quần thể lúa đột biến 4.1.2.1. Quần thể lúa đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ở thế hệ M3. Hình 4.3. Kết quả phân tích sự biểu hiện chất chỉ thỉ photphate tự do (HIP).Trong đó cá thể 54; 77; 78; 80; 154 thuộc quần thể đột biến OM1490. Các cá thể 202; 210 thuộc quần thể đột biến của OMCS2000. Qua kết quả hình 4.3 cho thấy cá thể số 77 đƣợc ghi nhận có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3, 3 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể 78 có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3, và ba hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể 80 có 5 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 210 có hai hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và hai hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 154 có 5 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 54 có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3. Cá thể số 202 có bốn hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Các cá thể này sau đó đƣợc trồng ở nhà lƣới và tiếp tục đƣợc phân tích ở các thế hệ tiếp theo. 32 Hình 4.4. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do (HIP). Trong đó cá thể 341, 348 thuộc quần thể đột biến OMCS2000. Qua hình 4.4 cho thấy cá thể 348 thể hiện tính axit thấp với 2 hạt trong 8 hạt đƣợc phân tích. Hai hạt này thể hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng ở mức 2 theo thang photpho chuẩn.Tƣơng tự cá thể 341 cũng có 2 hạt có biểu hiện tính axit phytic thấp, tƣơng đƣơng ở mức 2 theo thang photpho chuẩn. Hai cá thể này sau đó đƣợc tiếp tục trồng ở nhà lƣới để tiếp tục đƣợc kiểm tra ở các thế hệ tiếp theo. Hình 4.5. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do (HIP).Trong đó cá thể 165; 6; 3 biểu hiện đặc tính axit phytic thấp. 33 Từ kết quả hình 4.5 chúng tôi ghi nhận kết quả nhƣ sau: cá thể số 165 có một hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và 3 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 theo thang photpho chuẩn. Cá thể số 6 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng ở mức 3 và hai hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 3 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 16 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 14 có 4 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 tƣơng đƣơng với thang photpho chuẩn. Tuy nhiên các cá thể này biểu hiện tính trạng axit phytic thấp vẫn chƣa đồng nhất và mức biểu hiện tính axit phytic thấp so với đối chứng lúa hoang và Lpa-1 còn thấp rất nhiều. Vì vậy các cá thể này sau đó đƣợc đem ra nhà lƣới và tiếp tục đƣợc chọn ở các thế hệ tiếp theo. Hình 4.6. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị Photphat tự do. Các cá thể đƣợc ghi nhận có hàm lƣợng axit phytic thấp là :164; 162;168; 1; 81; 170 và cá thể dùng làm đối chứng là lúa vàng và lúa hoang. Các cá thể này thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M3. Kết quả hình 4.6 trên cho thấy cá thể số 1 biểu hiện tính axit phytic thấp nhất và tƣơng đối đồng nhất. Cá thể số 1 có 3 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và 5 hạt còn lại biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 trong 8 hạt đƣợc phân tích. 34 Các cá thể 81 và 170 cũng biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đối đồng nhất Tuy nhiên mức độ này vẫn không cao, mức biểu hiện tƣơng đƣơng ở mức chuẩn mức 2. Cá thể 164 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể 162 biểu hiện tính axit phytic thấp với 1 hạt ở mức 2. Cá thể 168 có 3 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 theo thang photpho chuẩn. Hình 4.7. Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do thế hệ M3. Các cá thể đƣợc ghi nhận là có hàm lƣợng axit phytic thấp là 205, thuộc quần thể OMCS 2000 và các cá thể 11, 4, 167 thuộc quần thể OM 1490. Qua kết quả hình 4.7 ta thấy cá thể 167 biểu hiện tính axit phytic thấp nhất. Trong đó có 1 hạt biểu hiện tính axit phytic rất rõ, tƣơng đƣơng ở mức 4, 1 hạt biểu hiện ở mức 3 và 3 hạt biểu hiện ở mức 2 trong 8 hạt đƣợc phân tích. Cá thể 205 biểu hiện tính axit phytic thấp với 8 hạt thể hiện màu ở mức 2. Cá thể số 11 chỉ có một hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng với mức 3. Cá thể số 4 biểu hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt thể hiện màu tƣơng đƣơng mức 2 theo thang photpho chuẩn. Tóm lại qua kết quả phân tích sinh hóa quần thể lúa ở thế hệ M3, ở giống OM 1490 đột biến số cá thể biểu hiện axit phytic thấp trong 185 cá thể đƣợc phân tích là:19 chiếm tỉ lệ 10,27 %. Cá thể biểu hiện tính axit phytic cao ở OM 1490 là 89,73 %. Tƣơng tự ở giống OMCS 2000, số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp 35 trong 165 cá thể đƣợc phân tích là: 5, chiếm tỷ lệ 3,03 %. Số cá thể biểu hiện tính axit phytic cao ở giống OMCS 2000 đột biến là 96,97 %. 10.27 89.73 3.03 96.97 0 20 40 6 80 100 120 axit phytic thấp axit phytic cao OM1490 OMCS2000 Biểu đồ 4.1. Biểu đồ thể hiện phần trăm số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp và cao ở giống OM 1490 đột biến và OMCS 2000 đột biến thế hệ M3 Tuy nhiên trong các cá thể đƣợc ghi nhận có hàm lƣợng axit phytic thấp thì sự biểu hiện tính axit phytic thấp không đồng nhất ở các mức trong 8 hạt phân tích. Do vậy việc đánh giá tính axit phytic thấp thông qua từng mức theo thang photpho chuẩn là cần thiết. Việc tính toán này dựa trên số hạt thể hiện màu trên tổng số hạt phân tích. Việc thể hiện phần trăm số hạt biểu hiện tính trạng axit phytic thấp theo từng mức cho ta thấy đƣợc mức độ biểu hiện tính axit phytic của các cá thể trong quần thể. 0 20 40 60 80 100 Mức 1 Mức 2 Mức 3 Mức 4 Mức 5 OM1490 OMCS2000 Biểu đồ 4.2. Biểu đồ thể hiện phần trăm tính trạng axit phytic thấp theo 5 mức thuộc quần thể OM 1490 và OMCS 2000 thế hệ M3 . 36 Qua biểu đồ hình 4.14 trên cho thấy số hạt biểu hiện tính axit phytic thấp (mức 2, mức 3, mức 4, mức 5) ở các cá thể đột biện thuộc quần thể OM 1490 cao hơn các cá thể đột biến thuộc quần thể OMCS 2000. 4.1.2.2. So sánh với kết quả ở thế hệ M2 đƣợc nghiên cứu trƣớc đây Theo T.S Nguyễn Thị Lang và cộng tác viên khi nghiên cứu hàm lƣợng axit phytic ở thế hệ M2 thì tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp thuộc quần thể OM 1490 chiếm 4,3 % và trên quần thể đột biến OMCS 2000 là 0,81%. Nhƣ vậy tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp ở thế hệ M3 đã tăng lên 5,97 đối với quần thể đột biến OM 1490 và 2,22 đối với quần thể OMCS 2000. 