Khóa luận Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh bình định bằng kỹ thuật RAPD

tính chất này giải thích được cấu trúc chặt chẽ của phân tử DNA, đặc biệt là cách thức tự sao chép để tạo ra hai phân tử con từ một phân tử mẹ. 2.6.2. Phƣơng pháp chiết tách DNA. Phương pháp chiết tách DNA cơ bản gồm ba bước - Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân. Thông thường người ta nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, Sarcosyl) và proteinase (Proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. - Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch chloroform và phenol, dung dịch phenol chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol chloroform. Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại. 22 - Bước 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhưng thông thường người ta dùng isopropanol. Nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. 2.6.3. Các chỉ thị dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền. Nguồn gốc tính đa dạng sinh học ở thực vật nói riêng và ở sinh vật nói chung nằm ở thứ tự các bộ ba trên phân tử DNA làm nên bộ máy di truyền của chúng. Hiếm có các cá thể trong cùng một loài hoặc cùng một giống có thứ tự các bộ ba trên DNA trong bộ gene giống hệt nhau. Việc xác định tính đa dạng sinh học cực kì quan trọng trong chọn giống vì các vật liệu di truyền dùng để lai tạo thường được đòi hỏi có tính đa dạng càng lớn càng tốt. Công nghệ Sinh học thực vật đã phát triển nhiều phương pháp mới, nhạy và chính xác để xác định và sử dụng tính đa dạng ở sinh vật. Để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các cá thể, quần thể về căn bản người ta thường dựa trên các DNA marker. DNA marker có thể được chia làm ba loại chỉ thị thường sử dụng: - Chỉ thị hình thái: Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể phát hiện được. Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lượng chỉ thị ít do không phải tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện được, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp. - Chỉ thị allozyme. Là những chỉ thị protein. Mỗi protein là sản phẩm biểu hiện của một hay một vài gene, do vậy người ta dựa vào điều này để tìm ra những chỉ thị. Dựa vào hàng loạt những enzyme giống nhau được mã hóa bởi những allen khác nhau nằm cùng trên một locus. Do sự khác nhau về điện tích của aminoacid, allozyme có thể được phân tách bằng điện di. Nhiều enzyme bất biến trong quần thể và hầu hết sự đa hình của những enzyme này chỉ do một vài biến đổi nhỏ. Kết quả mà chỉ thị allozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do có số lượng chỉ 23 thị có thể phát hiện được nhiều hơn, tuy nhiên số lượng chỉ thị cũng vẫn ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng. -Chỉ thị phân tử :phân tích sự khác nhau các cá thể ở mức độ phân tử (DNA, protein) SSCP, SSR, RAPD, AFLP… Các phương pháp nghiên cứu tính đa dạng di truyền ở mức độ phân tử này đều sử dụng sản phẩm DNA đã được chiết tách và tinh sạch. 2.6.3.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Là phương pháp dùng để so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn. Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài giống nhau hoàn toàn thì sau khi cắt DNA bằng enzyme giới hạn cùng loại sẽ thấy các band DNA hoàn toàn giống nhau về số lượng và kích thước. Ngược lại nếu có sự khác nhau về trình tự DNA (khác giống hoặc do đột biến) thì sẽ có sự khác nhau về các band DNA. Phương pháp tiến hành: DNA sau khi tách chiết được phân cắt bằng một enzyme nhất định, rồi chạy điện di, lúc này các đoạn DNA tách riêng ra với nhau tùy theo kích thước của nó chạy trên gel agarose, và tình trạng mở dây đơn (denature). Những đoạn DNA này được chuyển từ gel sang một thể rắn (tấm lọc nitrocellulose hoặc màng lọc bằng nylon), nơi nó bị cố định. Sau giai đoạn trước khi lai DNA, người ta cố định các vị trí trên màng nơi quá trình lai DNA sẽ xảy ra, các DNA (gene liên kết với marker) sẽ gắn với nucleic acid thăm dò (probe, hay RFLP marker) được đánh dấu bằng phóng xạ. Quá trình lai giữa DNA (gene) và probe như vậy được gọi là lai DNA. Sau khi lai, tấm lọc hay màng lọc được rửa để loại bỏ các probe không gắn, hoặc gắn yếu với DNA đang nghiên cứu. Tiếp sau đó, DNA lai với probe tự ghi trên biểu đồ phát xạ. Sau khi điện di, gel được chụp dưới tia cực tím. Các đoạn DNA xuất hiện thành các đốm liên tục. DNA lai với probe sẽ cho tín hiệu khi thể hiện ra trên phim X-quang. Các sọc có tính đa hình (polymorphism) có thể được quan sát để đánh giá. RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhưng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe người thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lượng và chất lượng rất cao. Do đó, người ta có xu hướng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase. 24 2.6.3.2. SSCP (Single - Strand Conformation Polymorphism). Người ta đã tìm thấy có sự chuyển dịch của đoạn DNA dạng dây đơn, ngắn, trong điều kiện chưa qua quá trình biến tính DNA thành dây đơn (denaturation). Người ta giả định rằng sự thay đổi chuỗi mã di truyền DNA là do sự thay đổi ngoại hình của dây đơn (single-strand conformation). Sự thay đổi này làm cho DNA chuyển dịch trên gel, tạo ra thể đa hình. Trong phân tích SSCP, phản ứng chuẩn PCR đã hoàn thành. Sản phẩm của PCR này lại bị mở dây đơn lần nữa và ngâm vào trong nước đá. Khi đó hiện tượng snap-back sẽ xảy ra trên cấu trúc thứ cấp. Để tránh hiện tượng đứt gãy cấu trúc thứ cấp, các mẫu phải được xử lý trong điều kiện lạnh. Nếu P32 được dùng trong PCR, thì phim chụp X-quang sẽ thể hiện vị trí của DNA trên gel. Nếu không, người ta sẽ dùng bạc để nhuộm gel. DNA khi nhuộm bằng bạc sẽ nhạy cảm gấp trăm lần nhuộm ethidium bromide. SSCP marker là công cụ rất mạnh và nhanh, nhưng nó chỉ áp dụng cho việc tìm kiếm thể đa hình của những đoạn phân tử DNA tương đối ngắn. SSCP có thể xác định tính chất dị hợp tử của những đoạn phân tử DNA (có cùng trọng lượng phân tử), và nó có thể phân biệt được sự thay đổi