Khóa luận Điều chế kháng huyết thanh thỏ và khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ đối với vi khuẩn Streptococcus sp

kháng thể tự nhiên trong lớp nhớt này đặc hiệu với các epitope có chứa thành phần carbohydrate của vách tế bào kháng nguyên. Trong lớp nhớt còn phát hiện có cả kháng thể đặc hiệu. Các phân tử hòa tan trong đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Gồm một số chất sau: lectines, lytic enzyme, transferrin/lactoferrin, ceruloplasmin, protein C – raeactive, interferon (IFN) đảm nhận các chức năng bổ trợ cho các đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Bổ thể Bổ thể là một kháng thể không đặc hiệu có trong huyết thanh tươi của các loài động vật, có tác dụng làm tan vi khuẩn đã được kháng thể cảm ứng. (Nguyễn Vĩnh Phước, 1979; trích bởi Hoàng Hải Hóa, 2001.) Trong huyết thanh cá tồn tại khoảng hơn 20 loại bổ thể khác nhau, chúng hoạt động qua hai cơ chế: hoặc tương tác với kháng thể đặc hiệu, hoặc hoạt động một cách không đặc hiệu với các phân tử ở bề mặt vật kí sinh (Sakai, 1992; trích bởi Fox, 2005.). 2.7.2. Đáp ứng miễn dịch thu đƣợc ở cá ( miễn dịch đặc hiệu) Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu có tính đặc hiệu cao đối với tác nhân gây bệnh . Sự đáp ứng này càng hoàn thiện sau mỗi lần tiếp xúc với tác nhân gây bệnh. Hệ thống miễn dịch đặc hiệu có thể ghi nhớ lại tác nhân gây bệnh và ngăn cản tác động gây bệnh của chúng ở lần tiếp xúc lặp lại tiếp theo (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Sự đáp ứng miễn dịch đặc hiệu bao gồm: Miễn dịch thể dịch: Với vai trò tham gia quan trọng của các tế bào lympho B. Ở cá, do thiếu tủy sống, sự trưởng thành và tăng sinh của các tế bào lympho B diễn ra ở lách và phần trước của thận (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Cá chỉ tổng hợp được một lớp Ig (immunoglobulin) tương đương với IgM ở thú. IgM ở cá xương có dạng tetreametric, ở cá sụn có dạng pentametric, trong khi ở cá mập và cá đuối có dạng monometric (Ambrosius và ctv., 1982; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). IgM là dạng Ig chủ yếu được tạo ra trong các đáp ứng miễn dịch thì đầu ở 21 thú. Ở cá không có kháng thể IgG. IgM có vai trò hoạt hóa bổ thể, có vai trò trong sự opsonin hóa, trung hòa virus và sự ngưng kết (Tizard, 1987; trích bởi Stoskopf S.K., 1993). Ở lớp nhớt của cá cũng có sự có mặt của các kháng thể loại IgM và Ig tương tự như IgA ở thú (St-Louis-Cornier và ctv., 1984; Lobb, 1987; trích bởi Stoskopf, 1993). Miễn dịch qua trung gian tế bào: Các lympho bào T sinh ra từ tuyến ức của cá giúp cho sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào . Sau các đáp ứng của đại thực bào, các lympho bào T – helper sẽ được kích hoạt, trưởng thành thành các tế bào effector. Nó nhận diện được kháng nguyên và gắn bám vào kháng nguyên thông qua các thể nhận trên bề mặt của các đại thực bào, từ đó kích thích đại thực bào sản sinh các loại cytokine. Cytokine tác động gián tiếp gây ra một loạt các phản ứng nhờ các quần thể tế bào khác. 2.8. Giới thiệu về chất bổ trợ 2.8.1. Nguyên lý tác dụng của chất bổ trợ Cơ chế tác động của chất bổ trợ dùng trong vaccine được giải thích như sau: Chất bổ trợ có tác dụng gây viêm, kích thích quá trình thực bào, giúp quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra mạnh hơn. Các chất bổ trợ hấp thu kháng nguyên và thải kháng nguyên từ từ ra từ chỗ tiêm. Chất bổ trợ còn có tác dụng lên tế bào lympho T hỗ trợ (TH). 2.8.2. Các loại chất bổ trợ thông dụng Các nhà khoa học đã tìm ra hàng trăm chất có tác dụng như chất bổ trợ cho vaccine. Tuy nhiên đa số trong các chất này, ngoài tính làm tăng khả năng miễn dịch và kéo dài thời gian miễn dịch cho vaccine, chúng lại có độc tính tương đối cao, vì thế không được sử dụng rộng rãi mà chỉ có ý nghĩa trong nghiên cứu và trong phòng thí nghiệm. Để chọn chất bổ trợ ta nên cân nhắc giữa độ an toàn và tính kích thích miễn dịch sao cho phù hợp. Hiện nay các chất bổ trợ được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất vaccine gồm các nhóm:  Nhóm chất vô cơ Nhôm hydroxit (Al(OH)3) – keo phèn 22 Nhôm phosphat (AlPO4) Nhôm kali sulfat (AlK(SO4)2.12H2O) – phèn chua  Nhóm chất hữu cơ Gồm những chất chủ yếu như protamin, mỡ động vật, dầu thực vật, dầu khoáng. Qua nhiều thực nghiệm cho thấy: một chất bổ trợ được chọn dùng để chế vaccine, ngoài hoạt tính kích thích sinh miễn dịch không đặc hiệu mạnh mẽ còn phải có tính an toàn cao, nghĩa là không gây phản ứng phụ sau khi tiêm (Nguyễn Mạnh Thắng, 2003). 2.9. Một số nét về vaccine phòng bệnh cho cá 2.9.1. Nguyên tắc ứng dụng vaccine Nguyên tắc của việc ứng dụng vaccine là dựa vào hai đặc tính cơ bản của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Đó là tính đặc hiệu và sự ghi nhớ miễn dịch. Các tế bào ghi nhớ cho phép hệ thống miễn dịch phát triển sự đáp ứng mạnh hơn khi có lần tiếp xúc lặp lại với kháng nguyên. Sự đáp ứng thứ cấp này đồng thời nhanh hơn và có hiệu quả hơn sự đáp ứng ban đầu. Nguyên tắc của vaccine là sử dụng các vi sinh vật (vi khuẩn, virus) hoặc độc tố của chúng đã được cải biến (làm yếu, gây chết) làm cho chúng trở nên một tác nhân không gây bệnh nhưng không làm mất tính kháng nguyên của chúng (Nguyễn Đình Bảng và Nguyễn Thị Kim Hương, 2003). Miễn dịch học cá có lịch sử ngắn hơn nhiều so với miễn dịch học người và thú. Báo cáo đầu tiên về vaccine trên cá là nghiên cứu về vaccine phòng bệnh furunculosis của Duff vào năm 1942 (Souter, 1983), đến nay đã có nhiều công trình nghiêu cứu về vaccine cho cá. Đặc biệt từ khi nhiều nhược điểm của các biện pháp phòng trị bệnh theo con đường hoá trị liệu bộc lộ nhiều nhược điểm, gây tác hại đến người tiêu dùng và môi trường, việc nghiên cứu và sử dụng vaccine phòng bệnh cho cá càng thêm sự khích lệ. Nhưng để đạt được một loại vaccine hiệu quả cả về mặt kinh tế và môi trường thật là khó (Aasjord và Slinde, 1994). Kể từ năm 1976 cho đến năm 1993, trong vòng gần 20 năm chỉ có 3 loại vaccine cho cá được thương mại hoá, đó là: vaccine phòng bệnh enteric – redmouth, vaccine phòng bệnh furunculosis, vaccine phòng bệnh do vibrio (Souter, 1983). 