Khóa luận Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP

Sản phẩm B Sản phẩm A 19 - Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4 do hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại. - Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và 5, do các primer không có chiều hướng vào nhau. Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước cơ bản:  Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR  Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid  Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Tuy nhiên trong thực tế khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR thường gặp phải một số vấn đề:  Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số band trên bảng gel điện di. Vì vậy nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng.  PCR buffer thường được cung cấp theo Taq - polymerase và có thể có hoặc không có Mg2+. Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau.  Taq - polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn. Vì vậy, loại Taq - polymerase và nồng độ của Taq đòi hỏi phải chính xác và được xác định qua thực nghiệm.  Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf. 2.2.3.6. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [17], [18] AFLP – đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc, do Vos và cộng sự phát minh 1975. Là kỹ thuật được áp dụng để phân tích tính đa dạng của sinh vật từ hàng trăm đoạn DNA giới hạn đã được khuếch đại đồng thời nhờ phản ứng PCR. Trên nguyên tắc, AFLP gồm hai nội dung cơ bản: Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn có bổ sung các adapter đặc hiệu tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trưng cho các primer đã chọn trước. 20 Adapter là một đoạn oligonucleotide đôi, được tổng hợp nhân tạo và có trình tự tương ứng với trình tự ở đầu đoạn DNA được phân cắt bởi một loại enzyme nhất định Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR qua hai giai đoạn với hai loại primer khác nhau.  Enzyme được sử dụng Để cắt DNA của bộ gene, hai enzyme cắt hạn chế được sử dụng: MseI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 4 base EcoRI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 6 base Ba loại đoạn DNA thu nhận được là: Một loại đoạn DNA được cắt bởi EcoRI ở cả hai đầu kết thúc, một loại đoạn DNA được cắt bởi EcoRI ở một đầu kết thúc này và MseI ở đầu kết thúc khác, và một loại đoạn DNA được cắt bởi MseI ở cả hai đầu kết thúc. Hình 2.3: Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI  Adapter Adapters sợi đôi chuyên biệt cho cả vị trí của EcoRI và vị trí của MseI. Sự gắn kết của adapter đối với DNA đã được cắt thay đổi vị trí cắt để ngăn chặn sự phân cắt thứ hai xảy ra sau khi đã gắn kết. Hình 2.4: Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI 21  Primer Có hai loại primer được sử dụng: Primer dùng trong khuếch đại tiền chọn lọc: Primer này được thiết kế tương ứng với adapter đã sử dụng, đồng thời có gắn thêm một nucleotide ở đầu 3’ để chọn lọc những đoạn DNA cần khuếch đại, cụ thể là EcoRI gắn thêm nucleotide A và MseI gắn thêm nucleotide C ở đầu 3’. Kết quả chủ yếu của việc chọn trước PCR là các đoạn DNA đó có một vị trí cắt của MseI và EcoRI, và cũng có nucleotide quan tâm. Bước khuyếch đại tiền chọn lọc sẽ làm giảm đi sự phức tạp trong việc thu nhận những đoạn DNA. Hình 2.5: Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP Primer dùng trong khuếch đại chọn lọc: Là các primer khuếch đại tiền chọn lọc được thêm vào từ 1 đến 2 nucleotide ở đầu 3’. Ví dụ: EcoRI A gắn thêm CT và MseI C gắn thêm AG vào đầu 3’. EcoRI A 5’-GAC TGC GTA CCA ATT CA-3’ MseI C 5’-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3’ EcoRI 5’FAM-GACTGCGTACCAATTC ACT-3’ MseI 5’-GATGAGTCCTGAGTAA CAG-3’ 22 Kết quả là so với primer được thiết kế tương ứng với adapter thì primer khuếch đại chọn lọc có thêm ba nucleotide ở đầu 3’. Điều này giúp cho việc lựa chọn các đoạn DNA chặt chẻ hơn, giảm sự phức tạp khi đọc kết quả các đoạn DNA trên gel. Sau khi được khuếch đại PCR với các primer này, kết quả của mỗi mẫu được phân tích trên máy giải trình tự DNA. Việc chọn lựa sự khuếch đại với hai primer EcoRI và MseI là khuếch đại chủ yếu các đoạn DNA được gắn hai primer EcoRI-MseI. Các đoạn DNA EcoRI-EcoRI không được khuếch đại. Các đoạn DNA MseI-MseI không được nhận biết trong quá trình khuếch đại do không chứa chất phát huỳnh quang. Chỉ có những sợi chứa EcoRI được nhận biết. Hình 2.6: Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP Trên cơ sở đó quy trình thực hiện AFLP có thể gồm bốn bước cơ bản:  Tách chiết và tinh sạch DNA.  Cắt các mẫu DNA nghiên cứu bằng các cặp enzyme giới hạn chọn lọc có bổ sung adapter tương ứng.  Tiến hành PCR hai giai đoạn với hai loại primer đặc hiệu, primer 1 + 1 nucleotide và primer 2 + 2 nucleotide. 23  Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập cây phát sinh chủng loại để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu. Ta có thể tóm tắt kỹ thuật AFLP như sau: Hình 2.7: Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP Kỹ thuật AFLP có các ưu điểm:  Lượng DNA cần cho phản ứng rất ít  Cho kết quả nhanh, ổn định và các lần lặp lại có độ tin cậy cao do kỹ thuật AFLP có các điều kiện nghiêm ngặt của phản ứng PCR.  Kỹ thuật AFLP thực hiện trên nhiều đối tượng sinh vật khác nhau.  Không cần biết trật tự nucleotide của hệ gene. AFLP được ứng dụng trong việc xây dựng bản đồ gene thực vật bao gồm:  Thiết lặp nhóm gene liên kết nhau trong một thể nhiễm sắc trong quá trình cho tạp giao  Làm bão hòa các vùng có gene lạ đưa vào  Ước lượng mức độ có quan hệ giữa các giống. 24 2.3. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2.3.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc Về cây điều bước đầu đã có một số nghiên cứu khá thành công như: Samal và ctv (2003) đã phân tích mối quan hệ di truyền giữa những quần thể của điều bằng kỹ thuật RAPD với 40 primer. Kết quả đã chọn ra 11 primer cho tính đa hình cao và phân biệt được mối tương quan di truyền giữa 20 giống điều nghiên cứu. Sunil Archak và ctv (2003) đã nghiên cứu DNA đặc trưng của các giống điều Ấn Độ bằng kỹ thuật RAPD và ISSR. Với 5 primer dùng trong kỹ thuật RAPD và 4 primer dùng trong ISSR đã đánh giá được mối tương quan di truyền của 35 giống điều khảo sát. Nhìn chung những thông tin về hệ gene cây điều chưa được biết nhiều, những nghiên cứu chỉ là bước đầu với những marker RAPD. Do đó việc sử dụng một marker hiệu quả hơn để tìm hiểu về hệ gene cây điều là một việc làm cần thiết, trên cơ sở đó kỹ thuật AFLP đang được quan tâm và sử dụng. 2.