4.3 10.27 0.81 3.03 0 2 4 6 8 10 12 Thế hệ M2 Thế hệ M3 OM1490 OMCS2000 Biểu 4.3. Biểu đồ so sánh tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp ở M2 và M3 thuộc quần thể OM 1490. 4.1.2.3. Quần thể lúa đột biến OM 1490 ở thế hệ M4 Chọn ngẫu nhiên 40 dòng thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M4 để phân tích đặc tính axit phytic thấp thông qua phản ứng sinh hóa. Các cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp đƣợc so sánh với thang photpho chuẩn. Sau khi phân tích tính trạng axit phytic thấp thì 40 dòng này sẽ đƣợc cho nảy mầm, ly trích DNA và đƣợc phân tích bằng PCR với marker RM207 và marker RM202. Marker RM 207 liên kết chặt chẽ với gen axit phytic thấp trên nhiễm sắc thể số 2 trong bộ gen của cây lúa. Marker RM 202 không có tác dụng giải thích tính trạng axit phytic thấp tuy nhiên marker cho thấy biểu hiện tính đa hình giữa các dòng đột biến. 37 Hình 4.8. Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do thế hệ M4. Các cá thể đƣợc ghi nhận là có hàm lƣợng axit phytic thấp là : 311-19; 328-1; 158-18; 144-2; 8-1; 8-3; 18-1; 122-1; 166-15 thuộc quần thể OM 1490. Qua kết quả phân tích hình 4.8, các cá thể 311-19; 328-1 biểu hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 trong 8 hạt phân tích ở mỗi cá thể. Các cá thể 158-18 có 2 hạt biều hiện tính phytic axit thấp tƣơng đƣơng mức 2, cá thể 144-2 biểu hiện tính axit phytic thấp với 5 hạt tƣơng đƣơng mức 2, cá thể 8-1 biểu hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt thể hiện màu tƣơng đƣơng mức 3, cá thể 8-3 với 1 hạt thể hiện màu ở mức 5 và 1 hạt ở mức 3, cá thể 18-1 thể hiện tính phytic axit thấp với 3 hạt tƣơng đƣơng mức 2, cá thể 122-1 thể hiện tính axit phytic thấp với 1 hạt ở mức 3 và 1 hạt thể hiện ở mức 4 và cá thể 166-15 thể hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt tƣơng đƣơng mức 3. Qua kết quả phân tích bằng phƣơng pháp sinh hóa cho thấy số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp là 9 trong 40 dòng phân tích, chiếm tỷ lệ 22,5 % và số cá thể biểu hiện tính axit phytic cao chiếm 77,5%. So với thế hệ M3 thì số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp đã tăng 12,23 %. 38 OM1490 10.27 22.5 0 5 10 15 20 25 Thế hệ M3 Thế hệ M4 OM1490 Biểu đồ 4.4. Biểu đồ so sánh tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp giữa thế hệ M3 và M4 thuộc quần thể đột biến OM 1490. OM1490, M4 22.5 77.5 0 20 40 60 80 1 0 axit phytic thấp axit phytic cao OM1490, M4 Biểu đồ 4.5 . Biểu đồ thể hiện phần trăm số cá thể biểu hiện tính axit thấp và cao thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M4. 4.2.Đánh giá tính trạng axit phytic thấp bằng Marker SSR 4.2.1Trên quần thể lúa mùa và lúa cao sản Chúng tôi tiến hành kiểm tra kiểu gen bằng marker SSR với marker RM 207 trên các cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp và các cá thể dùng làm đối chứng nhƣ dạng OM1490 và OMCS2000 chƣa đƣợc đột biến, lúa hoang ,Lpa-1, Xie Q. Zao. Cá thể OM1490 và OMCS2000 chƣa đƣợc đột biến này là đối chứng cho tính trạng axit phytic cao. Cá thể lúa hoang, Lpa-1, Xie Q. Zao là những cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp vì vậy chúng đƣợc dùng làm đối chứng cho tính trạng axit phytic thấp. Marker RM 207 liên kết chặt