Khóa luận Đánh giá hiệu quả tác dụng của một vài hợp chất tự nhiên chiết xuất từ thảo mộc trong điều trị bệnh phát sáng do vibrio harveyi trên tôm sú (penaeus monodon)

tại trên quả. Hình 2.4. Cành và quả ổi (Arima, 2002) Cây ổi có gốc ở châu Mỹ nhiệt đới được trồng rộng rãi ở nhiều nơi. Có khi gặp ở trạng thái hoang dại. Thu hái các bộ phận của cây quanh năm và phơi khô. Thành phần hoá học: Lá ổi chứa tinh dầu (0,31%) trong đó có dl-limonen. Còn có sitosterol, acid maslinic (acid cratagolic), acid guijavalic. Trong lá ổi non và búp non còn có 7 – 10% tanin pyrogalic, khoảng 3% nhựa. Nhựa cây ổi chứa acid d-galacturonic (72,03%), d-galactose (12,05%) và l-arabinose (4,40%). Cây, quả ổi có pectin, vitamin C; trong hạt có tinh dầu với hàm lượng cao hơn trong lá. Vỏ thân chứa acid ellagic. Ổi có vị ngọt và chát, tính bình; có tác dụng cầm ỉa chảy, tiêu viêm, cầm máu. Vỏ ổi cũng có vị chát, lá cũng vậy. Do có nhiều chất tanin nên nó làm săn niêm mạc ruột, làm giảm tiết dịch ruột, giảm nhu động ruột, còn có tác dụng kháng khuẩn (Arima, 2002) 2.5. Các hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc ngăn chặn dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm trong tương lai Ngày nay, với những thành tựu vượt bậc của mình, công nghệ sinh học đang dần dần chiếm lĩnh một vị trí quan trọng trong thế giới loài người. Có thể nói vai trò của công nghệ sinh ngày càng trở nên không thể thiếu, nó chính là một công cụ đắc lực giúp cho con người tìm hiểu và khám phá ra được những điều bí mật trong thế giới sinh học nhằm cải thiện chất lượng cuộc sống và hoạt động sản xuất của con người ngày càng tốt hơn. Những lĩnh vực như nông nghiệp, y tế, thực phẩm… có sự tham gia của công nghệ sinh học đang từng bước được hoàn thiện. Chính vì thế, trong tương lai, đây sẽ là một lĩnh vực được con người chú ý đến nhiều nhất, thế kỷ XXI sẽ là một thế kỷ của công nghệ sinh học. Trong lĩnh vực nông nghiệp nói chung, cũng như hoạt động sản xuất thủy sản nói riêng, công nghệ sinh học đã và đang thể hiện vai trò của mình trong việc nghiên cứu và ứng dụng các thành tựu nghiên cứu vào các vấn đề như kỹ thuật sản xuất, chất lượng giống, việc kiểm soát dịch bệnh… nhằm cải thiện việc sản xuất cũng như chất lượng của sản phẩm, góp phần thúc đẩy nền kinh tế của xã hội loài người phát triển đi lên một cách bền vững. Từ khi dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm bùng nổ, đã có nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm kiểm soát và ngăn chặn dịch bệnh này, trong đó đã có nhiều kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng vào trong hoạt động sản xuất thực tiễn. Các nhà khoa học nhìn nhận trong thời gian sắp tới việc ứng dụng của công nghệ sinh học vào việc giải quyết vấn đề bệnh phát sáng trên tôm sẽ tập trung vào hai hướng chính đó là: các phương pháp chẩn đoán phát hiện bệnh và các sản phẩm để ngăn chặn, kiểm soát dịch bệnh. 2.5.1. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc chẩn đoán phát hiện bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm Các kỹ thuật chẩn đoán phát hiện bệnh trên tôm ngày nay đã có nhiều tiến bộ nhờ việc áp dụng các thành tựu nghiên cứu của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ sinh học phân tử. Việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện bệnh trên tôm đã trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi ở nhiều nơi. Các kỹ thuật như ELISA và PCR đã được sử dụng để phát hiện các bệnh phổ biến trên tôm, đặc biệt là các bệnh do virus như bệnh đốm trắng do WSSV, bệnh đầu vàng… Ưu điểm của các phương pháp này là tính chính xác và rút ngắn được thời gian phát hiện. Đã có mhiều đề xuất về sử dụng các kỹ thuật như ELISA và PCR cho việc phát hiện nhanh bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm. Việc tìm các đoạn DNA và tạo ra các kháng thể bắt dính kháng nguyên đặc trưng của Vibrio đã được nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu. Năm 1998, Robertson và ctv đã nghiên cứu tạo ra một kháng thể đa dòng từ thỏ có thể dùng để phát hiện nhiều dòng V. harveyi. Theo các phương pháp này thời gian phát hiện bệnh được rút ngắn rất nhiều. Tuy nhiên, hiện nay tại nhiều nơi trên thế giới, người ta vẫn chủ yếu sử dụng phương pháp phân lập vi khuẩn để phát hiện bệnh phát sáng do chi phí để thực hiện phương pháp này thấp hơn các phương pháp ELISA và PCR. Do hạn chế về tính kinh tế nên đây sẽ là một hướng không khả thi trong thời gian sắp tới. 2.5.2. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc tạo ra các chế phẩm dùng trong ngăn chặn và điều trị bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm Kinh nghiệm nuôi tôm cho thấy việc phòng ngừa bệnh là một giải pháp hữu hiệu nhất giúp phát triển bền vững nghề nuôi tôm. Vì thế đây sẽ là một hướng hứa hẹn có nhiều triển vọng trong tương lai, chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu tìm ra các vaccine và chế phẩm sinh học để ngăn chặn dịch bệnh. Theo những hiểu biết từ trước đến nay, tôm sú là động vật bậc thấp có hệ miễn dịch không đặc hiệu. Điều này có nghĩa là việc sử dụng vacxin ở tôm sẽ không hiệu quả (Đào Văn Trí và ctv, 2001). Một đối tượng khác trong hướng nghiên cứu này là chế phẩm sinh học. Hiện nay trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại chế phẩm sinh học có khả năng ức chế các loài Vibrio như Zymetin, Dikaku, Biodream… Sự ra đời của các chế phẩm sinh học sẽ giúp hạn chế được việc sử dụng các loại hóa chất và kháng sinh trong nuôi tôm. Trong chế phẩm sinh học, tính cạnh tranh ức chế của các loài sinh vật giữ một vai trò rất quan trọng quyết định tới hiệu quả của loại chế phẩm đó. Điều này đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tập trung tìm ra các loài sinh vật có khả năng ức chế Vibrio. Và hiện nay, đối tượng nghiên cứu đang được tập chung vào các sinh vật sống ở biển có khả năng ức chế Vibrio gây hại. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có một dòng vi khuẩn ở biển là Pseudomonas I-2 có thể tạo ra các hợp chất ức chế chống lại các Vibrio gây bệnh trên tôm bao gồm V. harveyi, V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. damsela và V. vulnificus. Đây là một hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, bền với nhiệt, có thể hòa tan trong chloroform và chịu được các enzyme phân giải protein. Người ta tiến hành tách chiết chất này từ vi khuẩn bằng chloroform và tiến hành thử nghiệm, kết quả cho thấy dịch chiết đã làm giảm mật độ V. harveyi trong nước xuống khi dùng ở nồng độ 20 µg/µl và không ảnh hưởng tới ấu trùng của tôm thậm chí ở nồng độ 50 µg/µl. Vì vậy dòng Pseudomonas I-2 này sẽ có tiềm năng ứng dụng vào việc kiểm soát các Vibrio gây bệnh trên tôm trong các hệ thống sản xuất thủy sản (Karunasagar, 2001). Alteromonas sp. P7 là một vi khuẩn gram âm, di động, hình que, có cytochrome oxidase, có khả năng tổng hợp chất sắc tố trong môi trường nước biển. Chúng có khả năng phát triển ở nồng độ muối NaCl 6% và không phát triển trên môi trường agar có chứa sucrose, muối mật, thiosulphate citrate, trên môi trường Mac Conkey, hoặc trên môi trường không có NaCl. Vi khuẩn này không có khả năng phát sáng, không có enzyme amylase, gelatinase, catalase, urease và không khả năng tạo vòng indole cũng như biến đổi nitrate. Alteromonas sp. P7 có thể sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất và không có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác như là arabinose, dextrose, galactose, lactose, mannitol, sorbitol và sucrose. Với những đặc điểm này, người ta đã xếp vi khuẩn này vào loài Alteromonas và được chỉ định là Alteromonas sp. P7 (Abraham, 2004). Người ta đã phân lập Alteromonas sp. P7 từ các ấu trùng Fabricius của tôm sú và nhận thấy chúng có khả năng chống lại V. harveyi. Tất cả các dòng V. harveyi phân lập được bị ức chế theo các mức độ khác nhau bởi Alteromonas sp. P7 ở trong phòng thí nghiệm. Hợp chất kháng khuẩn được tạo ra bởi Alteromonas sp. P7 có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ và bám dính chặt lên bề mặt của các tế bào vi khuẩn và hợp chất này không bị phân hủy khi xử lý bằng trypsin (Okereke và Montville, 1991). Từ đó, người ta cho rằng hợp chất này có thể không phải là các protein có trong tự nhiên mặc dù các dòng Alteromonas xác định đã được báo cáo là sản xuất các hợp chất protein kháng khuẩn (Mc Carthy, 1994). Các chất kháng khuẩn được thải ra ngoài là sản phẩm của quá trình biến dưỡng thứ cấp. Người ta cho rằng các chất kháng khuẩn này có thể là một pyrole hoặc quinolinol hoặc tyrosol và isatin hoặc là một đường đa có khả năng tan trong ethyl acetate (T. J. Abraham, 2004). Các thí nghiệm được tiến hành đã chỉ ra rằng Alteromonas sp. P7 giúp giảm rõ rệt tỷ lệ chết ở ấu trùng tôm sú in vivo từ V. harveyi M3 bằng cách ngăn chặn sự phát triển và sinh sản của các vi khuẩn gây bệnh (Abraham, 2004). Gần đây, tại nhiều nơi trên thế giới đã nổi lên các đề tài nghiên cứu về khả năng ứng dụng của phage trong lĩnh vực thủy sản. Fraser (2003) và một số nhà khoa học khác đã nghiên cứu và phát hiện một loại phage có khả năng gây sinh tan chuyên biệt cho V. harveyi. Việc sử dụng các bacteriaphage chuyên biệt chống lại V. harveyi ngay từ đầu trong quy trình sản xuất sẽ giúp giảm tối thiểu mật độ hiện diện của V. harveyi trong nước, chất cặn và trong ruột vật nuôi và như thế sẽ ngăn chặn được sự phát sinh của dịch bệnh. Tuy nhiên việc sử dụng phage có các mặt hạn chế như tạo ra các dòng vi khuẩn mới kháng lại phage, hoặc bản thân các phage đó khó có thể kiểm soát được, cũng như tính độc của các phage đó cần phải xác định rõ ràng. Trước khi đưa vào ứng dụng trong thực tiễn, chúng ta cần phải tiếp tục tiến hành nhiều nghiên cứu khác để bảo đảm tính hiệu quả và an toàn của phage trong sản xuất. Tóm lại, hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc sản xuất ra các loại chế phẩm dùng để ngăn chặn dịch bệnh phát sáng sẽ có nhiều triển vọng trong thời gian tới. Tuy nhiên vẫn còn tồn tại một mặt hạn chế của các loại chế phẩm này, đó là giá thành của nó quá cao, điều này giải thích vì sao hiện nay nhiều hộ nông dân nuôi tôm vẫn còn cử dụng hóa chất và kháng sinh để xử lý bệnh tôm. Điều này thúc đẩy các nhà sản xuất nghiên cứu, tìm ra một kỹ thuật, một quy trình sản xuất mới để có thể sản xuất đại trà với số lượng lớn nhằm hạ giá thành sản phẩm, đáp ứng được nhu cầu và nguyện vọng của người nuôi tôm. Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian Từ 21/03/2005 đến 26/06/2005. 3.1.2. Địa điểm Phòng Bệnh học Thủy sản – Trung tâm Quan trắc – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. Trại Thực nghiệm nuôi Thủy sản Thủ Đức – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. 3.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu Hợp chất chiết xuất từ các thảo dược ký hiệu là B2 thuộc họ Fabaceae, L, L2 và M thuộc họ Asteraceae. 3.2.2. Đối tượng nghiên cứu Tôm sú không mang các mầm bệnh để bố trí thí nghiệm, trọng lượng bình quân từ 15 – 20 g/con. Giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng, phân lập từ tôm bệnh. 3.2.3. Dụng cụ và hóa chất 3.2.3.1. Dụng cụ Dụng cụ bố trí thí nghiệm: bể nuôi, hệ thống sục khí, vợt thùng, thau... Dụng cụ thu mẫu: kim tiêm (1 ml), đèn cồn, que cấy, bông thấm, găng tay, bao thùng xốp, chai lọ. Dụng cụ phân tích vi khuẩn: ống nghiệm các loại, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, pipet, đầu típ, tủ lạnh, tủ ấm, tủ cấy, nồi hấp autoclave... Dụng cụ quan sát, thử nghiệm kháng sinh đồ: thước đo vòng kháng khuẩn, đĩa giấy tẩm hợp chất chiết xuất làm kháng sinh đồ. Dụng cụ kiểm tra chất lượng nước: nhiệt kế thủy ngân 0 – 1000C, pH kế, bộ test NH3, DO, COD... 3.2.3.2. Môi trường và hóa chất Đĩa giấy tẩm các hợp chất cần thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau. Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose agar): môi trường đặc trưng dùng để chọn lọc V. harveyi. TSB (Tryptone Soya Broth): môi trường tăng sinh, phục hồi cho vi khuẩn. Môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar): môi trường dùng để tăng sinh, làm thuần vi khuẩn. Môi trường MHA (Mueller Hinton Agar): môi trường đặc trưng dùng làm kháng sinh đồ khảo sát tác dụng kháng khuẩn của hợp chất thử nghiệm. Các môi trường và hóa chất thử nghiệm đặc tính sinh hóa của vi khuẩn. Ngoài ra còn có nước biển (15‰) và một số hóa chất khác dùng trong thí nghiệm. 