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc Gần đây nhất có các nghiên cứu như: Nguyễn Thị Thanh Bình và ctv (2005) đã nghiên cứu đa hình một số giống tằm dâu bằng kỹ thuật RAPD với 5 primer. Kết quả đã phân tích được tính đa hình và tính đặc trưng của các giống tằm. Nguyễn Thu Thúy và ctv (2005) đã dùng kỹ thuật AFLP để so sánh đa hình giữa 2 nhóm cá tra có trọng lượng phân biệt và đã đạt được một số kết quả khả quan.v.v. 25 CHƢƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian  Đề tài được thực hiện từ tháng 4/2005 – tháng 9/2005 3.1.2. Địa điểm  Các mẫu điều được lấy tại các huyện của tỉnh Ninh Thuận  Mẫu được ly trích DNA, chạy RAPD và AFLP tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 3.2.Vật liệu 3.2.1. Các mẫu điều thí nghiệm  Địa điểm lấy mẫu: Mẫu được lấy tại các nông hộ, lâm trường ở 4 huyện Ninh Phước, Ninh Hải, Ninh Sơn và Bác Ái của tỉnh Ninh Thuận.  Cách chọn mẫu: Đầu tiên thu thập các thông tin về những cây điều trong vườn, sau đó chọn các mẫu có những tính trạng đặc biệt. Tùy theo thông tin thu được mà số mẫu thu nhận có thể khác nhau. Nếu vườn điều có nhiều cây đặc biệt thì có thể thu thập 3 – 5 mẫu, nếu không có cây nào đặc biệt thì có thể không lấy.  Cách lấy mẫu: Chọn những lá tươi tốt, lấy cả lá non, lá trưởng thành và lá già. Mỗi mẫu lấy khoảng 4 - 6 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tươi của lá. Đồng thời ghi đầy đủ những thông tin của cây được lấy mẫu theo phiếu điều tra có sẵn (phụ lục I)  Cách bảo quản mẫu đưa về phòng thí nghiệm: Mẫu sau khi lấy được cho vào thùng lạnh để bảo quản tạm thời. Sau đó cho vào tủ lạnh, để ở ngăn đá 10 – 15 ngày và dùng thùng lạnh đựng mẫu vận chuyển về phòng thí nghiệm. 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm 3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA - Dịch trích DNA (EB) - TE 1X (Tris-HCl, EDTA) - Chloroform : Isoamyl alcohol (24 : 1) - Sodium acetat 3 M 26 - RNase (10 mg/ml) - Ethanol 100% - Isopropanol - Ethanol 70% 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra định lƣợng DNA - Nước cất 2 lần khử ion (đã hấp khử trùng) - TE 1X 3.2.2.3. Hóa chất dùng để chạy RAPD - Taq buffer - dNTP - Taq DNA polymerase (ABgene và Biorad) - MgCl2 - Primer 1, primer 2, primer 9, primer 11 (IDT – Mỹ) - DNA mẫu - Nước cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV 3.2.2.4. Hóa chất dùng trong điện di và đọc kết quả - Agarose (Pháp) - Ladder 100 bp (Invitrogen) - TAE 0,5X - Ethidium bromide (Đức) - Loading dye 6X 3.2.2.5. Hóa chất dùng để chạy AFLP (Applied Biosystem) - Enzyme cắt EcoRI - EcoRI adapter - Enzyme cắt MseI - MseI adapter - Dung dịch đệm 5X - ATP (10 mM) - T4 DNA ligase - Primer EcoRI - Core Mix preselection amplification - Primer MseI - Core Mix selection amplification - Primer EcoRI chọn lọc - Nước cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV - Primer MseI chọn lọc 3.2.2.6. Hóa chất dùng để đọc kết quả AFLP (Applied Biosystem) - DNA chuẩn (GeneScan 500 ROX) - Chất biến tính (hidiformamide) 3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm - Chén sứ và chày giã (Đức) - Máy Vortex (IKA - Đức) - Cân điện tử (Ohaus - Mỹ) - Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh) - Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh) - Tủ sấy (Jencons-Anh) - Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức) - Máy điện di (Biorad) - Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) - Lò Viba (Electrolux) 27 - Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển) - Đầu típ các loại (Đức) - Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) - Máy PCR (PTC 100 - MJ) - Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản) - Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp) - Pipet các loại (Nichiryo - Nhật Bản) - Máy sequencer (ABI - Mỹ) 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA 3.3.1.1. Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)): gồm 12 bước  Bước 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Khuấy bằng vortex thật kỹ. Ủ ở 650 C trong 45 phút.  Bước 2: Thêm 500 ul Chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1), khuấy bằng vortex 10 phút, li tâm 5 phút 14000 vòng ở 100 C.  Bước 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bước 2.  Bước 4: Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 ul RNase, ủ ở 370 C trong 1giờ.  Bước 5: Thêm vào 250 ul dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200 C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).  Bước 6: Li tâm 5 phút 14000 vòng ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong.  Bước 7: Cho vào 300 ul TE 1X, ủ ở 370 C trong 1giờ.  Bước 8: Thêm 20 ul muối Sodium acetate 3 M, và 640 ul Ethanol 100%, trộn đều và để – 200 C trong 30 phút.  Bước 9: Li tâm 10 phút 14000 vòng ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.  Bước 10: Rửa cặn với 400 ul Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14000 vòng ở 10 0 C, đổ bỏ dịch trong.  Bước 11: Lặp lại bước 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 ul TE 1X, ủ ở 370 C trong 30 phút.  Bước 12: Bảo quản mẫu ở 40 C. 3.3.1.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di [12] Để định tính DNA, ta điện di các mẫu DNA đã ly trích trên gel agarose. Trong điện trường DNA di chuyển từ điện cực âm sang điện cực dương, vì DNA mang điện âm (do tính chất của nhóm phosphate). Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ sát giữa 28 hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh, do đó DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy ta có thể phân loại được các đoạn DNA trên gel agarose. Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA được phân ra tùy theo trọng lượng phân tử. Có thể quan sát chúng bằng mắt nhờ kỹ thuật nhuộm màu với ethidium bromide và chụp gel bằng tia cực tím. Cách tiến hành:  Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò Viba cho agarose tan thật đều.  Đổ gel, chờ agarose đông  Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 ul loading dye và 4 ul DNA mẫu.  Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 250 mA, thời gian khoảng 20 phút.  Nhuộm ethidium bromide khoảng 15 phút, sau đó đưa vào máy Geldoc đọc kết quả. 3.3.1.3. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế [12] Trên nguyên tắc, sự hấp thu ánh sáng khác nhau của các base nitơ của phân tử DNA mạch kép và mạch đơn, có thể xác định hàm lượng của DNA trong dung dịch. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Đồng thời để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch DNA thường đo giá trị OD280. Do protein có phổ hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, đồng thời hấp thụ ở bước sóng 260 nm gây nên sự sai lệch khi tính nồng độ của acid nucleic. Khi giá trị OD260/OD280 = 1,8 – 2,2 thì dịch trích DNA được coi là tinh sạch. Hàm lượng DNA được tính theo công thức: DNA (ng/ul) = [(62.9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * Độ pha loãng Cách tiến hành:  Xây dựng đường chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đường chuẩn.  Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thường pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: Hút 20 ul dung dịch DNA hòa tan với 1,8 ml TE 1X. Cho vào Curvette. Tiến hành đo OD. 29 DNA sau khi tách chiết và kiểm tra định tính, định lượng sẽ được bảo quản ở 40 C để dùng cho việc chạy RAPD và AFLP 3.3.2.Chạy RAPD 3.3.2.1. Primer Sử dụng 4 primer: primer1, primer 2, primer 9 và primer 11 để chạy RAPD  Trình tự của primer 1 (OPA 02): 5’TGCCGAGCTG 3’ và Tm = 40,7 0 C  Trình tự của primer 2 (OPA 03): 5’AGTCAGCCAC 3’ và Tm = 34,3 0 C  Trình tự của primer 9 (OPN 03): 5’GGTACTCCCC 3’ và Tm = 33,9 0 C  Trình tự của primer 11 (OPN 06): 5’GAGACGCACA 3’ và Tm = 35,3 0 C 3.3.2.2. Bố trí thí nghiệm Chọn vài mẫu DNA có độ tinh sạch cao để thực hiện phản ứng RAPD – PCR Thí nghiệm 1  Mục đích thí nghiệm: Khảo sát quy trình RAPD – PCR  Phương pháp tiến hành: Theo quy trình sau Bảng 3.1: Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD – PCR của thí nghiệm 1 Hóa chất Dung dịch gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer MgCl2 dNTP Primer Taq DNA polymerase DNA mẫu H2O 25 mM 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 5 U 20 ng/ul 2,5 ul 1,5 ul 0,25 ul 0,65 ul 0,1 ul 1 ul 19 ul 250 uM 150 uM 100 uM 6,5 pmol (260 uM ) 0,5 U 20 ng (Samal và ctv, 2003) 30 Bảng 3.2: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD – PCR của thí nghiệm 1 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 4 45 94 1 Ta 1 72 2 1 72 10 Hold 4 0 C (Samal và ctv, 2003) Ta: giảm 2 0 C so với Tm (nhiệt độ chảy) của primer  Chỉ tiêu đánh giá: Các band DNA trên gel điện di Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố chu kỳ đến phản ứng RAPD – PCR  Mục đích thí nghiệm: Xác định quy trình RAPD – PCR  Phương pháp tiến hành: Theo quy trình sau Bảng 3.3: Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD – PCR của thí nghiệm 2 (Samal và ctv, 2003) Hóa chất Dung dịch gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer MgCl2 dNTP Primer Taq DNA polymerase DNA mẫu H2O 25 mM 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 5 U 20 ng/ul 2,5 ul 1,5 ul 0,25 ul 0,65 ul 0,1 ul 1 ul 19 ul 250 uM 150 uM 100 uM 6,5 pmol (260 uM ) 0,5 U 20 ng 31 Bảng 3.4: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD – PCR của thí nghiệm 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 4 37 94 1 Ta 1 72 2 1 72 10 Hold 4 0 C  Chỉ tiêu đánh giá: Các band DNA trên gel điện di Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố MgCl2, dNTP và primer lên phản ứng RAPD – PCR  Mục đích thí nghiệm: Tối ưu hóa quy trình RAPD – PCR  Phương pháp tiến hành: Theo quy trình sau Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD – PCR của các nghiệm thức trong thí nghiệm 3 Nghiệm thức Hóa chất Dung dịch gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer Taq DNA polymerase DNA mẫu 25 mM 5 U 20 ng/ul 2,5 ul 0,1 ul 1 ul 250 uM 0,5 U 20 ng Nghiệm thức 1 MgCl2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 1,5 ul 0,25 ul 0,65 ul 150 uM 100 uM 6,5 pmol (260 uM ) Nghiệm thức 2 MgCl2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 2 ul 0,3 ul 0,65 ul 200 uM 120 uM 6,5 pmol (260 uM ) 32 Nghiệm thức 3 MgCl2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 2,5 ul 0,3 ul 0,65 ul 250 uM 120 uM 6,5 pmol (260 uM ) Nghiệm thức 4 MgCl2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 2 ul 0,35 ul 0,65 ul 200 uM 140 uM 6,5 pmol (260 uM ) Nghiệm thức 5 MgCl2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 2 ul 0,3 ul 0,7 ul 200 uM 120 uM 7,0 pmol (280 uM ) Nghiệm thức 6 MgCl2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 2,5 ul 0,35 ul 0,7 ul 250 uM 140 uM 7,0 pmol (280 uM ) H2O Thêm vào cho đủ 25 ul Bảng 3.6: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD – PCR của thí nghiệm 3 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 4 37 94 1 Ta 1 72 2 1 72 10 Hold 4 0 C  Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng và chất lượng các band DNA trên gel điện di Sau khi xác định quy trình tối ưu của phản ứng RAPD – PCR, tiến hành chạy RAPD với 50 mẫu và phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 33 3.3.3. Chạy AFLP (Quy trình theo Applied Biosystem) 3.3.3.1. Cắt thử DNA (300 ng) và chạy kiểm tra trên gel agarose 1,5% Phản ứng cắt gồm có:  300 ng DNA genome  4 U EcoRI  3 U MseI  6 ul 5X dung dịch đệm Ủ 2 giờ ở 370 C, 15 phút ở 700 C để bất hoạt enzyme, sau đó chuyển ngay sang đá rồi ly tâm để cho phản ứng dồn xuống đáy ống. Kiểm tra DNA đã cắt bằng cách lấy 10 ul điện di trên gel agarose 1,5% cùng với mẫu đối chứng xem DNA có được cắt hay không. Ở bước này nhằm kiểm tra chất lượng DNA bộ gene vì sự thành công của kỹ thuật AFLP phụ thuộc vào việc DNA bộ gene được cắt hoàn toàn bằng enzyme hạn chế. 3.3.3.2. Chuẩn bị hỗn hợp enzyme (cho 4 