Khóa luận Đánh giá tình trạng nhiễm tomato spotted wilt virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật elisa và xây dựng quy trình chẩn đoán tomato spotted wilt virus bằng kỹ thuật RT – PCR

cây trồng. Khi nhiệt độ xuống thấp, bọ trĩ mang virus qua đông dƣới dạng côn trùng nằm trong đất. Khi xuân đến, thời tiết ấm áp, bọ trĩ sẽ di chuyển từ cỏ dại sang cây trồng để truyền bệnh. Do đó, TSWV cứ lây nhiễm từ năm này sang năm khác, từ vụ này đến vụ khác từ những loài bọ trĩ ký sinh trên cây. 2.2.3.8. Triệu chứng bệnh Triệu chứng cây nhiễm TSWV rất đa dạng, tùy theo tuổi cây, điều kiện canh tác, mức độ nhiễm bệnh. Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm chấm. Đầu tiên những đốm này có màu vàng, nhƣng sau đó những vùng bị chết sẽ chuyển sang màu nâu đỏ. Khi bị nhiễm virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát triển nghiêng về một bên, lá cây nhăn nheo, vặn vẹo, nhƣ bóp nát, thân cây bị uốn cong, ngã, rủ xuống, phát triển bất thƣờng. Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá rụng dần và chết. 14 Cây trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc có quả nhƣng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên vỏ quả, làm năng suất giảm và giảm giá trị cảm quan. (Nguồn: Ken Pernezny và cộng sự, 2003). Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trƣờng gây ra. Vì thế cách chẩn đoán bệnh theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không chính xác Hình 2.3. Triệu chứng TSWV trên cà chua 2.2.3.9. Khống chế bệnh do TSWV Hiện nay hai phƣơng pháp chính đƣợc sử dụng là sử dụng cây kháng và chiến lƣợc quản lý nhằm giảm tác hại của TSWV. 15  Sử dụng cây kháng Sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép thúc đẩy quá trình nhận dạng, chọn lọc và lai tạo cây mới. Những marker phân tử liên kết với tính kháng TSWV đã đƣợc tìm thấy trong những dòng cà chua phát triển từ những dòng lai giữa SW 307 (Brommonschenkel, Tanksley và Cho) và cây kháng TSWV. Một số giống cà chua lai kháng TSWV sẵn có trên thị trƣờng: Giống Amelia (HMX – 0800) do công ty Harris Moran Seed cung cấp. Đặc tính của giống này là trái chín khá sớm, trái to, kháng TSWV, tuyến trùng, và 3 nòi nấm Fusarium gây héo. Amelia đƣợc thử nghiệm ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher trên 3 năm gần đây và cho kết quả tốt. Giống EX 1405037 do công ty Seminis Seeds cung cấp. Đặc tính của giống này là trái cà chua to, chín hơi trễ. EX 1405037 không cho kết quả tốt nhƣ Amelia ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher vào năm 2002 vì thời gian chín lâu hơn. Giống BHN 444 và BNN 640 do Seigers và công ty hạt Seedway cung cấp. Đặc tính của giống BHN 444 là cho trái lớn nhƣng hình dạng trái hơi thô, giống BHN 640 có tính kháng với ba nòi nấm Fusarium gây héo và kháng TSWV và trái của nó nhỏ hơn nhƣng bóng hơn BHN 444.  Chiến lƣợc quản lý TSWV Hiểu biết rõ về mối quan hệ giữa kí chủ – ký sinh – vectơ đã giúp chúng ta phát triển những biện pháp canh tác nhằm làm giảm đáng kể thiệt hại do TSWV gây ra trên những cây trồng nhạy cảm. Nếu sử dụng riêng lẻ từng biện pháp thì hiệu quả sẽ không cao. Vì vậy ngƣời ta thƣờng kết hợp nhiều biện pháp với nhau để giảm đến mức tối thiểu thiệt hại do virus gây ra. Biện pháp quản lý hiệu quả nhất là phòng ngừa, bao gồm các kỹ thuật: Bảo vệ cây con: cây con rất dễ bị nhiễm TSWV vì vậy cây con cần đƣợc trồng ở những nơi có cây trồng nhạy cảm với TSWV, trồng trong nhà kính hoặc sử 16 dụng màng che cẩn thận. Phun thuốc diệt côn trùng đều đặn để làm giảm khả năng sống của bọ trĩ trong vƣờn ƣơm. Cần phải loại ra và tiêu hủy nhanh chóng những cây có biểu hiện bệnh và những cây nghi ngờ nhiễm bệnh tiềm ẩn. Tránh trồng độc canh, nên hạn chế trồng cùng một loại cây trồng nhiều lần trên một ruộng đất. Trồng luân canh giữa các loại cây trồng nhạy cảm và không nhạy cảm với TSWV để loại bỏ mầm bệnh. Trồng với mật độ thích hợp sẽ hạn chế đƣợc bệnh. Sử dụng cây trồng sạch bệnh, cây kháng bệnh. Loại bỏ những nguồn chứa TSWV, cày đất nơi thu hoạch, loại bỏ các loài cỏ dại là ký chủ của TSWV chung quanh đồng ruộng. Nên bỏ hoang các đồng ruộng bị nhiễm bệnh khoảng 1 tháng. Sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau, đúng liều lƣợng và thời gian hợp lý để tiêu diệt đƣợc nhiều loài bọ trĩ cùng một lúc và đạt đƣợc kết quả tốt nhất. Khống chế bọ trĩ bằng biện pháp sinh học là có hiệu quả và có lợi nhất lại không ảnh hƣởng đến môi trƣờng. 2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng (Vũ Triệu Mân, 2003) Triệu chứng là những biểu hiện bên ngoài, phản ánh đặc điểm riêng biệt của một loại bệnh do một nguyên nhân nào đó gây ra. Đối với bệnh này, chẩn đoán theo triệu chứng bệnh là một phƣơng pháp nhanh chóng, khá chính xác. Vì vậy, có thể căn cứ vào triệu chứng bên ngoài điển hình về hình thái vết bệnh, màu sắc vết bệnh, vị trí và bộ phận cây bị bệnh mà chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên trong một số trƣờng hợp cũng dẫn đến nhầm lẫn, nhất là trong trƣờng hợp chẩn đoán các bệnh có triệu chứng bên ngoài tƣơng tự nhau nhƣng do các tác nhân khác nhau gây ra. Triệu chứng bên ngoài vẫn có thể biến đổi ít nhiều 17 tùy thuộc vào đặc điểm của giống cây, kỹ thuật canh tác và yếu tố ngoại cảnh. Do đó, trong những trƣờng hợp phức tạp cần phải tiến hành chẩn đoán bệnh bằng các phƣơng pháp bổ sung khác. 2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị (Vũ Triệu Mân, 2003) Cây chỉ thị là những cây ký chủ nhƣng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh chóng. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị là một phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật. Đối với virus cây chỉ thị đƣợc chia làm hai nhóm: Nhóm cây nhiễm bộ phận: là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Nhóm cây nhiễm hệ thống: là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây. 2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử (Vũ Triệu Mân, 2003) Trong tế bào ký chủ, virus thƣờng ở dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng đặc trƣng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau. Các tinh thể này đôi khi rất khó quan sát thấy. Vì vậy, để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng nhƣ mô thực vật bị nhiễm bệnh, ngƣời ta sử dụng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại lớn. Phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã đƣợc làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi ngờ mẫu có lẫn virus khác. Ngoài ra ngƣời ta còn dùng lát cắt mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu đƣợc cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh đƣợc cắt. 18 2.3.4. Phƣơng pháp ELISA (Vũ Triệu Mân, 2003) Phƣơng pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung đều dựa trên cơ sở sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Phƣơng pháp ELISA cho phép phát hiện và định lƣợng các thành phần nhƣ là: peptide, kháng nguyên, kháng thể, enzyme, hormone…1978 Clark và Adam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật ELISA để chuẩn đoán bệnh virus hại khoai tây và từ đó kỹ thuật này đƣợc công nhận là có độ chính xác cao hơn các phƣơng pháp huyết thanh học thông thƣờng. Kỹ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ RIA (Radio Immuno Assay) thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn nhƣng vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau. Thành phần cơ bản của phản ứng ELISA gồm: kháng nguyên, kháng thể, và cơ chất tạo màu. Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cho tất cả các dạng ELISA là: ELISA trực tiếp (Direct ELISA): Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme). ELISA gián tiếp (Indirect ELISA): Phƣơng pháp này khác ELISA trực tiếp ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme). 19 Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (kháng thể sơ cấp) và kháng thể phát hiện (kháng thể thứ cấp). Kĩ thuật này cũng đƣợc phân làm hai dạng: Direct sandwich ELISA Indirect sandwich ELISA 2.3.5. Phƣơng pháp RT – PCR 2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR (Bùi Chí Bửu, 1999) Khi DNA polymerase hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sens primer hay forward primer) và một mồi ngƣợc (antisens primer hay reverse primer). PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bƣớc sau: Biến tính phân tử DNA (Denature) Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing) Tổng hợp mạch mới (Extension) Ba bƣớc này hợp thành một chu kì và đƣợc lặp lại nhiều lần. Những phản ứng này đƣợc thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho quá trình biến tính và bắt cặp. 20 2.3.5.2. Nested PCR (Mc Pherson M.J., 2000) Đây là dạng cải biến của phƣơng pháp PCR, trong đó phản ứng sẽ đƣợc thực hiện lần lƣợt với hai hay nhiều cặp mồi, sau đó các mồi còn lại sẽ khuếch đại những đoạn nằm bên trong của sản phẩm PCR ban đầu bằng cách sử dụng sản phảm PCR đầu tiên này làm khuôn mẫu. Phƣơng pháp nested – PCR cũng có thể thực hiện với một cặp mồi đầu tiên và một mồi đơn cho phản ứng nested – PCR sau đó. Phƣơng pháp này đƣợc gọi là Heminested – PCR (HN – PCR). Với phƣơng pháp này, độ đặc hiệu của phản ứng tăng lên nhiều do mồi “nested” sẽ loại bỏ hầu nhƣ tất cả các sản phẩm không đặc hiệu của lần PCR đầu tiên. Tuy nhiên sử dụng nhiều mồi nên độ nhạy của phản ứng cũng tăng lên, do đó phản ứng dễ nhiễm hơn so với PCR thông thƣờng. Vì vậy phải hết sức cẩn thận khi thao tác ở từng giai đoạn PCR . 2.3.5.3. RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) Cùng với các phƣơng pháp: Real Time PCR, Nested PCR thì RT – PCR là một cải biến của phƣơng pháp PCR thông thƣờng nhằm đáp ứng những mục đích sử dụng khác nhau. Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên ngƣời ta sử dụng kỹ thuật RT – PCR. Trƣớc hết RNA đƣợc chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc . Mồi sử dụng trong giai đoạn này có thể là mồi “ngƣợc” của PCR giai đoạn sau, có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với đuôi poly A của mRNA), mà cũng có thể là hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA. Sau đó cDNA đƣợc khuếch đại nhờ Taq polymerase. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng Tth polymerase cho cả hai giai đoạn. Kỹ thuật RT – PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp, không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp cổ điển nhƣ Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). 21 RT – PCR một bƣớc: trong kỹ thuật RT – PCR một bƣớc quá trình tổng hợp cDNA và quá trình khuếch đại diễn ra trong cùng một phản ứng. Hình 2.4. Quy trình RT – PCR một bƣớc RT – PCR hai bƣớc: trong kỹ thuật này quá trình tổng hợp cDNA và quá trình khuếch đại diễn ra ở phản ứng tách biệt nhau. Hình 2.5. Quy trình RT – PCR hai bƣớc 22  Tổng hợp cDNA trên khuôn RNA gồm ba bƣớc : Ly trích RNA tổng số, trong đó có RNA của virus. Tổng hợp cDNA reverse transcriptase. Tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm, primer để tổng hợp sợi DNA đầu tiên có thể đƣợc lai chuyên biệt với một gen đích hay có thể kết hợp với toàn RNA. Có ba loại primer có thể dùng trong tổng hợp cDNA. (1) Oligo (dT): kết hợp với đuôi poly A của mRNA của động vật hữu nhũ. (2) Primer chuyên biệt với trình tự đã chọn trên RNA đích. (3) Random hexanucleotide: có thể khởi đầu sự tổng hợp cDNA ở nhiều điểm trên RNA khuôn mẫu tạo ra nhiều đoạn bản sao của toàn phân tử RNA. Chúng hữu dụng khi RNA đích là quá dài hay chứa quá nhiều cấu trúc bậc hai đến nỗi sự tổng hợp cDNA không bắt đầu hiệu quả bởi oligo (dT) hay primer chuyên biệt. Trong hầu hết trƣờng hợp, mục đích của những nhà nghiên cứu là tạo cDNA ban đầu dài và chứa nhiều thành phần của phân tử bổ sung với trình tự RNA đích. Do đó primer chuyên biệt là lựa chọn tốt nhất. Tiếp đến là oligo (dT) cũng tốt cho sự lựa chọn. Random hexamer không chuyên biệt và tạo ra những phân tử cDNA dài, ngắn khác nhau đƣợc sử dụng khi những phƣơng pháp kia không hiệu quả.  