của một vài nucleotide nào đó. Người ta cho nó là công cụ hữu dụng trong xét nghiệm bệnh di truyền ở người. Trong thực vật, SSCP chưa được phát triển nhiều. Người ta hi vọng, SSCP marker sẽ giúp cho việc phân nhóm di truyền ở con lai trở nên dễ dàng hơn, khi chúng ta có primer thích hợp đối với tính trạng quan trọng nào đó. 2.6.3.3. Microsatellite ( SSR: Simple Sequence Repeat). SSR là các trình tự hai nucleotide ((AC)n, (AG)n, (AT)n) hoặc ba nucleotide ((TAT)n, (TCT)n, (CAG)n) lặp lại. Do vậy nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên sự khuếch đại các trình tự lặp lại trên bộ gene bằng các primer đặc hiệu có khả năng bổ sung vào hai đầu của locus microsatellite. Sản phẩm PCR là các đoạn DNA có chiều dài khác nhau do sự biến thiên về độ dài được tách ra trên gel polyacrylamid hoặc trong mao quản của máy giải trình tự DNA. Do số lần lặp lại cao của microsatellite ở các cá thể nên sự đa hình cao hơn ở các trường hợp khác như RFLP, RAPD và sự đa hình ở các cá thể khác nhau tất nhiên là khác nhau. Chiều dài các đoạn DNA qua điện di thường có kích thước 100 – 200 bp. Tuy 25 nhiên, SSR thường được phân tích trên DNA hệ gene nhỏ mang trình tự lặp lại và kích thước của chúng được nhận biết sau khi điện di trên gel. SSR được thực hiện theo bốn bước:  Tách chiết và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu.  Thực hiện phản ứng khuếch đại qua PCR với các primer đặc trưng cho các đoạn lặp đơn giản.  Điện di kết quả trên gel polyacrylamid và tính toán số liệu, xác định mức độ giống và khác nhau giữa các đoạn lặp DNA.  Xử lý số liệu bằng các phần mềm Map Marker Program, SYSTAT, NTSYSpc .v.v. lập bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại. 2.6.3.4. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). AFLP – đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc, do Vos và cộng sự phát minh 1975. Là kỹ thuật được áp dụng để phân tích tính đa dạng của sinh vật từ hàng trăm đoạn DNA giới hạn đã được khuếch đại đồng thời nhờ phản ứng PCR. Trên nguyên tắc, AFLP gồm hai nội dung cơ bản: Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn có bổ sung các adapter đặc hiệu tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trưng cho các primer đã chọn trước. Adapter là một đoạn oligonucleotide đôi, được tổng hợp nhân tạo và có trình tự tương ứng với trình tự ở đầu đoạn DNA được phân cắt bởi một loại enzyme nhất định Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR qua hai giai đoạn với hai loại primer khác nhau.  Enzyme được sử dụng Để cắt DNA của bộ gene, hai enzyme cắt hạn chế được sử dụng: MseI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 4 base EcoRI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 6 base Ba loại đoạn DNA thu nhận được là: Một loại đoạn DNA được cắt bởi EcoRI ở cả hai đầu kết thúc, một loại đoạn DNA được cắt bởi EcoRI ở một đầu kết thúc này và MseI ở đầu kết thúc khác, và một loại đoạn DNA được cắt bởi MseI ở cả hai đầu kết thúc. 26 Hình 2.1: Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI  Adapter Adapters sợi đôi chuyên biệt cho cả vị trí của EcoRI và vị trí của MseI. Sự gắn kết của adapter đối với DNA đã được cắt thay đổi vị trí cắt để ngăn chặn sự phân cắt thứ hai xảy ra sau khi đã gắn kết. Hình 2.2: Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI  Primer Có hai loại primer được sử dụng: Primer dùng trong khuếch đại tiền chọn lọc: Primer này được thiết kế tương ứng với adapter đã sử dụng, đồng thời có gắn thêm một nucleotide ở đầu 3’ để chọn lọc những đoạn DNA cần khuếch đại, cụ thể là EcoRI gắn thêm nucleotide A và MseI gắn thêm nucleotide C ở đầu 3’. Kết quả chủ yếu của việc chọn trước PCR là các đoạn DNA đó có một vị trí cắt của MseI và EcoRI, và cũng có nucleotide quan tâm. Bước khuyếch đại tiền chọn lọc sẽ làm giảm đi sự phức tạp trong việc thu nhận những đoạn DNA. EcoRI A 5’-GAC TGC GTA CCA ATT CA-3’ MseI C 5’-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3’ 27 Hình 2.3: Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP Primer dùng trong khuếch đại chọn lọc: Là các primer khuếch đại tiền chọn lọc được thêm vào từ 1 đến 2 nucleotide ở đầu 3’. Ví dụ: EcoRI A gắn thêm CT và MseI C gắn thêm AG vào đầu 3’. Kết quả là so với primer được thiết kế tương ứng với adapter thì primer khuếch đại chọn lọc có thêm ba nucleotide ở đầu 3’. Điều này giúp cho việc lựa chọn các đoạn DNA chặt chẻ hơn, giảm sự phức tạp khi đọc kết quả các đoạn DNA trên gel. Sau khi được khuếch đại PCR với các primer này, kết quả của mỗi mẫu được phân tích trên máy giải trình tự DNA. Việc chọn lựa sự khuếch đại với hai primer EcoRI và MseI là khuếch đại chủ yếu các đoạn DNA được gắn hai primer EcoRI-MseI. Các đoạn DNA EcoRI-EcoRI không được khuếch đại. Các đoạn DNA MseI-MseI không được nhận biết trong quá trình khuếch đại do không chứa chất phát huỳnh quang. Chỉ có những sợi chứa EcoRI được nhận biết. EcoRI 5’FAM-GACTGCGTACCAATTC ACT-3’ MseI 5’-GATGAGTCCTGAGTAA CAG-3’ 28 Hình 2.4: Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP Trên cơ sở đó quy trình thực hiện AFLP có thể gồm bốn bước cơ bản:  Tách chiết và tinh sạch DNA.  Cắt các mẫu DNA nghiên cứu bằng các cặp enzyme giới hạn chọn lọc có bổ sung adapter tương ứng.  Tiến hành PCR hai giai đoạn với hai loại primer đặc hiệu, primer 1 + 1 nucleotide và primer 2 + 2 nucleotide.  Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập cây phát sinh chủng loại để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu. 29 Ta có thể tóm tắt kỹ thuật AFLP như sau: Hình 2.5: Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP Kỹ thuật AFLP có các ưu điểm:  Lượng DNA cần cho phản ứng rất ít  Cho kết quả nhanh, ổn định và các lần lặp lại có độ tin cậy cao do kỹ thuật AFLP có các điều kiện nghiêm ngặt của phản ứng PCR.  Kỹ thuật AFLP thực hiện trên nhiều đối tượng sinh vật khác nhau.  Không cần biết trật tự nucleotide của hệ gene. AFLP được ứng dụng trong việc xây dựng bản đồ gene thực vật bao gồm:  Thiết lặp nhóm gene liên kết nhau trong một thể nhiễm sắc trong quá trình cho tạp giao  Làm bão hòa các vùng có gene lạ đưa vào  Ước lượng mức độ có quan hệ giữa các giống. 