mẫu)  1 ul đệm 10X T4 DNA ligase có ATP  0,4 ul 0,5 M NaCl  0,2 ul 1 mg/ml BSA (làm loãng từ dung dịch mẹ 10 mg/ml)  4 unit MseI  20 unit EcoRI  4 Weiss unit T4 DNA ligase Trộn kỹ, ly tâm 10 giây. Giữ trong đá. 3.3.3.3. Thực hiện phản ứng cắt và gắn  1 ul đệm 10X T4 DNA ligase có ATP  1,0 ul 0,5 M NaCl  0,5 ul 1 mg/ml BSA  1,0 ul MseI adapter  1,0 ul EcoRI adapter  2,0 ul hỗn hợp enzyme (chuẩn bị ở bước 3.3.4.2)  Cho thêm 0,5 ug DNA mẫu (đối chứng cho 5,5 ul DNA từ KIT) 34 Trộn kỹ, ly tâm 10 giây. Để ở nhiệt độ phòng qua đêm hoặc 370 C trong 2 giờ. Cho thêm TE vào mỗi ống phản ứng cắt – gắn để được thể tích 200 ul. Giữ ở 2 – 60 C hoặc –200 C 3.3.3.4. Nhân bản tiền chọn lọc Cho vào ống 0,2 ml các thành phần:  4,0 ul DNA đã cắt – gắn và pha loãng (chuẩn bị ở bước 3.3.4.3)  1,0 ul primer tiền chọn lọc  15,0 ul hỗn hợp AFLP (P/N 402005) Bảng 3.7: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản tiền chọn lọc Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 72 2 phút 20 94 20 giây 56 30 giây 72 2 phút 1 60 30 phút Hold 4 0 C (Nguyễn Đức Thành, 2004) Sau khi nhân bản giữ ở 2 – 60 C. Kiểm tra nhân bản: Dùng 10 ul sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc điện di trên gel agarose 1,5%. Pha loãng sản phẩm: Cho 190 ul TE vào 10 ul sản phẩm còn lại, trộn kỹ, ly tâm và giữ ở 2 – 60 C Lưu ý: Nên ủ adapter ở 950 C trong 5 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng và ly tâm 14000 vòng/phút trước khi sử dụng. 3.3.3.5. Nhân bản chọn lọc Cho vào ống 0,2 ml các thành phần:  3,0 ul sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc đã pha loãng  1,0 ul primer MseI –CXX (5 uM)  1,0 ul primer EcoRI –AXX đánh dấu (1 uM) 35  15,0 ul hỗn hợp AFLP (P/N 402005) Bảng 3.8: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản chọn lọc (Nguyễn Đức Thành, 2004) Sản phẩm PCR chọn lọc được điện di trên máy giải trình tự DNA để đọc kết quả Cách tiến hành: Cho vào ống eppendorf 0,2 ml các thành phần:  9,0 ul chất biến tính (hidiformamide)  0,5 ul sản phẩm PCR chọn lọc  0,5 ul DNA chuẩn (GeneScan 500 ROX) Biến tính ở 950 C trong 5 phút (sử dụng máy PCR), sau đó làm lạnh ngay bằng đá và load vào giếng điện di trên máy giải trình tự DNA. 3.3.4. Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS Các band thu được từ kết quả điện di RAPD và số liệu từ AFLP được mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1. Band nào có thì chuyển thành 1, band không có chuyển thành 0. Bảng mã hóa được lưu dưới dạng file excel và chuyển sang phần mềm NTSYS phiên bản 2.1 để xử lý. Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 2 phút 1 94 20 giây 66 30 giây 72 2 phút 9 94 20 giây Giảm 10 C sau mỗi chu kỳ 30 giây 72 2 phút 20 94 20 giây 56 30 giây 72 2 phút 1 60 30 phút Hold 4 0 C 36 CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thu thập mẫu tại các vùng trồng điều thuộc tỉnh Ninh Thuận Chúng tôi đã tiến hành thu thập 55 mẫu điều ở 12 xã thuộc 4 huyện của tỉnh Ninh Thuận với các đặc điểm cơ bản về: kích thước hạt, quả; năng suất; thời gian ra hoa; số đợt trái trong năm, màu sắc hạt, quả;…trong đó nhóm điều Việt Nam chiếm 48%, điều Ấn Độ chiếm 36% (cách phân chia nhóm điều do người trồng điều đưa ra); tính trạng hạt to chiếm 38%, hạt nhỏ và trung bình chiếm 58%; tính trạng năng suất cao chiếm 52%, năng suất thấp và trung bình chiếm 42%; các mẫu vừa có tính trạng hạt to vừa cho năng suất cao chiếm 22% và có vài mẫu mang những đặc điểm đặc biệt như: trái màu trắng, màu nâu, màu xanh; cho trái 3 đợt trong năm; cây một năm tuổi có trái; hoa nhiều nhưng không trái; ra hoa, trái sớm…(các đặc điểm chi tiết được trình bày ở bảng 4.1 phần phụ lục II) Do cây điều ở tỉnh Ninh Thuận được trồng theo các chương trình gây rừng, phủ xanh đồi núi trọc đồng thời giúp người dân xóa đói giảm nghèo nên về mặt giống còn nhiều hạn chế. Các giống điều chưa được phân chia rõ rệt. Theo kinh nghiệm người trồng điều chia làm hai loại: Một loại cây phân tán rộng, hoa chùm, lá non màu đỏ gọi là điều Ấn Độ; một loại cây phân tán hẹp hoặc trung bình, lá non màu xanh gọi là điều Việt Nam. Để đánh giá đa dạng di truyền chúng tôi đã thu thập mẫu nhiều nơi và lựa chọn những tính trạng đặc biệt vì vậy số lượng mẫu tuy ít nhưng vẫn mang tính đại diện cho việc đánh giá. 4.2. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA DNA là thông tin di truyền, là vật liệu quan trọng dùng trong các thao tác nghiên cứu về phân tử. Vì vậy, hoàn thiện quy trình ly trích DNA nhằm thu được DNA tinh sạch, có chất lượng cao là bước đầu tiên, không thể thiếu trong các nghiên cứu về sinh học phân tử. Việc ly trích DNA từ lá điều gặp một số khó khăn do lá điều có lớp biểu mô ngoại bì bị cutin hóa mạnh, bên trong mô chứa nhiều protein, polysaccharide…làm cho DNA thu được có độ tinh sạch thấp. Để cải thiện chất lượng DNA ly trích chúng tôi đã thay đổi một vài yếu tố trong quy trình ly trích cho phù hợp. 37 Tóm tắt quy trình ly trích: cân Dịch lỏng (bỏ) Tủa trắng đục Dịch lỏng (bỏ) Rửa bằng Ethanol 70% (2 lần) + 100 ul TE 1X ủ 370 C /30 phút Để khô Bảo quản ở 40 C Mẫu 0,15 g Cho vào cối + 1,2 ml dịch trích EB Nghiền Dung dịch màu xanh đậm (vortex, ủ 650 C/45 phút) + 500 ul chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) Dung dịch màu xanh đậm Dịch lỏng màu xanh Cặn (bỏ) + 500 ul chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) Dịch lỏng màu xanh Dịch lỏng màu xanh nhạt Cặn (bỏ) vortex 10 phút, ly tâm 5 phút/14000 vòng/100 C vortex 10 phút, ly tâm 5 phút/14000 vòng/100 C + 2 ul RNase ủ 370 C/1 giờ Isopropanol lạnh (1 : 1) Dịch lỏng màu xanh nhạt có huyền phù (tủa ở -200 C qua đêm) Tủa trắng đục ly tâm 5 phút/14000 vòng/100 C + 300 ul TE 1X ủ 370 C/1 giờ Dung dịch trắng đục + 20 ul Sodium acetate 3 M, 640 ul Ethanol 100% Dung dịch trắng đục có huyền phù (để - 200 C / 30 phút) ly tâm 10 phút/14000 vòng/100 C Dịch lỏng màu xanh nhạt Hình 4.1 : Quy trình ly trích DNA 38 Quy trình ly trích sử dụng 2-mercaptoethanol có tác dụng phá hủy mạnh thành tế bào giúp cho việc giải phóng DNA hiệu quả hơn, muối sodium acetate làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA và cho chloroform isoamyl acohol 2 lần với việc ly