Khuếch đại cDNA lên nhiều bản bằng PCR. Giai đoạn này gồm có 3 bƣớc nhƣ sau: Biến tính: chuyển dây đôi thành dây đơn Bắt cặp: primer gắn vào vị trí chuyên biệt có trình tự bổ xung với nó trên cDNA khuôn mẫu. Kéo dài: kéo dài chuỗi mới nhờ enzyme polymerase. Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần, để tạo nhiều sản phẩm khuếch đại. Ba giai đoạn này xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (thông thƣờng: 94oC, 55oC, 72oC) với sự trợ giúp của enzyme polymerase. Sự lặp lại theo chu kỳ thƣờng xảy ra khoảng 30 lần để làm tăng các DNA muốn có khoảng 100 triệu lần. Một kỹ thuật mới phát triển là kỹ thuật in situ RT – PCR cho phép khuếch đại các RNA ngay trên mô và tế bào. Kỹ thuật này có nguyên tắc nhƣ trên, đƣợc 23 tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame. 2.4. Một số kết quả nghiên cứu về TSWV 2.4.1. Nghiên cứu nƣớc ngoài Sonya Broughton, Roger Jones và Brenda Coutts (2004) nghiên cứu về biện pháp quản lý bọ trĩ và bệnh TSWV. John M. Sherman, James W. Moyer, và Margaret E. Daub (1998) khảo sát khả năng chống chịu của cây hoa cúc với sự biểu hiện gene N (Nucleocapsid) của virus TSWV. M. T. Momol, J. E. Funderburk, S. Olson và J. Stavisky (2002) đánh giá hiệu quả của việc sử dụng lớp phủ phản chiếu tia UV và sử dụng Acibenzolar – S – methyl nhằm quản lý TSWV. M. D. Bandla, L. R. Campbell, D. E. Ullman, và J. L. Sherwood (1997) sử dụng kỹ thuật điện di protein và phản ứng huyết thanh có đánh dấu huỳnh quang để nghiên cứu về sự tƣơng tác giữa Glycoprotein của TSWV với thụ thể tiếp nhận ở thành dạ dày bọ trĩ. 2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc Nghiên cứu về virus nói chung và TSWV nói riêng còn khá mới, chủ yếu là những nghiên cứu ở các trƣờng Đại học. Nguyễn Ngọc Bích, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM (2003) bƣớc đầu nghiên cứu một số bệnh virus (TSWV, CMV, TMV) bằng kỹ thuật DAS – ELISA. Trần Thị Thu Hà, trƣờng Đại học Nông Lâm, Tp. HCM (2005) điều tra bệnh TSWV trên cây thuốc lá trong vƣờn nhân giống cây con tại tỉnh Tây Ninh. 24 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian tiến hành nghiên cứu từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007. Địa điểm lấy mẫu: lấy mẫu cà chua có triệu chứng bệnh TSWV tại tỉnh Tiền Giang tiến hành thu mẫu và trữ ở -200C cho đến khi phân tích. Việc phân tích đƣợc tiến hành tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh thuộc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trƣờng (RIBET), Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Dụng cụ và thiết bị 3.2.1.1. Dụng cụ Cối, chày sứ Lọ đựng hóa chất Eppendorf Hộp đựng đầu tip Micropipette Đầu tip Đĩa ELISA (microplates) 96 giếng Ống đong Khay đổ gel Bồn chứa ethium bromide Các dụng cụ cung cấp kèm theo kit ly trích RNA 25 3.2.1.2. Máy móc, thiết bị Máy cất nƣớc Cân phân tích Máy li tâm Tủ cấy Tủ mát Tủ định ôn Bồn ủ nhiệt Máy rửa ELISA Bồn ủ ELISA Máy đọc ELISA Máy vortex (IKA Works) Máy PCR Lò viba (Electrolux) Máy điện di Máy đọc gel 3.2.2. Hoá chất 3.2.2.1. Hoá chất dùng trong kỹ thuật ELISA Sử dụng kit ELISA do Agdia cung cấp gồm các thành phần sau: Dịch trích mẫu (SEB1 extract buffer 1X) Dung dịch đệm để pha kháng thể (Coating buffer) Kháng thể (Capture antibody) Dịch rửa (PBST wash buffer) Đối chứng dƣơng (Positive control) Đối chứng âm (Negative control) Dung dịch đệm để pha kháng thể có gắn enzyme (ECI enzyme conjugate buffer) 26 Kháng thể gắn enzyme alkaline – phosphatase (Conjugate antibodies) Dung dịch đệm để pha chất chỉ thị màu (PNP substrate buffer) Chất chỉ thị màu p – NPP Ngoài ra còn sử dụng thêm: Cồn 70 % Nƣớc cất hai lần khử ion và hấp khử trùng 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kỹ thuật RT – PCR  Hóa chất dùng trong ly trích RNA: sử dụng kit ly trích SV total RNA Isolation System do Promega cung cấp. Những hóa chất có sẵn trong kit: Dịch trích mẫu (RNA lysis buffer) Dịch pha loãng RNA (RNA dilution buffer) Dịch rửa (RNA wash solution) DNase I dạng bột DNase stop solution Dịch pha loãng DNase I (Yellow core buffer và MnCl2) Nuclease free water Bên cạnh đó cần sử dụng thêm các hoá chất đã có sẵn trong phòng thí nghiệm: β – mercaptoethanol 14,2 M Ethanol 95 – 100 % NaOH 0,1 M EDTA 1M DEPC (Diethyl pyrocarbonate)  Hóa chất dùng chạy RT – PCR  RT – PCR một bƣớc Reverse transcription 10X buffer MgSO4, 25 mM dNTP mix, 10 mM M – MLV reverse transcriptase 27 Taq DNA polymerase Primer xuôi Primer ngƣợc RNasin Nuclease free water  RT – PCR hai bƣớc Dùng tạo cDNA: sử dụng kit tổng hợp cDNA (Reverse transcription system) do Promega cung cấp với các thành phần sau: AMV reverse transcriptase Recombinant RNasinR ribonuclease inhibitor Oligo(dT)15 primer (0,5 µg/µl) Radom primers (0,5 µg/µl) 1,2 kb kanamycin positive control RNA (0,5 µg/µl) dNTP mix, 10 mM Reverse transcription 10X buffer MgCl2, 25 mM Nuclease free water Hoá chất sử dụng phản ứng PCR: do Promega cung cấp gồm có: Green GoTaq flexi bufer 5X MgCl2 (25 mM) dNTPmix (10 mM) GoTag DNA polymerase (0,5 U/µl) Nƣớc không chứa nuclease (Nuclease – free water) Primer: Cặp mồi 1: L1 (4377 – 4396) R 5’ – AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC – 3’ Tm = 53,7 L2 (4121 – 4140) F 5’ – ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA – 3’ Tm = 56,5 (J.Morris) 28 Cặp mồi 2 : P28 (3977 – 3996) 5’ – AGA GTG ATC CAT CGG AAG CC – 3’ Tm = 54 M6 (4700 – 4723) 5’ – GCA ATA GAG AGG AAT AAT CGC TCC – 3’ Tm = 55  Hóa chất sử dụng trong điện di Agarose TAE 0,5X Loading dye Ethium bromide Ladder 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Nội dung nghiên cứu Lấy mẫu cà chua có triệu chứng TSWV tại tỉnh Tiền Giang để tiến hành phân tích. Tiến hành phản ứng ELISA với mẫu bệnh thu đƣợc. Thống kê và so sánh tỉ lệ nhiễm TSWV giữa các vùng lấy mẫu thông qua kết quả ELISA. Lấy mẫu ELISA có biểu hiện dƣơng tính mạnh khảo sát nhằm tìm ra quy trình RT – PCR phù hợp. 3.