2.6.3.5. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Là phương pháp xác định sự đa hình về kích thước các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình 30 mà không cần biết trước thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn, dãy mã được thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thước khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thước khác nhau này được nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể được dùng như những marker để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD được xem như một phương pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã được thương mại hóa trên thị trường và các primer cũng rất dễ được tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. 3’ 1 2 3 5’ DNA mẫu 5’ 4 5 6 3’ Hình 2.6: Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR Ghi chú: - Các mũi tên biểu thị cho các primer (các primer có trình tự giống nhau, khoảng 10 nucleotide); các số 1, 2, 3, 4, 5, 6 tượng trưng cho các vị trí trên DNA mẫu mà primer gắn vào; các primer bắt cặp vào các vị trí 1, 2, 3 trên mạch đơn DNA mẫu 3’- 5’, các primer bắt cặp vào các vị trí 4, 5, 6 trên mạch đơn DNA mẫu 5’ - 3’. Trong trường hợp này, có 2 sản phẩm PCR được tạo thành: - Sản phẩm A: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 2 và 5. - Sản phẩm B: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 3 và 6. Sản phẩm B Sản phẩm A 31 - Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4 do hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại. - Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và 5, do các primer không có chiều hướng vào nhau. Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước cơ bản:  Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR  Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid  Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. PCR (Polymerase Chain Reaction). Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase do K. B. Mullis phát minh ra năm 1985. Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban đầu rất nhỏ. Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, chẩn đoán, di truyền quần thể và phân tích pháp y. Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme để nhân bản một đoạn DNA nhờ 1 cặp primer (oligonucleotide) tương hợp với hai đầu 3’ ở cả hai mạch của đoạn DNA đích (target sequence). Các oligonucleotide được dùng làm primer này cho phép DNA mẫu được nhân bản nhờ sự xúc tác của DNA - polymerase. Quá trình này gồm 3 giai đoạn:  Biến tính: Hai mạch của chuỗi xoắn kép được tách ra nhờ nhiệt độ cao (94 - 96 0 C)  Bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer liên kết vào các mạch của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung (nhiệt độ này phụ thuộc vào primer nhưng thường là 50 - 560 C)  Kéo dài: Kéo dài dây mới nhờ primer dưới sự thực hiện của DNA - polymerase (72 0 C). 32 Đó là một chu trình PCR. Do các sản phẩm mới được tổng hợp ra lại được dùng làm khuôn cho một primer khác, nên sau mỗi chu kỳ số bản sao của DNA đích lại được tăng lên gấp đôi so với chu kỳ ngay trước đó. Chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên được lặp lại nhiều lần (thường là 30 - 40 chu kỳ) sẽ dẫn đến việc nhân bản đoạn DNA đích đến hàng triệu phiên bản trong vài giờ đồng hồ. Ban đầu, khi chưa sử dụng loại enzyme Taq - polymerase người ta phải thêm DNA - polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA - polymerase cần cho quá trình tổng hợp DNA không chịu được nhiệt độ lớn hơn 900 C ở giai đoạn tách hai sợi của phân tử DNA. Sau này khi tìm được loại Taq - polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus - loại vi khuẩn sống ở suối nước nóng - một loại enzyme chịu nhiệt, thì chỉ cần cho một lần Taq - polymerase là đủ. Để cho các primer dễ dàng liên kết vào đoạn tương hợp trên DNA đích người ta thường tạo ra một số thay đổi ở primer. Chẳng hạn như gắn thêm điểm tiếp nhận enzyme giới hạn vào đầu 5’ của mỗi primer, hay việc làm thay đổi vùng xung quanh codon khởi đầu có thể làm tăng hiệu quả dịch mã ở sinh vật Eukaryote được chuyển gen… Một phản ứng PCR có sự tham gia của các thành phần: Taq buffer, MgCl2, dNTP, Primer, Taq DNA polymerase, DNA khuôn mẫu và H2O. Để phản ứng PCR thành công thì các thành phần này phải có một sự kết hợp hài hoà với nhau về nồng độ. Có thể tóm tắt quá trình PCR như sau: 33 (Andy Vierstraete, 1999) Hình 2.7: Cơ chế của phản ứng PCR Tuy nhiên trong thực tế khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR thường gặp phải một số vấn đề:  Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số band trên bảng gel điện di. Vì vậy nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng.  PCR buffer thường được cung cấp theo Taq - polymerase và có thể có hoặc không có Mg2+. Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau.  Taq - polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn. Vì vậy, loại Taq - polymerase và nồng độ của Taq đòi hỏi phải chính xác và được xác định qua thực nghiệm. 34  Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf. Vài trò của các thành phần trong phản ứng PCR.  