chẽ với gen axit phytic thấp nằm trên nhiễm sắc thể số 2. Marker RM 207 cho thấy sự khác biệt giữa các cá thể 39 có hàm lƣợng axit phytic cao và các cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp. Dựa vào những dòng đối chứng cao về hàm lƣợng axit phytic nhƣ OM 1490 và OMCS 2000 dạng bố mẹ chƣa đƣợc gây đột biến (lane 1 và lane 3) và đối chứng thấp về hàm lƣợng axit phytic nhƣ giống Lpa-1, giống lúa hoang, Xie Qing Zao (lane 2, lane 11, lane 12), các dòng khác đƣợc ghi nhận nhƣ sau: Các dòng có biểu hiện tính axit phytic thấp là OM 2718, OM 4498, lúa vàng. Theo kết quả nghiên cứu trƣớc đây kích thƣớc band hình trên bản điện di của các dòng này là 250 bp. Các dòng khác biểu hiện tính axit phytic thấp trong thử nghiệm bằng phƣơng pháp sinh hóa nhƣng không ghi nhận qua phân tích bằng marker phân tử là : OM 2490 (lane 4), nếp tóc (lane 5), OM 5731 (lane 6), Tám xoan (lane 7). Tuy nhiên sự đa hình nầy chƣa thấy rõ sự tách kiểu gen nghiên về hàm lƣợng phytic acid thấp hay cao . Do hàm lƣợng phytic acid trong hạt gạo có liên quan đa gen khó đánh giá đơn gen và một vài marker cần phải nghiên cứu và phối hợp di truyền số lƣợng để tách đa gen nầy. Hình 4.9:Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 207 trên quần thể lúa mùa và cao sản. 1: OM 1490 , 2: Lpa -1 , 3: OMCS 2000, 4: OM 2490 , 5: Nếp tóc ;6: OM 5731, 7: Tám xoan -93, 8: OM 2718, 9:OM 4498, 10: lúa Vàng , 11: lúa hoang , 12 : Xie Qing Zao 250bp 40 4.2.2. Trên quần thể đột biến OM 1490 ở thế hệ M 4 Bốn mƣơi dòng M4 đƣợc đánh giá kiểu gen thông qua hai marker RM 207F-R và RM 202F-R . Hai marker nầy đƣợc liên kết trên nhiễm sắc thể số 2 và nhiễm sắc thể số 11 theo thứ tự. Bảng 4.1.Các cá thể đƣợc ký hiệu theo số trong bằng điện di: 1. 39-1 2. 2-1 3. 12-14 4. 60-1 5. 80-1 6. 166-15* 7. 69-2 8. 8-3* 9. 20-1 10. 100-2 11. 61-2 12. 131-2 13. 122-1* 14. 311-19* 15. 1-13 16. 61-1 17. 129-2 18. 335-9 19. 249-1 20. 158-18* 21. 144-2* 22. 15-1 23. 173-2 24. 103-2 25. 38-1 26. 222-1 27. 171-1 28. 137-1 29. 11-2 30. 27-10 31. 107-1 32. 44-2 33. 328-1* 34. 8-1* 35. 338-20 36. 18-1* 37. 336-1 38. 261-10 39. 187-1 40. 338-1 ( Dấu “*” ký hiệu các cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp qua phân tích sinh hóa) Bảng 4.5. Các cá thể thuộc quần thể OM 1490 thế hệ M4 Đối với marker RM 202 là marker liên kết với nhiễm sắc thể số 11 , tuy nhiên ghi nhận có sự đa hình trên các dòng đột biến . Do đó đối với marker nầy chỉ là số liệu tham khảo để giải thích cho các gen đột biến nhƣng không giải thích rõ hàm lƣợng phytic acid cao và thấp (hình 4.10 và 4.11). Để phân tích marker liên kết với gen hàm lƣợng phytic thấp và cao , tiếp tục dùng marker RM 207F-R để chạy PCR . Sản phẩm PCR đƣợc chạy điện di trên gel agarose với nồng độ 3%. Kết quả ghi nhận băng hình cho thấy đa hình trên hình 4.12 và 4.13. Mặc dù không có thang DNA chuẩn trong bản điện di để xác định kích thƣớc các đa hình này nhƣng với sự so sánh với những đối chứng mà có tính trạng axit phytic cao trong phân tích sinh hóa và những nghiên cứu trƣớc đây của Lang và cộng sự năm 2004 thì những băng hình giải thích cho tính trạng axit phytic thấp này có kích thƣớc là 250 bp. So sánh kiểu gen và kiểu hình trên marker RM 207 trên quần thể M4 ghi nhận cả hai cho sự liên kết phù hợp trên bảng là 66,67 % . 