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu Do đặc tính cà chua đƣợc trồng rất phổ biến tại Tiền Giang nên việc lấy mẫu đƣợc tiến hành bằng cách liên hệ trực tiếp với hộ dân trồng cà chua. Tùy theo diện tích vƣờn trồng có thể lấy từ 10 – 15 mẫu, cách lấy mẫu theo sơ đồ bố trí lấy mẫu ở bảng 3.1, những mẫu còn lại đƣợc lấy một cách ngẫu nhiên. Lấy mẫu lá cà chua ở phần ngọn có triệu chứng bệnh TSWV trữ ở -200C cho đến khi tiến hành nghiên cứu (số lƣợng mẫu tùy vào số lƣợng thí nghiệm có thể tiến hành). Lấy mẫu cà chua không quá non và cũng không quá già. 29 30 Bảng 3.1. Sơ đồ bố trí lấy mẫu 1 3 5 2 4 Số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm Bảng 3.2. số lƣợng mẫu và vị trí lấy mẫu Tỉnh Huyện Xã Số lƣợng mẫu Tiền Giang Chợ Gạo Hòa Định 25 Bình Ninh 38 Gò Công Bình Nhì 42 Thạnh Nhật 30 Tổng số lƣợng mẫu 135 3.3.3. Phƣơng pháp phát hiện TSWV 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA Tiến hành theo hƣớng dẫn của protocol của kit ELISA Lấy 0,5 g mẫu trữ ở -200C cho vào cối thêm 2,5 ml dịch trích mẫu. Nghiền thật nát vụn, sau đó đổ vào eppendorf và ghi ký hiệu thật cẩn thận. 31 Đem ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 40C. Dùng micropipette hút phần dịch nổi sang một eppendorf mới và cũng ghi nhãn cẩn thận, trữ ở 40C Các bƣớc tiến hành: Bƣớc 1: Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí theo hƣớng dẫn của Kit Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H BF: ex tract buffer 1; 2…; 27: Số thứ tự của mẫu PC (Positive control) : Đối chứng dƣơng NC (Negative control): Đối chứng âm Substrate: chỉ load nƣớc cất Bƣớc 2: pha dịch đệm pha loãng kháng thể, pha loãng kháng thể 1/200, sau đó cho 100 µl kháng thể vào cột 2 – 11, dán băng keo và đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ. Bƣớc 3: rửa 3 lần với dung dịch đệm PBS – T bằng máy rửa. Bƣớc 4: cho nƣớc cất vào cột số 1(100 µl/giếng), cho đối chứng dƣơng và đối chứng âm vào 2 ô PC và 2 ô NC (100 µl/giếng), dịch nghiền mẫu (100 µl/giếng) vào ô từ 1 – 27. Đem ủ ở 40C qua đêm Bƣớc 5: rửa lại 3 lần với PBS – T bằng máy rửa. 32 Bƣớc 6: pha dung dịch đệm pha loãng kháng thể, pha loãng kháng thể có gắn enzyme 1/200. Hút 100 µl dung dịch kháng thể có gắn enzyme đã đƣợc pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau đó đem ủ ở 370C trong 2 giờ. Bƣớc 7: rửa lại 3 lần với PBS – T Bƣớc 8: hoà tan pNPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1 mg/ml của pNPP. Hút 100 µl cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ ở 370C trong 30 phút Bƣớc 9: đọc kết quả bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ.Trong đó, giá trị và biện luận của test ELISA đƣợc tính thông qua các giá trị đo OD của buffer, các đối chứng dƣơng, âm và của mẫu sau khi đã trừ đi giá trị OD của các giếng substrate (các giai đoạn đầu đƣợc phủ bằng nƣớc cất). OD mẫu = OD đọc đƣợc – OD của giếng substrate Giá trị OD này của mẫu sẽ đƣợc so sánh với một giá trị gọi là ngƣỡng (với ngƣỡng = hai lần giá trị OD trung bình của đối chứng âm) Kết quả: POS – đƣợc đánh giá là nhiễm bệnh khi OD của mẫu vƣợt xa ngƣỡng NEG – đƣợc đánh giá là không nhiễm bệnh khi giá trị OD của mẫu dƣới ngƣỡng. Ngoài ra, còn có thể đọc kết quả bằng mắt thƣờng thông qua sự tạo màu có thể nhìn thấy đƣợc của substrate bị thủy phân bởi enzyme: Màu vàng tƣơng ứng với kết quả dƣơng tính. Không màu tƣơng ứng với kết quả âm tính. Tuy nhiên phƣơng pháp này độ tin cậy không cao so với việc đọc kết quả bằng máy. 3.3.3.2. Phƣơng pháp RT – PCR Các mẫu có biểu hiện dƣơng tính mạnh với kỹ thuật ELISA sẽ đƣợc chọn để tiến hành phản ứng RT – PCR. Kỹ thuật RT – PCR đƣợc chia ra làm 2 dạng: RT – PCR một bƣớc (quá trình tạo cNDA và quá trình PCR diễn ra trong cùng 1 phản 33 ứng), RT – PCR hai bƣớc (quá trình tạo cDNA và quá trình PCR diễn ra trong 2 phản ứng riêng biệt).  Ly trích RNA Quá trình ly trích RNA đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit ly trích RNA (SV total RNA isolation system). Tuy nhiên ta phải chuẩn bị trƣớc một số dụng cụ và hóa chất sau: Nƣớc phải đƣợc xử lý với DEPC để khử RNase. Cối chày phải đƣợc hấp khử trùng sau khi đã đƣợc tráng nƣớc có chứa DEPC. Đầu tip, eppendorf phải đƣợc xử lý sao cho đảm bảo vô trùng và không còn sự hiện diện của enzyme phân hủy RNA. Pha DNase I từ dạng bột thành dạng lỏng Pha RNA lysis buffer Pha RNA wash solution Pha DNA stop solution Tris base pH = 7,5 Ethanol 70 %, 100 % β – mercaptoethanol Các bƣớc tiến hành ly trích RNA 1. Cân khoảng 30 mg mẫu lá có biểu hiện dƣơng tính với phản ứng ELISA, cắt ra từng miếng nhỏ (< 5 mm). Nghiền mịn trong nitơ lỏng. Chú ý không để cho mẫu bị chảy nƣớc trong lúc nghiền. 2. Cho 30 mg mẫu đã nghiền vào eppendorf 1,5 ml có nắp đậy. cho 175 µl RNA lysis buffer (đã bổ sung β – mercaptoethanol) vào eppendorf. 3. Thêm 350 µl RNA dilution buffer, trộn đều và ly tâm với tốc độ 12000 vòng ở 40C trong 10 phút. Hút dịch nổi sang eppendorf 1,5 ml. 4. Cho 200 µl ethanol 95 % vào eppendorf chứa dịch nổi, trộn bằng pipet 3 – 4 lần. 5. Hút dịch mẫu cho vào Spin Column Assembly (có trong kit). Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới ra khỏi Collection tube. 34 6. Cho 600 µl RNA wash solution (đã bổ sung ethanol 95 %) vào Spin Column Assembly. Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới. 7. Pha DNase I dạng bột với 275 µl Nuclease free water 8. Pha 5 µl DNase I + 40 µl yellow core buffer + 5 µl MnCl2. Cho 50 µl dung dịch DNase vào Spin Column Assembly, trộn đều bằng pipet. 9. Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Thêm 200 µl DNase stop solution (đã bổ sung ethanol 95 %). Ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. 10. Thêm 600 µl RNA wash solution. Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới. 11. Thêm 250 µl RNA wash solution vào Spin Column Assembly, ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 2 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới. 12. Chuyển Spin Column Assembly sang Elution tube 1,5 ml ( có trong kit). 13. Thêm 100 µl Nuclease free water vào Spin Column Assembly, ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. 14. Loại bỏ Spin Column Assembly, trữ Elution tube có chứa RNA ở -700C. Mẫu RNA ly trích đƣợc dùng làm nguyên liệu tiến hành chạy RT – PCR một bƣớc hoặc tổng hợp cDNA để chạy RT – PCR hai bƣớc.  Kiểm tra sản phẩm RNA bằng điện di Lấy mẫu RNA vừa ly trích (có sử dụng DNase I và không có sử dụng DNase I) tiến hành điện di trên gel agarose 1 %. So sánh kết quả đạt đƣợc. 35  RT – PCR một bƣớc Bảng 3.4. Thành phần hóa chất RT – PCR một bƣớc Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút M – MLV buffer 5X 1X 5 µl dNTPmix 10 mM 0,2 mM 0,5 µl Primer 1 10 µM 0,4 µM 1 µl Primer 2 10 µM 0,4 µM 1 µl MgSO4 25 mM 2 mM 2 µl M - MLV reverse transcriptase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl DNA polymerase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl RNA tổng số 2 – 5 µl Nuclease free water Thêm vào đủ 25 µl Tổng thể Tích 25 µl (Nguồn: Febbraio và Giugno, 2002) Chu kỳ nhiệt 1 chu kỳ: 480C trong 45 phút 94 0 C trong 2 phút 45 chu kỳ: 94 0 C trong 30 giây 50 0 C trong 1 phút 72 0 C trong 2 phút 1 chu kỳ: 720C trong 10 phút Giữ ở 40C 36 RT – PCR 2 bƣớc: Bƣớc 1: Tổng hợp cDNA. Quá trình tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của bộ kit (Reverse Transcription System). Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng tổng hợp cDNA nhƣ sau: Thể tích RNA tổng số tiến hành thí nghiệm là 2, 3, 4, 5 µl Primer sử dụng trong phản ứng tạo cDNA là Oligo(dT)15 primer và radom hexanucleotide primer Bảng 3.5. Thành phần hóa chất tổng hợp cDNA Chu kỳ nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA Đối với Oligo(dT)15 primer 42 0 C trong 15 phút 94 0C trong 5 phút Giữ ở 40C Thành phần Thể tích hút MgCl2 (25 mM) 4 µl Reverse Transcription buffer (10X) 2 µl dNTPmix (10 mM) 2 µl Recombinant RNasin ribonuclease inhibitor 0,5 µl AMV Reverse Transcription 1 µl Oligo(dT)15 Primer or Radom primer 4 µl Total RNA 2 – 5 µl Nuclease free water Thêm vào cho đủ 20 µl Tổng thể tích 20 µl 37 Đối với radom hexanucleotide primer Ủ nhiệt độ phòng 10 phút 42 0 C trong 15 phút 94 0C trong 5 phút Giữ ở 40C cDNA đƣợc tổng hợp (20 µl) có thể đem sử dụng ngay trong phản ứng PCR hoặc trữ ở -20 0C để chạy PCR sau. Bƣớc 2: Khuếch đại bằng PCR Bảng 3.6. Thành phần hoá chất PCR Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút Green GoTaq flexi buffer 5X 1X 10 µl MgCl2 25 mM 1,5 mM 3 µl dNTP mix 10 mM 0,2 mM 1 µl GoTaq DNA polymerase 5 U/ µl 1,25 U 0,25 µl Primer L1 10 µM 1 µM 5 µl Primer L2 10 µM 1 µM 5 µl cDNA 2 µl Nuclease free water 23,75 µl Tổng thể tích 50 µl Chu trình nhiệt cho phản ứng 1 chu kỳ 5 phút ở 940C 30 chu kỳ 1 phút ở 940C 1 phút ở 550C 1 phút ở 720C 38 1 chu kỳ 10 phút ở 720C Giữ ở 4oC trong 15 phút Trên đây là protocol chuẩn (J.Morris), nhƣng trong quá trình tiến hành chúng tôi thấy không cho kết quả nên đã có một số thay đổi để tìm ra qui trình phù hợp, một số thay đổi nhƣ sau: Hạ nhiệt độ bắt cặp từ 550C xuống 530C, 520C; 500C Hạ nhiệt độ bắt cặp kết hợp với tăng chu kỳ từ 30 chu kỳ lên 35 chu kỳ; 40 chu kỳ Hạ nhiệt độ bắt cặp, tăng chu kỳ kết hợp với tăng nồng độ mồi từ 1 µM lên 2 µM, 3 µM Tăng nồng độ MgCl2 từ 1,5 mM lên 2 mM; 2,5 mM Tăng nồng độ Taq DNA polymerase từ 1,25 U lên 1,5 U Hạ nhiệt độ bắt cặp xuống 520C, 530C; kết hợp tăng chu kỳ lên 40; tăng nồng độ mồi 2 µM; tăng nồng độ MgCl2 2 mM; tăng nồng độ Taq DNA polymerase 1,5 U. 3.3.3.3. Đổ gel điện di Chuẩn bị gel agarose 1 % 2 %. Agarose đã đƣợc nấu ở 650 W trong 1,5 phút, đổ vào khuôn đã chèn lƣợc để tạo giếng cho gel. Khi gel đông lấy lƣợc ra, ngâm gel trong dung dịch TAE 0,5X. Hút 2 μl loading dye trộn đều với 4 μl mẫu PCR. Bơm cẩn thận 6 μl hỗn hợp mẫu và loading dye vào giếng. Chạy điện di: hiệu điện thế 50 V, cƣờng độ dòng điện 250 mA, trong 60 phút. Lấy gel ra, nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (1 %) trong 20 phút. Rửa gel Đọc kết quả bằng máy đọc gel Chụp hình gel để lƣu lại. 39 Kết quả phản ứng PCR dƣơng tính : Có băng 276 bp đối với cặp mồi L1, L2 Có băng 704 bp đối với cặp mồi P28, M6 40 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật ELISA 4.1.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc huyện Chợ Gạo Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại xã Bình Ninh và xã Hòa Định thuộc huyện Chợ Gạo Xã Tổng số mẫu Số mẫu dƣơng tính Tỉ lệ nhiễm (%) Hòa Định 25 3 12,0 Bình Ninh 38 5 13,16 12,00 13,16 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 HÒA ĐỊNH BÌNH NINH XÃ TỈ LỆ (%) Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại huyện Chợ Gạo 41 Qua kết quả trên ta thấy tỉ lệ nhiễm TSWV tại huyện Chợ Gạo tƣơng đối thấp, cụ thể nhƣ sau: Xã Hòa Định 12,0 % Xã Bình Ninh 13,16 % Nhận xét: tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã khảo sát thuộc huyện Chợ Gạo là tƣơng đƣơng nhau. Nhƣ vậy có thể kết luận rằng bệnh TSWV chƣa chỉ phân tán rải rác tại huyện Chợ Gạo, bệnh không tập trung tại một địa điểm nhất định và chƣa phát thành đại dịch tại đây 4.1.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc thị xã Gò Công Bảng 4.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại xã Bình Nhì và xã Thạnh Nhật thuộc thị xã Gò Công Xã Tổng số mẫu Số mẫu dƣơng tính Tỉ lệ nhiễm (%) Bình Nhì 42 6 14,29 Thạnh Nhật 30 3 10,0 10,00 14,29 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 BÌNH NHÌ THẠNH NHẬT XÃ TỈ LỆ (%) Đồ thị 4.