Khóa luận Đánh giá tình trạng nhiễm Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus, Tomato Spotted Wilt Virus trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) tại tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật ELISA và chẩn đoán Tobacco Mosaic Vi

(D): Cây cà chua (E): Cây thuốc lá (F): Rau diếp ( 29 2.7 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do virus gây ra 2.7.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử. Trong tế bào ký chủ, virus thường ở dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng đặc trưng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau. Các tinh thể này đôi khi rất khó quan sát thấy. Vì vậy, để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng như mô thực vật bị nhiễm bệnh, người ta sử dụng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại lớn. Phương pháp trực tiếp và đơn giản nhất là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã được làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lưới đồng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phương pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trường hợp nghi ngờ mẫu có lẫn virus khác. Ngoài ra, người ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu được cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh được cắt. 2.7.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị Cây chỉ thị thực chất cũng là những cây ký chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhưng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh chóng. Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị là một phương pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật. Cây chỉ thị được chia làm hai nhóm: Nhóm cây nhiễm bộ phận: Là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Nhóm cây nhiễm hệ thống: Là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây. 2.7.3 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng Triệu chứng bệnh là biểu hiện bên ngoài, phản ánh những đặc điểm riêng biệt của một loại bệnh do một nguyên nhân nào đó gây ra. Do đó, đối với các loại bệnh này, chẩn đoán theo triệu chứng bệnh là một phương pháp nhanh chóng, khá chính xác. Vì vậy, có thể căn cứ vào triệu chứng bên ngoài thể hiện những đặc trưng điển hình về hình thái vết bệnh, màu sắc vết bệnh, vị trí và bộ phận bị bệnh mà chẩn đoán bệnh. 30 Tuy nhiên, trong một số trường hợp cũng dễ dẫn đến những nghi hoặc và nhầm lẫn, nhất là trong trường hợp chẩn đoán các bệnh có cùng một triệu chứng bên ngoài tương tự nhau nhưng thực chất lại do các ký sinh vật khác nhau gây ra. Triệu chứng bệnh tuy có tính chất ổn định nhưng vẫn có thể biến đổi ít nhiều tùy thuộc vào đặc điểm của giống cây và điều kiện ngoại cảnh. Do đó, trong những trường hợp phức tạp cần phải tiến hành chẩn đoán bệnh bằng các phương pháp bổ sung khác. 2.8 ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 2.8.1 Nguyên lý ELISA Kỹ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng: Kháng nguyên, kháng thể và cơ chất tạo màu, gồm hai bước: Phản ứng miễn dịch học: Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng hóa học: Nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng oxi nguyên tử và chính oxi nguyên tử này oxy hóa cơ chất tạo màu. Cơ chất tạo màu thay đổi màu chứng tỏ sự có mặt của enzyme và chứng minh sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể. 2.8.2 Phân loại ELISA 2.8.2.1 ELISA trực tiếp (Direct ELISA) ELISA trực tiếp được xem là dạng cơ bản nhất của ELISA. Là phương pháp đánh dấu kháng thể với huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên. Trong phương pháp này, kháng thể sơ cấp được đánh dấu phản ứng trực tiếp với kháng nguyên. Phương pháp ELISA trực tiếp thường được dùng để dò lượng kháng nguyên có trong mẫu bằng cách dùng kháng thể đơn dòng. 2.8.2.2 ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Hệ thống ELISA gián tiếp tương tự như ELISA trực tiếp ở chổ kháng nguyên được cố định trong pha rắn và sau đó, được gắn kết với kháng thể đặc hiệu được thêm vào. Tuy nhiên, các kháng thể này không gắn với các enzyme tạo màu như ở ELISA trực tiếp mà lại được gắn kết bằng kháng thể thứ cấp (có gắn enzyme tạo màu) được thêm vào sau đó. Các kháng thể thứ cấp này được sản xuất trong cơ thể động vật khác loài so với động vật sản xuất ra kháng thể sơ cấp. Do đó, nếu kháng thể sơ cấp được tạo ra từ cơ thể thỏ thì kháng thể thứ cấp sẽ là những Ig kháng thỏ sản xuất trong cơ 31 thể các động vật khác (thường là ngựa). Điều này tạo ra tính linh hoạt trong quá trình sử dụng. Phương pháp này sử dụng kháng thể thứ cấp được đánh dấu để phát hiện. Đầu tiên, kháng thể sơ cấp được gắn với kháng nguyên. Tiếp theo, cho kháng thể thứ cấp được đánh dấu vào để nhận biết kháng thể sơ cấp. Điều quan trọng là enzyme tạo màu phải có tính đặc hiệu. 2.8.2.3 Sandwich ELISA Sandwich ELISA là một xét nghiệm khá nhạy dùng để định lượng hormone, kháng nguyên gây bệnh truyền nhiễm và cytokine. Dạng ELISA này có thể cần thiết hơn ELISA trực tiếp và gián tiếp trong một vài trường hợp, đặc biệt là khi lượng mẫu cần phân tích quá loãng để gắn kết lên đĩa polystyrene (ví dụ như một protein trong nuôi cấy bề mặt) hoặc không gắn lên đĩa plastic (ví dụ như phân tử hữu cơ nhỏ). Đây là phương pháp xét nghiệm dựa trên việc đo lượng chất cần phân tích khi chất đó được gắn giữa hai kháng thể bắt (capture antibody) và kháng thể phát hiện (detecting antibody). 2.8.3 Các yếu tố ảnh hƣởng trong phản ứng ELISA Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng. Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên. Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên. Hoạt tính chuyên biệt của kháng thể thứ hai. 2.8.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng ELISA Đối chứng âm cho kết quả dương tính do bị nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc do bản thân đối chứng bị nhiễm. Đối chứng dương không xuất hiện màu mà mẫu kiểm tra có màu là do đối chứng quá hạn sử dụng hay điều kiện bảo quản không tốt. Đối chứng dương và mẫu kiểm tra có màu quá thấp thì cần phải kiểm tra lại kháng thể được gắn vào enzyme và nồng độ chất tạo màu. 2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.9.1 Nguyên tắc DNA polymerase là enzyme có chức năng tổng hợp các sợi đơn DNA. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần 32 sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (primer). Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới. Thông qua phương pháp PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Người ta còn gọi nó là kỹ thuật tạo dòng DNA in vitro. Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bước: Bước 1: Biến tính sợi đôi thành sợi đơn (Denaturation) Phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của phân tử, thường là 94oC – 95oC, trong vòng 30 giây – 1 phút. Bước 2: Giai đoạn lai (Hybridization) Primer gắn vào 2 sợi đơn DNA ở vị trí chuyên biệt. Giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer), cho phép primer bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC, tùy thuộc vào Tm của primer, và kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay giai đoạn kéo dài (Extension) Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase, vốn là polymerase chịu nhiệt, hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Một chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng DNA khuôn mẫu lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng mẫu ban đầu. Theo nguyên tắc, PCR được áp dụng để khuếch đại các DNA có chiều dài từ 200 – 2000 bp. Tổng số DNA khuếch đại = m × 2n n : số chu kỳ. m : số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra. Để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta cần phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó để tạo các primer bổ sung chuyên biệt. Các primer này gồm 1 primer xuôi 33 (forward primer), ký hiệu là F và 1 primer ngược (reverse primer), ký hiệu là R. Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là “xuôi” và “ngược” so với chiều phiên mã của gen. 2.9.2 Ƣu nhƣợc điểm của phản ứng PCR  Ưu điểm Độ nhạy rất cao. Thao tác đơn giản. Thời gian thực hiện nhanh. Độ tinh sạch của mẫu không cần cao. Định lượng so sánh một sản phẩm thu nhận từ nhiều nguồn gốc khác nhau. Cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, dễ bị phân hủy từng phần như trong các vết máu để lâu ngày, hóa thạch, tóc, móng tay người đã chết. Có thể giúp nhận biết được gen đột biến do mất đoạn, thêm đoạn hay đột biến điểm.  Hạn chế Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên. Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Việc mở nắp các eppendorf sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín, như phòng thí nghiệm, sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi eppendorf bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng một số biện pháp sau: Các công đoạn thao tác khác nhau phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau. 34 Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không được sử dụng vào các thao tác khác để tránh sự nhiễm. Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phần tử còn lại từ các lần khuếch đại trước. Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sao cho đủ với các lần thao tác. Các hãng sản xuất đưa ra thị trường nhiều hệ thống có thể loại bỏ hoàn toàn sự ngoại nhiễm. Tuy nhiên bất lợi là giá thành cao. Các sai sót gây ra do Taq polymerase. Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (1000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không quan trọng nếu chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA. Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt. Ví dụ: Đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính xác. 2.10 RT – PCR ( Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) 2.10.1 Nguyên tắc Phương pháp RT – PCR dùng để nhân hay khuếch đại DNA bổ sung nhờ enzyme “Reverse transcriptase”. RNA được chuyển mã ngược thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngược. cDNA được khuếch đại nhờ Taq polymerase. Sử dụng hai primer có tính chuyên tính đối với gen, một cDNA có chuỗi trình tự đã được biết rõ, người ta cho khuếch đại trong PCR. Tuy nhiên, cái khó là làm sao phân lập những bản sao của cDNA toàn bộ chiều dài, vì cơ sở thông tin về chuỗi mã của phân tử mRNA cũng rất hạn chế. Chuỗi mã chưa được biết này nằm kề một đoạn nhỏ của chuỗi mã đã biết rõ, chuỗi mã chưa được biết không thể được khuếch đại bằng phương pháp PCR thông thường. 2.10.2 Phƣơng pháp thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA Trường hợp 1: Đối với các loại virus có đuôi poly(A) thì sự tổng hợp cDNA có thể được thực hiện dựa vào các loại primer: oligo(dT), primer chuyên biệt cho gen cần khuếch đại và cuối cùng là primer ngẫu nhiên – các đoạn gồm 6 35 nucleotide. Đoạn oligo(dT) dùng mRNA làm dây nền để tổng hợp cDNA dây đơn. Kết quả là cuối dây cDNA tạo thành móc hình cong. Khi mRNA được xử lý với NaOH, móc cong này trở thành primer cho DNA polymerase I, hoàn thành việc cặp dây đôi DNA. Móc cong này được cắt bởi S1 nuclease. Trường hợp 2: Đối với các loại virus không có đuôi poly(A) thì sự tổng hợp cDNA chỉ dựa vào các primer chuyên biệt. 2.11 Một số kỹ thuật PCR khác 2.11.1 Kỹ thuật PCR đảo (Inverse PCR) Kỹ thuật này dùng phân lập các phần nằm trước hoặc sau một đoạn DNA đã biết, từ đó phân tích được chuỗi nucleotide nằm trước hoặc sau của một gen. Kỹ thuật này gồm các giai đoạn sau: Cắt DNA bằng enzyme giới hạn. Các đoạn DNA được nối lại thành dạng vòng và sử dụng như DNA khuôn cho phản ứng PCR với hai mồi đặc hiệu xuất phát từ phần DNA đã biết. Như vậy kỹ thuật này được sử dụng để xác định promoter hoặc các đoạn nucleotide làm nhiệm vụ điều khiển hoạt động của gen. 2.11.2 Kỹ thuật NESTED – PCR Nguyên tắc của kỹ thuật này tương tự như kỹ thuật PCR bình thường. Sản phẩm DNA của phản ứng PCR thứ nhất (với cặp primer thứ nhất) được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR thứ hai (dùng cặp primer thứ hai) với khoảng cách giữa hai primer lần sau ngắn hơn lần trước. Làm như vậy nhằm tăng tính đặc hiệu, tính chính xác cho sản phẩm cần khuếch đại và sản lượng thu được cũng nhiều hơn. 2.11.3 Kỹ thuật RACE (Rapia Amplification of cDNA Ends) Kỹ thuật thực hiện với đầu 5’ (5’RACE) và 3’ (3’RACE) của trình tự cDNA.  