41 Hình 4.10. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 202 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M4 Hình 4.11. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 202 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M4 Hình 4.12. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 207 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M4 Ở hình 4.12 cho thấy sự đa hình thể hiện với hai băng hình 34 và 36 tƣơng đƣơng với hai cá thể 8-1 và 18-1. Hai băng hình này giải thích cho tính trạng axit 250bp 42 phytic thấp trong phân tích kiểu gen với marker RM207 liên kết chặt chẽ với gen axit phytic thấp trên nhiễm sắc thể số 2. Các băng hình còn lại thể hiện tính trạng axit phytic cao trong phân tích kiểu gen. Hình 4.13. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 207 Kết quả phân tích hình 4.13 cho thấy sự đa hình đƣợc thể hiện trên bản điện di. Các băng hình thể hiện tính trạng axit phytic thấp là các band hình thứ 6; 8; 20; 21 tƣơng ứng với các cá thể 166-15; 8-3; 158-18; 144-2. Các băng hình còn lại thể hiện tính trạng axit phytic cao trong phân tích kiểu gen. Một số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp khi phân tích bằng phƣơng pháp sinh hóa nhƣng không ghi nhận đặc điểm này khi phân tích bằng marker RM207 là 122-1, 311-19, 328-1. 250bp 250bp 43 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận Các cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp rất ít và thƣờng không đồng nhất.Tuy nhiên qua so sánh thì số cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp tăng dần qua các thế hệ chọn lọc M2 đến M4 Kết quả phân tích sinh hóa ở thế hệ M3, chúng tôi tìm đƣợc 19 cá thể thuộc quần thể đột biến OM 1490 trong 185 cá thể đƣợc phân tích và 5 cá thể thuộc quần thể đột biến OMCS 2000 biểu hiện tính axit phytic thấp.Tuy nhiên mức độ biểu biện tính axit phytic thấp vẫn chƣa cao và chƣa đồng nhất so với giống đối chứng ( lúa hoang, Lpa-1, Lpa-2). Đối với giống lúa mùa chỉ ghi nhận 2 cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng mức 3 theo thang photpho chuẩn là Nếp tóc và Tám Xoan. Đối với 130 giống lúa cao sản để đánh giá hàm lƣợng axit phytic. Kết quả chỉ ghi nhận giống OM 2490, OM 4498 , OM 2718 ; OM 5731-5 ; OM 5731-7 và DS 2002 đều tạo phức màu xanh tƣơng đƣơng với giếng chuẩn thứ 3. Ở thế hệ M4 ghi nhận có 9 cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp trong 40 cá thể phân tích. Tuy nhiên khi Kiểm tra lại bằng marker SSR với primer 207 thì chỉ ghi nhận có 6 cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp. Tìm đƣợc một marker RM 202 liên kết trên nhiễm sắc thể số 11 cho đa hình và tách các dòng đột biến thuộc quần thể đột biến OM 1490 . Đối với kiểu gen phân tích trên marker RM 207 trên nhiễm sắc thể số 2 có ghi nhận đa hình trên các giống có hàm lƣợng axit phytic thấp, tuy nhiên cũng còn vài giống ghi nhận là phytic axit thấp bên kiểu hình nhƣng khi đánh giá bằng marker chƣa cho thấy đa hình . Điều nầy cũng ghi nhận rõ ràng rằng trên hạt gạo cần phải xem xét sự ổn định của các thế hệ nhất là các dòng đột biến. Dựa vào phân tích đánh dấu bằng marker phân tử SSR, chúng ta có thể khai thác tiềm năng kiểu gen của các dòng hoặc cây bố mẹ. Do đó, việc chọn lọc 44 cẩn thận các dòng đột biến sẽ giúp chúng ta có nguồn vật liệu lai phù hợp và dễ khai thác, chọn lựa theo các gen có hàm lƣợng axit phytic cao và thấp nhƣ mong muốn. 5.2.Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu và chọn lọc các cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp ở các thế hệ tiếp theo để tăng số cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp và tăng tính đồng nhất. Tuy nhiên đối với quần thể đột biến đặc biệt là đột biến vật lý , việc chọn lựa quần thể biến động trong một giống rất khó cần phải sử dụng một phƣơng pháp phân tích genome với kỹ thuật SNP để khai thác sự biến động các allele nhỏ trong quần thể đột biến. Đề nghị nghiên cứu tiếp tục bản đồ finemapping cho gen axit phytic thấp trên nhiều quần thể để tìm nhiều marker liên kết cả gen chính và gen phụ trên các tính trạng nầy . 45 CHƢƠNG VI Tài liệu tham khảo 6.1. Tài liệu tiếng việt. 1. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương Pháp Cơ Bản Trong Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học. Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp,TP.Hồ Chí Minh, p 63-72. 2. Nguyễn Thị Lang, Trần Đình Giỏi và Bùi Chí Bửu. 2005. Nghiên Cứu Gen Lúa Có Hàm Lượng Axit Phytic Thấp. Tạp chí Nông Nghiệp (chuẩn bị đăng). 3. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thạch Cân, Trần Thị Lũy, Trịnh Hoàng Khải, Phạm Thị Bé Tƣ, Nguyễn Thị Tâm, Đặng Minh Tâm, Bùi Thị Dƣơng Khuyều, Nguyễn Thuần Khiết, Trần Thanh Sơn, Trần Bá Thảo. 2002. Ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống lúa chất lượng cao. Sở khoa học công nghệ và môi trƣờng tỉnh An Giang. 4. Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu,1999. Định hướng công tác chọn tạo gen kháng sâu bệnh cho cây lúa bằng marker phân tử. Hội nghị nghiên cứu và ứng dụng sinh học ở ĐBSCL lần thứ I tháng 5/1999. Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật tỉnh Cần Thơ. 5.Trịnh Hoàng Khải, 2004. Đánh giá tính trạng nông học và tính trạng axit phytic ở những dòng somclonal đột biến. Đề cƣơng luận văn thạc sĩ chuyên nghành công nghệ sinh học. 6. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, 1998. Giáo Trình Sinh Hóa Hiện Đại. Nhà Xuất Bản Giáo Dục. 7. Vũ Văn Vụ, 2000. Sinh lý học thực Vật. Nhà xuất bản giáo dục, 251 trang. 6.2. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 8. Hill B., Hankins L., Trapp S. A., Sutton A.L., and Richert B. T.,2002.Effects of Low Phytic Acid Corn, Low Phytic Acid Soybean Meal and Phytase on Nutrient Excretion and Nutrient Digestibility in Pigs. Purdue University Swine Research Report 46 9. Marie T. Ruel and Howarth E. Bouis, June 1997. Plant breeding: a long-term strategy for the control of zinc deficiency in vulnerable populations.The American journal of clinical nutrition volume 30. 10. Drew L. Kershen, 11-2002. Agricultural Biotechnology: Environmental Benefits for Identifiable Environmental Problems. 11. Shi J. and Beach L. R.,1999 . The application of Genomics to improve the nutritional value of corn 12. Lott N.A. John, Ockenden I., Raboy Victor and Batten D. G., 2000. Phytic acid and phosphorus in crop seeds and fruits : a global estimate. Seed science research 10: pp. 11-33. 