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại thị xã Gò Công 42 Kết quả trên cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV hai xã khảo sát thuộc thị xã Gò Công cũng tƣơng đối thấp, cụ thể nhƣ sau: Xã Bình Nhì 14,29 % Xã Thạnh Nhật 10,0 % Tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV tại xã Bình Nhì cao hơn xã Thạnh Nhật, tuy nhiên sự khác biệt là không đáng kể . Điều này đã nói lên một điều là TSWV cũng xảy ra rải rác tại thị xã Gò Công, bệnh chƣa đủ điều kiện phát triển thành đại dịch ở thời điểm khảo sát. 4.1.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công Bảng 4.3. Tỉ lệ nhiễm TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công Địa bàn Tổng số mẫu Số mẫu dƣơng tính Tỉ lệ nhiễm (%) Huyện Chợ Gạo 63 8 12,7 Thị xã Gò Công 72 9 12,5 Tổng 135 17 12,6 12,70 12,50 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 H.CHỢ GẠO TX.GÒ CÔNG ĐỊA BÀN TỈ LỆ (%) Đồ thị 4.3. Tỉ lệ nhiễm TSWV huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công 43 Thông qua kết quả trên ta thấy tỉ lệ nhiễm TSWV ở huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công là ngang nhau. Nhƣ vậy từ kết quả ELISA đã phần nào cho chúng ta biết tình hình nhiễm TSWV tại tỉnh Tiền Giang là không cao, trung bình khoảng 12,6 %. Bệnh TSWV chƣa phát triển thành dịch một phần là do ảnh hƣởng của điều kiện tự nhiên nơi đây buộc ngƣời dân nơi đây xuống giống đồng loạt, ngƣời dân thƣờng xuyên sử dụng thuốc diệt công trùng, ngƣời dân đã biết phủ bạt để hạn chế dịch bệnh, cộng thêm vào đó là ngƣời dân thay đổi các loại cây trồng khác nhau, vệ sinh đồng ruộng nên virus không có cây kí chủ quanh năm, nhƣng không đƣợc chủ quan bởi vì với sự phát tán rộng rãi của virus này là nguy cơ tìm ẩn rất nguy hiểm, có thể bùng phát thành đại dịch bất cứ lúc nào nếu không có biện pháp quản lý phù hợp. Tỉ lệ nhiễm TSWV theo độ tuổi và theo giống rất khó xác định vì: Thời điểm xuống giống tại địa bàn điều tra là đồng loạt nhau Đối với tên giống cây thì ngƣời dân rất ít quan tâm. 4.1.4. Tỉ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng Qua đánh giá khách quan có thể ƣớc tính tỉ lệ nhiễm TSWV tại tỉnh Tiền Giang là khoảng 60 %. So sánh tỉ lệ nhiễm bệnh qua triệu chứng và kết quả ELISA ta thấy có điều bất hợp lý là tỉ lệ nhiễm TSWV qua triệu chứng cao hơn nhiều so vơi kết quả ELISA (cao gấp 2,6 lần). Tuy nhiên không thể chỉ dựa vào điểm này mà kết luận phƣơng pháp ELISA không chính xác, bởi vì nguyên tắc phản ứng ELISA dựa vào sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể nên có độ đặc hiệu và độ tin cậy rất cao. Từ kết quả trên cho thấy không thể chỉ dựa vào triệu chứng để kết luận tỉ lệ nhiễm bệnh đƣợc. Bởi vì trên cây trồng có rất nhiều bệnh khác nhau, triệu chứng của chúng tƣơng tự nhau, thêm vào đó sự tƣơng tác giữa các bệnh có thể tạo ra những triệu chứng của bệnh khác. Ngoài ra, triệu chứng bệnh dƣới điều kiện môi 44 trƣờng khác nhau thì sẽ biểu hiện thành những triệu chứng khác nhau rất khó nhận biết. 4.2. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật RT – PCR 4.2.1. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA (a) (b) Hình 4.1. Kết quả điện di RNA tổng số Chú thích: Hình 4.1.a không sử dụng DNase I trong quá trình ly trích. Hình 4.1.b có sử dụng DNase I trong quá trình ly trích So sánh kết quả Hình 4.1.a và Hình 4.1.b ta thấy có sự khác biệt rất lớn giữa sử dụng DNase I và không sử dụng DNase I trong quá trình ly trích. Ở Hình 4.1.a sản phẩm RNA có rất nhiều tạp, tạp này có thể là DNA hoặc RNA của tế bào thực vật hoặc là cả hai bởi vì khi nhuộm trong ethium bromide thì cả DNA và RNA đều có thể phát sáng dƣới tia UV. Ngƣợc lại ở Hình 4.1.b sản phẩm RNA tƣơng đối sạch, có thể là DNase I đã phân giải phần lớn các phân tử DNA nên khi nhuộm với ethium bromide thì không còn đủ số lƣợng để phát sáng dƣới tia UV. Khi so sánh kết quả Hình 4.1.a và Hình 4.1.b thì ta có thể khẳng định: Tạp trong quá trình ly trích RNA (không sử dụng DNase I) phần lớn là DNA tế bào thực vật. Vì khi sử dụng DNase I thì kết quả điện di không thấy xuất hiện tạp. 45 Kết quả ly trích RNA đã không đạt kết quả hoặc do lƣợng RNA quá ít nên không đủ để phát sáng. 4.2.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA 1 2 3 4 Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA Chú thích: Giếng 1: thực hiện phản ứng reverse transcription với 2 µl RNA tổng số Giếng 2: thực hiện phản ứng reverse transcription với 3 µl RNA tổng số Giếng 3: thực hiện phản ứng reverse transcription với 4 µl RNA tổng số Giếng 4: thực hiện phản ứng reverse transcription với 5 µl RNA tổng số Kết quả điện di cho thấy khi chạy phản ứng reverse transcription với các thể tích RNA tổng số lần lƣợt 2 µl, 3 µl, 4 µl và 5 µl đều không cho sản phẩm cDNA trên gel điện di. Điều này có thể do lƣợng RNA tổng số ly trích đƣợc quá ít nên khi chạy reverse transcription sản phẩm cDNA tạo ra quá ít nên không phát sáng dƣới tia UV sau khi nhuộm ethium bromide, hoặc cũng có thể là quá trình reverse transcription đã không thành công. 46 4.2.