Kỹ thuật thực hiện với đầu 5’: Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất qua phiên mã ngược từ phân tử mRNA bằng mồi RT (có gắn Phospho ở đầu 5’) đặc hiệu. Phân hủy RNA ở thể lai DNA – RNA bằng RNase H. Tạo vòng (circularization) sợi đơn cDNA hoặc tạo chuỗi (concatemers) bằng RNA ligase. Khuếch đại DNA bằng NESTED – PCR. 36  Kỹ thuật thực hiện đối với đầu 3’: Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất qua sự phiên mã ngược với adaptor dT ở đầu 3’ của mRNA. Thực hiện PCR gen bằng mồi đặc hiệu và primer adaptor dT có ba vị trí cắt giới hạn (dT – 3 sites adaptor primer) (Kpn I, Xba I, BamH I). Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn thích hợp (Kpn I hoặc Xba I hoặc BamH I). Tạo dòng đoạn DNA nhận được (sau khi cắt) ở vectơ thích hợp và xác định trình tự. 2.13 Những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc bệnh do TMV, CMV, TSWV gây ra 2.13.1 Những nghiên cứu trên thế giới Năm 1996, Steve Whitham, Sheila Mccormick và Barbara Baker đã chuyển gen N của thuốc lá vào cà chua, tạo tính kháng TMV cho cà chua chuyển gen. Năm 1998, Ki Huyn Ryu, Chung Ho Kim và Peter Palukaitis đã chứng minh rằng protein vỏ của CMV quy định dãy ký chủ của CMV khi nhiễm vào lúa mì. Năm 2001, R. T. Folkertsma, R. W. Goldbach và J. Hille đã mô tả gen SW – 5 của Lycopersicon pervuvianum tạo ra tính kháng TSWV. Năm 2002, Luciana Tavella và cộng sự đã tiến hành việc xác định TSWV trong vector dẫn truyền là Frankliniella occidentalis. 2.13.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam Một vài nghiên cứu tại trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh trong những năm gần đây: Năm 2003, Nguyễn Ngọc Bích đã nghiên cứu một số bệnh do virus trên thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh bằng phương pháp ELISA. Kết quả cho thấy: Tại thời điểm điều tra, CMV, TMV, TSWV đang phát triển khá mạnh ở vùng này. Năm 2005, Nguyễn Đình Trường chẩn đoán thấy trên cây ớt (Capsicum annum L.) ở ngoại thành TP. Hồ Chí Minh và một số tỉnh lân cận có nhiễm TSWV, nhưng chưa phát triển mạnh. Năm 2005, Lâm Ngọc Hạnh sau khi đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus trên cà chua (Solanum lycopersicum) đã có kết luận: Tại Lâm Đồng, cà chua nhiễm CMV là chủ yếu, TSWV chưa gây bệnh ở khu vực này vào thời điểm điều tra. 37 Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 03 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006. Địa điểm lấy mẫu: Xã Trà Vong – Huyện Tân Biên – Tỉnh Tây Ninh. Xã Tân Thuận – Huyện Bến Cầu – Tỉnh Tây Ninh. Xã Lộc Ninh – Huyện Dương Minh Châu – Tỉnh Tây Ninh. Tiến hành chẩn đoán CMV, TMV và TSWV tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu Công tác điều tra được tiến hành như sau: Liên hệ với các hộ dân trồng thuốc lá và đậu phộng tại tỉnh Tây Ninh, thực hiện điều tra theo mẫu điều tra đã chuẩn bị sẵn gồm các chỉ tiêu: Đặc điểm vườn trồng, chủng loại giống, kỹ thuật canh tác, tình hình sâu bệnh. Khâu lấy mẫu được thực hiện như sau: Lấy mẫu theo phương pháp năm điểm trên hai đường chéo góc. Lấy phần ngọn cây bị xoăn đọt, lá bị khảm, có triệu chứng của bệnh do TMV, CMV và TSWV gây ra. Tùy theo diện tích vườn có thể lấy từ 5 tới 10 mẫu, cho vào bọc nylon, có ghi nhãn cẩn thận về thời gian, địa điểm, chủ vườn, loại cây, tuổi cây, triệu chứng, điều kiện canh tác. Mẫu được cho vào thùng xốp và được giữ lạnh cho đến khi kết thúc đợt lấy mẫu. Mẫu được đem về phòng thí nghiệm trong điều kiện được giữ lạnh và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích. 3.3 Dụng cụ Cối, chày sứ nghiền mẫu, kéo cắt mẫu, cân phân tích, micropipette P10, P100, P1000, eppendorf, đầu tip, tủ định ôn, tủ cấy vô trùng, nồi hấp, tủ sấy, máy ly tâm, đĩa ELISA (mỗi đĩa 96 giếng), máy rửa ELISA, máy đọc ELISA, máy PCR, bồn điện di, bồn nhuộm Ethidium Bromide, máy chụp gel. 38 3.4 Phƣơng pháp chẩn đoán CMV, TMV và TSWV bằng dDAS – ELISA (direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 3.4.1 Hóa chất Bộ kit ELISA cho CMV, TMV và TSWV do công ty BioRad cung cấp gồm: Extraction buffer (dung dịch đệm trích mẫu). Coating buffer X1 (dung dịch đệm pha kháng thể). Conjugate buffer X1 (dung dịch đệm pha kháng thể có gắn enzyme) Substrate buffer X1 (dung dịch đệm pha cơ chất). Kháng thể đơn dòng. Kháng thể gắn enzyme. Chất chỉ thị màu p – Nitrophenyl phosphate (p – NPP). Dung dịch đệm rửa (PBS – T). Đối chứng dương (Positive control). Đối chứng âm (Negative control). 3.4.2 Phƣơng pháp thực hiện 3.4.2.1 Ly trích mẫu Mẫu lấy về được trữ ở -20oC. Cân 0,5 gam mẫu lá cho vào cối, thêm 2,5 ml dịch trích mẫu, nghiền thật nát vụn thành dạng dung dịch. Sau đó, cho mẫu nghiền vào eppendoff 1,5 ml gần đầy, ghi ký hiệu mẫu. Ly tâm 5000 vòng/ phút trong 3 phút, ở 4oC. Dùng micropipette P1000 hút phần dịch nổi sang eppendorf 1,5 ml mới, ghi ký hiệu mẫu (loại bỏ cặn lắng). Giữ ở 4oC để thực hiện ELISA trong vòng 24 giờ. 3.4.2.2 Thực hiện phản ứng ELISA Bước 1: Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí. Mỗi đĩa 2 đối chứng âm và 2 đối chứng dương. Bước 2: Pha loãng kháng thể trong dung dịch đệm (coating buffer), theo tỷ lệ có sẵn trong kit. Trên mỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hút vào 100 µl, chạy trên 5 đĩa. Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa lại và đặt vào tủ ủ ở 37oC, trong 2 giờ. Bước 3: Rửa 3 lần với dung dịch rửa PBS T, mỗi lần 3 phút bằng máy rửa ELISA. 39 Bước 4: Mỗi đối chứng âm và dương được hòa tan với 1 ml nước cất. Hút nước cất, 100 µl mỗi giếng, cho vào cột đầu tiên (số 1) (Substrate). Hút 100 µl đối chứng dương vào mỗi giếng, vào 2 ô PC (Positive control). Hút 100 µl đối chứng âm vào mỗi giếng, vào 2 ô NC (Negative control). Hút 100 µl dung dịch trích mẫu vào mỗi giếng, tổng cộng 135 mẫu, cho vào 5 đĩa, mỗi đĩa 27 mẫu, mỗi mẫu 2 giếng. Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa lại. Ủ qua đêm ở 4oC. Bước 5: Rửa 3 lần với PBS T, mỗi lần 3 phút bằng máy rửa ELISA. Bước 6: Pha kháng thể có gắn enzyme vào dung dịch đệm tương tự như pha kháng thể bước 2. Hút 100 µl nước cất vào mỗi giếng, cho vào cột số 1. Hút 100 μl dung dịch kháng thể có gắn enzyme vào mỗi giếng từ cột số 2 đến cột số 11. Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa, đem ủ ở 37oC trong 2 giờ. Bước 7: Rửa 3 lần với dung dịch rửa PBS T, mỗi lần 3 phút bằng máy rửa ELISA. Bước 8: Hòa tan p - NPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1mg/ ml của p - NPP. Cách pha: Nghiền nát thành bột mịn 7 viên p- NPP (mỗi viên 5 mg), cho vào 35 ml dung dịch đệm Subtrate (không màu), chờ 5 phút để p - NPP tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Hút 100 µl cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ ở 37 oC trong 30 phút. Bước 9: Đọc kết quả bằng máy đọc OD với bước sóng 450 nm, tại các thời điểm 30 phút, 1 giờ, 2 giờ sau khi ủ với chất tạo màu. OD mẫu = OD đọc (thô) – OD trung bình của các giếng có cơ chất (Substrate). OD mẫu so với ngưỡng (ngưỡng = hai lần trung bình OD của đối chứng âm). POS: Kết quả dương tính - nhiễm bệnh khi OD của mẫu vượt quá ngưỡng. NEG: Kết quả âm tính - không nhiễm bệnh khi OD của mẫu dưới ngưỡng. Bên cạnh đó kết quả cũng có thể được đánh giá bằng mắt thường thông qua sự đổi màu của các giếng: Những giếng xuất hiện màu vàng: Giếng chứa mẫu bị nhiễm bệnh. Những giếng không màu: Giếng chứa mẫu không bị nhiễm bệnh. 40 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trên đĩa ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substract BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substract BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substract PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substract PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substract NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substract NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H Chú thích: Substract: Nước cất. BF: Dịch trích, PC: Đối chứng dương, NC: Đối chứng âm. Vùng load mẫu (số từ 1 đến 27) 3.5 Phƣơng pháp chẩn đoán TMV bằng RT PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 3.5.1 Hóa chất Hóa chất ly trích RNA: Lysis solution (dịch trích mẫu). Low stringency wash solution (dịch rửa nhẹ). High stringency wash solution (dịch rửa nặng). Elution solution (dịch hòa tan RNA). DNase I dạng bột. Dịch pha loãng DNase I. Polyvinylpyrolidone – 40 (PVP) 2%. Các hóa chất để thưc hiện phản ứng RT - PCR: Kit tổng hợp cDNA do BioRad cung cấp. Dung dịch đệm PCR (10 X PCR buffer). iTaq DNA polymerase 5U/ µl. Hỗn hợp dNTP 10 mM. MgCl2 50 mM. cDNA được tổng hợp ở trên. 41 Primer (F và R). Agarose. Loading dye 6X (thuốc nhuộm). Thang chuẩn (ladder) 1000 bp (BioRad). TAE 1X. Nước không chứa nuclease (Nuclease free water). 3.5.2 Phƣơng pháp thực hiện 3.5.2.1 Ly trích RNA Bước 1: Cân khoảng 60 mg mẫu đã qua chẩn đoán ELISA cho kết quả dương tính, cắt nhỏ mẫu (<5 mm). Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý với NaOH, EDTA, rửa bằng nước cất, bọc giấy bạc, đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, sấy khô 1 ngày đêm), nghiền mẫu thành bột mịn với nitơ lỏng. Bước 2: Cho 60 mg mẫu đã nghiền vào tube ly tâm 2 ml có nắp đậy (không có RNase). Hòa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) bổ sung PVP 2% (gồm 14 μl PVP 2% + 700 μl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu). Bước 3: Thêm 700 μl dung dịch ly giải đã được trộn ở trên vào tube 2 ml chứa mẫu, trộn mẫu bằng pipet khoảng 10 lần (hút lên xuống để phá vỡ mẫu). Bước 4: Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút, chuyển toàn bộ dịch nổi vào tube ly tâm 2 ml mới có nắp đậy. Bước 5: Thêm 700 μl ethanol 70%, hòa tan bằng pipet cho đến khi dịch không còn phân lớp. Bước 6: Ủ ấm dung dịch hòa tan (elution solution) trong bồn ủ (water bath) ở 70 oC (chuẩn bị cho bước 15). Đặt RNA binding column (RNA bc) vào tube 2 ml không nắp. Bước 7: Cho 700 μl dung dịch ở bước 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 60 giây (ở 4oC), loại bỏ dịch lọc trong ống rửa và đặt RNAbc trở lại. Cho dịch còn lại vào cột, ly tâm 60 giây. Làm tiếp cho đến khi hết dịch. Bước 8: Dịch rửa low stringency (20 ml) từ 5X pha loãng bằng 80 ml ethanol 95% 100% xuống còn 1X. Bước 9: Cho 700 μl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC, loại bỏ dịch lọc. 42 Bước 10: Pha DNase I (đang ở dạng bột mịn) với 250 μl Tris 10mM 7,5pH . Hòa tan bằng pipet (trộn nhẹ). Bước 11: Trộn 5 μl DNase I với 75 μl dung dịch DNase delution trong tube 1,5 ml. Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây. Loại bỏ dịch lọc (phần dịch bên dưới). Bước 12: Cho 700 μl dung dịch high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại bỏ dịch lọc. Bước 13: Cho 700 µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại bỏ dịch lọc. Bước 14: Ly tâm thêm 12000 vòng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa. Bước 15: Chuyển RNAbc vào tube 1,5 ml có nắp, cho vào 80 μl dung dịch rửa trôi (elution solution) ở bước 6, để 1 phút cho dung dịch thấm, ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở 4oC để thu RNA tổng số. Bảo quản ở 4oC hay sử dụng ngay cho RT – PCR. 3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT PCR RT PCR 2 bước: Bước 1: Tổng hợp cDNA Thành phần hóa chất: 5X iScript Reaction Mix 4 μl iScript Reverse Transcriptase 1 μl Nuclease free water 13 μl RNA tổng số 2 μl Tổng thể tích 20 μl Thay đổi lần lượt RNA tổng số chạy thí nghiệm: 2 μl, 4 μl, 6 μl, 8 μl, 10 μl. Chu trình nhiệt: 5 phút 25oC 40 phút 42oC 5 phút 85oC Giữ ở 4oC 43 Bước 2: Khuếch đại bằng PCR Sử dụng cặp primer có trình tự như sau: Forward primer: Tm = 64 o C 5’-CCGCTTTCTCTGGAGTTTGTGTCGG-3’ Reverse primer: Tm = 64 o C 5’-CCCTCGCTTTATTACGTGCCTGCG-3’ Thành phần hóa chất: Thể tích Nồng độ cuối iTaq buffer 10X 5 μl 1 X MgCl2 2,5 μl 2,5 mM dNTP 1μl 200 µM iTaq DNA polymerase 0,5 μl 0,5 μl primer F 