Nồng độ các chất trong hỗn hợp PCR: Nồng độ enzyme: thường sử dụng ở nồng độ 0,1 – 0,5 U/25 μl dung dịch phản ứng. Nếu như nồng độ enzyme Taq polymerase quá cao có thể làm phát sinh những sản phẩm không đặc hiệu, còn nếu nồng độ enzyme Taq polymerase quá thấp thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không có đủ enzyme. Các dNTPs: Hàm lượng các dNTPs trong khoảng 20 – 200 μM cho kết quả ổn định và đặc hiệu. Bốn loại dNTPs (A, T, G, C) phải có nồng độ gần tương đương nhau. Hàm lượng MgCl2: Nồng độ tối ưu của MgCl2 cho kết quả PCR tốt. Ion Mg + có thể ảnh hưởng đến: - Nhiệt độ để biến tính mạch đôi thành mạch đơn. - Quá trình bắt cặp của primer: MgCl2 làm tăng khả năng bắt cặp chính xác của primer với DNA template. - Sự đặc hiệu của sản phẩm PCR: bao gồm cả sự bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn và sự nối dài chính xác. - Hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Thông thường hàm lượng ion Mg+ cần thiết từ 0,5 – 2.5 mM. Hiện trong nước đã áp phương pháp RAPD-PCR để nghiên cứu đa dạng di truyền như. Đánh giá đa dạng di truyền xuất xứ lim xanh bằng chỉ thị RAPD và AND lục lạp (Nông nghiệp và PTNT, 2005, 15, 80-8) của Nguyễn Hoàng Nghĩa và CS Sử dụng phương pháp RAPD để xác định nguồn gốc giống dứa Cayenne và xây dựng biện pháp phòng trừ một số sâu bệnh hại quan trọng trên cây dứa của TS. Lê Đình Đôn, KS. Huỳnh Văn Quang - Bộ môn Bảo vệ thực vật - ĐH Nông lâm. 2004 Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD-PCR để đánh giá tính đa dạng di truyền ở một số loài cây dược liệu bản địa ở Việt Nam”. ThS. Hoàng Thị Hoà, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN.v.v. 35 Hình 2.8 Sơ đồ tóm tắt quy trình RAPD-PCR 5 ` 5 ` 5* 5* 3 ` 3 ` 3 ` 3 ` Primer ngẫu nhiên Thực hiện PCR với những primer ngẫu nhiên Sau phả n ứkết quả PCR, phát hiện band đem điện di 36 CHƢƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm. 3.1.1. Thời gian.  Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2006 đến tháng 6/2006. 3.1.2. Địa điểm.  Thực hiện thu thập mẫu lá điều của những cây điều đặc biệt và điển hình. Các mẫu điều được lấy tại các huyện của tỉnh Bình Định.  Mẫu được ly trích DNA, chạy RAPD tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 3.2. Phƣơng pháp chọn mẫu. Tiến hành thu thập mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật và điển hình trong vườn của những nông hộ được khảo sát theo mẫu in sẵn (xem phụ lục). Lựa chọn nông hộ để khảo sát một cách ngẫu nhiên. Những đặc điểm nổi bật được chọn chủ yếu gồm:  Năng suất: cao hay thấp.  Ra hoa: nhiều hay ít, sớm hay muộn, một đợt hay nhiều đợt, nở đồng loạt hay phân tán.  Chùm: nhiều hay ít, một chùm có nhiều hay ít hạt.  Hạt: to hay nhỏ, màu sắc hạt.  Thân và cành cây: sum suê hay thưa thớt.  Hiện tượng rụng trái non: nhiều hay ít.  Quả: to hay nhỏ, màu sắc, ngọt hay chát.  Khả năng chống chịu sâu hại: cao hay thấp. 37 3.3.Vật liệu 3.3.1. Các mẫu điều thí nghiệm.  Địa điểm lấy mẫu: Mẫu được lấy tại các nông hộ ở 3 huyện Hoài Nhơn,Hoài Ân, An Lão, của tỉnh Bình Định.  Cách chọn mẫu: Đầu tiên thu thập các thông tin về những cây điều trong vườn, sau đó chọn các mẫu có những tính trạng đặc biệt. Tùy theo thông tin thu được mà số mẫu thu nhận có thể khác nhau. Nếu vườn điều có nhiều cây đặc biệt thì có thể thu thập 3 – 5 mẫu, nếu không có cây nào đặc biệt thì có thể không lấy.  Cách lấy mẫu: Chọn những lá tươi tốt, lấy cả lá non, lá trưởng thành và lá già. Mỗi mẫu lấy khoảng 4 - 6 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tươi của lá. Đồng thời ghi đầy đủ những thông tin của cây được lấy mẫu theo phiếu điều tra có sẵn (phụ lục I)  Cách bảo quản mẫu đưa về phòng thí nghiệm: Mẫu sau khi lấy được cho vào thùng lạnh để bảo quản tạm thời. Sau đó cho vào tủ lạnh, để ẩm ở tầng mát và dùng thùng lạnh đựng mẫu vận chuyển về phòng thí nghiệm. 3.3.2Phƣơng pháp nghiên cứu. 3.3.2.1. Hóa chất thí nghiệm và kiểm tra DNA Hóa chất dùng cho tách chiết và kiểm tra DNA lá điều  Dung dịch chloroform – isoamyl alcohol (CIA) có tỉ lệ chloroform : isoamyl alcohol = 24 : 1.  RNase (10 mg/ml) – enzyme phân huỷ RNA.  Dung dịch isopropanol lạnh.  Sodiumacetate 3 M.  Ethanol 96 % và ethanol 70 %.  Agarose.  TAE (Tris – Acetate – EDTA).  Dịch tách chiết EB (Extraction buffer), pha 100 ml (bảng 3.1). 38 Bảng 3.1. Thành phần và cách pha EB. Thành phần Lượng dùng (pha trong 100 ml) CTAB(hexade- cyltrimethylammoniumbromide) EDTA 0,5 M Mercaptroethanol NaCl 5 M Tris – HCl 0,5 M Nước 2 g. 4 ml. 1 ml. 28 ml. 20 ml. Thêm cho đến 100 ml.  Dung dịch TE 1 X (Tris – HCl và ethylendiamine tetra acetate), cách pha (bảng 3.2). Bảng 3.2. Thành phần và cách pha TE 1 X. Thành phần Lượng dùng (pha trong 250 ml) Tris – HCl 1 M EDTA 0,5 M 1 ml. 0,2 ml  Loading dye.  Ethidiumbromide.  Nước cất siêu sạch khử ion. 3.3.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra định lƣợng DNA - Nước cất 2 lần khử ion (đã hấp khử trùng) - TE 1X 3.3.3. Phƣơng pháp ly trích DNA 3.3.3.1. Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)): gồm 12 bước  Bước 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Khuấy bằng vortex thật kỹ. Ủ ở 650 C trong 45 phút. 39  Bước 2: Thêm 500 μl Chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1), khuấy bằng vortex 10 phút, li tâm 5 phút 14000 vòng ở 100 C.  Bước 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bước 2.  Bước 4: Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 ul RNase, ủ ở 370 C trong 1giờ.  Bước 5: Thêm vào 250 ul dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200 C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).  Bước 6: Li tâm 5 phút 14000 vòng ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong.  Bước 7: Cho vào 300 μl TE 1X, ủ ở 370 C trong 1giờ.  Bước 8: Thêm 20 μl muối Sodium acetate 3 M, và 640 μl Ethanol 100%, trộn đều và để – 200 C trong 30 phút.  Bước 9: Li tâm 10 phút 14000 vòng ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.  Bước 10: Rửa cặn với 400 μl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14000 vòng ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.  Bước 11: Lặp lại bước 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 μl TE 1X, ủ ở 370 C trong 30 phút.  Bước 12: Bảo quản mẫu ở 40 C. 3.3.3.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di. Để định tính DNA, ta điện di các mẫu DNA đã ly trích trên gel agarose. Trong điện trường DNA di chuyển từ điện cực âm sang điện cực dương, vì DNA mang điện âm (do tính chất của nhóm phosphate). Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ sát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh, do đó DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy ta có thể phân loại được các đoạn DNA trên gel agarose. Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA được phân ra tùy theo trọng lượng phân tử. Có thể quan sát chúng bằng mắt nhờ kỹ thuật nhuộm màu với ethidium bromide và chụp gel bằng tia cực tím. Cách tiến hành:  Pha gel agarose với nồng độ 0,8%: Cân 0,1 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò Viba cho agarose tan thật đều. 40  Đổ gel, chờ agarose đông  Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye và 4 μl DNA mẫu.  Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 250 mA, thời gian khoảng 20 phút.  Nhuộm ethidium bromide khoảng 15 phút, sau đó đưa vào máy Geldoc đọc kết quả. 3.3.3.3. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế. Trên nguyên tắc, sự hấp thu ánh sáng khác nhau của các base nitơ của phân tử DNA mạch kép và mạch đơn, có thể xác định hàm lượng của DNA trong dung dịch. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Đồng thời để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch DNA thường đo giá trị OD280. Do protein có phổ hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, đồng thời hấp thụ ở bước sóng 260 nm gây nên sự sai lệch khi tính nồng độ của acid nucleic. Khi giá trị OD260/OD280 = 1,8 – 2,2 thì dịch trích DNA được coi là tinh sạch. Hàm lượng DNA được tính theo công thức: DNA (ng/ l) = [(62.9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * Độ pha loãng Cách tiến hành:  Xây dựng đường chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đường chuẩn.  Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thường pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: Hút 10 μl dung dịch DNA hòa tan với 90 μl TE 1X. Cho vào Curvette. Tiến hành đo OD.Kết quả đo OD. DNA sau khi tách chiết và kiểm tra định tính, định lượng sẽ được bảo quản ở 40 C để dùng cho việc chạy RAPD. 41 3.3.3.4 Hóa chất và quy trình chạy RAPD – PCR. Baûng 3.3: Hóa chất cho phản RAPD – PCR. TÊN NỒNG ĐỘ PCR BUFFER 250μm Taq DNA polymerase 0,5u MgCl2 200μm DNTP 120μm Primer 11 6,5pm Nước cất DNA 20ng/μl Bảng 3.4 thành phần hóa chất cho một phản ứng RAPD – PCR. HÓA CHẤT DUNG DỊCH GỐC THỂ TÍCH SỬ DỤNG NỒNG ĐỘ CUỐI PCR BUFFER 25mM 2,5μl 250 M μl Taq DNA polymerase 5u 0,1 μl 0,5u MgCl2 25mM 2 μl 200 M μl dNTP 10MM 0,3 μl 120 M μl Primer 11 10PMOL/L 0,65μl 6,5PMOL(260μm/μl) Nước 18,45μl Quy trình nhiệt RAPD - PCR Bảng 3.5: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD – PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thờigian (phút) 1 94 4 37 94 1 Ta 1 72 2 1 72 10 Hold 4 0 C 42 3.3.3.5. Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS Các band thu được từ kết quả điện di RAPD và số liệu từ AFLP được mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1. Band nào có thì chuyển thành 1, band không có chuyển thành 0. Bảng mã hóa được lưu dưới dạng file excel và chuyển sang phần mềm NTSYS phiên bản 2.1 để xử lý. 43 3.3.4. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.3.4.1.Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho tách chiết và kiểm tra DNA  Chày cối nghiền mẫu (Đức).  Cân điện tử (Ohaus, Mỹ).  Ống eppendorf 1,5 ml (Pháp).  Các loại pipette 0,5 μl – 10 μl, 10 μl – 100 μl và 100 μl – 1000 μl (Nichiryo, Nhật).  Các loại đầu tipe 0,5 μl – 10 μl, 10 μl – 100 μl và 100 μl – 1000 μl (Đức).  Bao tay (Malaysia).  Máy vi ly tâm 14.000 vòng/phút (Hettich, Đức).  Tủ sấy (Anh).  Tủ ủ mẫu (Anh).  Tủ – 20oC (Sanyo, Nhật).  Nồi hấp autoclave (Nhật).  Máy điện di (Biorad, Thụy Điển và Cosmo Bio Co, Nhật).  Máy vortex (Đức).  Tủ hút, tủ cấy vô trùng (Việt Nam / Anh).  Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad, USA).  Giếng đổ gel. 3.3.4.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật PCR – RAPD  Các loại pipette 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl.  Các loại đầu tipe 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl.  Bao tay.  Tủ hút (Việt Nam / Anh).  Tủ lạnh các loại (Nhật).  Ống eppendorf 200 μl.  Máy PCR PTC Thermocycle 100.  Giếng đổ gel.  Máy điện di (Biorad). 44  Máy chụp hình DNA Geldoc. Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng và chất lượng các band DNA trên gel điện di. Sau khi xác định quy trình tối ưu của phản ứng RAPD – PCR, tiến hành chạy RAPD với 50 mẫu và phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 2.1. 45 CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thu thập mẫu tại các vùng trồng điều thuộc tỉnh Bình Định. Chúng tôi đã tiến hành thu thập 50 mẫu điều thuộc 3 huyện của tỉnh Bình Định với các đặc điểm cơ bản về: kích thước hạt, quả; năng suất; thời gian ra hoa; số đợt trái trong năm, màu sắc hạt, quả;…Trong đó nhóm điều Việt Nam chiếm 38%, điều Ấn Độ chiếm 62% (cách phân chia nhóm điều do người trồng điều đưa ra); tính trạng hạt to chiếm 54%, hạt nhỏ và trung bình chiếm 46%; tính trạng năng suất cao chiếm 64%, năng suất thấp và trung bình chiếm 36%; các mẫu vừa có tính trạng hạt to vừa cho năng suất cao chiếm 32% và có vài mẫu mang những đặc điểm đặc biệt như: trái màu trắng, màu nâu, màu xanh, màu hồng hoa nhiều nhưng không trái; ra hoa, trái sớm…(các đặc điểm chi tiết được trình bày ở phần phụ lục II). Do cây điều ở tỉnh Bình Định được trồng theo một cách tự phát trong dân và các chương trình gây rừng, phủ xanh đồi núi trọc đồng thời giúp người dân xóa đói giảm nghèo nên về mặt giống còn nhiều hạn chế. Các giống điều chưa được phân chia rõ rệt. Theo kinh nghiệm người trồng điều chia làm hai loại: Một loại cây phân tán rộng, hoa chùm, lá non màu đỏ gọi là điều Ấn Độ; một loại cây phân tán hẹp hoặc trung bình, lá non màu xanh gọi là điều Việt Nam. Để đánh giá đa dạng di truyền Tôi đã thu thập mẫu nhiều nơi và lựa chọn những tính trạng đặc biệt vì vậy số lượng mẫu tuy ít nhưng vẫn mang tính đại diện cho việc đánh giá. Tôi tiến hành quá trình li trích DNA của 50 mẫu và thu được DNA ở cả 50 mẫu đạt tiêu chuẩn dùng cho các kỹ thuật phân tử. Việc kiểm tra kết quả li trích chỉ được thực hiện trên gel điện di. Sau khi điện di được nhuộm ethidium bromide 25 phút. Kết quả được nhân điện trên hình chụp. Qua hình chụp kết quả li trích. Tôi thấy kết qủa li trích DNA của tôi còn nhiều tạp chất và DNA gãy. Từ quá trình thực hiện Tôi đã rút ra một số nhận xét như trình bày ở phần 4.2.d i 46 4.2. Một số vấn đề tách chiết DNA ở lá điều  Đặc điểm: Sau khi tách chiết, DNA lá điều thường bị gãy nhiều (hình 4.1), có lẽ do tế bào lá điều có lớp thành tế bào dày và cứng, khó nghiền nên khi nghiền mạnh tay dễ làm gãy DNA. Lượng DNA thu được trong nghiên cứu này không cao, trung bình khoảng 70 – 80 ng/μl, có thể do lá điều có nhiều chất thứ cấp khác như polyphenol, polypeptide,…gây khó khăn cho quá trình tách chiết. Một số mẫu có nồng độ DNA rất thấp (khoảng 30 ng/μl trở xuống) đều là của những mẫu lá non hay những lá đã trưởng thành nhưng còn mềm.  