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi Chúng tôi đã tiến hành Blast trên NCBI để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và thu đƣợc kết quả là cả 2 cặp mồi L1, L2 và P28, M6 đều chỉ bắt cặp đặc hiệu với virus TSWV dbj|D10066.1|TSWLRPOLM Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds. Length=8897 4.2.4. Kết quả phản ứng RT – PCR 4.2.4.1. Phản ứng RT – PCR hai bƣớc Sau khi thay đổi hầu hết các thông số phản ứng, kết quả chạy RT – PCR hai bƣớc không cho kết quả dƣơng tính với virus TSWV, chúng tôi đƣa ra nhận định sau: Kết quả ly trích RNA đã không thành công Do quá trình tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành với mồi ngẫu nhiên hay mồi Oligo (dT) nên đôi khi không tạo ra sản phẩm là các đoạn gen cần khuếch đại. Hàm lƣợng RNA tổng số quá thấp đến việc cDNA đƣợc tạo ra rất ít. Trong khi đó chúng ta chỉ sử dụng một lƣợng nhỏ sản phẩm cDNA để chạy PCR nên không cho kết quả dƣơng tính. 4.2.4.2. Phản ứng RT – PCR một bƣớc Sau khi phản ứng RT – PCR hai bƣớc không cho kết quả chúng tôi đã tiến hành chạy thử nghiêm quy trình RT – PCR một bƣớc với cặp mồi L1, L2và đã cho kết quả nhƣ sau: 47 Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm RT – PCR một bƣớc Chú thích: L: Ladder Từ kết quả trên ta thấy bên cạnh băng sản phẩm (276 bp) có xuất hiện băng sản phẩm phụ khoảng 140 bp. Điều này có thể do: Nồng độ MgCl2 quá cao (2 mM) nên ảnh hƣởng đến độ đặc hiệu của mồi. Nhiệt độ bắt cặp thấp (500C) so với Tm của mồi lần lƣợt là 53,70C và 56,5 0C làm giảm độ đặc hiệu của mồi. Nồng độ Taq polymerase cao (2,5 U) cũng làm tăng mức độ tạp của sản phẩm RT – PCR. Do điều kiện hạn chế của đề tài, ban đầu chúng tôi chỉ chuẩn bị hóa chất để chạy RT – PCR hai bƣớc nên chúng tôi chƣa có đủ điều kiện để tối ƣu, phản ứng RT – PCR một bƣớc chỉ dừng lại mức thử nghiệm. Nhận định chung Sau khi kết hợp kết quả phản ứng ELISA, phản ứng RT – PCR một bƣớc và phản ứng RT – PCR hai bƣớc có thể kết luận có hai nguyên nhân làm phản ứng RT – PCR không ra kết quả: Phản ứng tạo cDNA đã không tạo ra sản phẩm chứa đoạn gen mong muốn. Hàm lƣợng RNA tổng số quá ít nên khi sử dụng lƣợng nhỏ (2 – 5 µl) để tổng hợp cDNA, sau đó lại chỉ dùng 2 µl trong tổng số 20 µl sản phẩm cDNA để chạy PCR. Nhƣ vậy lƣợng cDNA hút đƣợc để tiến hành PCR là rất ít hoặc có thể không có. 276 bp Phần tạp L 48 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Sau khi tiến hành chẩn đoán bệnh TSWV trên cà chua tại huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công thuộc tỉnh Tiền Giang chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Tỉ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra Xã Hòa Định: 12,0 % Xã Bình Ninh: 13,16 % Xã Bình Nhì: 14,29 % Xã Thạnh Nhật: 10,0 % Tỉ lệ nhiễm theo triệu chứng trung bình trong tỉnh là 60,0 % Chƣa xây dựng đƣợc quy trình RT – PCR hai bƣớc chẩn đoán TSWV. Bƣớc đầu tìm ra đƣợc quy trình RT – PCR một bƣớc chẩn đoán bệnh TSWV, tuy nhiên cần tối ƣu một vài thông số để đạt hiệu quả tốt hơn. 5.2. Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu mức độ gây hại theo giống, theo độ tuổi và theo các thời điểm khác nhau trong năm. Đặc biệt nghiên cứu khả năng lây nhiễm TSWV trên các đối tƣợng khác. Kết hợp sử dụng cây chỉ thị chẩn đoán sớm bệnh TSWV trên đồng ruộng. Tiếp tục xây dựng quy trình RT – PCR hia bƣớc chẩn đoán TSWV. Dù quy trình RT – PCR một bƣớc cho ra sản phẩm nhƣng kết quả vẫn còn tạp. Chúng tôi đề nghị thay đổi các thông số về nhiệt độ, thời gian, số chu kì, hóa chất (Taq polymerase, MgCl2,MgCl2, primer) lƣợng RNA khuôn mẫu…. để kết quả tốt hơn. 49 Đối với phản ứng RT – PCR hai bƣớc để khắc phục trƣờng hợp hàm lƣợng RNA tổng số quá ít nên xây dựng quy trình Nested – PCR. Giải trình tự sản phẩm PCR để khẳng định chắc chắn hơn về kết quả PCR. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Mai Thị Phƣơng Anh, Trần Văn Lài và Trần Khắc Thi, 1996. Rau và trồng rau (giáo trình cao học nông nghiệp). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 254 trang 2. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chinh, 2003. Cẩm nang sâu bệnh hại cây trồng (quyển 2: cây thực phẩm). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 596 trang 3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2005. Sinh học phân tử (Giới thiệu phương pháp và ứng dụng). Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 238 trang 4. Tạ Thu Cúc, 1999. Kỹ thuật trồng cà chua. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP.Hồ Chí Minh, Việt Nam. 104 trang 5. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp – Ứng dụng). Tái bản lần thứ nhất. Nhà xuất bản Giáo dục, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 301 trang 6. Lâm Ngọc Hạnh, 2005. Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng quá trình chẩn đoán Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 114 trang 7. Nguyễn Thị Lan, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 219 trang 8. Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi, 2004. Kỹ thuật di truyền và ứng dụng. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia, Hà Nội, Việt Nam. 304 trang 51 9. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 103 trang. 10. Nguyễn Đình Trƣờng, 2005. Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 85 trang 11. Khoa Nông Học, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 2006. Giáo trình cây rau. 175 trang TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 12. Craig H. Canaday, 2007. Tomato spotted wilt virus (TSWV) information and control strategies. Dept of Entomology and Plant Pathology, The University of Tennessee, West Tennessee Research and Education Center (WTREC) Jackson, Tennessee. 8 pages 13. Sonya Broughton, Roger Jones and Brenda Coutts, 2004. Management of thrips and tomato spotted wilt virus. Farmnote No. 69/2004. 4 pages 14. M.J. McPherson and S.G. Moller, 2000. PCR. BIOS Scientific Publishers Ltd. Chapter 3/p 23 – 59 15. Paul Maris, 2004. Evaluation of thrips resistance in pepper to control Tomato spotted wilt virus infection. Thesis Wageningen University – with references – with summary in Dutch. ISBN 90 – 8504 – 002 – 7. 120 pages 16. J.Morris, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, Y041 1LZ, UK. Protocol for the diagnosis of quarantine organisms. 35 pages 17. H. D. Shew and G. B. Lucas, 1990. Compendium of Tobacco disease. APS PRESS. 67 pages 18. College of Agricultural & Environmental Sciences, 2005. Tospoviruses In Solanaceae and Other Crops in The Coastal Plain of Georgia. Research report number 704, december, 2005. 40 pages 52 19. Introduction to Antibodies – Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (ELISA). 20. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoadSorbent Assay). INTERNET 21. 22. 23. 24. 25. PHỤ LỤC Phụ lục 1 Hình chụp kết quả ELISA Phụ lục 2 Kết quả blast với cặp mồi L1, L2 Distance tree of results Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident Links AB190813.1 Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence 37.4 37.4 34% 3.3 100% AY070218.1 Tomato spotted wilt virus RNA- dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds 37.4 37.4 34% 3.3 100% D10066.1 Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds 37.4 74.7 68% 3.3 100% dbj|AB190813.1| Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence Length=8917 Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus Query 39 aTCAGTCGAAATGGTCGGCA 58 |||||||||||||||||||| Sbjct 4133 ATCAGTCGAAATGGTCGGCA 4152 gb|AY070218.1| Tomato spotted wilt virus RNA-dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds Length=8640 Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus Query 39 aTCAGTCGAAATGGTCGGCA 58 |||||||||||||||||||| Sbjct 4100 ATCAGTCGAAATGGTCGGCA 4119 dbj|D10066.1|TSWLRPOLM Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds Length=8897 Sort alignments for this subject sequence by: E value Score Percent identity Query start position Subject start position Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus Query 39 aTCAGTCGAAATGGTCGGCA 58 |||||||||||||||||||| Sbjct 4121 ATCAGTCGAAATGGTCGGCA 4140 Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 AATTGCCTTGCAACCAATTC 20 |||||||||||||||||||| Sbjct 4396 AATTGCCTTGCAACCAATTC 4377 Phụ lục 3 Kết quả blast với cặp mồi P28, M6 Distance tree of results Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident Links AY070218.1 Tomato spotted wilt virus RNA- dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds 44.6 44.6 43% 0.020 100% D10066.1 Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds 44.6 81.9 80% 0.020 100% AB198742.1 Tomato spotted wilt virus gene for L protein, complete cds 39.2 39.2 43% 0.83 95% AB190813.1 Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence 39.2 39.2 43% 0.83 95% gb|AY070218.1| Tomato spotted wilt virus RNA-dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds Length=8640 Score = 44.6 bits (48), Expect = 0.020 Identities = 24/24 (100%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Minus Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 |||||||||||||||||||||||| Sbjct 4698 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 4675 dbj|D10066.1|TSWLRPOLM Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds Length=8897 Sort alignments for this subject sequence by: E value Score Percent identity Query start position Subject start position Score = 44.6 bits (48), Expect = 0.020 Identities = 24/24 (100%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Minus Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 |||||||||||||||||||||||| Sbjct 4723 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 4700 Score = 37.4 bits (40), Expect = 2.9 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 AGAGTGATCCATCGGAAGCC 20 |||||||||||||||||||| Sbjct 3977 AGAGTGATCCATCGGAAGCC 3996 dbj|AB198742.1| Tomato spotted wilt virus gene for L protein, complete cds Length=8913 Score = 39.2 bits (42), Expect = 0.83 Identities = 23/24 (95%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Plus Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 |||||||||||||||||| ||||| Sbjct 4183 GCAATAGAGAGGAATAATTGCTCC 4206 > dbj|AB190813.1| Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence Length=8917 Score = 39.2 bits (42), Expect = 0.83 Identities = 23/24 (95%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Minus Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 |||||||||||||||||| ||||| Sbjct 4734 GCAATAGAGAGGAATAATTGCTCC 4711 Phụ lục 4 Thành phần hóa chất phản ứng RT – PCR một bƣớc đã chọn Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút M – MLV buffer 5X 1X 5 µl dNTPmix 10 mM 0,2 mM 0,5 µl Primer 1 10 µM 0,4 µM 1 µl Primer 2 10 µM 0,4 µM 1 µl MgSO4 25 mM 2 mM 2 µl M - MLV reverse transcriptase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl DNA polymerase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl RNA tổng số 2 – 5 µl Nuclease free water Thêm vào đủ 25 µl Tổng thể Tích 25 µl Phụ lục 5 PHIẾU ĐIỀU TRA Mã số ..................................................................................................................... Nơi lấy mẫu ........................................................................................................... Chủ hộ ................................................................................................................... Giống cây .............................................................................................................. Tuổi cây ................................................................................................................ Tình trạng vƣờn .................................................................................................... Cách trồng ............................................................................................................. Độ thuần ................................................................................................................ Diện tích trồng ...................................................................................................... Năng suất .............................................................................................................. Mùa vụ .................................................................................................................. Bệnh có thƣờng xảy ra không ............................................................................... Triệu chứng ...........................................................................................................