1 µl 0,4 μM primer R 1 µl 0,4 μM Nuclease free water 34 µl cDNA 5µl Tổng thể tích 50 μl Chu trình nhiệt: 1 chu kỳ 3 phút ở 94oC 35 chu kỳ 1 phút ở 94oC 1 phút ở 57oC 1 phút 15 giây ở 72oC 1 chu kỳ 7 phút ở 72oC Giữ ở 4oC trong 10 phút. 3.5.2.3 Đổ gel điện di Chuẩn bị gel agarose 1% 2%. Agarose đã được nấu chín đến 50oC – 60oC, 650W trong 2 phút, đổ vào khuôn và chèn lược vào để tạo gel. Lấy luợc ra, ngâm gel trong dung dịch TAE 1X. Hút 2 μl loading dye trộn đều với 4 μl mẫu PCR. 44 Bơm cẩn thận 6 μl hỗn hợp mẫu và thuốc nhuộm vào giếng. Chạy điện di: Hiệu điện thế 50 V, cường độ dòng điện 245 mA, trong 60 phút. Lấy gel ra, ngâm trong ethidium bromide (1%) trong 20 phút. Rửa gel. Đọc kết quả dưới tia UV. Chụp hình gel để lưu lại. Đọc kết quả phản ứng PCR: Dương tính khi có đoạn 921 bp, âm tính khi không có đoạn 921 bp. 45 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dƣơng Minh Châu và Bến Cầu Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV trên đậu phộng Huyện Số mẫu (+) Tổng số mẫu Tỷ lệ nhiễm (%) Dương Minh Châu 0 35 0 Bến Cầu 0 30 0 Chú thích: (+): Dương tính Kết quả trên cho thấy tất cả các mẫu đậu phộng thu thập được đều không có biểu hiện dương tính với TSWV (0%). Đậu phộng trồng tại 2 huyện này có triệu chứng biểu hiện giống như triệu chứng bệnh do TSWV gây ra nhưng không phát hiện được dương tính khi chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA. Điều này, có thể giải thích là do bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường. Qua người dân, chúng tôi biết rằng, nước tưới tiêu tại địa bàn điều tra được lấy từ những giếng đào sâu trong lòng đất, tận dụng mạch nước ngầm là chủ yếu. Thời điểm tiến hành điều tra, thu thập mẫu nhằm vào những tháng tỉnh Tây Ninh đang là mùa khô, thời tiết khá nóng, nắng gay gắt, giếng đào dần cạn nước, đất trồng khô, nứt nẻ, và việc thiếu nước tưới đã xảy ra, nhưng vẫn chưa có biện pháp khắc phục. Đậu phộng trồng tại đây bị thiếu nước lâu ngày nên hình thái cây bị biến đổi: Lá vàng, thân cây rủ xuống. Nắng khá gay gắt và nóng làm cháy lá, đốm lá, gây héo lá, giống như bị hoại tử và lá rụng dần. Các triệu chứng này đã dẫn tới việc lầm tưởng cây đã nhiễm TSWV. Kết quả này còn chứng tỏ một điều là không thể dựa hoàn toàn vào triệu chứng bên ngoài mà xác định bệnh. Bên cạnh đó, cũng có khả năng là thật sự TSWV chưa nhiễm trên đậu phộng ở huyện Dương Minh Châu và Bến Cầu vào thời điểm thu thập mẫu. 46 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại huyện Tân Biên và Bến Cầu Thể hiện qua Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.1. Bảng 4.2 Kết quả ELISA đối với CMV, TMV, TSWV trên thuốc lá Tác nhân gây bệnh Số mẫu (+) Số mẫu (-) Tổng số mẫu Tỷ lệ nhiễm (%) CMV 26 26 52 50 TMV 29 13 42 69,1 TSWV 0 70 70 0 Chú thích: (+): Dương tính (-): Âm tính 0 10 20 30 40 50 60 70 CMV TMV TSWV Số mẫu dương tính Số mẫu âm tính Số mẫu điều tra Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ số mẫu thuốc lá dƣơng tính, âm tính với CMV, TMV và TSWV Sau khi tiến hành chẩn đoán TSWV cho 70 mẫu thuốc lá thu được tại 2 huyện Tân Biên và Bến Cầu của tỉnh Tây Ninh, không phát hiện được mẫu dương tính với TSWV (0%). Điều này có thể được giải thích bởi 3 lý do sau: Tại các huyện thu thập mẫu, TSWV vào thời điểm này còn ít, chưa phát tán rộng, nên chưa lấy được đúng mẫu đã nhiễm TSWV. Do mẫu được lấy chủ yếu dựa theo triệu chứng bên ngoài nên có thể mẫu đã nhiễm các virus khác với TSWV nhưng triệu chứng biểu hiện lại tương tự như nhiễm TSWV. S ố m ẫ u Tác nhân gây bệnh 47 Vì thu thập theo triệu chứng nên có thể những triệu chứng này là do ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, phân bón hay do điều kiện canh tác gây ra. Ngoài ra, các mẫu thuốc lá và đậu phộng cùng được lấy tại huyện Bến Cầu đều không có biểu hiện nhiễm TSWV (0%), kết quả này cũng góp phần cho thấy rằng tại đây TSWV chưa xuất hiện và gây bệnh. Trong khi đó, mẫu thuốc lá có biểu hiện dương tính với CMV (50%) và TMV (69,1%) khá cao. Như vậy, có thể nói rằng vào tháng 4 năm 2006 (thời gian thu thập mẫu), cây thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh đang chịu ảnh hưởng của CMV và TMV. 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu Bảng 4.3 Kết quả ELISA đối với CMV trên thuốc lá Huyện Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%) Tân Biên 20 33 60,6 Bến Cầu 6 19 31,6 Chú thích: (+): Dương tính 0 10 20 30 4 50 60 70 Tân Biên Bến Cầu Mẫu dương tính Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV giữa Tân Biên và Bến Cầu Kết quả từ Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.2 cho thấy: Trên tổng số mẫu thuốc lá thu được tại từng địa bàn điều tra, huyện Tân Biên có tỷ lệ nhiễm CMV khá cao (60,6%), trong khi đó tại huyện Bến Cầu tỷ lệ nhiễm CMV ít hơn (31,6%). Như vậy, Tân Biên có tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV cao gấp 2 lần so với Bến Cầu. Kết quả này có thể lý giải như sau: T ỷ l ệ % Huyện 48 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tân Biên Bến Cầu Mẫu dương tính CMV được lây lan chủ yếu qua rệp thuốc lá. Khi khảo sát tại huyện Tân Biên ta thấy cỏ dại, lùm bụi khá nhiều, không được phát quang. Đây chính là nơi cư trú tốt cho rệp, và tạo điều kiện cho chúng sinh sôi, phát triển mạnh mẽ. Vì thế, tại đây CMV được lan truyền nhanh hơn, nhiều hơn. Tại Bến Cầu, công tác vệ sinh, dọn dẹp cỏ dại quanh khu vực trồng thuốc lá được thực hiện tốt hơn. Các bụi rậm được phát quang sạch sẽ, rệp không còn chổ để trú ẩn, không có điều kiện thuận lợi để phát triển. Nên số lượng không tăng thêm nhiều, khả năng truyền virus cũng giảm. 