2.9.2 Các dạng vaccine dùng cho cá Vaccine chết (killed vaccine) là dạng vi sinh vật đã được bất hoạt thông qua các phương pháp xử lí hoá – lí. Hầu hết các vacine được thương mại hiện nay để phòng 23 các bệnh trên động vật thuỷ sản đều dựa vào phương pháp xử lí bằng formalin (Austin, 1984; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Ngoài ra còn sử dụng một số hoá chất như: chloroform và phenol, hoặc các tác nhân vật lí như: sodium hydroxide, sodiumdodecyl sulfate, nhiệt độ để giết chết vi sinh vật (Stoskopf S. K., 1993). Vaccine nhược độc (attenuated vaccine): dùng các vi sinh vật đã được làm yếu, bằng cách: xử lí vi sinh vật với hoá chất ở nồng độ cận ngưỡng chết, xử lí nhiệt độ thấp. Phương pháp thông thường là nuôi cấy chúng ở môi trường không thích hợp hoặc với nhiệt độ không thuận lợi cho sự sinh trưởng. Tuy nhiên vaccine dạng này vẫn chưa được thương mại hóa vì những e ngại là vi sinh vật dùng chế vaccine có thể trở nên có độc lực mạnh hơn . Hiện nay ngoài hai dạng vaccine phổ biến trên, các nhà nghiên cứu đang hướng đến sản xuất vaccine tiểu đơn vị (subunit vaccine) và các loại peptide tổng hợp dùng làm vaccine phòng bệnh cho cá. 2.9.3. Các phƣơng pháp chủng vaccine cho cá Việc chủng vaccine trên cá có nhiều sự lựa chọn hơn so với trên thú và con người. Hiện nay hầu hết các loại vaccine sử dụng cho động vật có xương sống là ở dạng tiêm (injection) , có thể tiêm dưới da, tiêm cơ hay tiêm xoang bụng (Souter, 1983; Stoskopf S. K., 1993). Ở cá, sự tiêm xoang bụng (intraperitoneal = i.p.) cho hiệu giá kháng thể cao hơn với nhiều loài vi khuẩn và virus (Austin, 1984; Wolf, 1988), nhưng nếu tiêm chủng với số lượng cá lớn sẽ không khả thi. Các đường chủng khác như chủng qua đường miệng thông qua thức ăn hoặc qua đường hậu môn. Tuy nhiên phương pháp này không hiệu quả bởi vì vaccine bị phá hủy ở đường tiêu hóa của cá (Austin và Austin, 1987). Vì vậy, việc cấp qua lỗ hậu môn sẽ tránh được tác động phân hủy vaccine ở đường ruột cá nhưng tốn nhiều công nên chẳng ưu việt hơn phương pháp cấp bằng đường tiêm vào xoang bụng. Để chủng vacine với số lượng cá lớn, phương pháp ngâm và tắm là thích hợp nhất. Các phương pháp này thích hợp với cá nhỏ, nhưng cũng không nên chọn cá quá nhỏ vì sẽ tạo đáp ứng miễn dịch kém do hệ thống miễn dịch chưa trưởng thành (Tatner và Horne, 1984; Manning và Mugal, 1985, trích bởi Aasjord và Slinde, 1994). 2.10. Giới thiệu về phản ứng ngƣng kết dùng trong chẩn đoán miễn dịch học 2.10.1. Định nghĩa kháng nguyên và kháng thể 24 Kháng nguyên (Antigen) Kháng nguyên là những dị chất đối với cơ thể, có đặc tính khi vào cơ thể sẽ kích thích sinh ra những chất phản ứng đặc hiệu, đối lập với chúng, gọi là kháng thể. Kháng thể sinh ra sẽ phản ứng một cách đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1979). Kháng thể (Antibody) Kháng thể là các protein của huyết thanh được gọi tên chung là globulin miễn dịch (immunoglobulin), được sinh ra trong huyết thanh khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, cơ thể phản ứng bằng cách sản sinh ra kháng thể để chống lại kháng nguyên. Tính chất đặc hiệu của kháng thể là kết hợp một cách đặc hiệu với kháng nguyên đã sinh ra nó (Đặng Đức Trạch và ctv., 1987; trích bởi Hoàng Hải Hóa, 2001). 2.10.2 Phản ứng ngƣng kết Là sự dính các vi khuẩn vào nhau thành đám nhờ có kháng thể tương ứng và khi có mặt dung dịch nước muối sinh lí (chất điện phân) (Vương Thị Việt Hoa và ctv., 1999). Đối với các kháng nguyên hữu hình như xác vi khuẩn, khi gặp kháng thể đặc hiệu, các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau thành đám lớn, mắt thường có thể quan sát được. Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp. Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể đặc hiệu. Khi cho kháng nguyên hữu hình (tế bào vi khuẩn đã chết) trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, các vi khuẩn phân tán rời xa nhau trong hỗn dịch, sẽ kết lại với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám ngưng kết lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng. Trong thực tế, phản ứng ngưng kết xảy ra được còn phụ thuộc nhiều điều kiện khác nhau. (Lê Văn Hùng, 2002). Kháng thể gây ngưng kết gọi là kháng thể ngưng kết, còn kháng nguyên kích thích sinh ra kháng thể ngưng kết gọi là kháng nguyên ngưng kết. Phản ứng tạo ra cặn lợn cợn. Không phải chỉ có vi khuẩn có khả năng ngưng kết mà cả hồng cầu, nấm men, nấm mốc, tinh trùng... cũng có khả năng gây ngưng kết (Vương Thị Việt Hoa và ctv., 1999 25 III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1. Thời gian Từ ngày 1/3/2005 đến ngày 15/7/2005 3.1.2. Địa điểm Địa điểm thu mẫu: tại các bè nuôi xảy ra dịch bệnh. Địa điểm thí nghiệm: Trại thực nghiệm thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh. Địa điểm phân tích mẫu: Phòng Bệnh học, Khoa Thủy sản, Trường đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu  Dụng cụ Đĩa petri Que cấy Lame và lamelle Ðèn cồn Erlen, bình tam giác Ống nghiệm Bơm tiêm Kéo Kẹp Ðĩa microplate 96 giếng (dạng hình chữ "U"). Pipetman và pipette  Thiết bị Kính hiển vi Tủ lạnh Cân phân tích Bể xi măng nuôi 0,75 m3 Máy sục khí Máy lắc (Stuart Scientific) 26 Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen)  Vật liệu Vi khuẩn Streptococcus sp. phân lập từ cá bị nhiễm bệnh do Streptococcus sp. tại thời điểm thực hiện đề tài. Thỏ Cá rô phi đỏ  Hóa chất Nước cất Dầu khoáng Cồn 96o Nước muối sinh lý 0,9% Môi trường thạch dinh dưỡng NA (Nutrient Agar) Môi trường canh dinh dưỡng NB (Nutrient Broth) Glycerol Thuốc gây mê (Ethylenglycol monophenylether – C2H10O2) Dung dịch formalin 36% (Xưởng sản xuất thực nghiệm, Công ty hóa chất vật liệu điện và vật tư khoa học kỹ thuật - Bộ Thương mại) . 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp thu mẫu cá bệnh Dụng cụ: túi nylon, bình oxy. Nguyên tắc thu mẫu: Ghi các triệu chứng cá bệnh trước khi thu mẫu. Không thu mẫu cá đã chết, mẫu thu phải có những biểu hiện bệnh lí đặc trưng. Số lượng mẫu thu: 5 – 10 mẫu. 3.3.2. Phƣơng pháp bảo quản và vận chuyển mẫu Mẫu cá bệnh được cho vào túi nylon chứa từ 1/3 – 1/2 lượng nước, sau đó bơm khí oxy vào rồi cột chặt túi lại. Vận chuyển mẫu cá bệnh đến nơi phân tích (Phòng thí nghiệm) càng nhanh càng tốt. 27 3.3.3. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh Phương pháp chung được thể hiện qua sơ đồ dưới đây: Mẫu cá Mổ khám Ghi nhận các dấu hiệu bệnh tích Lấy mẫu vi khuẩn (gan, thận, não) Cấy mẫu lên môi trường NA Xem xét khuẩn lạc Ghi nhận kết quả  Phƣơng pháp kiểm tra dấu hiệu bên ngoài và mổ khám bệnh tích -Kiểm tra các dấu hiệu bên ngoài: quan sát cách cá bơi, mắt, vảy, da, vây bụng, hậu môn và mang của cá bệnh, nhận định sự khác biệt so với cá khỏe. -Mổ khám bệnh tích bên trong: +Mổ xoang bụng cá: trước khi tiến hành mổ cá, cá cần được đánh vẩy sạch tại vị trí cần mổ, sau đó dùng bông tẩm cồn 70o sát trùng thật kĩ tại khu vực mổ để tránh sự nhiễm tạp của các vi khuẩn từ bên ngoài. -Đặt cá với phần bụng quay về phía người mổ. -Cắt bỏ vây lưng và vây ngực. -Mổ xoang bụng cá bằng 3 đường cắt: Đường thứ nhất: bắt đầu từ phía trước hậu môn cho đến phần đầu, dừng trước nắp mang. Đường thứ hai: bắt đầu từ trước hậu môn hướng lên phía trên theo thành bụng tiếp giáp thân về phía đầu đến phần mở của mang cá. Đường thứ ba: nối hai đường cắt trên. 28 Não cá (màu trắng đục) Hình 3.1 : Đƣờng cắt giải phẫu xoang cơ thể cá. -Dùng kẹp đã khử trùng gắp bỏ phần cơ bụng cá đã cắt. -Quan sát các mô và cơ quan sau: Quan sát dịch nhầy xoang bụng và màu của dịch nhầy, chất dịch có nhiều hay ít. Gan: kiểm tra màu sắc, bề mặt, rìa của gan. Lách: như trên Thận: kiểm tra màu sắc, kích cỡ. + Mổ phần đầu cá: dùng kéo cắt một đường ngay phía sau mắt cá, một đường ngay trên đỉnh nắp mang sao cho đối xứng qua sống lưng cá. Chiều dài đường cắt khoảng 1 cm. Cắt bỏ phần cơ và sụn giữa hai đường cắt, sẽ bộc lộ phần não của cá. Hình 3.2 : Giải phẫu não cá 29  Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Mẫu vi khuẩn thường được lấy ở gan, thận và não. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn mẫu từ thận và não cá vì sẽ hạn chế được sự nhiễm tạp các vi sinh vật không mong muốn từ bên ngoài. Dùng kẹp gạt các phần nội tạng sang một bên, thận cá nằm sâu trong xoang bụng cá, ngay phía dưới xương sống. Dùng mũi kéo đã khử trùng cắt một vết nhỏ trên thận. Đưa que cấy vòng nhúng vào chỗ cắt, sau đó cấy ria trên môi trường thạch NA. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 18 – 24 h. Đối với mẫu cấy từ não cũng thực hiện tương tự như khi lấy mẫu ở thận.  Phƣơng pháp xác định vi khuẩn Streptococcus sp. có trong mẫu Sau 24h nuôi cấy mẫu, ta tiến hành quan sát màu sắc, hình thái và mật độ của khuẩn lạc đã mọc. Khuẩn lạc Streptococcus sp. trên môi trường NA có màu trắng đục, hình tròn, rìa đều, bóng, lồi thấp, tâm hơi đậm, đường kính từ 0,5 – 0,7 mm. Chọn khuẩn lạc có đặc điểm trên cấy chuyền sang đĩa môi trường NA mới, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 h để phân lập dòng vi khuẩn. Từ đĩa cấy chuyền thu được, tiến hành lưu trữ vi khuẩn làm giống trong môi trường canh NB có bổ sung 50% glycerol (v/v). Để quan sát hình thái vi khuẩn, ta thực hiện bằng cách: dùng que cấy lấy một ít khuẩn từ một khuẩn lạc có hình thái đặc trưng trên cho lên lam kính có sẵn một giọt nước muối sinh lí, quan sát hình thái vi khuẩn với vật kính 40 của kính hiển vi. Streptococcus sp. có dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, thành từng cặp hoặc tạo thành chuỗi dài. Trong môi trường canh, Streptococcus sp. có dạng chuỗi dài hơn trong môi trường thạch. 3.3.4. Phƣơng pháp nuôi cấy và thu sinh khối vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC (Formalin Killed Cell)  Phƣơng pháp nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn Dùng que cấy vòng đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống vi khuẩn gốc cấy lên đĩa môi trường NA, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24h. Đây là bước tăng sinh sơ khởi (tiền tăng sinh) để chọn được khuẩn lạc như mong muốn và số lượng cần thiết. 30 Chọn khuẩn lạc mong muốn cấy vào bình môi trường NB. Nút chặt bình, nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng trong 24h. Yêu cầu là bình nuôi cấy phải lớn để có thể thu được sinh khối vi khuẩn mong muốn.  Phƣơng pháp tạo FKC Sau 24 h nuôi cấy, môi trường trở nên đục do vi khuẩn phát triển nhiều. Để kiểm tra sự tạp nhiễm, lấy mẫu cho lên lam kính, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40, xem xét hình thái đặc trưng của vi khuẩn và các vi sinh vật có hình thái khác. Dùng pipette hút dung dịch formalin 36% với số thể tích bằng 0,5% thể tích môi trường có trong bình (Theo Aasjord P. M. và Slinde E., 1994). Trộn đều, để qua đêm. Với nồng độ trên, formalin sẽ giết chết hết số vi khuẩn có trong bình. Đem li tâm huyền dịch vi khuẩn ở 6000 vòng/phút trong 20 phút. Hút bỏ phần nước nổi. Rửa lại bằng nước muối sinh lí 0,9% liên tiếp 3 lần để xả sạch hết formalin. Xác vi khuẩn thu được sẽ có màu trắng, đựơc gọi là vi khuẩn dạng FKC. Số vi khuẩn thu được đem cân để xác định khối lượng, rồi pha loãng bằng nước muối sinh lí để thu được huyễn dịch FKC có nồng độ 10 mg/ml. Để kiểm chứng vi khuẩn đã bị tiêu diệt hoàn toàn, dùng que cấy vòng lấy một ít mẫu cấy từ bình nuôi NB đã cho formalin lên đĩa môi trường NA, đem ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát sự xuất hiện khuẩn lạc vi khuẩn trong một tuần liên tục. Nếu không thấy bất kì khuẩn lạc xuất hiện thì vi khuẩn đã hoàn toàn bị tiêu diệt. 3.3.5. Phƣơng pháp cấp huyền dịch vi khuẩn dạng FKC và gây cảm nhiễm cho cá Chúng tôi chọn phương pháp cấp FKC của vi khuẩn Streptococcus sp. bằng phương pháp tiêm xoang bụng (intraperitoneal = i.p.) vì nó tạo cho cá đáp ứng miễn dịch tốt hơn các phương pháp khác (Klesius và ctv., 2000; Stoskopf S. K., 1993). Gây cảm nhiễm cho cá cũng bằng phương pháp tiêm trên. Xi lanh dùng để tiêm phải có dung tích và mũi kim thích hợp với từng kích cỡ cá để tránh gây stress cho cá có thể dẫn đến tử vong. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn xi lanh bằng plastic có dung tích 1ml. Liều tiêm phụ thuộc vào kích cỡ cá. Đối với cá có trọng lượng nhỏ hơn 50 g/cá thể: tiêm liều 0,1 ml. Đối với cá có trọng lượng lớn hơn 50 g/cá thể: liều 0,2 ml. Liều tiêm này được áp dụng cho cả tiêm FKC và gây cảm nhiễm. 