13. Raboy V., Gerbasi P. F., Young A. K., Stoneberg D. Sierra, Pickett G. Suewiya, Bauman T. Andrew , Murthy P.N. Pushpalatha, Sheridan F. William, and Ertl S.David, September 2000.Origin and Seed Phenotype of Maize low phytic acid 1-1 and low phytic acid 2-1. Plant Physiol 124: 355-368. 14. Raboy V., 2002. Progress in breeding low phytate crops. Journal Nutrition 132 Lackey K. H., Pope M. P. and Johnson D. M., 2003. Expression of L-Myoinositol- 1-photphate synthase in organelles. Plant Physiology 132: pp.2240-2247. Các trang web: www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm www.etd.lsu.edu/docs/available/etd-03242004- 154627/unrestricted/Chapters1and2.pdf www.Chemicalland21.com www.etd.lsu.edu/docs/available/etd-03242004- 154627/unrestricted/Chapters1and2.pdf www.ajcn.org/cgi/content/abstract/68/2/488S www.ansc.purdue.edu/swine/swineday/sday02/4.htm www.botanischergarten.ch/Benefits/KershenEnvirBenefits.pdf 47 Phụ lục 1.Thành phần các dung dịch chuẩn bị trong phƣơng pháp sinh hoá Thành phần Hàm lƣợng Thể tích (ml) 0.4M HCl 6N H2SO4 2.5%(NH4)2Mo 10% Vitamin C 1mM K2PO4 3.5 ml 16.3 ml 2.5g 10.00g 0.013g 100 100 100 100 100 2.Thành phần TE (pH=8) Thành phần Nồng độ Thể tích 50ml Tris(PH=8) EDTA (pH=8) H2O 10 mM 0.5M 0.5ml 0.1ml 49.6ml 3. Thành phần loading buffer 10X Thành phần Thể tích 1M Tris (pH=8) Glycerol 0,5M EDTA (pH=8) Bromphenol blue Xylen cyanol R H2O 0,5ml 5,0ml 100,0 l 15,0mg 15,0mg 4,5ml 4.Thành phần TAE 50X Thành phần Thể tích (1lít) Tris baz Glacial acetic axit 0,5M EDTA (pH=8) 24g 57,1ml 100ml 5. Thành phần dung dịch ly trích Dung dịch ly trích bao gồm các thành phần sau: 48 1M Tris, 5M NaCl, 0.5M EDTA. Các thành phần này đƣợc lấy theo thể tích tƣơng ứng là 100ml 1M Tris, 100ml 5M NaCl, 40ml 0.5M EDTA và thêm nƣớc cấtt 2 lần vào cho đủ 1000ml. 6. Bảng thể hiện số hạt có tính trạng axit phytic thấp theo từng mức ở các cá thể đột biến thế hệ M3 thuộc quần thể đột biến OM 1490. Mức Cá thể Mức1 (hạt) Mức 2 (hạt) Mức 3 (hạt) Mức 4 (hạt) Mức 5 (hạt) 1. Cá thể 54 2. Cá thể 77 3. Cá thể 78 4. Cá thể 80 5. Cá thể 154 6. Cá thể 165 7. Cá thể 6 8. Cá thể 3 9. Cá thể 16 10. Cá thể 14 11. Cá thể 1 12. Cá thể 81 13. Cá thể 170 14. Cá thể 164 15. Cá thể 162 16. Cá thể 168 17. Cá thể 167 18. Cá thể 11 19. Cá thể 4 7 4 4 3 3 4 4 4 6 4 0 0 0 6 7 5 3 7 6 0 3 3 5 5 3 2 2 2 4 5 8 8 2 1 3 3 0 2 1 1 1 0 0 1 2 2 0 0 3 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 49 7. Bảng thể hiện số hạt có tính trạng axit phytic thấp theo từng mức ở các cá thể đột biến thế hệ M3 thuộc quần thể đột biến OMCS 2000. Mức Cá thể Mức 1 (hạt) Mức 2 (hạt) Mức 3 (hạt) Mức 4 (hạt) Mức 5 (hạt) Cá thể 210 Cá thể 202 Cá 348 Cá thể 341 Cá thể 205 4 4 6 6 0 2 4 2 2 8 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8. Bảng thể hiện số hạt có tính trạng axit phytic thấp theo từng mức ở các cá thể đột biến thế hệ M4 thuộc quần thể đột biến OM 1490 Mức Cá thể Mức1 (hạt) Mức 2 (hạt) Mức 3 (hạt) Mức 4 (hạt) Mức 5 (hạt) 20. cá thể 158-18 21. Cá thể 144-2 22. Cá thể 8-1 23. Cá thể 8-3 24. Cá thể 18-1 25. Cá thể 122-1 26. Cá thể 166-15 27. Cá thể 311-19 28. Cá thể 328-1 6 3 6 6 5 6 6 6 6 2 5 0 0 3 0 0 2 0 0 2 1 0 1 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0