tâm tốc độ cao giúp loại bỏ được tạp chất như protein, polysaccharide...qua đó chất lượng DNA thu được tốt hơn. Nhìn chung quy trình ly trích khá ổn định và hiệu quả, vấn đề là tìm cách hạn chế sự đứt gãy của DNA, điều này phụ thuộc nhiều vào các tác nhân cơ học. Chúng tôi thực hiện ly trích 55 mẫu, thu được DNA ở 50 mẫu đạt tiêu chuẩn dùng cho các kỹ thuật phân tử, chiếm 90,9%. Trong 50 mẫu thu được có 52% số mẫu đạt DNA tinh sạch có OD > 1,8 và 80% số mẫu có hàm lượng DNA lớn hơn 50 ng/ul. Trong đó có 44% số mẫu vừa có OD > 1,8 vừa có hàm lượng DNA lớn hơn 50 ng/ul. (kết quả chi tiết ở bảng 4.2 phần phụ lục II). Đối với 5 mẫu ly trích thu được DNA không đạt đều là 5 mẫu lá non, có thể do lá non chứa nhiều nhựa và các hợp chất phenol nên khi loại bỏ các tạp chất đồng thời mất đi một lượng DNA đáng kể. Do đó kết quả ly trích lá non thu được lượng DNA rất thấp, không đủ tiêu chuẩn để thực hiện RAPD – PCR. Như vậy thích hợp nhất cho việc ly trích là lá trưởng thành. Hình 4.2: Các mẫu DNA ly trích 12, 13, 14, 16, 18, 19, 21, 29: NH12 – NH29; 7 – 10: NP7 – NP10; 38, 39, 41: NS38 – NS41; 42, 50: BA42, BA50 12 13 14 16 18 19 21 29 7 8 9 10 38 39 41 42 50 39 Qua hình 4.2 chúng tôi nhận thấy việc ly trích theo hình 4.1 là tương đối phù hợp, mặc dù kết quả điện di cho thấy có hiện tượng DNA bị gãy (gel bị smear) nhưng kết quả đo OD tương đối tốt và hàm lượng DNA cũng khá cao (trung bình 108 ng/ul). Trong quá trình ly trích chúng tôi nhận thấy một số vấn đề sau:  Lúc cân mẫu chuẩn bị nghiền, tránh để lá điều thoát hơi nước, nếu không việc ly trích DNA sẽ không đạt hiệu quả thậm chí không có DNA. Do sự thoát hơi nước tự nhiên làm lá điều bị khô, các mô bị tổn thương dẫn đến sự hư hỏng DNA. Có thể dùng bịch nylon để đựng mẫu sau khi cân hoặc dùng giấy gói lại, tuy nhiên dùng bịch nylon hiệu quả hơn  Dịch trích EB khi bảo quản thường có hiện tượng kết tủa (CTAB) ảnh hưởng đến hiệu quả ly trích DNA, do đó cần ủ dung dịch EB ở 650 C khoảng 5 phút trước khi sử dụng  Quá trình nghiền ảnh hưởng đến sự đứt gãy DNA, do đó khi nghiền tránh tạo bọt và không nghiền quá mạnh  Ở các bước cho TE vào hòa tan DNA không nên khuấy bằng vortex (khuấy bằng vortex DNA sẽ gãy). Nếu ủ ở 370 C trong 30 phút mà DNA chưa tan hết thì ủ ở thời gian lâu hơn  Khuấy trộn nhẹ, kỹ để tránh gãy DNA, thường khuấy bằng vortex khoảng 800 – 900 vòng  Ở bước 3 và bước 4 khi chuyển lấy dịch trong cẩn thận tránh lấy phạm vào phần tạp phía dưới, nếu không độ tinh sạch sẽ không cao. Thường bước 3 hút khoảng 450 ul và bước 4 hút khoảng 300 ul  Ở bước 11 khi để khô cặn cần chú ý, nếu để quá khô sẽ làm hỏng DNA, nếu còn ethanol sẽ ảnh hưởng xấu đến DNA trong quá trình bảo quản và phản ứng PCR. 4.3. Xác định quy trình RAPD – PCR và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều hiện đƣợc trồng tại tỉnh Ninh Thuận 4.3.1.Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình RAPD – PCR của Samal và ctv (2003) Với quy trình ở thí nghiệm này, sản phẩm PCR không có band trên gel điện di, mặc dù Samal và ctv (2003) đã thu được kết quả rất tốt. Điều này có thể do việc sử dụng hóa 40 chất có nguồn gốc khác nhau nên kết quả không giống nhau. RAPD – PCR không cho sản phẩm có thể do số chu kỳ quá lớn, làm cho Taq - polymerase giảm hoạt tính và các thành phần trong phản ứng PCR cạn kiệt, dẫn đến sự ức chế trong phản ứng PCR. Sunil Archak và ctv (2003) đã tiến hành phản ứng RAPD – PCR với quy trình khác với Samal và ctv (2003), số chu kỳ khuếch đại là 40 và cũng thu được kết quả rất tốt. Do đó chúng tôi nghĩ đến việc giảm số chu kỳ trong phản ứng PCR. 4.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của yếu tố chu kỳ đến phản ứng RAPD - PCR Sản phẩm PCR có xuất hiện band trên gel điện di nhưng kết quả các band còn mờ. Hình 4.3: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 ở thí nghiệm 2 Nguyên nhân có thể do thành phần hóa chất hoặc số chu kỳ chưa phù hợp. Chúng tôi tiến hành thay đổi chu kỳ nhiệt với 39 chu kỳ khuếch đại nhưng kết quả thu được không tốt hơn. Do đó chúng tôi thực hiện thí nghiệm 3 để tìm quy trình tối ưu hơn. 4.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố MgCl2, dNTP và primer lên phản ứng RAPD – PCR NH13 NH14 NH15 NH16 NH18 NH25 NS31 BA42 NP6 NP9 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5NT6 NP6, primer 11 NP9, primer 1 41 Hình 4.4: Sản phẩm PCR của 6 nghiệm thức khi thực hiện với primer 1 và primer 11 ở thí nghiệm 3 (NT: Nghiệm thức) Sau khi thực hiện thí nghiệm 3 chúng tôi nhận thấy nghiệm thức 2 (bảng 3.5 trang 31) là tối ưu nhất và trong số 4 primer thì primer 1 và primer 11 có xuất hiện các band, còn primer 2 và primer 9 không cho band trên gel điện di. 4.3.4. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều hiện đƣợc trồng tại tỉnh Ninh Thuận với primer 11 Chúng tôi thực hiện chạy RAPD với primer 11 trên 50 mẫu kết quả thu được 13 band (hình 4.5, hình 4.6, hình 4.7, hình 4.8 và hình 4.9) trong đó có 11 band đa hình chiếm tỷ lệ 84,6% và 2 band đồng hình chiếm tỷ lệ 15,4% (kích thước khoảng 580 bp và 850 bp), kích cỡ của các band khoảng từ 280 bp – 1900 bp (hình 4.8). Band đồng hình có mặt trong tất cả các mẫu còn band đa hình có ở mẫu này nhưng không có ở mẫu kia. Các band đa hình là cơ sở phân biệt giữa các mẫu có tính trạng khác nhau từ đó làm nền tảng để phân chia và xác định giống. Có band đa hình chỉ xuất hiện ở một vài mẫu như các band có kích thước khoảng 280 bp, 700 bp, 1100 bp, 1550 bp (hình 4.6, 4.8 và 4.9) 42 Hình 4.5: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu đƣợc từ huyện Ninh Phƣớc và Ninh Hải Từ sản phẩm RAPD – PCR cho thấy chất lượng DNA mẫu ít ảnh hưởng đến kết quả RAPD – PCR. Trong một vài trường hợp chúng tôi thấy sản phẩm RAPD – PCR có vệt và các band không rõ, nguyên nhân có thể do điều kiện PCR chưa phù hợp hoặc do DNA mẫu gãy quá nhiều. NP1 NP2 NP3 NP4 NP5 Ladder NP6 NP7 NP 8 NP9 NP10 NH19 NH11 NH 12 NH13 NH14 NH15 Ladder NH16 NH17 NH18 BA48 BA49 BA50 600 bp 1750 bp 1500 bp 100 bp 580 bp 850 bp band đồng hình 1100 bp 43 Hình 4.6: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu đƣợc từ huyện Ninh Hải và Bác Ái Hai band đồng hình có kích thước (khoảng) 580 bp và 850 bp cho band rất rõ, trong khi các band 280 bp, 1200 bp và 1550 bp (hình 4.8)…còn mờ. Chúng tôi đã tiến hành thay đổi điều kiện PCR nhưng các band mờ chỉ rõ hơn ở một mức độ nhất định. Để band mờ rõ hơn thì có thể phải thay đổi nhiều yếu tố trong phản ứng PCR và có thể kết quả cũng sẽ mất đi một vài band đã có. Trong điều kiện khóa luận chúng tôi chưa khảo sát sâu vấn đề này nên kết quả thu được còn vài band chưa rõ nếu nhìn bằng mắt. Tuy nhiên nếu sử dụng chức năng detecband trong máy Geldoc thì các band này vẫn được nhận diện rõ ràng. Hình 4.7: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu đƣợc từ huyện Ninh Hải Qua hình 4.5, 4.6 và 4.7 chúng tôi thấy các mẫu NH14, NH19 và NH28 không xuất hiện band nguyên nhân có thể là do thao tác trong quá trình chạy PCR hoặc do primer 11 không phù hợp với các mẫu này. Do đó nên thực hiện lại phản ứng RAPD – PCR đối với các mẫu NH14, NH19 và NH28 để có kết luận chính xác hơn. NH20 NH21 NH22 NH23 NH24 NH25Ladder NH26 NH27 NH28 NH29 NH30 band đa hình 44 Hình 4.8: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu đƣợc từ huyện Ninh Sơn Sử dụng 5 primer trong kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa hình của các giống tằm dâu (Nguyễn Thị Thanh Bình, 2005) thì trung bình mỗi primer cho 13,4 band, với primer 11, Samal và ctv (2003) đã chạy RAPD thu được 11 band trong đó có 9 band đa hình và 2 band đồng hình. Ở một nghiên cứu khác Sunil Archak và ctv (2003) đã chạy RAPD trên cây điều với 5 primer thu được 56 band, trung bình 11,2 band trên mỗi primer. Điều này cho thấy primer 11 có tính đa hình cao và khá ổn định. Trong các mẫu đã nghiên cứu có 37 mẫu xuất hiện band 750 bp chiếm tỷ lệ 78,72% số mẫu khảo sát. Tuy nhiên band 750 bp lại xuất hiện không đồng nhất, giữa các mẫu còn có sự chênh lệch. Điều này có thể do bản chất trọng lượng phân tử của band nhưng cũng có thể do quá trình điện di làm sai lệch các band (điện di không thẳng). Band 750 bp có thể là band đặc biệt dùng để phân biệt giữa các giống. Do đó nên tách band này để giải trình tự nhằm giải đáp cho sự chênh lệch và phục vụ cho công tác phân biệt và chọn giống. NS31 NS32 NS33 NS34 NS35 NS36 Ladder NS37 NS38 NS39 NS40 NS41 280 bp 1900 bp 1550 bp 1200 bp 750 bp 45 Hình 4.9: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu đƣợc từ huyện Bác Ái Hình 4.10: Xác định các band dƣới dạng peak trong máy Geldoc. Từ kết quả thu được trên gel điện di chúng tôi mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1 (xem chi tiết ở bảng 4.3 phần phụ lục II) để phân tích mối tương quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu bằng phần mềm NTSYS phiên bản 2.1. Chúng tôi chọn 7 mẫu đại diện với các đặc điểm: Giữa các mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp nhất (NS32 với BA47 là 0.38) và cao nhất (NP2 với BA46 là 1,00) trong tổng số 47 mẫu nghiên cứu (3 mẫu NH14, NH19 và NH28 không phân tích) và 4 mẫu NP10, NH12, NS40, BA46 dùng trong kỹ thuật AFLP để phân tích hệ số đồng dạng di truyền. Ladder BA42 BA43 BA44 BA45 BA46 BA47 700 bp 750 bp 46 Bảng 4.1: Hệ số đồng dạng di truyền của 7 mẫu đại diện trong kỹ thuật RAPD Mẫu NP2 NP10 NH12 NS32 NS40 BA46 BA47 NP2 1.000000 NP10 0.692307 1.000000 NH12 0.769230 0.615384 1.000000 NS32 0.538461 0.692307 0.769230 1.000000 NS40 0.769230 0.615384 0.846153 0.615384 1.000000 BA46 1.000000 0.692307 0.769230 0.538461 0.769230 1.000000 BA47 0.846153 0.538461 0.615384 0.384615 0.615384 0.846153 1.000000 Bảng 4.1 là kết quả phân tích hệ số đồng dạng di truyền trên 7 mẫu đại diện cho thấy hệ số này biến thiên từ 0,38 đến 1,00. Như vậy các mẫu phân tích có quan hệ di truyền khá xa nhau. Tuy nhiên kết luận này còn phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp. Nếu các mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp chiếm một tỷ lệ lớn thì các mẫu phân tích có quan hệ di truyền xa nhau. Ngược lại nếu chỉ một vài mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp thì không kết luận được. Trên cơ sở bảng hệ số đồng dạng di truyền, chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại đối với 24 mẫu điều mà tại Ninh Thuận thường được người trồng điều xếp vào nhóm điều Việt Nam. 47 Coefficient 0.65 0.74 0.82 0.91 1.00 NP10 NP1 NP7 NH11 BA48 BA49 NP5 NS34 BA42 NP9 NH20 NH21 NH23 NH30 NS41 NH22 NS38 NP10 NH15 NH17 NS36 NH25 BA45 BA46 BA47 Hình 4.11: Cây phát sinh chủng loại của 24 mẫu thuộc nhóm điều Việt Nam tại tỉnh Ninh Thuận Qua hình 4.11 cho thấy hệ số đồng dạng di truyền của các mẫu thuộc nhóm điều Việt Nam biến thiên từ 0,65 đến 1,00. Có quan hệ di truyền tương đối gần nhau nhưng cây phát sinh chủng loại có rất nhiều nhánh cho thấy nhóm điều Việt Nam có sự phân ly rất phức tạp. Đây có thể là kết quả của việc phát triển trồng mới tự phát, hạt giống là tổ hợp của sự giao phấn ngẫu nhiên của các cá thể cha mẹ khác nhau. Similarity Coefficient 48 Coefficient 0.69 0.77 0.84 0.92 1.00 NH12 NP2 BA44 NS31 NP4 NH27 NP6 NH26 NP8 NH12 NH18 NS39 NS32 NS35 NP3 NH13 BA50 NS40 BA43 Hình 4.12: Cây phát sinh chủng loại của 18 mẫu thuộc nhóm điều Ấn Độ tại tỉnh Ninh Thuận Qua hình 4.12 cho thấy hệ số đồng dạng di truyền của các mẫu thuộc nhóm điều Ấn Độ biến thiên từ 0,69 đến 1,00. Có quan hệ di truyền gần hơn nhóm điều Việt Nam Similarity Coefficient 49 và cây phát sinh chủng loại cũng có rất nhiều nhánh, cho thấy nhóm điều Ấn Độ cũng xảy ra tình trạng tương tự như nhóm điều Việt Nam. Coefficient 0.68 0.76 0.84 0.92 1.00 NH11 NP3 BA50 NP4 NP7 NH11 NP8 NS37 NS32 NS35 BA44 BA46 Hình 4.13: Cây phát sinh chủng loại của 11 mẫu có tính trạng hạt to và năng suất cao tại tỉnh Ninh Thuận Qua hình 4.13 chúng tôi nhận thấy mặc dù các mẫu có cùng tính trạng hạt to và năng suất cao nhưng về kiểu gene lại có sự khác nhau tương đối xa. Các mẫu có tính trạng hạt to và năng suất cao chủ yếu thuộc nhóm điều Ấn Độ. Mẫu BA46 thuộc nhóm điều Việt Việt Nam Ấn Độ Việt Nam Ấn Độ Similarity Coefficient 50 Nam nhưng lại có kiểu gene khá gần với mẫu BA44 điều Ấn Độ. Như vậy BA46 có thể là cây lai giữa điều Việt Nam và điều Ấn Độ 51 Coefficient 0.66 0.75 0.83 0.92 1.00 NP10 NP1 NP6 NP7 NH11 NP4 NH27 NP5 BA48 BA49 NH26 NP8 