Khó khăn trong việc tách DNA từ lá điều: Lá điều già trong quá trình li trích thu đươc rất ít DNA không đạt yêu cầu cho việc thực hiện phản ứng RAPD- PCR. Là điều còn non cho kết quả tách DNA không tốt giá tri đo OD cao nhưng tạp nhiều. Điều này có thể do lá non đang trong thời kỳ sinh trưởng mạnh nên nồng độ các hợp chất thứ cấp nhiều, ảnh hưởng không tốt đến việc tách chiết DNA, ngoài ra trong lá non hàm lượng nước cao làm cho số lượng DNA trong lá non ít hơn lá trưởng thành. Vì vậy kết quả li trích chỉ đạt được kết quả tốt đối với lá trưởng thành.  Biện pháp khắc phục: Đối với lá điều trưởng thành, chúng tôi cũng đưa ra một số lưu ý khi thực hiện quá trình tách chiết. -Trước khi nghiền mẫu đem EB ủ ở 650C để trách dịch trích bị kết  Cần phải giữ cho lá không bị khô trước khi nghiền, công đoạn nghiền phải đều tay, không nghiền mạnh, tránh tạo bọt. Sử dụng máy vortex khuấy trộn kỹ ở tốc độ thấp, khoảng 600 –1.000 vòng/phút.  Khi thêm 500 μl chloroform : isoamylalcohol (24:1), sau đó có thể dùng máy vortex khuấy trộn ở tốc độ thấp như bước 1 hay chỉ cần đảo nhẹ trong khoảng 10 phút để hạn chế gãy DNA. 47  Chỉ nên hút khoảng 500 μl dịch ở bên trên, tránh chạm đầu típ vào vách ngăn cách giữa 2 pha vì đây là phần chứa nhiều protein bị loại bỏ sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả li trích.  Chỉ nên hút khoảng 250 – 300 μl dịch trích.  Thêm vào 250 μl dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở -20oC trong khoảng 1 giờ (nên để qua đêm). Nên lấy tỉ lệ DNA : dung dịch isopropanol lạnh tỉ lệ 1 : 1.  Cho vào 300 μl TE 1 X, ủ 37oC trong 1 giờ. Có thể chỉ để khoảng 30 phút vì mục đích của bước này chỉ để cho DNA tan ra.  Lặp lại bước trên, để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 μl TE 1 X, ủ ở 37oC trong 30 phút, phải để thật khô, không còn ethanol trong kết tủa DNA do ethanol ảnh hưởng xấu tới DNA và phản ứng PCR.  So với một số nghiên cứu trước trong quy trình li trích tôi có một vài thay đổi. Tăng thời gian ủ từ 45 phút lên 60 phút giảm nhiệt độ ủ còn 550C nhằm mục đích tăng sự ổn định của DNA. Từ kinh nghiệm thực nghiệm tôi đưa ra quy trình sau. 48 Tóm tắt quy trình ly trích: Dịch lỏng (bỏ) Tủa trắng đục Dịch lỏng (bỏ) Rửa bằng Ethanol 70% (2 lần) + 100 μl TE 1X ủ 370 C /30 phút Để khô Bảo quản ở 40 C Mẫu 0,15 g Cho vào cối + 1,2 ml dịch trích EB Nghiền Dung dịch màu xanh đậm (vortex, ủ 55-600 C/60 phút) + 500 μl chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) Dung dịch màu xanh đậm Dịch lỏng màu xanh Cặn (bỏ) + 500 μl chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) Dịch lỏng màu xanh Dịch lỏng màu xanh nhạt Cặn (bỏ) vortex 10 phút, ly tâm 5 phút/14000 vòng/100 C vortex 10 phút, ly tâm 5 phút/14000 vòng/100 C + 2 μl RNase ủ 370 C/1 giờ Isopropanol lạnh (1 : 1) Dịch lỏng màu xanh nhạt có huyền phù (tủa ở -200 C qua đêm) Tủa trắng đục ly tâm 5 phút/14000 vòng/100 C + 300 μl TE 1X ủ 370 C/1 giờ Dung dịch trắng đục + 20 μl Sodium acetate 3 M, 640 μl Ethanol 100% Dung dịch trắng đục có huyền phù (để - 200 C / 30 phút) ly tâm 10 phút/14000 vòng/100 C Dịch lỏng màu xanh nhạt Hình 4.1 : Quy trình ly trích DNA 49 Quy trình ly trích sử dụng 2-mercaptroethanol có tác dụng phá hủy mạnh thành tế bào giúp cho việc giải phóng DNA hiệu quả hơn, muối sodium acetate làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA và cho chloroform isoamyl acohol 2 lần với việc ly tâm tốc độ cao giúp loại bỏ được tạp chất như protein, polysaccharide...qua đó chất lượng DNA thu được tốt hơn. Nhìn chung quy trình ly trích khá ổn định và hiệu quả, vấn đề là tìm cách hạn chế sự đứt gãy của DNA, điều này phụ thuộc nhiều vào các tác nhân cơ học. ALO4 AL09 AL07 AL08 HA04 HA05 HA06 HA07 HH14 HH15 3H03 3H10 Hình 4.2Kết quả ly trích DNA đƣợc điện di trên gel agarose nồng độ 0,8% 4.3 Kết quả thực hiện RAPD – PCR và đánh giá đa dạng di truyền. Việc phát triển kĩ thuật RAPD-PCR đã được thực hiện ở một số đề tài trước tại trung tâm trên các mẫu thu thập ở địa phương khác (Nghiên cứu đa dạng di truyền các cá thể điều trồng tại Bình Thuận của Phạm Văn Bình 2005, Nghiên cứu đa dạng di truyền các cá thể điều trồng tại Vũng Tàu của Quỳnh Anh 2005). Nhìn chung các phương pháp trước đây đã tương đối ổn định. Chính vì vậy không nghiên cứu để tìm ra nghiệm thức tốt nhất như ở các đề tài trước. Tôi chỉ chạy RAPD-PCR ở nghiệm thức mà đề tài trước cho là tốt nhất. 4.3.1. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của một số cá thể điều đƣợc trồng tại Bình Định với primer11 Chúng tôi thực hiện chạy RAPD với primer 11 trên 50 mẫu kết quả thu được 8 band trong đó có 3 band đa hình và 5 band đồng hình (kích thước khoảng 580bp và 50 850bp), kích cỡ các band đa hình có ở mẫu này nhưng không có ở mẫu kia. Các band đa hình là cơ sở phân biệt giữa các mẫu có tính trạng khác nhau từ đó làm nền tảng để phân chia và sác định giống. Các band đa hình chỉ xuất hiện ở một vài mẫu. Bảng 4.1Thành phần cho một phản ứng RAPD-PCR: HÓA CHẤT DUNG DỊCH GỐC THỂ TÍCH SỬ DỤNG NỒNG ĐỘ CUỐI PCR BUFFER 25mM 2,5 μl 250M μl Taq DNA Polymerase 5u 0,1 μl 0,5u MgCl2 25mM 2 μl 200M μl dNTP 10MM 0,3 μl 120M μl Primer 10pmol/l 0,65 μl 6,5pmol(260μm/ μl) Nước 18,45 μl Bảng 4.