3.3. Phương pháp tiến hành Nội dung tiến hành đề tài có thể chia thành 2 giai đoạn thử nghiệm: 3.3.1. Thử nghiệm trong phạm vi phòng thí nghiệm Tiến hành thử nghiệm tác dụng của các hợp chất B2, L, L2 và M theo phương pháp kháng sinh đồ. Mục tiêu là sàng lọc các chất có hiệu quả và xác định các mức nồng độ có ý nghĩa của chất đó đối với vi khuẩn V. harveyi trong phòng thí nghiệm. Gồm các bước sau: Phân lập dòng thuần V. harveyi từ tôm có dấu hiệu nhiễm khuẩn Thử nghiệm sinh hóa để xác định V. harveyi Thử nghiệm tác dụng của các chất bằng phương pháp kháng sinh đồ Xác định nồng độ có hiệu quả kháng vi khuẩn Sơ đồ 1. Bố trí thử nghiệm tác dụng của các hợp chất 3.3.1.1. Phân lập dòng thuần Vibrio harveyi Lấy mẫu: chọn ngẫu nhiên 2-3 con tôm nuôi ao có dấu hiệu nhiễm khuẩn. Lấy máu tôm: mỗi con 0,1 ml, sau đó nhỏ lên các đĩa cấy chứa môi trường TCBS, dàn đều khắp bề mặt môi trường, mỗi con cấy lên 1 đĩa. Ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ. Chọn khuẩn lạc phát sáng trên môi trường TCBS cấy chuyền sang môi trường BHIA (có bổ sung 2% NaCl). Ủ trong tủ ấm ở 300C, 24 giờ để thuần hóa và tăng sinh V. harveyi. Tiến hành thử nghiệm các đặc tính sinh hoá của V. harveyi: khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol, malnose, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng citrate như nguồn carbone duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gas từ glucose, kiểm tra khả năng lên men và oxy hoá; khả năng phân giải Gelatin; khả năng sử dụng Nitrate; phản ứng Indol hoá; khả năng sử dụng các acid amin (Jonh, 1994). 3.3.1.2. Phương pháp kháng sinh đồ theo phương pháp Mc Farland (Bauer và Kirby, 1997) Nguyên tắc Khả năng ức chế của các hợp chất thảo dược được xác định dựa vào đường kính vòng vô khuẩn hình thành do sự khuếch tán các hợp chất xung quanh đĩa giấy tẩm hợp chất. Hiệu quả kháng khuẩn được xác định dựa vào đường kính của các vòng ức chế vi khuẩn. Cách tiến hành Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn theo phương pháp Mc Farland. Bảng 3.1. Thành phần dung dịch của các ống nghiệm trong thí nghiệm Mc Farland Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BaCl2 1%(ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 H2SO4 1%(ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0 Tb/ml(x 108) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Chuẩn bị vi khuẩn để thử nghiệm kháng sinh đồ: giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng. Vi khuẩn được cấy tăng sinh trên môi trường BHIA + 2% NaCl, thu tế bào vi khuẩn và huyền phù với nước muối sinh lý 2% vô trùng. Pha hỗn hợp dịch tế bào của vi khuẩn sao cho dung dịch huyền phù có cùng độ đục với ống số 3 theo Mc Farland. Chuẩn bị các đĩa giấy (đường kính = 6mm) trong điều kiện vô trùng. Hòa tan các hợp chất thảo dược trong dung môi DMSO với các nồng độ dự kiến thử nghiệm tùy vào mức độ tan của các hợp chất trong dung môi. Cụ thể, các nồng độ cho từng hợp chất là: + Hợp chất B2: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 µg/µl. + Hợp chất L: 600, 700, 800, 900, và 1000 µg/µl. + Hợp chất L2: 600, 700, 800, 900 và 1000 µg/µl. + Hợp chất M: 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/µl. Dùng pippet hút 5 µl các hợp chất cần thử nghiệm tẩm vào các đĩa giấy. Chuẩn bị các đĩa môi trường MHA để thử kháng sinh đồ. Dùng pipet hút 0,5 ml dung dịch vi khuẩn cho vào môi trường MHA trong đĩa petri, dàn đều dịch vi khuẩn lên đĩa thạch. Sau đó dùng pipet hút hết phần dung dịch vi khuẩn thừa trên mặt thạch. Dùng kẹp vô khuẩn lấy các đĩa giấy đã tẩm các hợp chất hợp chất thử nghiệm đặt lên bề mặt thạch, cách mép đĩa petri khoảng 2,5 cm, đảm bảo mặt đĩa giấy tẩm hợp chất tiếp xúc phẳng với bề mặt thạch. Ủ các đĩa petri trong tủ ấm ở 300C sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ kiểm tra và đo vòng vô khuẩn. 3.3.2. Thử nghiệm trong phòng ướt Wet-lab Sau giai đoạn thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, bước đầu đánh giá hợp chất M là có hiệu quả nhất đối với V. harveyi. Giai đoạn tiếp theo là tiến hành thí nghiệm đánh giá hiệu quả điều trị của hợp chất M đối với tôm đã cho nhiễm V. harveyi trong bể nuôi trong phòng Wet-lab. Hai nồng độ của hợp chất M được chọn để thử nghiệm là 500 và 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Sơ đồ tiến hành thử nghiệm được trình bày như sau: Tôm không mang các mầm bệnh Lô đối chứng âm, 15 con Lô đối chứng dương, 15 con Lô thử nghiệm nồng độ 500 mg/kg, 15 con Lô thử nghiệm nồng độ 750 mg/kg, 15 con Tiêm 0,05 ml nước muối sinh lý Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn Theo dõi biểu hiện của tôm Chăm sóc, theo dõi, đánh giá hiệu quả của thuốc đối với vi khuẩn Cho tôm ăn thức ăn có tẩm thuốc nồng độ 750 mg/kg Cho tôm ăn thức ăn có tẩm thuốc nồng độ 500 mg/kg Cho tôm ăn thức ăn thường Cho tôm ăn thức ăn thường Sơ đồ 2. Bố trí thử nghiệm trong phòng Wet-lab Chuẩn bị 15 bể thí nghiệm, nước biển sau khi kiểm tra các tính chất hóa lý được cho vào mỗi bể 50 lít. Thí nghiệm bố trí thành 4 lô: Lô đối chứng âm: bố trí 3 bể, không gây cảm nhiễm, chỉ tiêm 0,05 ml dung dịch nước muối sinh lý và cho ăn thức ăn tổng hợp không tẩm hợp chất thử nghiệm. Lô đối chứng dương: bố trí 3 bể, các con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và sử dụng thức ăn tổng hợp không tẩm hợp chất thử nghiệm. Lô thử nghiệm tác dụng của thuốc ở nồng độ 500 mg/kg: bố trí 3 bể, các con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và cho ăn thức ăn tổng hợp có tẩm hợp chất M với nồng độ 500 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Lô thử nghiệm tác dụng của thuốc ở nồng độ 750 mg/kg: bố trí 3 bể, các con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và cho ăn thức ăn tổng hợp có tẩm hợp chất M với nồng độ 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Các con tôm sau khi tiêm được thả lại bể theo đúng bố trí. Chăm sóc và quan sát các dấu hiệu biểu hiện bệnh bằng cách so sánh với đối chứng âm và đối chứng dương. Quan sát theo dõi các biểu hiện của tôm, bắt đầu cho tôm ăn thức ăn có tẩm thuốc ngay khi có biểu hiện bệnh. 3.3.2.1. Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá lý của nước nuôi Trong kỹ thuật nuôi tôm, vấn đề chất lượng nước nuôi rất quan trọng. Nước nuôi tôm phải có các tính chất hoá lý phù hợp với tôm, nếu không có thể làm tôm bị sốc và chết. Vì vậy trước khi thả tôm, cần phải tiến hành kiểm tra các tính chất hoá lý của nước nuôi. Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá lý của nước: Đo độ mặn của nước biển bằng máy đo độ mặn. Đo pH: dùng pH meter cầm tay để đo pH. NH3/: sử dụng bộ test NH3 của Sera. Đo COD: dùng KMnO4 để oxy hóa các chất hữu cơ, sau đó dùng KI trung hòa KMnO4 dư và chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột. Đo DO: dùng MnCl2 và KI/NaOH để cố định mẫu nước và chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột. Trong quá trình nuôi phải thường xuyên theo dõi và kiểm tra để đảm bảo chất lượng của nước nuôi tôm. 3.3.2.2. Tiến hành thu mẫu và kiểm tra vi khuẩn Tiến hành lấy mẫu nước và mẫu tôm tại các thời điểm: Trước khi gây cảm nhiễm. Khi gây cảm nhiễm. Sau 7 ngày dùng thuốc. Sau 10 ngày dùng thuốc. Sau 14 ngày dùng thuốc. Kiểm tra vi khuẩn trong mẫu nước Lấy mỗi bể khoảng 25 ml nước, các mẫu nước của các bể cùng lô thị nghiệm được trộn lại đựng trong bình nhựa để mang về phân tích. Mẫu nước đem về phòng thí nghiệm sẽ được kiểm tra bằng cách trải cho thật khô trên các đĩa thạch chứa môi trường TCBS, mỗi lô sẽ cấy 3 đĩa: 2 đĩa cấy với 50 µl mẫu nước và một đĩa cấy với 100 µl mẫu nước. Kiểm tra vi khuẩn trong tôm Mỗi lần lấy mẫu bắt khoảng 3 con ở mỗi bể. Tiến hành lấy mẫu máu tôm của từng con (0,1 ml). Sau đó mẫu máu của từng con sẽ được cấy trải lên 1 đĩa thạch chứa môi trường TCBS. Ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ. Xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là các khuẩn lạc màu lục, khi quan sát trong tối thấy phát sáng. Cấy vi khuẩn sang môi trường BHIA + 2% NaCl, ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ để tăng sinh khối vi khuẩn. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol, manitol, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng citrate như nguồn carbone duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gas từ glucose; khả năng phân giải Gelatin; khả năng khử Nitrate; phản ứng Indol hoá; khả năng sử dụng các acid amin như arginine, lysine, ornitine; phản ứng với esculine; khả năng sử dụng tinh bột; phản ứng VP và phản ứng O/F (Jonh, 1994). 3.3.3. Phương pháp phân tích số liệu thống kê Các số liệu thí nghiệm được xử lý sử dụng phần mềm thống kê SPSS và EXCEL. SPSS là một chương trình phân tích số liệu tự động do máy tính thực hiện dựa trên các công thức toán học đã được lập trình. Các công thức toán học thường dùng trong phân tích thống kê (Nguyễn Văn Đức, 2001): ∑ n i=1 Xi X = n 1 X Trung bình (Mean): (Xi – X)2 ∑ n i=1 n-1 1 S2 = Phương sai (Variance): S2 Độ lệch chuẩn (Standard deviation): S Trong thí nghiệm này: Xi là giá trị của các vòng kháng khuẩn ở các nồng độ thí nghiệm (mm). n là số lần lập lại thí nghiệm. Phương pháp so sánh 2 giá trị nghiệm thức (Nguyễn Văn Đức, 2001): Ở đây mỗi nghiệm thức là các giá trị vòng kháng khuẩn ở mỗi nồng độ ở mỗi điểm thời gian. Cách tiến hành: Đặt giả thiết H0: m1 = m2 ∑ n i=1 Xi X = n 1 Xi = X1i – X2i (Xi – X)2 ∑ n i=1 n-1 1 S2 = √S2/n |X| t(n-1) = Từ giá trị của phân phối Student t suy ra p là mức độ sai khác ý nghĩa dựa vào bảng phân bố t. Nếu p > 0,05, chấp nhận giả thuyết H0 tức là hai giá trị không khác nhau về mặt thống kê. Nếu p ≤ 0,05, không chấp nhận giả thuyết H0 tức là hai giá trị khác nhau về mặt thống kê. Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm 4.1.1 Kết quả phân lập dòng thuần Vibrio harveyi Kết quả phân lập từ các mẫu máu của các con tôm nghi ngờ bệnh thấy xuất hiện các khuẩn lạc nghi ngờ và kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa đã xác định đây là V. harveyi. Vi khuẩn này được dùng cho các thí nghiệm về sau. Bảng 4.1. Kết quả các phản ứng sinh hoá định danh V. harveyi Đặc điểm sinh hóa V. harveyi Màu khuẩn lạc Vàng Gram - Đối chứng - Arginine - Lysine + Ornitine + Glucose + Gasglucose - Galactose - Lactose - Sucrose + Sorbitol - Manitol + Gelatin + Indol - VP - O/F +/+ Esculine + Citrate + Tinh bột + Khử Nitrate + 4.1.2. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ Qua bước đầu sàng lọc với độ lập lại 5 lần, kết quả ghi nhận như sau (Bảng 4.2): Cả 3 hợp chất L, L2 và M đều có tác dụng kháng khuẩn đối với V. harveyi ở tất cả các nồng độ thử nghiệm, trong đó hợp chất M có hiệu quả cao hơn so với L và L2 ở các khoảng thời gian sau 4, 8 và 12 giờ. Hợp chất B2 không có tác dụng đối với V. harveyi. Dung môi hòa tan DMSO không có tác dụng đối với V. harveyi. Bảng 4.2. Kết quả tác dụng của các hợp chất ở các khoảng thời gian Khoảng thời gian B2 L L2 M 4 giờ - + ++ +++ 8 giờ - + ++ +++ 12 giờ - + ++ +++ Ghi chú: (+): hiệu quả thấp; (++): hiệu quả vừa; (+++): hiệu quả cao; (-): không có hiệu quả. 4.1.3. Kết quả thử nghiệm hợp chất M Sau khi sàng lọc, hợp chất M có hiệu quả nhất. Vì thế, bước thử nghiệm tiếp theo là lập lại thí nghiệm kháng sinh đồ cho hợp chất M với số lần lập lại 25 lần. Và kết quả được trình bày trong Bảng 4.5. Kết quả cho thấy tất cả các nồng độ thử nghiệm của hợp chất M đều có tác dụng đối với V. harveyi. Tuy nhiên hiệu quả tác dụng ở mỗi nồng độ có sự sai khác ý nghĩa (p < 0,05) sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ, nhìn chung đường kính vòng vô khuẩn ở mỗi nồng độ tăng sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ (Bảng 4.4). Bảng 4.3. So sánh hiệu quả của hợp chất M qua các khoảng thời gian ở từng nồng độ thử nghiệm Nồng độ (µg/µl) Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Sau 4 giờ (1) Sau 8 giờ (2) Sau 12 giờ (3) 200 12,95 ± 0,44 13,30 ± 0,48 14,75 ± 1,36 p(1)&(2) = 0,010; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,000 300 14,02 ± 0,44 14,67 ± 0,48 15,41 ± 1,16 p(1)&(2) = 0,000; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,020 400 14,82 ± 0,38 15,18 ± 0,50 15,91 ± 0,50 p(1)&(2) = 0,006; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,000 500 14,89 ± 0,50 15,27 ± 0,64 15,93 ± 0,76 p(1)&(2) = 0,049; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,005 600 14,98 ± 0,45 15,37 ± 0,54 16,12 ± 0,77 p(1)&(2) = 0,008; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,001 700 15,28 ± 0,48 15,90 ± 0,50 16,41 ± 0,83 p(1)&(2) = 0,010; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,004 Sự khác biệt về hiệu quả giữa các nồng độ được trình bày trong Bảng 4.5: Sau 4 giờ: so sánh đường kính vòng kháng khuẩn ở 2 nồng độ 200 và 300 µg/µl các nồng từ 400 µg/µl, 500 µg/µl, 600 µg/µl và 700 µg/µl cho tác dụng không khác biệt nhau lắm (p(400)&(500) = 0,558 > 0,05, p(400)&(600) = 0,295 > 0,05, p(500)&(600) = 0,562 > 0,05, p(600)&(700) = 0,053 > 0,05). Sau 8 giờ: có sự khác biệt về đường kính của các vòng vô khuẩn ở các nồng độ 200, 300 và 700 µg/µl so với các nồng độ khác, nhưng giữa các nồng độ 400 µg/µl, 500 