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá Huyện Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%) Tân Biên 18 26 69,2 Bến Cầu 11 16 68,8 Chú thích: (+): Dương tính Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm TMV giữa Tân Biên và Bến Cầu Các số liệu từ Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.3 đã cho thấy: Tại huyện Tân Biên, thuốc lá nhiễm TMV khá cao (69,2%) và tại huyện Bến Cầu, tỷ lệ này cũng khá cao (68,8%). Khi so sánh tỷ lệ thuốc lá bệnh giữa 2 huyện, ta nhận thấy rằng tỷ lệ này là tương đương nhau. T ỷ l ệ % Huyện 49 TMV chủ yếu tồn tại trong tàn dư thực vật của vụ truớc để lại trên đồng ruộng. Nhưng hiện nay, tại các huyện này, sau khi thuốc lá được thu hoạch xong thì phần thân, rễ còn lại sẽ được giữ làm phân bón cho vụ sau mà không được đốt bỏ. Điều này đã tạo điều kiện cho TMV phát triển trở lại và tiếp tục gây bệnh cho vụ trồng kế tiếp. TMV nằm trong xác cặn bã thực vật sẽ bị phân hủy ngoài tự nhiên trong vòng từ 5 đến 6 tháng do thời tiết. Tuy nhiên, vì Tây Ninh là một địa bàn chuyên canh trồng thuốc lá ở nước ta nên các vụ mùa được trồng liên tục, kế tiếp nhau, không có thời gian nghỉ giữa 2 vụ. Do đó, cây thuốc lá nhiễm bệnh từ vụ này sang vụ khác, năm này sang năm khác mà không thể khắc phục được. Tỷ lệ nhiễm TMV khá cao tương đương nhau tại huyện Tân Biên và Bến Cầu cũng còn do sự lưu thông giữa những vùng trồng thuốc lá trong tỉnh. Những đoàn xe vận chuyển thuốc lá nguyên liệu trong quá trình di chuyển từ vùng này sang vùng kia, đồng thời cũng mang TMV trên những lá thuốc còn sót lại hay trên những vật dụng có liên quan theo và góp phần phát tán bệnh. Ngoài ra, thuốc lá thường xuyên nhiễm CMV, TMV trong suốt mùa vụ và từ năm này sang năm khác còn vì lý do khách quan sau: Tây Ninh là vùng trồng thuốc lá phổ biến với diện tích lớn, nhưng chủ yếu việc trồng trọt diễn ra ở những hộ gia đình, tập quán của người nông dân là thường trồng những loại cây như bầu bí, dưa, thơm hay vài loại hoa làm cảnh, đây chính là những cây ký chủ của CMV và TMV. Đồng thời luôn tìm thấy dạng khảm trên các cây trồng này quanh năm. Nên khi các cây này đã nhiễm virus thì nó dễ dàng và nhanh chóng phát tán sang thuốc lá. Khi trong vườn thuốc lá xuất hiện cây bị bệnh, nhưng vì lý do kinh tế, mà người nông dân thường vẫn tiếp tục trồng những cây này, mà không tỉa bỏ, vì thế từ một vài cây bệnh ban đầu đã mau chóng lan sang các cây khác. 50 4.1.5 Tỷ lệ thuốc lá chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp CMV và TMV trên số mẫu thu thập đƣợc Bảng 4.5 Kết quả ELISA đối với mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp CMV và TMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV Tác nhân gây bệnh Số mẫu (+) Tổng số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%) Chỉ nhiễm CMV 0 42 0 Chỉ nhiễm TMV 20 47,6 Nhiễm CMV và TMV 11 26,2 Chú thích: (+): Dương tính 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Chỉ nhiễm CMV Nhiễm CMV và TMV Chỉ nhiễm TMV Mẫu dương tính Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ giữa các mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV Theo kết quả từ Bảng 4.5 và Biểu đồ 4.4, số mẫu thuốc lá chỉ nhiễm TMV chiếm tỷ lệ cao nhất là 47,6%. Số mẫu nhiễm hỗn hợp CMV và TMV là 26,2%, nhưng không có mẫu nào nhiễm CMV mà không nhiễm TMV. Điều này cũng có nghĩa là tất cả các mẫu điều tra lúc này đều bị nhiễm TMV. Như vậy, có thể nói rằng TMV đang là virus gây bệnh chủ yếu cho thuốc lá ở Tân Biên và Bến Cầu vào thời điểm khảo sát. T ỷ l ệ % Tác nhân gây bệnh 51 0 10 20 30 40 50 60 70 80 TC1 TC2 TC3 Mẫu dương tính 4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc trên cây thuốc lá Sau khi so sánh kết quả chẩn đoán bằng phương pháp ELISA và triệu chứng trên lá cây thuốc lá quan sát được trên đồng ruộng, tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh được thể hiện qua Bảng 4.6 và Biểu đồ 4.5. Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc trên lá Triệu chứng Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%) Lá dày, phồng rộp (TC1) 2 8 25 Lá có khảm xanh – vàng (TC2) 55 70 78,6 Lá khảm nặng, hoại tử (TC3) 10 25 40 Chú thích: (+) : Dương tính TC1: Triệu chứng 1 [Hình 4.12 (D) và 4.13 (B)] TC2: Triệu chứng 2 [Hình 4.12 (C)] TC3: Triệu chứng 3 [Hình 4.13 (C) và 4.13 (D)] Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng Từ tỷ lệ này có thể cho phép nhận định: Các lá thuốc lá có triệu chứng khảm xanh – vàng (TC2) có khả năng nhiễm CMV và TMV (78,6%) khá cao. Một số cây thuốc lá có biểu hiện triệu chứng khác như: Cây lùn, còi cọc hơn so với các cây khác (tất cả được trồng cùng lúc và trong điều kiện canh tác như nhau) như trong Hình 4.13 (E). Nhưng trên lá của tất cả các cây có sự thay đổi hình thái vừa nêu trên đều mang một hay tất cả các triệu chứng đã xét trong Bảng 4.6. Vì vậy, có thể nói T ỷ l ệ % Triệu chứng 52 việc thu thập mẫu thuốc lá nhiễm CMV, TMV dựa vào triệu chứng biểu hiện trên lá cây sẽ dễ dàng hơn là thu thập theo các triệu chứng khác. Bên cạnh đó, cũng có một số cây thuốc lá có mang các triệu chứng như trên, nhưng lại không cho kết quả dương tính khi tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA. Điều này, một lần nữa cũng khẳng định rằng việc xác định cây nhiễm virus mà chỉ dựa vào triệu chứng biểu hiện là không hoàn toàn chính xác. Trong quá trình điều tra, thu thập mẫu, chúng tôi thấy có triệu chứng cong ngọn trên cây thuốc lá, là triệu chứng đặc trưng do TSWV gây ra. Tuy nhiên, những mẫu này, sau khi dùng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán đã không cho kết quả dương tính. Có lẽ, đó là do số lượng của TSWV quá ít, không đủ để biểu hiện thành phản ứng dương tính. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chưa xác định được tỷ lệ nhiễm bệnh của từng giống thuốc lá. Vì bà con nông dân ở đây đa số chỉ biết là mua giống tại công ty nào thôi, hầu như không quan tâm đến giống của cây thuốc lá đang trồng là gì. Một lý do nữa, là do chưa có điều kiện để đánh giá tình trạng nhiễm CMV, TMV và TSWV trên các cây thuốc lá được trồng trong nhà lưới (ngăn cách bọ trĩ, rệp thuốc lá mang virus tới lây nhiễm cho cây) và các cây thuốc lá được trồng trong vườn của Tổng Công ty Thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh, nên nghiên cứu này chỉ được thực hiện trên những cánh đồng trồng thuốc lá của các hộ gia đình. Vì thế, chúng tôi chưa khảo sát được tỷ lệ nhiễm virus của thuốc lá khi trồng ngoài tự nhiên và khi trồng trong điều kiện cách ly với côn trùng môi giới truyền bệnh. 53 (A) (B) (C) (D) Hình 4.12: Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu (2006) (A): Cây thuốc lá khỏe (B), (C), (D): Triệu chứng cây thuốc lá nhiễm virus TMV 54 (A) (B) (C) (D) (E) (F) (B), (C), (D), (E), (F): Triệu chứng cây nhiễm virus CMV và TMV Hình 4.13: Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên (2006) (A): Cây thuốc lá khỏe 55 4.2 Kết quả RT – PCR Sau khi có kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA, chọn những mẫu dương tính mạnh với TMV tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR.  