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thờigian (phút) 1 94 4 37 94 1 33 1 72 2 1 72 10 Hold 4 0 C Sau khi thực hiện phản ứng RAPD-PCR, sản phẩm sau phản ứng được điện di trên gel agarose nồng độ 2% với dung lượng 8 μl mẫu với 3 μl loadindye điện di trên điện cực 50V-100mA thời gian 60 phút, sau đó đem nhuộm trong ethidium bromide trong 30 phút. Kết quả được chụp tại máy chụp gel hình 4.3. 51 Ladd AL07 HA03 HA04 HA19 HH08 HH16 HH18 HH23 HH19 3H05 3H11 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR trên gel khi thực hiện với primer11 4.3.2 Đánh giá quy trình phản ứng RAPD-PCR Quy trình thực hiện phản ứng RAPD-PCR khá ổn định cho nhiều band, có độ phân giải và độ sáng khá tốt, song còn một số vấn đề: Khả năng nhân bản qua phản ứng RAPD-PCR cao, tuy nhiên khả năng làm phát sinh chỉ thị phân tử lại thấp, thể hiện mức độ giống nhau về số lượng và độ dài các band trong tổng số các mẫu thực hiện RAPD-PCR thành công. Như vậy, hiệu quả phát hiện chỉ thị phân tử bằng kỹ thuật RAPD-PCR có hạn chế. Một số mẫu không ra kết quả tốt: chúng tôi nhận thấy một điều là những mẫu ra kết quả không tốt là những mẫu lá trưởng thành nhưng còn nền, có nồng độ DNA ly trích được thấp (chỉ khoảng 20-30ng/ μl) hoặc do hàm lượng tạp chất trong quả trình ly trích. Với những mẫu này có thể thực hiện lại và có thể cho nhiều hơn 1μl DNA mẫu vào hỗn hợp phản ứng. Một số band không rõ: có thể trong quá trình điện di, các band có độ dài gần bằng nhau nên khó tách ra rõ ràng. Chúng tôi sử dụng nồng độ 2% agarose và điện di ở 50V trong 1 giờ cho độ phân tách cao hơn xong vẫn gặp một số khó khăn, điển hình là các band di chuyển không đều, có thể do điện cực bị cong hay do hiệu ứng thành máy điện di ảnh hưởng đến sự di chuyển của các DNA. Những mẫu này nên thực hiện lại phản ứng RAPD-PCR hay chạy điện di lại, cho lượng mẫu nhiều hơn và chỉnh sửa máy điện di có thể cho kết quả tốt hơn. 52 4.3.3 Phân tích kết quả phản ứng RAPD-PCR bằng phần nềm NTSYS Từ kết quả điện di chúng tôi mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1 ( xem chi tiết ở bảng 4.3 phần phục lục ii) để phân tích mối tương quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu bằng phần mềm NTSYS2.1. 4.3.4 Đánh giá đa dạng di truyền. Đánh giá đa dạng di truyền thông qua cây di truyền dụa trên các yếu tố: Hệ số tương đồng di truyền. Mức độ phân nhánh của cây di truyền.  Tại Bình Định nơi có diện tích trồng điều không được tập trung nên việc thu thập mẫu gặp nhiều khó khăn. Chính vì vậy tôi chỉ thu thập mẫu ở những huyện có diện tích đồi núi lớn. Vì từ năm 1995 tỉnh có chương trình trồng điều để phủ xanh đồi núi trọc với dự án xóa đói giảm nghèo của tỉnh, ở ba huyện Hoài Nhơn, Hoài Ân, An Lão là nơi có diện tích đồi núi nhiều. Vì vậy chúng tôi chủ yếu thu thập mẫu ở những huyện này. Khi đánh giá đa dạng di truyền của cây chúng tôi có kết quả sau:  Đa dạng di truyền của huyện An Lão có 8 mẫu có kết qủa RAPD-PCR, kết quả đánh giá đa dạng di truyền được hiển thị theo dạng bảng và dạng cây di truyền (hình 4.4 -4.5) 53 Hình 4.4 Cây di truyền một số cây điều tiêu biểu ở huyện An Lão Hình 4.5 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS đối với các mẫu điều tại huyện An Lão  Kết quả phân tích của huyện An Lão ta thấy hệ số di truyền dao động từ 0,5-1,00. như vậy các mẫu phân tích có hệ số di truyền khá gần nhau. Qua bảng số liệu và cây di truyền ta thấy có một mẫu Al04 nằm riêng biệt một nhánh. Theo kết quả điều tra thì mẫu này có tính trạng về hình thái cây thấp,ít cánh, trái vàng chát, 54 hạt lớn nhưng bị lép hạt. Trên kết quả điện di tôi thây mẫu này không có vạch 850bp so với các mẫu khác. Có thể vạch 850 bp là vạch có gen quy định tính trạng hạt lớn tròn căng. Đây có thể là một chỉ thị làm tiền đề cho những nghiên cứu sau này cho công tác tuyển chọn giống.  Đa dạng di truyền của cây điều ở huyện Hoài Ân Có 19 mẫu có kết quả RAPD-PCR kết quả đánh giá đa dạng di truyền được hiển thị theo dạng bảng và dạng cây di truyền ở hình 4.6. Hình 4.6 Cây di truyền một số cây điều tiêu biểu ở huyện Hoài Ân  Kết quả phân tích của huyện Hoài Ân ta thấy hệ số di truyền dao động từ 0,73-1,00. Như vậy các mẫu phân tích có quan hệ di truyền khá gần nhau về mặt di truyền. Có thể những giống điều ở đây có sự tạp giao với nhau hoặc có thể là sự đồng bộ trong việc tuyển chọn giống của huyện.Qua bảng điều tra nông dân tôi cũng nhận thấy sự đồng bộ về những tính trạng như: cây thấp đến cao trung bình, hạt lớn tròn căng .v.v.  Đa dạng di truyền của cây điều ở huyện Hoài Nhơn có 22 mẫu có kết quả RAPD-PCR, kết quả đánh giá đa dạng di truyền được hiển thị theo dạng bảng và dạng cây di truyền( hình 4.7). 55 Hình 4.7 Cây di truyền một số cây điều tiêu biểu ở huyện Hoài Nhơn  Kết quả phân tích của huyện Hoài Nhơn ta thấy hệ số di truyền dao động từ 0,375- 1,00 như vậy các mẫu phân tích có quan hệ di truyền khá xa. Cây di truyền được chia thành 11 nhánh. Riêng mẫu HH14 tạo thành một nhánh riêng trong cây di truyền của hyện Hoài Nhơn. Trong phiếu điều tra tôi nhận thấy cây này có tính trạng cây cao tán rộng, trái vàng ngọt hạt rất lớn năng suất cao và khá ổn định. Trên hình điện di tôi thấy có xuất hiện vạch khoảng 650 bp, qua bảng so sánh tôi thấy vạch này chỉ có ở mẫu này không có ở mẫu khác đây có thể là một chỉ thị phân tử để làm tiền đề cho những nghiên cứu cho công tác tuyển chọn giống.  