µg/µl và 600 µg/µl cho thấy không có sự khác biệt đáng kể của các vòng kháng khuẩn (p(400)&(500) = 0,529 > 0,05, p(400)&(600) = 0,208 > 0,05, p(500)&(600) = 0,611 > 0,05). Sau 12 giờ: nhìn chung tác dụng của các nồng độ không còn khác biệt nhiều (p > 0,05), riêng chỉ thấy ở nồng độ 200 µg/µl có sự khác biệt ý nghĩa so với các nồng độ khác (p(200)&(400) = 0,000 < 0,05, p(200)&(500) = 0,004 < 0,05, p(200)&(600) = 0,000 < 0,05, p(200)&(700) = 0,000 < 0,05), đường kính của các vòng kháng khuẩn ở nồng độ 200 µg/µl nằm trong khoảng 14,75 ± 1,36mm. Thử nghiệm hiệu quả của hợp chất M ở các nồng độ 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/µl đều tạo ra các vòng vô khuẩn lớn hơn 12 mm (tức lớn hơn hai lần đường kính đĩa giấy kháng sinh). Kết quả này cho thấy đường kính của các vòng vô khuẩn được tạo ra từ hợp chất M ở các nồng độ thử nghiệm đều có ý nghĩa, tức các nồng độ thử nghiệm của hợp chất M đều có hiệu quả đối với V. harveyi (Lý Thị Thanh Loan và ctv, 2004). Trong các nồng độ thử nghiệm của hợp chất M, nồng độ 700 µg/µl cho các vòng vô khuẩn lớn nhất (sau 4, 8 và 12 giờ lần lượt là 15,28 ± 0,48, 15,90 ± 0,50 và 16,41 ± 0,83 mm) và có sự gia tăng đường kính vòng vô khuẩn từ nồng độ 200 đến nồng độ 700 µg/µl. Nhưng nhìn chung ở các nồng độ 400, 500, 600 và 700 µg/µl của hợp chất M không có sự khác biệt đáng kể về đường kính vòng vô khuẩn sau các khoảng thời gian thử nghiệm (p > 0,05), tức các nồng độ này cho hiệu quả tác dụng với vi khuẩn gần như nhau và như thế có thể xem nồng độ 400 µg/µl là mức nồng độ có ý nghĩa đối với V. harveyi. Bảng 4.4. So sánh đường kính vòng vô khuẩn giữa các nồng độ sau các khoảng thời gian đối với V. harveyi Thời gian Đường kính vòng vô khuẩn (mm) 200 µg/µl (1) 300 µg/µl (2) 400 µg/µl (3) 500 µg/µl (4) 600 µg/µl (5) 700 µg/µl (6) 4 giờ 12,95 ± 0,44 14,02 ± 0,44 14,82 ± 0,38 14,89 ± 0,50 14,98 ± 0,45 15,28 ± 0,48 p(1)&(2) = 0,000 p(1)&(3) = 0,000 p(1)&(4) = 0,000 p(1)&(5) = 0,000 p(1)&(6) = 0,000 p(2)&(3) = 0,000 p(2)&(4) = 0,000 p(2)&(5) = 0,000 p(2)&(6) = 0,000 p(3)&(4) = 0,558 p(3)&(5) = 0,295 p(3)&(6) = 0,003 p(4)&(5) = 0,562 p(4)&(6) = 0, 007 p(5)&(6) = 0,053 8 giờ 13,30 ± 0,48 14,67 ± 0,48 15,18 ± 0,50 15,27 ± 0,64 15,37 ± 0,54 15,90 ± 0,50 p(1)&(2) = 0,000 p(1)&(3) = 0,000 p(1)&(4) = 0,000 p(1)&(5) = 0,000 p(1)&(6) = 0,000 p(2)&(3) = 0,008 p(2)&(4) = 0,001 p(2)&(5) = 0,000 p(2)&(6) = 0,000 p(3)&(4) = 0,529 p(3)&(5) = 0,208 p(3)&(6) = 0,000 p(4)&(5) = 0,611 p(4)&(6) = 0,002 p(5)&(6) = 0,004 12 giờ 14,75 ± 1,36 15,41 ± 1,16 15,91 ± 0,50 15,93 ± 0,76 16,12 ± 0,77 16,41 ± 0,83 p(1)&(2) = 0,132 p(1)&(3) = 0,000 p(1)&(4) = 0,004 p(1)&(5) = 0,000 p(1)&(6) = 0,000 p(2)&(3) = 0,056 p(2)&(4) = 0,127 p(2)&(5) = 0,064 p(2)&(6) = 0,011 p(3)&(4) = 0,922 p(3)&(5) = 0,328 p(3)&(6) = 0,038 p(4)&(5) = 0,413 p(4)&(6) = 0,098 p(5)&(6) = 0,236 700 µg/µl 600 µg/µl 500 µg/µl 200 µg/µl 300 µg/µl 400 µg/µl ĐC Hình 4.1. Kết quả kháng sinh đồ của hợp chất M 4.2. Kết quả thử nghiệm trong phòng Wet-lab 4.2.1. Kết quả kiểm tra tính chất hoá lý của nước nuôi Kết quả kiểm tra các tính chất hoá lý của nước nuôi tôm được trình bày trong bảng 4.6: Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra các tính chất hóa lý của nước nuôi tôm Chỉ tiêu Kết quả pH 8,2 Độ mặn 15 (‰) NH3 0,03 Độ kiềm 60 COD 11,32 mg/l DO 3,7 mg/l Kết luận các tính chất này phù hợp cho nuôi tôm. 4.1.2.2. Kết quả bố trí thí nghiệm Sau khi cảm nhiễm, thả tôm trở lại bể, quan sát sau một ngày thì thấy tôm có dấu hiệu yếu lờ đờ, ăn kém, đuôi và chủy bị lỡ, một số con bơi lượn trên mặt nước, khi quan sát vào ban đêm thì thấy một số con tôm ở phần đầu và ngực phát ra ánh sáng màu xanh nhạt (trừ các bể đối chứng âm). Các bể cảm nhiễm đều có tôm bị chết. Sau một ngày, bắt đầu tiến hành cho tôm ăn thức ăn có tẩm hợp chất đã sàng lọc có hiệu quả qua thử nghiệm kháng sinh đồ là hợp chất M, ghi nhận: Lô đối chứng âm: tôm vẫn khỏe mạnh hoạt động bình thường, không có tôm chết. Lô đối chứng dương: tôm vẫn còn yếu, kém ăn, hay bơi lượn trên mặt nước và thấy phát sáng ở phần đầu khi quan sát trong tối. Tỷ lệ chết của lô đối chứng dương sau khi kết thúc thí nghiệm là khá cao trên 77,8%. Lô thử nghiệm: đối với các bể thí nghiệm cho tôm ăn thức ăn có trộn hợp chất M ở 2 nồng độ 500 mg/kg và 750 mg/kg, kết quả sau 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày tôm vẫn phát triển bình thường, quan sát thấy tôm trở lại hoạt động bình thường, không còn bơi lượn trên mặt nước và trong tối quan sát không còn thấy tôm phát sáng ở phần đầu. Tỷ lệ tôm chết đã giảm một cách rõ rệt so với các bể đối chứng dương (Bảng 4.7). Sau khi bắt đầu cho tôm ăn thức ăn có trộn hợp chất M thì không còn thấy tôm chết. Bảng 4.6. Tỷ lệ tôm chết (%) ở các lô thử nghiệm Lô thí nghiệm Trước khi cảm nhiễm Sau 1 ngày cảm nhiễm Sau 7 ngày dùng thuốc Sau 10 ngày dùng thuốc Sau 14 ngày dùng thuốc Lô đối chứng âm 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Lô đối chứng dương 0,0 20,0 37,8 53,4 77,8 Lô thử nghiệm 500 mg/kg 0,0 22,2 22,2 22,2 22,2 Lô thử nghiệm 750 mg/kg 0,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Sau khi dùng thuốc, đối với các lô thử nghiệm tác dụng của thuốc, kết quả kiểm tra mẫu tôm sau 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày cho thấy không còn sự hiện diện của vi khuẩn, tuy nhiên đối với mẫu nước kết quả kiểm tra sau 7 ngày vẫn thấy có vi khuẩn nhưng đến 10 ngày và 14 ngày kiểm tra không còn phát hiện vi khuẩn. Kết quả kiểm tra vi khuẩn ở các mẫu nước và mẫu tôm của các lô thí nghiệm được trình bày trong Bảng 4.8: Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra V. harveyi trong các mẫu nước và mẫu tôm của các bể thí nghiệm (số mẫu dương tính/ số mẫu kiểm tra) Lô thí nghiệm Trước khi cảm nhiễm Sau cảm nhiễm 1 ngày Sau 7 ngày dùng thuốc Sau 10 ngày dùng thuốc Sau 14 ngày dùng thuốc Mẫu nước Mẫu tôm Mẫu nước Mẫu tôm Mẫu nước Mẫu tôm Mẫu tôm Mẫu tôm Mẫu nước Mẫu tôm Lô đối chứng dương Bể 1 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 Bể 2 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 Bể 3 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 Lô đối chứng âm Bể 1 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Bể 2 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Bể 3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Lô thử nghiệm 500 mg/kg Bể 1 