Tiến hành ly trích RNA tổng số (80 µl) từ lá thuốc lá bằng kit ly trích Aurum TM Total RNA Mini Kit do Bio – Rad cung cấp.  Thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA (20 µl) với bộ kit iScriptTM cDNA Synthesis Kit cũng do Bio – Rad cung cấp. Kết quả RT – PCR thu được có thành phần hóa chất và chu trình nhiệt như sau: Bước 1: Tổng hợp cDNA Thành phần hóa chất: 5X iScript Reaction Mix 4 μl iScript Reverse Transcriptase 1 μl Nuclease free water 13 μl RNA tổng số 2 μl Tổng thể tích 20 μl Chu trình nhiệt: 5 phút 25oC 40 phút 42oC 5 phút 85oC Giữ ở 4oC Bước 2: Khuếch đại cDNA bằng PCR Thể tích Nồng độ cuối iTaq buffer 10X 5 μl 1 X MgCl2 2,5 μl 2,5 mM dNTP 1μl 200 µM iTaq DNA polymerase 0,5 μl 0,5 μl primer F 1 µl 0,4 μM primer R 1 µl 0,4 μM Nuclease free water 34 µl cDNA 5µl Tổng thể tích 50 μl 56 Chu trình nhiệt: 1 chu kỳ 3 phút ở 94oC 35 chu kỳ 1 phút ở 94oC 1 phút ở 57oC 1 phút 15 giây ở 72oC 1 chu kỳ 7 phút ở 72oC Giữ ở 4oC trong 10 phút.  Đổ gel điện di sản phẩm PCR Gel agarose có nồng độ 1,5%, tiến hành điện di với hiệu điện thế 50 V, cường độ dòng điện 245 mA, trong vòng 60 phút. Ngâm trong EtBr trong vòng 20 phút.  Kết quả điện di Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Tân Biên La : Thang chuẩn 1000 bp 1, 2, 3 : Sản phẩm PCR 3 mẫu 22, 26, 42 Sản phẩm PCR trên Hình 4.14 có kích thước khoảng 1000 bp. 1000 bp 57 Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Bến Cầu La : Thang chuẩn 1000 bp 4, 5, 6 : Sản phẩm PCR 3 mẫu 53, 54, 62 Sản phẩm PCR trên Hình 4.15 có kích thước khoảng 1000 bp. Kết quả điện di trên Hình 4.14 và Hình 4.15 đã cho thấy các sản phẩm PCR thu được đều có kích thước khoảng 1000 bp thay vì là 921 bp. Tuy kết quả này không đúng với lý thuyết nhưng các sản phẩm này có kích thước khá gần với kích thước lý thuyết. Các mẫu 22, 26, 42 (thu thập tại huyện Tân Biên) và các mẫu 53, 54, 62 (thu thập tại huyện Bến Cầu) là những mẫu cho kết quả dương tính với TMV rõ nhất trong chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA. Các mẫu này sau khi tiến hành RT – PCR thì các sản phẩm PCR thu được đều có kích thước khoảng 1000 bp. Năm 2005, Lâm Ngọc Hạnh, Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh đã tiến hành chẩn đoán TMV trên cây cà chua của tỉnh Lâm Đồng cũng bằng phương pháp RT – PCR., với cùng cặp mồi đang sử dụng. Kết quả sản phẩm PCR thu được cũng có kích thước khoảng 1000 bp. Điều này có thể chứng minh được rằng: Có sự hiện diện của TMV trong các mẫu thuốc lá thu thập được. Thuốc lá tại 2 huyện Tân Biên và Bến Cầu của tỉnh Tây Ninh nhiễm cùng môt dòng TMV. 1000 bp 58 Như vậy, bước đầu có thể kết luận, tại Việt Nam, cà chua và thuốc lá đã nhiễm cùng một dòng TMV. Tuy nhiên, dòng virus này lại có khác biệt với dòng virus được dùng để thiết kế cặp mồi. Vậy câu hỏi đặt ra là: Dòng TMV tại Việt Nam đã biến đổi như thế nào so với các dòng virus khác? Phải chăng đó là do cặp primer này thiết kế dựa trên dòng TMV của Trung Quốc, nó sẽ khuếch đại đoạn có kích thước là 921 bp đối với TMV nhiễm trên cây bệnh ở Trung Quốc. Nhưng sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 1000 bp, điều này có thể giải thích là dòng TMV tại Việt Nam đã có biến đổi trong cấu trúc. Sự biến đổi này xảy ra là do sự thay đổi về địa lý, khí hậu giữa 2 nước, nên TMV đã biến đổi cho phù hợp với điều kiện ngoại cảnh Việt Nam. Trong nghiên cứu này, vì chưa có điều kiện chẩn đoán TMV gây bệnh trên các loài cây khác và chưa giải trình tự đoạn sản phẩm PCR thu được nên chúng tôi chưa trả lời được chính xác câu hỏi trên. 59 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau khi tiến hành chẩn đoán TMV, CMV và TSWV trên các mẫu thuốc lá và đậu phộng tại 3 huyện Tân Biên, Bến Cầu, Dương Minh Châu thuộc tỉnh Tây Ninh, chúng tôi thu được kết quả sau: Thuốc lá và đậu phộng tại địa bàn điều tra, vào thời điểm điều tra, chưa có biểu hiện của việc nhiễm TSWV. Dịch bệnh virus trên thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh vào thời điểm nghiên cứu chủ yếu là do TMV gây nên (69,1%). Thuốc lá trồng tại huyện Tân Biên có tỷ lệ nhiễm CMV (60,6%) và TMV (69,2%) khá cao. Thuốc lá trồng tại huyện Bến Cầu nhiễm TMV là chủ yếu (68,8%). Bước đầu chẩn đoán được sự hiện diện của TMV trên thuốc lá trồng tại tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật RT – PCR. 5.2 Đề nghị Với những trở ngại và nghi vấn trong quá trình nghiên cứu bệnh virus trên thuốc lá và đậu phộng, chúng tôi có một số đề nghị sau: Tiếp tục theo dõi mức độ nhiễm TSWV trên cây thuốc lá và đậu phộng tại những thời điểm khác nhau và những vùng khác nhau tại tỉnh Tây Ninh. Nghiên cứu thêm về mức độ lây nhiễm, điều kiện phát triển, biện pháp phòng trừ của bệnh TMV, CMV và TSWV trên cây thuốc lá và đậu phộng nhằm hạn chế thiệt hại khi dịch bệnh xảy ra. Tiến hành ly trích thu RNA bằng phương pháp siêu ly tâm trong khuynh độ đường để so sánh với quy trình ly trích bằng kit. Thực hiện việc chẩn đoán TMV bằng kỹ thuật RT – PCR trên các loại cây khác, cũng là ký chủ của TMV, góp phần xác định rõ dòng TMV tại Việt Nam. Giải trình tự đoạn sản phẩm PCR trên để bổ sung vào ngân hàng dữ liệu gen của virus ở Việt Nam và hỗ trợ cho những nghiên cứu sâu hơn. 60 Phần 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Ngọc Bích, 2003. Bước đầu nghiên cứu một số bệnh virus chính trên vùng thuốc lá tỉnh Tây Ninh. Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005. Sinh học phân tử, tái bản lần thứ 4. Nhà xuất bản giáo dục, trang 190 – 198, 200 – 206. 