NP9 NH12 NH18 NH24 NH20 NH21 NH23 NH22 NS40 NS37 NS39 NS38 NS31 BA42 NS32 NS34 NS35 NH29 NH30 NS33 NS41 BA43 NH16 NP3 NH13 NS36 NH15 NH17 BA50 NP10 NP2 BA46 BA44 NH25 BA45 BA47 Hình 4.14: Cây phát sinh chủng loại của 47 mẫu điều tại tỉnh Ninh Thuận X Y A B BII BI Similarity Coefficient 52 Để đánh giá tổng quát quần thể điều toàn tỉnh, chúng tôi đã tiến hành lập cây phát sinh chủng loại thể hiện quan hệ di truyền giữa 47 mẫu điều nghiên cứu (hình 4.14). Kết quả cho thấy các mẫu chia thành hai nhóm lớn (X và Y) có hệ số đồng dạng di truyền là 0,66. Trong 47 mẫu phân tích nhóm X chỉ có 6 mẫu, do đó có thể phân biệt 6 mẫu này với các mẫu còn lại. Trong nhóm X mẫu NP2 và BA4 có hệ số đồng dạng di truyền 0,93 và cùng có hệ số đồng dạng di truyền với NH5 khoảng 0,87. Điều này cho thấy các mẫu này có quan hệ di truyền rất gần nhau và khá xa với các mẫu khác. 6 mẫu nhóm X được phân bố trên cả 3 huyện Ninh Phước, Ninh Hải và Bác Ái của tỉnh Ninh Thuận. Nhóm Y lại chia thành hai nhóm A và B có hệ số đồng dạng di truyền khoảng 0,68. Nhóm B chia làm 2 nhóm nhỏ BI và BII. Nhóm BII chỉ có một mẫu NP10, trên thực tế mẫu này có tính trạng đặc biệt là cây rất ít trái, tuy nhiên về mặt kiểu gene lại không có những band khác lạ. Nhóm BI gồm 6 mẫu NP3, NH13, NS36, NH15, NH17 và BA50 có hệ số đồng dạng di truyền dao động từ 0,86 đến 1,00. Có thể nhóm BI là một giống và được phân bố đều ở 4 huyện Ninh Phước, Ninh Hải, Ninh Sơn và Bác Ái. Nhóm A chia thành rất nhiều nhóm nhỏ, các mẫu trong nhóm này phân bố đều khắp tỉnh Ninh Thuận. Có thể nhóm này chỉ gồm một vài giống nhưng có sự lai hỗn tạp giữa các cá thể trong vườn, dẫn đến các cây lai có sự khác nhau ở một vài band trên gel điện di. Đặc biệt là mẫu NH16 có kiểu gene rất khác với các mẫu trong nhóm, band 1100 bp chỉ xuất hiện ở mẫu NH16 và BA47, nhưng ở mẫu NH16 band này rất sáng trong khi mẫu BA47 rất mờ. Band 1100 bp là một band đặc biệt, có thể là marker của một tính trạng nào đó nhưng trong giới hạn khóa luận này chúng tôi chưa xác định rõ. Để tìm hiểu sâu hơn, nên tách band này ra giải trình tự DNA nhằm phục vụ cho việc nhận định: xem đây có phải là một marker của tính trạng nào không? Qua cây phát sinh chủng loại ở hình 4.14 cho thấy hệ số đồng dạng di truyền giữa các mẫu phân tích biến thiên từ 0,66 đến 1,00. Điều này chứng tỏ các mẫu có đặc điểm di truyền tương đối gần nhau nhưng cây phát sinh chủng loại có rất nhiều nhánh cho thấy quần thể điều hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận có nguồn gene rất phong phú. Mẫu số 47 có kiểu gene khá xa với các mẫu còn lại và trên thực tế mẫu này có tính trạng đặc biệt là khi chín trái màu xanh. Các mẫu NP2, NH25, BA44, BA45 và BA46 có 53 kiểu gene khá gần nhau và khác xa với các mẫu khác nhưng trên thực tế mẫu NH25 lại có tính trạng đối lập với các mẫu NP2, BA44 và BA46. Các mẫu NH16, NH17 và NS34 có những tính trạng gần nhau (một năm 2, 3 đợt trái) nhưng kiểu gene lại khá xa nhau. Tuy nhiên cũng có các mẫu có kiểu hình giống nhau và kiểu gene cũng gần nhau như mẫu NP8, NP9, NH12, NH18 và NH24; mẫu NP4 và NH27; mẫu NP3, NH13 và NS36... Kết quả trên cho thấy tính đa hình của quần thể điều tại tỉnh Ninh Thuận đối với primer 11 và tính trạng kiểu hình thực tế có sự khác biệt rất lớn, cần phải nghiên cứu kỹ về chỉ thị DNA để có cơ sở chọn giống phù hợp và hiệu quả. 4.3.5. Một vài điểm lƣu ý khi thực hiện kỹ thuật RAPD  Không dùng giấy dán vào thành eppendorf để đánh dấu mẫu khi chạy RAPD - PCR  RAPD – PCR rất nhạy cảm với các thành phần hóa chất, chỉ cần thay đổi 1 yếu tố thì sản phẩm thu được sẽ khác nhau. Do đó cần kiểm tra lại toàn bộ quy trình khi có sự thay đổi về một yếu tố nào đó  Khi thay đổi về nhiệt độ bắt cặp của primer thì thường biến thiên 20 C, thay đổi 10 C ít có sự khác biệt  Máy PCR khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau. Khi gặp trở ngại về việc điện di thì nguyên nhân có thể do:  Kỹ thuật đổ gel: Agarose chưa tan đều hoặc do agarose quá nguội khi đổ.  Điện trường của máy điện di: Do điện thế không ổn định hoặc điện cực bị cong.v.v.  Dung dịch điện di: Cần thay dung dịch điện di khác. 4.4. Kết quả bƣớc đầu của việc sử dụng kỹ thuật AFLP trong nghiên cứu tính đa hình của một số mẫu Chúng tôi thực hiện kỹ thuật AFLP đối với 12 tổ hợp primer chọn lọc trên 4 mẫu NP10, NH12, NS40 và BA46 54 Bảng 4.2:Kết quả các cặp tổ hợp primer chọn lọc dùng trong AFLP Tổ hợp Primer MseI Primer EcoRI Màu huỳnh quang Số band 1 MseI-CAA EcoRI-ACT xanh dương 16 2 MseI-CAA EcoRI-AAC vàng 1 3 MseI-CAA EcoRI-AGG xanh lá cây 19 4 MseI-CAA EcoRI-ACC xanh dương 2 5 MseI-CAA EcoRI-AGC vàng 4 6 MseI-CAA EcoRI-ACG xanh lá cây 1 7 MseI-CAG EcoRI-ACA xanh dương 5 8 MseI-CAG EcoRI-AGC vàng 6 9 MseI-CAG EcoRI- AAG xanh lá cây 4 10 MseI-CAG EcoRI-AGT xanh dương 3 11 MseI-CAG EcoRI-AAC vàng 3 12 MseI-CAG EcoRI-AGG xanh lá cây 2 4.4.1. Kết quả phản ứng cắt và gắn Hình 4.15: Sản phẩm phản ứng cắt và gắn (ĐC: Đối chứng) Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng cắt và gắn cho thấy DNA bị cắt thành rất nhiều đoạn nhỏ trải dài trên gel điện di. Phản ứng được thực hiện khá thành công, DNA được cắt hoàn toàn. NP10 NH12 NS40 BA46 ĐC 55 4.4.2. Kết quả khuếch đại tiền chọn lọc Hình 4.16: Sản phẩm PCR tiền chọn lọc (ĐC: Đối chứng) Qua hình 4.16 cho thấy kết quả PCR tiền chọn lọc chưa tốt lắm. Lượng sản phẩm tạo thành còn ít nên kết quả điện di còn mờ và chưa thấy dấu hiệu phân chia các band. Tuy nhiên với kết quả này có thể thực hiện tiếp giai đoạn PCR với các tổ hợp primer chọn lọc. 4.4.3. Kết quả khuếch đại chọn lọc Sau khi điện di sản phẩm PCR khuếch đại chọn lọc trên máy giải trình tự DNA, chúng tôi nhận thấy 2 cặp tổ hợp primer 1 và 3 là cho kết quả tốt nhất. Cặp primer 1 cho 16 band và cặp primer 3 cho 19 band, tuy nhiên cặp primer 1 cho band ở cả 4 mẫu trong khi cặp primer 3 chỉ cho các band ở mẫu BA46, NS40 và NH12. 