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Bể 2 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 Bể 3 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 Lô thử nghiệm 750 mg/kg Bể 1 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Bể 2 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 Bể 3 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 Như vậy ở các bể tôm được ăn thức ăn có trộn hợp chất M ở cả hai nồng độ là 500 mg/kg và 750 mg/kg làm tăng khả năng chống lại mầm bệnh V. harveyi cho tôm và giảm tỷ lệ tôm chết rõ rệt, điều này chứng tỏ cả hai nồng độ thử nghiệm 500 mg/kg và 700 mg/kg của hợp chất M đều có tác dụng điều trị bệnh cho tôm, như vậy có thể xem nồng độ 500 mg/kg là liều điều trị có hiệu quả bệnh do V. harveyi trên tôm. Và qua theo dõi ban đầu nhận thấy hợp chất M không ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của tôm, tôm được điều trị bằng hợp chất M vẫn phát triển bình thường, quan sát tôm vẫn lột xác bình thường. Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy: Hợp chất M chiết xuất từ thảo dược thuộc họ Asteraceae có tác dụng hiệu quả đối với V. harveyi trong phòng thí nghiệm. Hợp chất M có hiệu quả điều trị bệnh phát sáng do V. harveyi gây ra trên tôm, giúp giảm tỷ lệ tôm chết do bệnh. 400 µg/µl là nồng độ trên đĩa giấy kháng sinh có ý nghĩa về hiệu quả đối với V. harveyi. Liều điều trị hiệu quả của hợp chất M trong phòng Wet – lab đối với bệnh do V. harveyi trên tôm là 500 mg/kg. 5.2. Đề nghị Để đề tài này đạt hiệu quả cao hơn, chúng tôi xin có một số đề xuất: Cần nghiên cứu tìm hiểu thành phần và cấu trúc hóa học của thuốc để hiểu rõ cơ chế tác dụng của thuốc từ đó có thể đề xuất ra các biện pháp sử dụng thuốc có hiệu quả hơn. Cần tiến hành thử nghiệm hiệu quả của thuốc trên đối tượng là các ấu trùng của tôm vì đây là đối tượng bị thiệt hại nặng nhất do bệnh do V. harveyi. Nên tiến hành thử nghiệm hiệu quả điều trị của hợp chất M đối với bệnh do vi khuẩn V. harveyi trên tôm ở quy mô nồng hộ để đánh giá hiệu quả điều trị bệnh của hợp chất M trong sản xuất thực tiễn. Cần nghiên cứu để xác định LD50 (liều gây chết 50%) của hợp chất M đối với tôm để đưa ra các khuyến cáo cho các nhà nuôi tôm sử dụng thuốc có hiệu quả không gây hại đến tôm. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hà Anh, 2004. Bệnh ở tôm nuôi và đôi lời bàn. Tạp chí Thủy sản, số 3/2004: tr. 33 – 35, Bộ Thủy sản, Hà Nội. Baticados C. L., 1992. Bệnh tôm sú (Nguyễn Phương Lan dịch). Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 50 trang. Thái Thị Thanh Dương, 2004. Về tiêu thụ tôm của Việt Nam. Tạp chí Thủy sản, số 2/2004: tr. 8 – 9, Bộ Thủy sản, Hà Nội. Huỳnh Hữu Đức, 2004. Nuôi tôm ở các nước châu Á. Báo Con Tôm, số 104: tr. 30, Bản tin của Hội Nghề cá Việt Nam, TP. Hồ Chí Minh. Nguyễn Văn Đức, 2001. Phương pháp kiểm tra thống kê sinh học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 978 – 19. 268 trang. Nguyễn Văn Hảo, 2000. Một số vấn đề kỹ thuật nuôi tôm sú công nghiệp, Nhà Xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. tr. 7 – 24. Nguyễn Văn Hảo, 2003. Hệ thống một số bệnh thường gặp trên ấu trùng tôm sú tại Khánh Hoà và các tỉnh phía Nam, Một số bệnh thường gặp trên tôm sú (Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II). Nhà xuất bản nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. tr. 108 – 122. Đỗ Thị Hoà, Võ Khả Tâm, Trần Thị Lan Hương, 2001. Nghiên cứu bệnh đỏ mang trên tôm mẹ và bệnh đục thân, bệnh phát sáng trên ấu trùng tôm sú, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II , TP. Hồ Chí Minh. Đỗ Thị Hoà, 1992. Một số bệnh thường gặp ở tôm, Bài giảng về bệnh cá tôm (Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II ), Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. tr. 43 – 53. Lý Thị Thanh Loan, 1999. Các bệnh thường gặp trên Thủy sản nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Giáo Trình hướng dẫn ôn tập thi tuyển công chức, Ngạch nghiên cứu viên nuôi trồng thủy sản (Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II), Bộ Thủy sản, TP. Hồ Chí Minh. tr. 197 – 228. Lý Thị Thanh Loan, Phạm Võ Ngọc Ánh, Mã Tũ Lan, Trương Hồng Việt và Phạm Văn Điền, 2004. Hiệu quả của một vài loại kháng sinh có thể thay thế Chloramphenicol và Nitrofurans trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá nuôi nước ngọt ở Đồng bằng sông Cửu Long, Tuyển tập Nghề cá sông Cửu Long (Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II), Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. tr. 331 – 342. Nguyễn Thanh Phương, Kỹ thuật nuôi thủy sản ven biển nhiệt đới, khoa thủy sản, Đại học Cần Thơ, 2004. Bộ Thủy sản, 2004. Báo cáo Bộ Thủy sản từ 1990-2003, Báo cáo tại VINAFISH 2004. Phạm Văn Tình, 2000. Kỹ thuật sản xuất giống tôm sú chất lượng cao, Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 76 trang. Đào Văn Trí, Võ Văn Nha, Lê Minh Hải, Trần Huỳnh Cường và Phạm Vũ Hải, 2001. Thử nghiệm sử dụng Vaccine Norvax Shrimp Vib®, Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học công nghệ (1984 – 2004), Trung tâm nghiên cứu thủy sản III, Nha Trang. Tr. 463 – 474. Đào Văn Trí, 2005. Sản xuất và nuôi thương phẩm các loài tôm biển ở Việt Nam trong thời gian qua, định hướng nghiên cứu và sản xuất trong thời gian tới, Tuyển tập hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản, (Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III), Vũng Tàu, 22 – 23/12/2004, Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. tr. 551 – 559. Trần Văn Vỹ, Phạm Văn Trang và Nguyễn Duy Khoát, 1993. Nuôi tôm nước ngọt và nước lợ xuất khẩu, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. tr. 9 – 13. Hà Yên, Canh canh nỗi lo thị trường, 1 – 2004, Vietnamnet. TIẾNG ANH Abraham T. J., 2004. Antibacterial marine bacterium deter luminous vibriosis in shrimp larvae. Vol. 27, NAGA, WorldFish Center Quarterly. p. 3 – 4. Arima H., 2002. Isolation of antimicrobial compounds from guava (Psidium guajava L.) and their structural elucidation. Biosci. Biotechnol. Biochem, 66: 1727 – 1730. American Chemical Society, Washington, USA. Bauer and Kirby, 1997. Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically, fourth edition, approed standard, NCCLS document M7 – A4 (ISBN 1 – 56238 – 309 – 4). Chatterjee A., Sukul N., Laskar S., Ghoshmajumdar S., 1982. Nematicidal principles from two species of Lamiaceae Ocimum sanctum and Ocimum basilicum. J Nematol, 14: 118 – 122. W. Bengal 731235, India. Eleonor A. T., Milagros R. P., Armando C. F., Gilda L. P., Casiano H. C. J., Yasuo I., 2003. Antibacterial activity of tilapia Tilapia hornorum against Vibrio harveyi. Aquaculture, 232: 145 – 152, Aquaculture Department, Southeast Asian Fisheries Development Center, Philippines. Fraser S., A novel anti-bacterial agent addressing a critical need in a large and growing market, Centex Shrimp, 12 – 2005, Mahidol University, Bangkok  10400, Thailand. Gotke N., Maeshwari M. L., 1990. Nematicidal activity of Myristica fragrans against Meloidogyne incognita. Indian Perfumer, 34: 105 – 107. India. Gregory M. R. and George S., 2005. Biological Study of Container Vessels at the Port of Oakland, Smithsonian Environmental Research Center, The Port of Oakland, Oakland, CA 94607. p. 49 – 51. Harris L., Owens L. and Smith S.,1996. A selective and differential medium for Vibrio harveyi. Appl. Environ. Microbiol, 62: 3548 – 3550. Department of Biomedical and Tropical Veterinary Sciences, James Cook University of North Queensland, Townsville, Australia. Jonh G. H., Noel R. K., Peter H. A. S., James T. S. and Stanley T. W., 1994. Bergey’s manual of determinative bacteriology. Universiteit, Lab. Voor microbiologie, K. L. Ledeganeke, Belgium. p. 194 – 196. Karunasagar I., Chythanya R., Iddya K, 2001. Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture, 208: 1 – 10. Department of Fishery Microbiology, University of Agricultural Sciences, College of Fisheries, Mangalore-575 002, India. Lavilla – Pitogo C.R., Lean˜o E. M., Paner M. G., 1998. Mortalities of pond-cultured juvenile shrimp, Penaeus monodon, associated with dominance of luminescent vibrios in the rearing environment. Aquaculture, 164: 337 – 349. Elsevier Science, Philippines. Lightner, D.V. 1988. Vibrio disease of penaeid shrimp. Developments in Aquaculture and Fisheries Science, 17: 42 – 47. Elsevier, Amsterdam. Liu P. C., Lee K. K., Tu C. C. and Chen S. N.,1997. Purification and characterization of a cysteine protease produced by pathogenic luminous Vibrio harveyi, Curr Microbiol, 35: p. 32 – 39. Department of Aquaculture, National Taiwan Ocean University, Keelung, Taiwan. McCarthy S. A., Johnson R. M. and Kakimoto D., 1994. Characterization of an antibiotic produced by Alteromonas luteoviolacea. J. Appl. Bacteriol, 77: 426 – 432. Japan. Montero A. B., Austin B., 1999. Characterization of extracellular products from an isolate of Vibrio harveyi recovered from diseased post-larval Penaeus vannamei (Bonne). J Fish Dis, 22: 377 – 386. Edinburgh EH14 4AS, Scotland Okereke A. and Montville T. J., 1991. Bacteriocin inhibition of Clostridium botulinum spores by lactic acid bacteria. J. Food Prot, 54: 349 – 353. Department of Food Science, Rutgers State University of New Jersey, New Brunswick 08903-0231. Ranajit K. B., Kausik B., Ishita C.and Uday B., 2002. Biological activities and medicinal properties of neem (Azadirachta indica), Vol. 82, Current science, Department of Physiology, Indian Institute of Chemical Biology, Kolkata 700 032, India. Robertson P. A. W., Xu H. S. and Austin B.,1998. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of Vibrio harveyi in penaeid shrimp and water. Journal of Microbiological Methods, 34: 31 – 39. Department of Biological Sciences , Heriot-Watt University , Riccarton , Edinburgh EH 14 4AS , Scotland ,UK. Shahi A. K., Kaul M. K., Renu G., Prabhu D., Suresh C. and Gulam N. Q., 2005. Determination of essential oil quality index by using energy summation indices in an elite strain of Cymbopogon citrates. Flavour and Fragrance Journal, 20: 118 – 121. Regional Research Laboratory, Jammu Tawi - 180 001, India. Shenzhen, 2002. China International Recreational Fisheries and Aquaria Congress and Exhibition 2001, Sea World, China. p.20-23. Sivarama V., Babua M. M., Immanuela G., Murugadassa S., Citarasub T. and Mariana M. P., 2004. Growth and immune response of juvenile greasy groupers (Epinephelus tauvina) fed with herbal antibacterial active principle supplemented diets against Vibrio harveyi infections. Aquaculture, 237: 9 – 20. Center for Marine Science and Technology, Manonmaniam Sundaranar University, Tamil Nadu, India. Sung H. H., Hsu S. F., Chen C. K., Ting Y. Y. and Chao W. L., 2001. Relationships between disease outbreak in cultured tiger shrimp (Penaeus monodon) and the composition of Vibrio communities in pond water and shrimp hepatopancreas during cultivation. Aquaculture. 192:101 – 110. Elsevier Science, Tawain. Vattanaviboon P. and Mongkolsuk S., 2001. Unusual adaptive, cross protection responses and growth phase resistance against peroxide killing in a bacterial shrimp pathogen, Vibrio harveyi. FEMS Microbiology Letters, 200: 111-116, Laboratory of Biotechnology, Chulabhorn Research Institute, Bangkok, Thailand. Wijayati D. A., 2003. Efficacy of some herbs on controlling Vibrio sp and their toxicity to black tiger-shrimp (Penaeus monodon Fabricius) post larvae, Kasetsart University, Assistant Professor Nontawith Areechon, PhD. 98 pages Zhang X. H., Meaden P. G. and Austin B., 2001. Duplication of Hemolysin Genes in a Virulent Isolate of Vibrio harveyi. Appl. Environ. Microbiol, 67(7): 3161 – 3167. American Society for Microbiology, Department of Biological Sciences, Heriot-Watt University, Riccarton, Edinburgh EH144AS, Scotland. PHỤ LỤC Bảng 1. Bảng kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ lần lập lại 25 lần của hợp chất M sau 4 giờ Đĩa Nồng độ 200 300 400 500 600 700 1 12,18 13,28 13,98 14,34 15,22 14,78 2 13,06 13,46 14,26 14,84 15,00 15,80 3 12,58 13,86 16,00 14,90 14,38 15,42 4 13,48 14,96 15,08 14,58 14,68 15,16 5 12,56 14,08 14,72 15,16 15,24 15,74 6 13,78 13,28 14,86 14,26 14,46 15,06 7 12,12 13,46 14,52 14,72 14,68 14,98 8 13,62 14,16 13,82 14,12 14,16 14,52 9 13,48 13,82 15,54 15,62 14,22 15,82 10 12,72 13,64 15,12 15,02 13,64 15,02 11 13,74 14,52 15,28 15,12 15,20 15,62 12 12,12 13,36 14,42 14,28 14,26 15,52 13 12,04 12,48 14,68 15,18 15,08 15,28 14 13,44 14,14 14,98 15,84 14,82 16,48 15 12,66 13,92 14,88 14,76 14,88 15,32 16 13,14 14,28 15,18 14,14 15,46 15,94 17 12,64 14,06 15,26 15,04 15,08 16,48 18 12,78 15,22 15,66 15,86 16,00 16,92 19 12,62 14,78 14,62 15,06 15,88 16,54 