Đa dạng di truyền của cây điều ở Bình Định có 50 mẫu có kết quả RAPD-PCR, kết quả đánh giá đa dạng di truyền được hiển thị theo dạng bảng và dạng cây di truyền (hình 4.8) 56 Hình 4.8 Cây di truyền một số cây điều tiêu biểu tại Bình Định  Theo như cây di truyền, các cá thể điều tại Bình Định được chia thành 10 nhánh trung bình mỗi nhánh 5 mẫu, có mức độ tương đồng di truyền từ 37,5%- 100%. Theo đánh giá của chúng tôi thông qua kĩ thuật RAPD-PCR, những cây điều trồng tại Bình Định có tính đa dạng di truyền ở mức từ trung bình đến trung bình khá. Chúng tôi nhận thấy các giống điều được trồng tại huyện Hoài Ân, An Lão có mức độ phân bố rộng nhất, đồng thời có mức độ tương đồng di truyền khá cao, thể hiện có nhiều mẫu có số vạch giống nhau và cùng phân bố cùng một nhánh trong cây di truyền. Các cây điều trồng tại huyện Hoài Nhơn có mức đa dạng di truyền khá cao, đông thời có bản chất di truyền giống với các cây điều trồng tại Hoài Ân và An Lão. Điều này cũng thật dễ hiểu vì theo kết quả điều tra thì cây điều ở Hoài Nhơn có độ tuổi cao hơn. Có thể các giống điều ở Hoài Nhơn đem trồng ở các huyện khác. 57 4.3.5.Hạn chế của kết quả đánh giá đa dạng di truyền bằng kĩ thuật RAPD-PCR. Từ quá trình thực hiện tôi rút ra một số kết luận. Số lượng mẫu thu thập được chưa đủ để thực hiện thực tế, chưa mang tính đại diện cao. Do những hạn chế của kĩ thuật điện di bằng agarose không cho độ phân tách cao, độ dài của các band có thể không bằng nhau nhưng không thể phân biệt bằng mắt thường nên có thể nhận định sai lệch band điện di. 4.3.6. Một vài điểm lƣu ý khi thực hiện phản ứng RAPD-PCR.  Không dùng giấy dán vào thành eppendorf để đánh dấu mẫu khi chạy RAPD-PCR.  RAPD-PCR rất nhạy cảm với các thành phần hóa chất, chỉ cần có sự thay đổi về một yếu tố nào đó thì sản phẩm thu được sẽ khác nhau. Do đó cần kiểm tra lại toàn bộ quy trình khi có sự thay đổi một yếu tố nào đó.  Khi thay đổi về nhiệt độ bắc cặp của primer thì thường biến thiên 20C, thay đổi 10C ít có sự khác biệt.  Máy PCR khác nhau cho kết quả khác nhau.  Khi gặp trở ngại về việc điện di thì nguyên nhân có thể do:  Kỹ thuật đổ gel: agarose chưa tan dều hoặc do agarose quá nguội khi đổ.  Điện trường của máy điện di: do điện thế không ổn định hoặc điện cực bị cong v.v.  Dung dịch điện di: cần thay dung dịch điện di khác.  Dung dịch nhuộm gel cũng ảnh hưởng, tốt nhất nên sử dụng dung dịch mới pha và chỉ dùng cho nhuộm gel RAPD-PCR. 58 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1Kết luận. Từ các kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: Quy trình tách chiết DNA khá ổn định. Ly trích được 50 mẫu DNA đạt tiêu chuẩn dùng trong các kĩ thuật sinh học phân tử.  Primer 11dùng trong kĩ thuật RAPD-PCR cho 8 band đối với các mẫu thí nghiệm, trong đó có 5 band đồng hình, 3 band đa hình. Primer 11 có tính đa hình cao đối với các cá thể điều. Kết quả thu được 217 band trong tổng số 50 mẫu thu thập tại Bình Định.  Việc phân tích RAPD-PCR sử dụng primer11 các cá thể điều trồng tại Bình Định có hệ số di truyền trên cấy phát sinh chủng loại dao động trong khoảng 0,375-1,00.  Cây phát sinh nhiều nhánh chứng tỏ các cá thể điều trồng tại Bình Định có sự tạp giao giữa các giống điều. 5.2Đề nghị. 5.2.1Đề nghị phƣơng pháp nghiên cứu.  Khảo sát thêm các primer khác dùng trong kĩ thuật RAPD.  Khảo sát thêm các maker phân tử như AFLP,SSR…để phân tích đa dạng di truyền một cách chính sác hơn.  Cần xác định đa dạng di truyền của các cá thể trên diện rộng, số lượng mẫu lớn hơn.  Các band có trọng lượng 850 bp và 650 là những band tao nên sự khác biệt. Có thể sử dụng làm các chỉ thị phân tử cho những nghiên cứu sau này. 5.2.2 Về phƣơng hƣớng phát triển canh tác điều ở Bình Định.  Tránh tình trạng phát triển cây điều một cách tự phát như hiện nay.  Tiến hành điều tra và nghiên cứu đa dạng di truyền những giống điều hiện có. Chọn lọc cá thể có những tính trạng tốt, tiến hành nghiên cứu sâu hơn về những cá thể này. 59  Định hướng phát triển chiến lược lâu dài cụ thể cải thiện giống cũng như kĩ thuật canh tác 60 Tài liệu tham khảo Tài liệu trong nƣớc 1 Châu Văn Quang.2005. Điều tra hiện tượng canh tác và bước đầu xác định tính đa dạng di truyền của một số giống điều đang trồng ở tỉnh Bình Phước nhờ kĩ thuật PCR . LVTN kỹ sư nông học trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 2Phạm Văn Bình 2005. Đánh giá sơ bộ đa dạng di truyền của quần thể điều(Anacardium occidentale L) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kĩ thuật RAPD và AFLP. LVTN công nghệ sinh học trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh . 3Nguyễn Thị Huyền 2005 Bước đầu xây dựng ngân hàng gen trên cây điều ở một số huyện của tỉnh đồng nai. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư nông học Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 4 Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thi Hằng, Nông Văn Hải 2005 ..nghiên cứu đa hình một số giống tằm dâu bằng kỹ thuật rapd. Tạp chí di truyền học và ứng dụng. 5 Nguyễn Việt Chƣơng. 2000 Kinh nghiệm trồng điều theo phương pháp mới. Nhà xuất bản Thanh Niên 6 Phạm Đình Thanh. 2003 Hạt Điều: sản xuất và chế biến. nhà xuất bản Khoa Học và Kĩ Thuật Hà Nội (trang 9-12; 28-36). 7 Khuất Hữu Thanh. 2003 Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp Hồ Chí Minh ( trang 221). 8 Phạm Thành Hổ, 1998 Di truyền học. Nhà xuất bản giáo dục (trang 612) 9 Hồ Thị Thùy Dƣơng, 2002 Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 24- 30; 122-124). 10 Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang. 1999 Di truyền phân tử: những nguyên tắc cở bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nôi Nghiệp Tp Hồ Chí Minh (trang 275). 11 Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản viên khoa học và công nghệ Niềm Nam- Viện Công Nghệ Sinh Học Hà Nội. 12 Lê Duy Thành, 2001 Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. (trang 159). 61 13 Nguyễn Văn Uyển 1996. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật- tập II. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp Hồ Chí Minh (trang 56). 14 Nguyễn Thị Lang 2001. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Tài liệu nƣớc ngoài. 15 Kazutoshi Okuno and Shuichi Fukuoka, 1998. Manual for DNA extraction in plants. Janpan international cooperatoin agency. 16 Sunil Archak, Arbika B. Gaikwad, Diksha Gautam, E.V.V.B. Rao, K.R.M. Swamy and J.L.Karihaloo. 2003 DNA fingerprinting of indian cashew (Anacardium occidentale L) varieties using RAPD and ISSR techniques. Euphytica 230: p 397-404. 17 Samal. S, Rout G.R, Lenka P.C 2003. Analysis of genetic relationships between polulations of cashew (Anacardium occidentale L) by using morphological characterisation and RAPD markers. Plant soil environ 49: p176-182. 62 MỘT VÀI HÌNH ẢNH CÂY ĐIỀU. 63 64 65