2 cặp primer này có thể được dùng để chạy AFLP trong việc đánh giá đa dạng quần thể điều. Hình 4.17: Các band thể hiện dƣới dạng peak trong kết quả điện di trên máy giải trình tự DNA Trong 12 cặp primer chọn lọc được sử dụng có 6 cặp dùng primer MseI-CAA và 6 cặp dùng primer MseI-CAG. Vậy sự khác biệt của kết quả là dựa vào primer EcoRI-AXX. Ở đây kết NP10 NH12 NS40 BA46 ĐC 56 quả thu được chỉ có 35 band (số band của tổ hợp primer 1 và 3) và mẫu NP10 chỉ có 4 band, mẫu NH12 có 6 band. Điều này cho thấy việc sử dụng tổ hợp primer EcoRI-AXX thu được thông tin quá ít, có thể chưa đủ số liệu để đánh giá chính xác mối quan hệ của các mẫu nghiên cứu. Để thu được lượng thông tin nhiều hơn nên khảo sát thêm các tổ hợp primer EcoRI-AX. Sau khi điện di sản phẩm PCR chọn lọc trên máy giải trình tự DNA, kết quả được đưa qua phần mềm NTSYS để sử lý số liệu (mã hóa số liệu được trình bày ở bảng 4.4 phần phụ lục II) Bảng 4.3: Hệ số đồng dạng di truyền của 4 mẫu điều trong kỹ thuật AFLP Tên Mẫu NP10 NH12 NS40 BA46 NP10 1.0000000 NH12 0.6774194 1.0000000 NS40 0.4193548 0.2258065 1.0000000 BA46 0.5161290 0.1935484 0.5806452 1.0000000 Qua bảng 4.3 chúng tôi thấy hệ số đồng dạng di truyền biến thiên từ 0,19 đến 0,67, các mẫu này có quan hệ di truyền rất xa nhau, so với bảng 4.1 hệ số đồng dạng di truyền của các mẫu khác nhau. Điều này nói lên mức độ tin cậy giữa 2 kỹ thuật. Tuy nhiên vì kỹ thuật AFLP chỉ thực hiện trên 4 mẫu và chỉ ở mức độ khảo sát 12 cặp tổ hợp primer nên chưa thể đưa ra kết luận để so sánh và đánh giá các mẫu. Coefficient 0.34 0.42 0.51 0.59 0.68 NP10 NP10 NH12 NS40 BA46 Hình 4.18: Cây phát sinh chủng loại của 4 mẫu trong kỹ thuật AFLP Qua hình 4.18 chúng tôi thấy mẫu NP10 và NH12 có hệ số đồng dạng di truyền khoảng 0,68 gần giống với kỹ thuật RAPD (0,61). Mẫu NS40 và BA46 có quan hệ di truyền giống nhau khoảng 58% trong khi kỹ thuật RAPD là 76%. Điều này cho thấy độ tin cậy của 2 kỹ thuật có một sự chênh lệch nhất định. Similarity Coefficient 57 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận Từ các kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:  Quy trình tách chiết DNA của lá điều khá ổn định. Ly trích được 50 mẫu (trên tổng số 55 mẫu) đạt DNA tiêu chuẩn dùng trong các kỹ thuật sinh học phân tử  Quy trình RAPD – PCR tốt nhất là quy trình ở nghiệm thức 2 của thí nghiệm 3 (Bảng 3.5 trang 31).  Primer 11 dùng trong kỹ thuật RAPD – PCR cho 13 band đối với các mẫu thí nghiệm, trong đó có 2 band đồng hình và 11 band đa hình. Primer 11 có tính đa hình cao đối với quần thể điều.  Với việc phân tích RAPD sử dụng primer 11 thì quần thể điều hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận có hệ số đồng dạng di truyền trên cây phát sinh chủng loại dao động trong khoảng 0,65 – 1,00.  Cây phát sinh chủng loại có rất nhiều nhánh chứng tỏ quần thể điều ở tỉnh Ninh Thuận có sự tạp giao rất phức tạp.  Quy trình kỹ thuật AFLP ổn định, 2 tổ hợp primer MseI-CAA với EcoRI-ACT và MseI-CAA với EcoRI-AGG cho tính đa hình cao, có thể được dùng để đánh giá tính đa dạng của quần thể điều. 5.2. Đề nghị  Tối ưu quy trình ly trích DNA đối với lá điều non bằng cách cho thêm 10% CTAB vào bước 3, tiếp theo cho dung dịch kết tủa vào, sau đó cho dung dịch NaCl – TE.  Khảo sát thêm các primer khác dùng trong kỹ thuật RAPD  Tách riêng các band 750 bp và 1100 bp khi chạy RAPD với primer 11 để giải trình tự nhằm giải đáp cho sự chênh lệch giữa các mẫu và phục vụ cho công tác phân biệt và chọn giống.  Thực hiện kỹ thuật AFLP đối với các tổ hợp primer chọn lọc khác và trên các tổ hợp primer chọn lọc MseI-CXX với EcoRI-AX. 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nƣớc: 1. Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng, Nông Văn Hải, 2005. Nghiên cứu đa hình một số giống tằm dâu bằng kỹ thuật RAPD. Tạp chí di truyền học và ứng dụng 2. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,1999. Di truyền phân tử: những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. 275 trang 3. Hoàng Chương và Cao Vĩnh Hải,1999. Kỹ thuật trồng điều. Nhà xuất bản nông nghiệp TP Hồ Chí Minh.Trang 3; 12-14; 21-26; 34-39 4. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 24-30; 122-124. 5. Đỗ Thị Hòa, 2005. Bước đầu điều tra hiện trạng canh tác và xây dựng ngân hàng di truyền invitro các giống điều ở một số huyện trồng điều chính ở Tỉnh Bình Dương. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học - Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 6. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản giáo dục TP Hồ Chí Minh. 612 trang. 7. Nguyễn Thị Huyền, 2005. Bước đầu xây dựng ngân hàng gen trên cây điều ở một số huyện của tỉnh Đồng Nai. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học - Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 8. Hoàng Thị Liễu, 2004. Phân tích mức độ đa dạng di truyền và xây dựng phương pháp nhận diện một số giống cacao trên cơ sở kỹ thuật PCR. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học - Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 9. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 221 trang. 10. Phạm Đình Thanh, 2003. Hạt điều: sản xuất và chế biến. Nhà xuất bản nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. Trang 9-12; 28-36. 11. Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản viện khoa hoc và công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội. 12. Lê Duy Thành, 2001. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 159 trang. 59 13. Nguyễn Văn Uyển, 1996. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật - tập II. Nhà xuất bản nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. trang 56. Tài liệu nƣớc ngoài: 14. Kazutoshi Okuno and shuichi Fukuoka, 1998. Manual for DNA extraction in plants. Japan international cooperation agency. 15. Sunil Archak, Ambika B. Gaikwad, Diksha Gautam, E.V.V.B. Rao, K.R.M. Swamy and J.L. Karihaloo, 2003. DNA fingerprinting of Indian cashew (Anacardium occidentale L.) varieties using RAPD and ISSR techniques. Euphytica 230: p. 397 - 404 16. Samal. S, Rout G.R., Lenka P.C., 2003. Analysis of genetic relationships between populations of cashew (Anacardium occidentale L.) by using morphological characterisation and RAPD markers. Plant soil environ 49: p. 176 - 182 17. 18. http: //www.biotech.ufl.edu/WorkshopsCourses/ Word_files/AFLP%20Workshop%20Manual.doc 19. http: //www.weihenstephan.de/pbpz/bambara/html/rapd.htm