31 3.3.6. Phƣơng pháp lấy máu và thu huyết thanh. Lấy máu cá Vào những ngày theo định kì lấy máu cá, sử dụng 3 con cá bất kì trong lô để lấy 3 mẫu máu. Cá sau khi lấy máu được loại bỏ khỏi lô thí nghiệm. Để lấy mẫu máu, dùng bơm tiêm bằng plastic loại 5 ml, đầu kim 26G * 1/2. Theo Smith và ctv. (1952; trích bởi Stoskopf M. K., 1993), xi lanh bằng plastic được khuyến cáo sử dụng hơn so với xi lanh bằng thuỷ tinh vì nó ít làm cho máu chóng đông hơn, cũng như nó dễ kiếm, rẻ và đã được tiệt trùng sẵn. Đâm mũi kim vào cơ phía mặt bụng cá, hơi chệch về phía trước hậu môn so với phần đầu một chút cho đến khi nào chạm vào xương sống cá. Tiếp tục đẩy nhẹ, giữ chặt và hút máu cho chảy vào xi lanh. Vì máu cá ít cho nên cần phải thao tác nhanh, nếu không máu sẽ đông lại bịt kín mũi kim gây trở ngại cho thao tác lấy. Máu lấy được cho chảy từ từ vào thành xi lanh rồi để nằm nghiêng trong 15 – 20 phút cho máu đông lại. Cần nới pitton ra xa phần máu để tạo khoảng trống cho huyết thanh chảy ra, cũng như khi thu huyết thanh sẽ không làm vỡ hồng cầu, ảnh hưởng đến chất lượng huyết thanh. Mẫu máu thu được được mang lên phòng thí nghiệm để thu huyết thanh và thử phản ứng ngưng kết. Nếu chưa thực hiện công việc tiếp theo thì để mẫu máu qua đêm trong ngăn mát của tủ lạnh. Lấy máu trên thỏ: Thỏ được lấy máu ở tĩnh mạch vành tai. Các chú ý khi lấy máu thỏ cũng tương tự như lấy máu trên cá. Hình 3.3. Thao tác lấy mẫu máu trên cá 32 Thu huyết thanh Có thể thu huyết thanh bằng cách chắt lấy huyết thanh sau khi để xi lanh nằm nghiêng, các thành phần trong huyết tương đã đông lại. Hoặc li tâm mẫu máu, cách này sẽ thu được nhiều huyết thanh và huyết thanh trong hơn. 3.3.7. Phƣơng pháp thực hiện phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính Dùng một phiến kính sạch, nhỏ lên đó một giọt huyết thanh của cá hay thỏ, sau đó nhỏ vào một giọt kháng nguyên đã biết, trộn đều, đọc kết quả trong vài phút. Nếu trong huyết thanh có kháng thể tương ứng thì sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ tạo thành đám ngưng kết dạng lấm tấm như hạt cát hay dạng bông. Phản ứng ngưng kết mạnh khi cho kết quả trong 5 phút. Để so sánh, thực hiện mẫu đối chứng tương tự như trên nhưng với một kháng nguyên khác. Hình 3.4 : Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính 3.3.8. Phƣơng pháp xác định hiệu giá của phản ứng ngƣng kết Sử dụng đĩa microplate 96 giếng (giếng chữ U) để thực hiện phản ứng ngưng kết. Kháng nguyên sử dụng là dung dịch FKC nồng độ 10 mg/ml. Thực hiện chuỗi pha loãng huyết thanh bậc 2: Cho 25 μl nước muối sinh lý vào tất cả các giếng trừ giếng H1. Cho 25 μl huyết thanh vào các giếng H1 và G1. Dùng pipetman để trộn hỗn hợp ở trong giếng G1. Như vậy ta sẽ được hỗn hợp huyết thanh pha loãng 2 lần. Chuyển 25 μl của giếng G1 sang giếng F1. Tiếp tục thực hiện như thế cho đến giếng A1 (chú ý: nhớ hút bỏ 25 μl hỗn hợp huyết thanh và nước muối ra khỏi giếng cuối cùng). Kháng nguyên Kháng thể 33 Đối với huyết thanh từ thỏ đối chứng cũng làm đồng thời để dễ kiểm soát được kết quả. Thêm 25 μl huyền phù vi khuẩn vào mỗi giếng, rồi bọc đĩa lại bằng một miếng phim. Đặt đĩa lên máy vortex và tiến hành vortex trong 2 phút. Kết quả sẽ được ghi nhận lại ở giếng cuối cùng có xuất hiện sự ngưng kết Gieáng H1 G1 F1 E1 D1 C1 B1 A1 Nöôùc muoái sinh lyù ( l) 25 25 25 25 25 25 25 Huyeát thanh ( l) 25 25 Vi khuaån ( l) 25 25 25 25 25 25 25 25 Toång coäng ( l) 50 50 50 50 50 50 50 50 Hình 3.5 : Sơ đồ biểu diễn cách xác định hiệu giá của phản ứng ngƣng kết 3.4. Cách bố trí và tiến hành thí nghiệm Chúng tôi bố trí và tiến hành 4 thí nghiệm sau: 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tạo đáp ứng miễn dịch trên thỏ, bƣớc đầu điều chế kháng huyết thanh dùng cho chẩn đoán và điều trị. Vật liệu và dụng cụ: + Thỏ: 2 con, trọng luợng mỗi con là 1,5 kg. Một con để tiêm huyền dịch FKC của vi khuẩn Streptococcus sp., con còn lại được tiêm nước muối sinh lí 0,9%. Thỏ được nuôi trong chuồng có kích thước 40 x 60 x 40cm. Cho thỏ ăn thức ăn tự nhiên được rửa sạch như rau muống, cà rốt … + Vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC: được chuẩn bị theo qui trình 3.3.4 + Dầu khoáng: đóng vai trò là chất bổ trợ (adjuvant) để tăng hiệu lực tạo đáp ứng miễn dịch trên thỏ. + Bơm tiêm để tiêm huyễn dịch FKC và lấy máu thỏ loại 5 ml. 34 Cách tiến hành: + Nhũ hóa 1ml FKC và 1ml dầu khoáng (tỉ lệ 1:1) bằng cách cho vào ống ly tâm có nắp và lắc mạnh. Dùng ống tiêm 5ml hút dung dịch trên. + Cắt lông lưng thỏ một vùng rộng phía mặt lưng, tiêm 1ml dung dịch trên dưới da thỏ. Sau đó, thỏ được tiêm huyền dịch FKC lặp lại theo định kỳ: sau 2 tuần (14 ngày), 4 tuần (28 ngày), 5 tuần (35 tuần). Thỏ đối chứng tiêm nước muối sinh lí. Đồng thời tại các thời điểm này, chúng ta lấy mẫu máu từ thỏ, thu huyết thanh và thử phản ứng ngưng kết với kháng nguyên (vi khuẩn Streptococcus sp.) để xác định mức độ tạo kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên. Trên thỏ đối chứng cũng thực hiện cách thử nghiệm tương tự như trên. Bảng 3.1 : Lịch tiêm huyền dịch vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC cho thỏ Ngày tiêm Loại để tiêm Vị trí tiêm Liều tiêm (ml) Ngày lấy máu Ngày thứ 1 Ngày thứ 14 Ngày thứ 28 Ngày thứ 35 Ngày thứ 42 FKC + DK FKC + DK FKC + DK FKC FKC Dưới da Dưới da Dưới da Dưới da Tĩnh mạch tai 1 1 1 1 1 Ngày thứ 14 Ngày thứ 28 Ngày thứ 35 Ngày thứ 42 Ngày thứ 49 Chú thích: FKC: các tế bào của vi khuẩn Streptococcus sp. được giết bởi dung dịch formalin. DK: dầu khoáng 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ nuôi cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) đối với vi khuẩn Streptococcus sp. đã đƣợc tiêm vi khuẩn dạng FKC trƣớc đó Dụng cụ và vật liệu: + Cá rô phi đỏ: có trọng lượng trung bình là 34,6 g. Được nuôi trong điều kiện thí nghiệm 1 tháng trước khi tiến hành thí nghiệm. Cá được nuôi bằng thức ăn viên công nghiệp. Sau khi tiêm gây cảm nhiễm, cá không được cho ăn. 35 + Bể xi măng: có thể tích 0,75 m3, đặt trong nhà có mái che, sục khí liên tục và thay nước hàng ngày. + Huyền dịch của vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC: chuẩn bị tương tự như mục 3.3.4. + Vi khuẩn Streptococcus sp.: cùng dòng vi khuẩn điều chế FKC. Trước tiên vi khuẩn được nưôi cấy tăng sinh trên môi trường thạch NA, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24h. Sau đó thu nhân sinh khối vi khuẩn. Pha loãng vi khuẩn bằng nước muối sinh lí 0,9%. Vi khuẩn được xác định nồng độ bằng cách thực hiện theo phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch. Cách thực hiện: Thí nghiệm được bố trí thành 6 lô gồm: 3 lô thí nghiệm (E1, E2, E3) và 3 lô đối chứng (C1, C2, C3) với các mật độ cá nuôi khác nhau: 25 con (mật độ nuôi thấp), 50 con (mật độ nuôi trung bình), 100 con (mật độ nuôi cao). Tiêm cá vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC như mục 3.3.5. Cá ở lô đối chứng tiêm nước muối sinh lí. 14 ngày sau khi chủng cá, thực hiện gây cảm nhiễm (tiêm thử thách) tất cả số cá (cả lô thí nghiệm và lô đối chứng) với vi khuẩn Streptococcus sp. còn sống có nồng độ 8,5*105 CFU/ml với liều tiêm và cách tiêm như mục 3.3.5. Sau khi gây cảm nhiễm, cá không được cho ăn. Tiếp tục theo dõi trong 14 ngày, mỗi ngày kiểm tra xem có cá chết hay hấp hối không. Nếu có thì tiến hành phân tích quan sát dấu hiệu, mổ khám bệnh tích và phân lập vi khuẩn để xác định nguyên nhân. Sau thời gian thí nghiệm, tất cả số cá còn lại được giải phẩu để phân lập vi khuẩn gây bệnh giống như phân lập mẫu cá bệnh thu ngoài tự nhiên. 36 Hình 3.6: Bể bố trí thí nghiệm 2 Tóm tắt thí nghiệm được thể hiện qua bảng 3.2 Bảng 3.2. : Cách bố trí thí nghiệm 2 Lô Các thông số Lô thí nghiệm Lô đối chứng E1 E2 E3 C1 C2 C3 Số cá (con) Loại chủng Liều chủng (ml/cá thể) Nồng độ vi khuẩn (CFU/ml) Liều gây cảm nhiễm (ml) Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm (ngày) 25 FKC 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 50 FKC 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 100 FKC 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 25 NMSL 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 50 NMSL 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 100 NMSL 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 Chú thích: FKC: Formalin Killed Cell – Các tế bào vi khuẩn được giết bởi formalin NMSL: Nước muối sinh lí 0,9%. 37 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian tạo đáp ứng miễn dịch dặc hiệu trên cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) sau khi tiêm huyền dịch dạng FKC của vi khuẩn Streptococcus sp. Vật liệu và dụng cụ: + Cá rô phi đỏ có trọng lượng trung bình là 87,3 g được mua từ bè nuôi của nông dân, cá được nuôi trong điều kiện thí nghiệm 1 tháng trước khi tiến hành thí nghiệm. Cá được cho ăn thức ăn viên công nghiệp. + Bể nuôi: là bể xi măng, có thể tích 0,75 m3, đặt trong mái che, sục khí liên tục và được thay nước đã được khử chlorine hàng ngày. + Huyền dịch dạng FKC của vi khuẩn Streptococcus sp.: chuẩn bị theo mục 3.3.4 + Thuốc gây mê: loại ethylenglycol monophenylether + Bơm tiêm: loại 1 ml dùng dể tiêm vaccine, loại 5ml dùng để lấy mẫu máu. + Lam kính + Nước muối sinh lí + Máy li tâm Cách tiến hành: Thí nghiệm được chia thành 2 lô: A1 và A2. Mỗi lô bố trí 50 con cá. Chuẩn bị huyễn dịch vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC có nồng độ 1 mg/ml bằng cách pha loãng với nước muối sinh lí 0,9%. Tiêm với liều 0,2 ml vào xoang bụng cá. Lô A2 được tiêm nhắc với liều lượng như trên vào ngày thứ 15 sau khi tiêm lần thứ nhất. Trước khi tiêm, cá được gây mê. Sau khi tiêm, định kì lấy máu cá, thu huyết thanh, thử phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. Thực hiện liên tục cho đến khi nào không phát hiện kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn Streptococcus sp. Toàn bộ thí nghiệm được tóm tắt theo bảng 3.3: 38 Bảng 3.3 : Cách bố trí thí nghiệm 3 Lô thí nghiệm A1 A2 Tổng số cá (con) Số lần tiêm (lần) Nồng độ vaccine (mg/ml) Liều tiêm (ml/cá thể) Ngày lấy máu kể từ sau khi tiêm 50 1 1 0,2 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 50 2 1 0,2 15, 20, 25, 30. 3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng phòng bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. trên cá rô phi đỏ đã đƣợc tạo đáp ứng miễn dịch bằng cách tiêm FKC trƣớc đó. Dụng cụ và vật liệu: + Cá điêu hồng từ thí nghiệm 3: sau 30 ngày được tiêm FKC của vi khuẩn Streptococcus sp. lần đầu + Bể nuôi: bể xi măng, có thể tích 0,75 m3, sục khí liên tục và thay nước hàng ngày để đảm bảo chất lượng nước. + Vi khuẩn Streptococcus sp.: chuẩn bị tương tự như thí nghiệm 2 + Bơm tiêm: loại 1 ml + Kéo, kẹp, đĩa petri Cách tiến hành: Toàn bộ thí nghiệm 4 được tóm tắt theo bảng 3.4 39 Bảng 3.4. : Cách bố trí thí nghiệm 4 Tên lô thí nghiệm B1 B2 B3 Số cá (con) Nguồn lấy Số lần đã tiêm FKC trước đó (lần) Thời gian chờ trước khi thử thách (ngày) Liều tiêm thử thách (ml/cá thể) Nồng độ vi khuẩn (CFU/cá thể) Thời gian theo dõi sau khi tiêm (ngày) 15 A1 1 30 0,2 1,58*10 6 14 15 A2 2 30 0,2 1,58*10 4 14 15 A2 2 30 0,2 1,58*10 6 14 Thí nghiệm được chia thành 3 lô: B1, B2, B3. Mỗi lô bố trí 15 con cá. Gây cảm nhiễm cho cá với vi khuẩn Streptococcus sp. còn sống bằng cách tiêm vào xoang bụng cá với nồng độ và liều tiêm như bảng 3.4. Trước khi tiêm, cá được gây mê. Thí nghiệm được theo dõi trong 14 ngày sau khi tiêm, mỗi ngày kiểm tra xem có cá chết hay hấp hối không. Nếu có thì tiến hành phân tích, quan sát dấu hiệu và mổ khám bệnh để tìm nguyên nhân. Sau thời gian theo dõi, toàn bộ số cá còn lại được giải phẫu để phân lập vi khuẩn gây bệnh giống như phân lập mẫu cá bệnh thu ngoài tự nhiên. 40 IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thí nghiệm 1 Bảng 4.1 : Kết quả kiểm tra hiệu giá ngƣng kết của kháng huyết thanh thỏ tại những thời điểm khác nhau Thời gian (ngày) Thỏ Loại tiêm Kết quả thử nghiệm sự ngưng kết Hiệu giá (lần pha loãng) 0 ĐC NMSL - TN FKC + DK (da) - 14 ĐC NMSL - TN FKC + DK (da) - 28 ĐC NMSL - TN FKC + DK (da) + 1 35 ĐC NMSL - TN FKC (da) + 2 42 ĐC NMSL - TN FKC (tai) + 4 49 ĐC X - TN X + 8 Chú thích: NMSL: nước muối sinh li,9% FKC: Formalin Killed Cell DK: dầu khoáng ĐC: đối chứng TN: thí nghiệm (+): phản ứng ngưng kết dương tính (–): phản ứng ngưng kết âm tính. X: không tiêm Trong 4 tuần đầu tiên, chúng tôi thực hiện tiêm thỏ bằng FKC có trộn dầu khoáng nhưng khi kiểm tra hiệu giá ngưng kết, kết quả âm tính, riêng ngày 28 thấy có ngưng kết nhưng rất yếu. Pha loãng huyết thanh ra 2 lần thì không còn ngưng kết. 41 TN A B Sau ngày 28, chúng tôi tiêm FKC không có dầu khoáng. Kết quả thể hiện trong lần lấy máu vào ngày 35, 42. Lượng kháng thể tăng lên rõ rệt. Vào ngày 49, chúng tôi thu kháng huyết thanh và thực hiện hiệu giá ngưng kết. Có phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên – kháng thể khi pha loãng huyết thanh 8 lần. Điều đó chứng tỏ, trong 4 tuần đầu, khả năng đáp ứng miễn dịch chưa mạnh. Có thể do một nguyên nhân là sự nhũ hóa giữa dầu khoáng và FKC được thực hiện không hiệu quả. Chú thích: A: Dương tính: vi khuẩn bất hoạt phân tán đều ở đáy giếng. B: Âm tính: vi khuẩn bất hoạt lắng tụ tạo thành đốm trắng nhỏ ở đáy giếng. ĐC: thỏ đối chứng. TN: thỏ thí nghiệm. Hình 4.1. : Kết quả ngƣng kết trên đĩa 96 giếng Chúng tôi cũng thực hiện các thử nghiệm ngưng kết nhanh trên phiến kính giữa huyết thanh thỏ với vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC và vi khuẩn còn sống phân lập từ cá rô phi đỏ cảm nhiễm vào các thời điểm kiểm tra hiệu giá ngưng kết. Các kết quả thu được tương ứng với kết quả kiểm tra hiệu giá ngưng kết. ĐC TN 42 4.2. Kết quả thí nghiệm 2 Sau khi phân lập được chủng vi khuẩn Streptococcus sp. từ mẫu bệnh phẩm, chúng tôi tiến hành điều chế dạng FKC và tiêm cho cá. 14 ngày sau khi chủng, cũng từ chủng vi khuẩn chúng tôi sử dụng để gây cảm nhiễm cho cá với liều lượng 8,5*105 CFU/ml nhằm xác định hiệu lực phòng bệnh của cá tiêm FKC. Thí nghiệm được theo dõi trong 14 ngày tính từ lúc tiêm huyền dịch vi khuẩn. Kết quả gây cảm nhiễm được trình bày qua bảng 4.2 Bảng 4.2 : Số cá chết trong 14 ngày theo dõi Tên lô C1 C2 C3 E1 E2 E3 Số cá trong lô (con) 25 50 100 25 50 100 Số cá chết Ngày thứ 1 Ngày thứ 2 Ngày thứ 3 Ngày thứ 4 Ngày thứ 5 Ngày thứ 6 Ngày thứ 7 Ngày thứ 8 Ngày thứ 9 Ngày thứ 10 Ngày thứ 11 Ngày thứ 12 Ngày thứ 13 Ngày thứ 14 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 1 0 0 1 1 2 0 2 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 5 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tổng 3 1 12 3 3 11 Tỉ lệ (%) 12 2 12 12 6 11 43 Bảng 4.2 cho thấy không có sự khác biệt về tỉ lệ chết nếu so sánh trong cùng một mật độ nuôi giữa cá được tiêm FKC và cá đối chứng (tiêm nước muối sinh lí): 12% (lô E1) và 12% ( lô C1) (mật độ nuôi thấp), 2% (lô C2) và 6% (lô C2) (mật độ trung bình), 12% (lô E3) và 11% (lô C3) (mật độ cao). Kết quả cũng tương tự khi so sánh tỉ lệ chết của các mật độ nuôi khác nhau trong cùng điều kiện thí nghiệm. Theo kết quả nghiên cứu của Shoemaker C.A và ctv. (2000) về ảnh hưởng của mật độ nuôi và liều cảm nhiễm của vi khuẩn Streptococus iniae lên cá rô phi (Oreochromis niloticus) với 3 mật độ: 5,6 g/l, 11,2 g/l, 22,4 g/l và gây cảm nhiễm cá với liều vi khuẩn từ 2,5*107 – 1*108 CFU/ml bằng phương pháp ngâm, cho thấy mật độ có ảnh hưởng đến tỉ lệ chết của cá. Mật độ nuôi thấp sẽ cho tỉ lệ chết thấp hơn. Có lẽ trong thí nghiệm này, liều tiêm chưa đủ dể tạo độc lực mạnh làm chết cá. Bảng 4.2 cũng cho thấy số cá chết thường tập trung trong tuần lễ đầu tiên sau khi tiến hành cảm nhiễm vi khuẩn cho cá. Những ngày còn lại không có cá chết, chỉ có duy nhất ở lô cá đối chứng có mật độ nuôi 100 con/bể (Lô C3). Theo kết quả nghiên cứu của Chang và Plumb (1996), cá chết có những triệu chứng bệnh lí khá điển hình như mắt lồi và giác mạc đục. Song trong thí nghiệm mà chúng tôi tiến hành không ghi nhận được các triệu chứng bệnh tích điển hình như vậy. Nhưng khi phân lập thì xác định được chủng vi khuẩn Streptococcus sp. trong mẫu bệnh phẩm. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Klesius và ctv. (1999) với một liều chủng vaccine S. iniae dạng FKC qua con đường i.p. trên cá rô phi (Oreochromis niloticus) đã làm giảm tỉ lệ chết xuống 91,3% và ngăn ngừa được các triệu chứng như: bơi lội bất thường, lồi mắt và giác mạc đục trên cá có trọng lượng 25 g và 100 g. Trong thí nghiệm của chúng tôi, cá có trọng lượng trung bình là 34,6 g và tỉ lệ sống sót trên nhóm tiêm FKC là 88 – 94%. Cũng theo nghiên cứu sau đó của Klesius và ctv. (2000) trên cùng đối tượng, Klesius cho rằng hiệu lực của vaccine phụ thuộc vào độ tuổi của cá, cá nhỏ sẽ tạo đáp ứng miễn dịch kém hơn so với cá lớn. Kết luận này cũng được Muzquiz và ctv. (1999; trích bởi Klesius và ctv., 2000) đưa ra nhưng trên đối tượng nuôi là cá hồi. Từ thí nghiệm 2 chúng tôi cũng ghi nhận các kết quả tương tự như các kết quả của các công trình nghiên cứu trước đây. Theo ghi nhận của chúng tôi thì hầu hết các cá chết trong thời gian theo dõi cá nhỏ, có trọng lượng cơ thể từ 15 – 20 g. Điều này phù hợp với kết luận ở trên. 44 Việc phân lập vi khuẩn từ cá chết trong thời gian theo dõi phát hiện thấy vi khuẩn Streptococcus sp. trong mẫu bệnh phẩm, theo chúng tôi có lẽ liều tiêm chưa đủ tạo độc lực mạnh, và bản thân cá tồn tại sức đề kháng với mầm bệnh. Tuy nhiên sự loại thải vi khuẩn xảy ra không hoàn toàn, một số ít vi khuẩn vẫn xâm nhập vào các nội quan nhưng chưa tạo độc lực đủ mạnh để gây nên các triệu chứng bệnh đặc trưng. Tuy nhiên, nếu so sánh về tỉ lệ chết với nhóm cá đối chứng, rõ ràng huyễn dịch FKC đã chuẩn bị không chứng tỏ được hiệu quả. Nếu nghi ngờ một số yếu tố tạo stress có tác động đến tỉ lệ chết thì theo kết quả nghiên cứu cứu Evans và ctv., (1999) vaccine làm giảm sự tạo stress khi có mầm bệnh xâm nhiễm. Trong nghiên cứu này của ông, đối tượng nghiên cứu là cá rô phi vằn (O. niloticus) và vaccine phòng bệnh do S. agalactiae. Sau khi hết thời gian theo dõi 14 ngày, chúng tôi tiến hành giải phẫu tất cả số cá còn lại, phân tích vi sinh vật giống như phân tích mẫu cá bệnh thu ngoài tự nhiên. Kết quả phân tích qua giải phẫu được thể hiện qua bảng 4.3 Bảng 4.3: Số cá phát hiện có nhiễm Streptococcus sp. qua giải phẫu Lô C1 C2 C3 E1 E2 E3 Số cá giải phẫu (con) Kết quả phát hiện Tổng số cá nhiễm (con) Tỉ lệ sau cùng (%) 22 0 3 12 49 0 1 2 88 12 24 24 22 0 3 12 47 0 3 6 89 5 16 16 Qua bảng 4.3 cho thấy có 17 con phát hiện có nhiễm Streptococcus sp., tập trung vào các lô cá mật độ cao 100 con/bể: 5 con ở lô E3 và 12 con ở lô C3. Kết quả này đã bộc lộ tỉ lệ cảm nhiễm ở lô nuôi mật độ cao (100 con/bể) giữa cá có tiêm và không tiêm FKC có sự khác biệt rõ rệt (16% so với 24%). Cá được tiêm FKC có khả năng chống stress tốt hơn cá không tiêm FKC, giảm được tỉ lệ cảm nhiễm vi khuẩn. Bảng 4.3 cũng thể hiện tỉ lệ cảm nhiễm với vi khuẩn của cá ở mật độ nuôi cao cao hơn so với nuôi ở mật độ thấp (25 con/bể và 50 con/bể) trong cả lô đối chứng và lô tiêm FKC, chứng tỏ sức đề kháng của cá kém hơn