20 13,06 14,22 15,78 14,38 14,92 14,64 21 13,22 14,34 14,88 14,30 14,28 15,54 22 13,42 13,96 14,68 14,68 15,14 16,24 23 12,84 13,44 14,44 14,26 16,04 15,38 24 13,26 14,62 15,84 14,06 15,24 15,80 25 12,14 14,28 15,02 14,10 14,22 15,58 Bảng 2. Bảng kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ lần lập lại 25 lần của hợp chất M sau 8 giờ Đĩa Nồng độ (mg/ml) 200 300 400 500 600 700 1 12,52 13,88 14,14 14,32 15,54 14,96 2 13,48 13,82 14,32 15,16 16,42 15,82 3 13,84 14,88 16,74 15,04 14,48 15,76 4 13,54 15,06 15,44 15,00 15,08 15,52 5 13,06 14,74 15,18 16,52 15,56 16,08 6 13,14 15,48 15,32 14,78 14,76 15,14 7 12,52 14,02 14,66 14,24 14,64 15,34 8 13,24 13,86 14,06 14,56 14,36 15,64 9 14,44 15,06 15,66 15,82 14,34 15,48 10 12,22 14,66 15,44 15,00 13,84 14,46 11 14,72 14,96 15,54 15,36 15,46 16,08 12 12,36 13,94 15,76 15,64 14,96 15,82 13 12,12 12,92 15,24 15,32 15,38 15,48 14 13,16 14,56 15,48 16,44 15,42 16,84 15 13,06 14,54 15,66 15,06 14,82 14,78 16 13,28 14,72 15,86 14,42 15,76 16,44 17 12,34 14,12 15,88 15,76 15,30 16,92 18 13,72 15,36 15,42 16,26 16,62 17,88 19 13,38 15,22 15,50 15,28 16,22 16,28 20 13,14 14,58 15,62 14,38 15,52 15,02 21 13,24 14,94 15,46 14,34 14,86 16,04 22 13,66 14,60 15,38 15,14 15,56 16,00 23 13,32 14,12 14,92 14,66 16,52 16,06 24 13,06 15,64 15,72 14,44 16,00 16,18 25 12,82 14,82 15,22 14,20 14,34 15,36 Bảng 3. Bảng kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ lần lập lại 25 lần của hợp chất M sau 12 giờ Đĩa Nồng độ 200 300 400 500 600 700 1 13,66 15,28 15,30 14,90 16,44 17,24 2 14,24 13,70 15,48 15,66 17,54 15,82 3 14,34 16,56 16,16 16,74 13,56 15,90 4 16,98 17,04 16,00 15,02 16,18 15,72 5 13,48 14,00 15,22 16,08 14,88 15,42 6 14,06 17,02 15,94 14,32 14,46 15,26 7 13,68 14,66 14,88 16,38 16,48 17,34 8 13,52 13,78 15,84 15,16 15,58 15,34 9 14,36 17,26 16,52 16,38 15,16 15,48 10 14,36 15,88 16,28 15,38 14,72 15,22 11 16,38 16,72 16,10 15,88 16,28 16,84 12 15,64 15,56 16,64 16,48 15,56 16,94 13 12,06 13,84 16,86 16,82 16,22 17,62 14 15,32 14,72 15,74 17,34 17,10 17,36 15 15,44 17,50 15,72 14,76 15,66 14,42 16 17,78 15,64 15,58 14,38 16,84 16,42 17 16,56 16,08 17,08 16,06 16,42 16,00 18 17,24 17,04 16,92 17,28 16,96 18,00 19 15,84 15,96 15,56 15,34 16,78 17,08 20 14,28 14,04 15,72 14,02 15,44 14,22 21 14,72 16,66 16,72 15,24 14,34 14,76 22 16,24 17,00 16,54 15,90 16,66 17,14 23 16,38 14,74 16,34 15,86 18,16 17,22 24 18,38 19,96 17,42 14,70 18,04 16,78 25 15,02 16,44 17,44 14,06 14,08 15,62 Bảng 4. Thành phần các môi trường trong bộ test sinh hoá định danh Vibrio harveyi STT Tên môi trường Thành phần môi trường 1 Đối chứng (+) NaCl: 2,5 g Glucose: 0,1 g Trypton: 1 g Bromocrezol: 0,002 g pha trong 100 ml nước cất 2 Arginine 0,5 g Arginine 2 g NaCl pha trong 100 ml dung dịch đối chứng 3 Lysine 0,5 g Lysine 2 g NaCl pha trong 100 ml dung dịch đối chứng 4 Ornitine 0,5 g Ornitine 2 g NaCl pha trong 100 ml dung dịch đối chứng 5 Đường 0,5 g đường 1,5 g phenol red 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 6 VP MR – VP: 1,7 g 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 7 Indol Tryptone wasser: 1,5 g 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 8 Gelatin Tryptone: 1,0 g BE: 0,5 g Gelatin: 12 g NaCl: 2,5 g pha trong 100 ml nước cất 9 Manitol 2,2 g Manitol 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 10 Tinh bột Tinh bột: 0,2 g TSB: 3 g Agar: 1,5 g 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 11 Citrate 2,43 g Citrate 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 12 O/F (200ml) NaCl: 3 g Glucose: 2 g Tryptone: 1 g BE: 0,6 g Agar: 3 g K2HPO4: 0,06 g Bromomethyl blue: 0,016 g pha trong 200 ml nước cất Bảng 5. Paired Samples Test Sig. (2-tailed) Pair 1 200 (4g) - 200 (8g) 0,010 Pair 2 200 (4g) - 200 (12g) 0,000 Pair 3 200 (8g) - 200 (12g) 0,000 Pair 4 300 (4g) - 300 (8g) 0,000 Pair 5 300 (4g) - 300 (12g) 0,000 Pair 6 300 (8g) - 300 (12g) 0,020 Pair 7 400 (4g) - 400 (8g) 0,006 Pair 8 400 (4g) - 400 (12g) 0,000 Pair 9 400 (8g) - 400 (12g) 0,000 Pair 10 500 (4g) - 500 (8g) 0,049 Pair 11 500 (4g) - 500 (12g) 0,000 Pair 12 500 (8g) - 500 (12g) 0,005 Pair 13 600 (4g) - 600 (8g) 0,008 Pair 14 600 (4g) - 600 (12g) 0,000 Pair 15 600 (8g) - 600 (12g) 0,001 Pair 16 700 (4g) - 700 (8g) 0,000 Pair 17 700 (4g) - 700 (12g) 0,000 Pair 18 700 (8g) - 700 (12g) 0,004 Pair 19 200 (4g) - 300 (4g) 0,000 Pair 20 200 (4g) - 400 (4g) 0,000 Pair 21 200 (4g) - 500 (4g) 0,000 Pair 22 200 (4g) - 600 (4g) 0,000 Pair 23 200 (4g) - 700 (4g) 0,000 Pair 24 300 (4g) - 400 (4g) 0,000 Pair 25 300 (4g) - 500 (4g) 0,000 Pair 26 300 (4g) - 600 (4g) 0,000 Pair 27 300 (4g) - 700 (4g) 0,000 Pair 28 400 (4g) - 500 (4g) 0,558 Pair 29 400 (4g) - 600 (4g) 0,295 Pair 30 400 (4g) - 700 (4g) 0,003 Pair 31 500 (4g) - 600 (4g) 0,562 Pair 32 500 (4g) - 700 (4g) 0,007 Pair 33 600 (4g) - 700 (4g) 0,053 Pair 34 200 (8g) - 300 (8g) 0,000 Pair 35 200 (8g) - 400 (8g) 0,000 Pair 36 200 (8g) - 500 (8g) 0,000 Pair 37 200 (8g) - 600 (8g) 0,000 Pair 38 200 (8g) - 700 (8g) 0,000 Pair 39 300 (8g) - 400 (8g) 0,008 Pair 40 300 (8g) - 500 (8g) 0,001 Pair 41 300 (8g) - 600 (8g) 0,000 Pair 42 300 (8g) - 700 (8g) 0,000 Pair 43 400 (8g) - 500 (8g) 0,529 Pair 44 400 (8g) - 600 (8g) 0,208 Pair 45 400 (8g) - 700 (8g) 0,000 Pair 46 500 (8g) - 600 (8g) 0,611 Pair 47 500 (8g) - 700 (8g) 0,002 Pair 48 600 (8g) - 700 (8g) 0,004 Pair 49 200 (12g) - 300 (12g) 0,132 Pair 50 200 (12g) - 400 (12g) 0,000 Pair 51 200 (12g) - 500 (12g) 0,004 Pair 52 200 (12g) - 600 (12g) 0,000 Pair 53 200 (12g) - 700 (12g) 0,000 Pair 54 300 (12g) - 400 (12g) 0,056 Pair 55 300 (12g) - 500 (12g) 0,127 Pair 56 300 (12g) - 600 (12g) 0,064 Pair 57 300 (12g) - 700 (12g) 0,011 Pair 58 400 (12g) - 500 (12g) 0,922 Pair 59 400 (12g) - 600 (12g) 0,328 Pair 60 400 (12g) - 700 (12g) 0,038 Pair 61 500 (12g) - 600 (12g) 0,413 Pair 62 500 (12g) - 700 (12g) 0,098 Pair 63 600 (12g) - 700 (12g) 0,236 Bảng 6. Số tôm chết ở các bể thí nghiệm sau các khoảng thời gian Lô thí nghiệm Bể Sau 1 ngày cảm nhiễm Sau 7 ngày dùng thuốc Sau 10 ngày dùng thuốc Sau 14 ngày dùng thuốc Đối chứng dương 1 4 7 9 13 2 3 5 9 12 3 2 5 6 10 Đối chứng âm 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 3 0 0 0 0 Lô thử nghiệm 500 mg/kg 1 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 Lô thử nghiệm 750 mg/kg 1 2 2 2 2 2 4 4 4 4 3 3 3 3 3