3. Lâm Ngọc Hạnh, 2005. Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng quá trình chẩn đoán Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. 4. Vũ Công Hậu, Ngô Thế Dân, Trần Thị Dung, 1995. Cây lạc. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 199 – 223, 318 – 368. 5. Phạm Hoàng Hộ, 1993. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Trẻ, cuốn 2, tập 2, trang 968. 6. PGS. TS. Nguyễn Thị Lang, GS. TS. Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử. Giới thiệu và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, trang 87 – 98. 7. ThS. Võ Thị Thu Oanh, 2002. Bệnh cây đại cương. Bộ môn Bảo vệ thực vật. Khoa Nông học. Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh, trang 47 – 53. 8. Lê Đình Thụy, Phạm Kiến Nghiệp, 1996. Thuốc lá – Trồng và chế biến. Nhà xuất bản TP. Hồ Chí Minh, trang 14 – 17, 42 – 48, 77 – 84. 9. Nguyễn Đình Trường, 2005. Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. 61 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 10. Antigus, M. Lapidot, N. Ganaim, J. Cohen, O. Lachman, M. Pearlsman, B. Raccah and A. Gera, 1997. Biological and Molecular Characterization of Tomato Spotted Wilt Virus in Israel. Phytoparasitica 25 (4), page 319 – 330. 11. John R. Crowther, the International Atomic Agency, Vienna, Australia, 2001. The ELISA Guidebook, volume 149. Human Press, New Yersey, page 11 – 21. 12. Karen Delahaut, UW – Madison IPM Program, February 2002. Onion thrips. University of Wisconsin – Extension. 13. R. T. V. Fox, School of Plant Sciences, University of Reading, UK, 1993. Principles of Diagnostic Techniques in Plant Pathology. Cab International, Wallingford, Oxon OX1KDE UK, page 129 – 138. 14. Natalie P. Goldberg, Extension PlantPathologist, 2005. Tomato Spotted Wilt Virus. Guide H – 242. Cooperative Extension Service, College of Agriculture and Home Economic, New Mexico State University. 15. Tom Kucharek et al, March 2002. Tomato Spotted Wilt Virus of Agronomic, Vegetable and Ornamental Crops. Circ – 0914. 16. Georgia P. Love, Agricultural Extension Agent, Roberson County Center of the North Carolina Cooperative Extension Service, May 2004. Tomato Spotted Wilt Virus. 17. C. L. Madahar, Botary Departmbent, Panjab University, India, 1999. Molercular Biology of Plant viruses. Kluwer Acadimic Publishers. Printed in the United State of American, page 78 – 79. 18. M. J. McPherson, School of Biochemistry and Molercular Biology, University of Leeds, Leed, UK and S. G. Moller, Laboratory of Plant Molecular Biology, Rockefeller University, NewYork, USA, 2001. PCR. BIOS Scientific Publishers Ltd, 9 Newtwc Place, Magdulen Road, Oxford OX4 dRE, UK, 276 pages. 19. M. Murakami, M. Gallo – Meagher, D. W. Gorbet, R. L. Meagher, March 2006. Utilizing immuoassays to determine systemic tomato spotted wilt virus infection for elucidating field resistance in peanut. Crop Protection, volume 25, issue 3. ISSN 0261 – 2194. 20. Scott C. Ockey M. S., Senior Research Associate and Sherman V. Thomson Ph. D., Extension Plant Pathologist Emeritus. Tomato Spotted Wilt Virus. Exotic Pest Monitoring Series. EPMS 007. 62 21. Sambrook and Russell. Molecular Cloning, 2001. A laboratory manual, third edition, volume 2. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold spring Harbor, NewYork, page 8.46 – 8.61. 22. Sherwood, J. L., German, T. L., Moyer, J. W. and D. E. Ullman, 2003. Tomato Spotted Wilt. The Plant Health Instructor. DO1: 10.1094/PHI - 1 - 2003 - 0163 - 02. 23. Dr. Ken Whitman, LSU Plant Pathologist, 27 September 2004. Tomato Spotted Wilt Virus, volume 04 No. 9, page 2. 24. Plant Pathology Teacher Workshop, University of Georgia Department of Plant Pathology, 2001. Tomato Spotted Wilt Virus in Peanuts. TÀI LIỆU TỪ INTERNET 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. < bin/board/board.cgi?id=symptoms&action=view&gul=10&page=7&go_cnt=0 > 36. 63 Phụ lục 1 HÌNH KẾT QUẢ ELISA TEST VIRUS TSWV Các giếng D2, E2 của các Đĩa 1, Đĩa 2, Đĩa 3, Đĩa 4 và Đĩa 5 là các giếng đối chứng dương: Màu vàng. Các giếng C11 của Đĩa 1 và F8 của Đĩa 3: Màu vàng giống đối chứng dương là do nhiễm từ cơ chất tạo màu. 64 Phụ lục 2 BẢNG MẪU ĐIỀU TRA Mã số ..................................................................................................................... Nơi lấy mẫu ........................................................................................................... Chủ hộ ................................................................................................................... Giống cây .............................................................................................................. Tuổi cây ................................................................................................................. Tình trạng vườn ..................................................................................................... Cách trồng ............................................................................................................. Phương pháp trồng ................................................................................................ Diện tích trồng ....................................................................................................... Năng suất ............................................................................................................... Độ thuần của vườn ................................................................................................ Có vectơ truyền bệnh hay không ........................................................................... Mùa vụ ................................................................................................................... Bệnh có thường xảy ra không ............................................................................... Triệu chứng ........................................................................................................... 65