khi nuôi ở mật độ cao. 45 Hình 4.2 : Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Streptococcus sp. trên môi trƣờng NA sau 24h nuôi cấy 4.3. Kết quả thí nghiệm 3 Mẫu máu cá được lấy định kì, thu huyết thanh và thử nghiệm phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với vi khuẩn dạng FKC nhằm phát hiện kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn Streptococcus sp. Kết quả thử nghiệm ngưng kết được thể hiện trong bảng 4.4 Bảng 4.4: Kết quả thực hiện phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính của các mẫu thu đƣợc với vi khuẩn Streptococcus sp. Lô A1(tiêm FKC 1 lần) A2 (được tiêm nhắc) Số mẫu máu mỗi lần thu (mẫu) 3 3 Ngày lấy máu, thử phản ứng ngưng kết 7 10 15 20 25 30 35 40 45 20 25 30 Kết quả + + + + + + + + - + + + Chú thích: (+) : dương tính (–) : âm tính 46 Do số lượng cá có giới hạn (50 con/lô) và vì phải trích lấy thực hiện tiếp thí nghiệm 2 sau 30 ngày theo dõi, nên chúng tôi chỉ theo dõi khả năng tạo kháng thể đến ngày thứ 45 đối với lô cá tiêm FKC liều đơn. Đối với lô tiêm FKC nhắc lại, huyết thanh cá được theo dõi đến ngày thứ 30. Khả năng tạo đáp ứng miễn dịch ở cá điêu hồng diễn ra trong thời gian được 40 ngày. Đến ngày thứ 45 thì hoàn toàn không phát hiện được nữa. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trên cá nói chung. Các nghiên cứu đó cho rằng việc tạo đáp ứng miễn dịch trên cá sau khi tiếp xúc với tác nhân gây bệnh thường kéo dài khoảng vài tháng nếu không có sự tiếp xúc lặp lại sau đó như nghiên cứu của Eldar và ctv. (1997) trên cá hồi (Oncorhynchus mykiss) với vaccine phòng Streptococcus iniae khi tiêm qua xoang bụng chỉ với liều đơn có thể phát hiện kháng thể đặc hiệu trong 4 tháng. Khả năng tạo kháng thể tốt nhất vào khoảng 3 tuần đầu sau khi cá được chủng vaccine. Điều này căn cứ vào thời gian phản ứng ngưng kết xảy ra và mức độ tạo thành ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Kết quả này chúng tôi không thể hiện ra đây nhưng qua các thử nghiệm đã được ghi nhận . Tất cả số mẫu huyết thanh thử nghiệm đều cho phản ứng. Như vậy khả năng tạo đáp ứng rất đồng đều giữa các cá thể trong đàn . Dù không tiếp tục theo dõi trên lô được tiêm FKC nhắc lại, nhưng chắc chắn thời gian tạo đáp ứng miễn dịch với vi khuẩn Streptococcus sp. sẽ kéo dài hơn với lô chỉ chủng liều đơn . Có thể là do cá lớn, trọng lượng trung bình là 87,3 g nên khả năng tạo đáp úng miễn dịch tốt. 4.4. Kết quả thí nghiệm 4 Kết quả theo dõi số cá chết hoặc hấp hối và số cá cảm nhiễm được thể hiện qua bảng 4.5 47 Bảng 4.5. Kết quả theo dõi trong suốt thí nghiệm 4 Tên lô thí nghiệm B1 B2 B3 Nguồn lấy (lô) A1 A2 A2 Số cá trong lô (con) 15 15 15 Số cá chết (con) 0 0 0 Số cá mổ khám (con) 15 15 15 Số cá phát hiện có nhiễm (con) 0 0 0 Tỉ lệ tổng nhiễm (%) 0 0 0 Bảng 4.5 cho thấy không có cá hấp hối hay chết trong suốt thời gian theo dõi, cũng như sau khi mổ khám vào cuối thí nghiệm, không phát hiện thấy cá nhiễm vi khuẩn Streptococcus sp. Qua kết quả thu được từ thí nghiệm 3, chúng tôi phát hiện cá có thể tạo được kháng thể đặc hiệu trong thời gian 40 ngày. Kết quả đó là trên cá rô phi được chủng liều đơn. Vì cá có các tế bào có chức năng ghi nhớ miễn dịch trong hệ thống miễn dịch nên sẽ tạo được đáp ứng mạnh hơn trong lần tiếp xúc lặp lại với cùng loại kháng nguyên, cho nên trên cá được tiêm FKC lặp lại, thời gian sản xuất kháng thể đặc hiệu sẽ dài hơn. Theo Klesius và ctv., (1999) khả năng miễn dịch kháng S. iniae của cá rô phi phụ thuộc vào kháng thể kháng S. iniae cả về lượng và chất. Kết quả thu được từ thí nghiệm 3 cho thấy rằng trong khoảng tháng đầu tiên sau khi tiêm FKC, cá tạo được lượng kháng thể kháng vượt trội. Cá được tiêm thử thách sau giao đoạn này nên khả năng kháng bệnh sẽ cao. Ở thí nghiệm này, cá tạo đáp ứng miễn dịch tốt mặc dù được thử thách với nồng độ vi khuẩn rất cao là 1,58*106 CFU/ml. Hơn nữa, cá được thí nghiệm ở đây là cá lớn (trọng lượng trung bình là 87,3 g) nên khả năng đề kháng và tạo đáp ứng miễn dịch tốt hơn so với cá nhỏ. Điều này chúng tôi đã thảo luận ở trên. Kết quả thu được cũng gần giống với kết quả nghiên cứu của Klesius và ctv. (1999) đạt từ 84,2 – 94,7% khi các nhà nghiên cứu tiến hành trên cá có trọng lượng trung bình là 100 g có tỉ lệ sống sót tương đối (RPS – relative percent survival) nhưng liều thử thách cao hơn 1*108 CFU/cá thể, thời gian theo dõi dài hơn tới 60 ngày. Với thời gian tạo kháng thể như thế thì vi khuẩn đã bị trung hòa hoàn toàn, cô lập và loại thải khỏi cơ thể trong những ngày đầu. Điều này được chứng minh qua việc 48 không phát hiện được vi khuẩn trong nội quan của cá khi mổ khám – phân lập sau khi hết 14 ngày theo dõi. Như vậy, việc tiêm cho cá rô phi có trọng lượng trung bình là 87,3 g với huyền dịch FKC của vi khuẩn Streptococcus sp. bằng phương pháp tiêm i.p. đã giúp cá không bị cảm nhiễm vi khuẩn đã dùng gây bệnh . 49 V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Ở thỏ có xảy ra sự đáp ứng miễn dịch với vi khuẩn Streptococcus sp. nhưng khả năng tạo đáp ứng miễn dịch chưa cao trong 7 tuần (49 ngày) khảo sát. Khả năng tạo đáp ứng miễn dịch trên cá có trọng lượng 34,6 g kém, không đủ để bảo vệ cơ thể cá khỏi nhiễm bệnh do Streptococcus sp. Mật độ nuôi có ảnh hưởng lên tỉ lệ cảm nhiễm vi khuẩn Streptococcus sp. giữa mật độ cao (100 con/1m3) và mật độ thấp (25 con/m3), giữa mật độ cao và mật độ trung bình (50 con/m3) dù đã được hay chưa được kích thích đáp ứng miễn dịch trước đó. Tuy nhiên, giữa mật độ nuôi thấp và mật độ nuôi trung bình, tỉ lệ cảm nhiễm không có sự khác biệt. Cá có trọng lượng 87,3 g cho đáp ứng miễn dịch cao khi tiêm xoang bụng (i.p.) với FKC của vi khuẩn Streptococcus sp., thời gian tạo kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus sp. khi tiêm liều đơn kéo dài được 40 ngày. Cá có trọng lượng 87,3 g đã được kích thích tạo đáp ứng miễn dịch trong 30 ngày có tỉ lệ nhiễm Streptococcus sp. sau khi gây nhiễm là 0,00% trên tất cả các lô. 5.2. Đề nghị Trên cá Tiếp tục theo dõi khả năng đáp ứng miễn dịch của cá khi được kích thích miễn dịch lặp lại về thời gian, cường độ đáp ứng. Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố khác ảnh hưởng đến tỉ lệ chết vì bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp, từ đó đưa ra chiến lược quản lí và kiểm soát dịch bệnh để đạt được hiệu quả kinh tế cao nhất và an toàn cho môi trường. Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. và các bệnh do vi khuẩn khác cho cá. Trên thỏ Tiếp tục khảo sát đáp ứng của thỏ với các chất bổ trợ khác. Nghiên cứu điều chế kháng huyết thanh thỏ có hiệu giá ngưng kết cao hơn với vi khuẩn Streptococcus sp. dùng cho chẩn đoán bệnh. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1/ Báo Khoa học phổ thông và Nhà văn hóa khoa học, 2002. Hội thảo chuyên đề: Thủy sản: nuôi trồng, chất lượng và xuất khẩu. Website: www.ctu.edu.vn/colleges/aquaculture/aquafishdata/index.htm. 2/ Dương Phượng Uyên, 2005. Khảo sát kỹ thuật nuôi và bệnh do Streptococcus sp. trên cá rô phi nuôi bè. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Thủy sản, trường Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3/ Đỗ Ngọc Liên, 1999. Miễn dịch học cơ sở. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, 240 trang. 4/ Hoàng Hải Hóa, 2001. Chẩn đoán huyết thanh học bệnh thương hàn gà do Samonella gallinarum – pullorum bằng phương pháp ngung kết nhanh trên phiến kính. Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ Khoa Chăn nuôi – Thú y, Đại học Nông Lâm Tp. HCM 5/ Lê Văn Hùng, 2002. Miễn dịch học thú y. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Tp. HCM, Việt Nam. 192 trang. 6/ Mai Chi, 2002. Thấy cá điêu hồng tìm hiểu nguồn gốc rô phi đỏ. Báo Khoa học phổ thông số 638 : 43 – 46. 7/ Nguyễn Đình Bảng và Nguyễn Thị Kim Hương, 2003. Vaccine và chế phẩm miễn dịch trong phòng và điều trị. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 8/ Nguyễn Mạnh Thắng, 2003. Nghiên cứu sử dụng montanide – 50 làm chất bổ trợ miễn dịch cho vaccine tụ huyết trùng. Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ Khoa Chăn nuôi – Thú y, Đại học Nông Lâm Tp. HCM . 9/ Nguyễn Thị Ngọc Bích, 2005. Khảo sát một số đặc điểm gây bệnh của các vi khuẩn phân lập từ cá rô phi nuôi bè. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Thủy sản, Trường Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh. 10/ Nguyễn Tri Cơ, 2004. Điều tra tình hình nuôi và dịch bệnh trên cá rô phi nuôi bè ở đồng bằng sông Cửu Long và cách phòng trị. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Thủy sản, Trường Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh. 51 11/ Nguyễn Vĩnh Phước, 1977. Vi sinh vật thú y. Tập 1. Nhà xuất bản ĐH và THCN, Hà Nội. 12/ Trần Văn Vỹ, 1999. 35 câu hỏi đáp về nuôi cá rô phi. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 13/ Võ Văn Tuấn, 2005. Hiện trạng và tình hình bệnh vi khuẩn trên cá rô phi đỏ nuôi lồng bè tại tỉnh Đồng Nai. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Thủy sản, trường Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh. 14/ Vương Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Tô Minh Châu, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Lâm Thanh Hiền và Nguyễn Thúy Hương, 1999. Vi sinh vật học đại cương.Tủ sách trường Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh, 220 trang. 52 Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 1/ Aasjord P. M. and Slinde E., 1994. Fish vaccine: development, production and use of bacterial vaccine with special reference to salmon. Fisheries processing biotechnological application (Martin A. M.). Chapman & Hall, London, England, p. 432 – 465. 2/ Chang P.H. and Plumb J.A., 1996. Histopathology of experimental Streptococcus sp. infection tilapia (Oreochromis niloticus) and channel catfish (Ictalurus punctatus) (Rafinesque). Journal of fish disease.: 236. 3/ Eldar A., Horovitcz C. and Bercovier H., 1997. Development and efficacy of affecting mortality of Streptococcus iniae infection infarmed rainbow trout. Vet. Immunol. Immunpathol. Vol.56, no. 1 – 2:175 – 183. 4/ Evans J.J, Klesius P.H., Shoemaker C.A. and Fitzpatrick B.T., 2005. Streptococcus agalactiae vaccination and infection stress in Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Journal of Applied Aquaculture 13 (issue 3/4):105 – 115. 5/ Fox J. M., 2005. Immune respone of aquatic organisms. Website: www.sci.tamuec.edu/pals/index/WEBPAGE/immune.ppt 6/ Klesius P.H., Shoemaker C.A and Evans J.J, 2000. Efficacy of single and combined Streptococcus iniae isolate vaccine administered by intraperitoneal and intramuscular routes in tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture 188: 237 – 246. Elsivier science B.V, Armterdam, NL. 7/ Klesius P.H., Shoemaker C.A and Evans J.J., 1999. Efficacy of a killed Streptococcus iniae vaccine in tilapia (Oreochromis niloticus). Bull. Ass. Fish Pathol 19 (1): 1-3. 8/ Nguyen H.T. and Kanai K., 1999. Selective agars for the isolation of Streptococcus iniae from Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, and its cultural environment. Journal of Applied Microbiology 86 : 769 – 776. 9/ Popma T., Masser M., 1999. Tilapia, life history and biology. Website: www.aquanic.org/publicat/usda_rac/srac/283fs.pdf. 10/ Roberson B.S., 1990. Bacterial agglutination. Techniques in fish immunology (J.S Stolen, TC Pletcher, D.P. Anderson, B.S Roberson, W.B. van Muiswinkel), SOS Publications, New Jesey, USA, p. 81 – 86. 53 11/ Shoemaker C.A., Klesius P.H and Evans J.J., 1999. Density and dose: factors affecting mortality of Streptococcus iniae infected tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture 188: 229 – 235. 12/ Souter W. B., 1983. Immunization with vaccines. A guide to integrated fish health management in the Great Lakes basin (Meyer F. P., Warren J. W., Carey T. G.), Ann Arbor, Michigan, USA , p. 111 – 119. Website: www.glfc. Org/pubs/special_pubs/sp83_2/pdf/chap13.pdf 13/ Stoskopf M. K., 1993. Clinical examination and procedures. Fish medicine (Stoskopf M. K.), W. B. Sounder, Philadelphia, USA, p. 62 – 78. 14/ Stoskopf S. K., 1993. Immunology. Fish medicine (Stoskopf M. K. ), W. B. Sounder, Philadelphia, USA, p. 149 – 159. 15/ Weistein M.R et al., 1997. Invasive infections due to a fish pathogen, Streptococcus iniae. The New England Journal of Medicine 337 (9): 589 – 595. Website: www.nejm.org. 16/ Yanong R.P.E. và Floyd R.F, 2001. Streptococcal infections of fish. Website: www.edis.ifas.ufl.edu/FA057-25k