Khóa luận Dịnh danh và phân nhóm nấm Trichoderma spp. Phân lập tại Việt Nam

garose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5, có kích thƣớc 600 bp Hình 4. 4 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R, có kích thƣớc 320 bp 4.3. Kết quả định danh tên loài Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma khảo sát đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI. Dựa vào độ tƣơng đồng di truyền (%) kết hợp với kết quả định danh bằng hình thái, để từ đó xác định tên loài của 11 dòng Trichoderma khảo sát. Dòng T37: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. sinensis, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T37 là Trichoderma longibrachiatum. 28 Bảng 4. 1 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T37 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) (mã số truy cập-tên loài-địa điểm phân lập) 1: X93938-T.reesei-Đức 100 99 99 99 99 99 98 2: AY328038-T.longibrachiatum-Hunrary 99 100 99 99 99 99 98 3: DQ297053-T.longibrachiatum-Mexico 99 99 100 100 100 99 99 4: T37-T.sinensis-ITS_rDNA-Việt Nam 99 99 100 100 100 99 99 5: Z48726-T.saturnisporum-Đức 99 99 100 100 100 100 99 6: AF048744-T.saturnisporum-Hàn Quốc 99 99 99 99 100 100 99 7: DQ083012-T.sinensis-Đài Loan 98 98 99 99 99 99 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: DQ297066-T.longibrachiatum-Mexico 100 100 99 78 78 81 84 2: T37-T.sinensis-tef1-Việt Nam 100 100 99 67 67 69 75 3: AY937412-T.longibrachiatum-Hoa Kỳ 99 99 100 76 75 80 84 4: AY750888-T.sinensis-Đài Loan 78 67 76 100 99 85 79 5: AY750889-T.sinensis-Đài Loan 78 67 75 99 100 85 78 6: AY937414-T.saturnisporum-Nam Phi 81 69 80 85 85 100 78 7: Z23012-T.reesei-Phần Lan 84 75 84 79 78 78 100 Dòng T42: Với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái là T. viride, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T42 là Trichoderma asperellum. Bảng 4. 2 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T42 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AY585878-T.atroviride-Hungary 100 100 100 100 99 99 99 98 99 2:Z48818-T.atroviride-Đức 100 100 100 100 100 99 98 98 98 3:DQ313146-T.koningiopsis-Canada 100 100 100 100 100 99 99 98 99 4:DQ313135-T.koningiopsis-Brazil 100 100 100 100 100 99 99 98 99 5:DQ313155-T.viride-New Zealand 99 100 100 100 100 100 98 98 98 6:DQ315439-T.viride-Anh 99 99 99 99 100 100 98 98 98 7:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 99 98 99 99 98 98 100 100 100 8:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 98 98 98 98 98 98 100 100 100 9:T42-T.viride-ITS_rDNA-Việt Nam 99 98 99 99 98 98 100 100 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AF348116-T.viride-Hoa Kỳ 100 99 90 91 89 88 86 77 84 2:DQ307555-T.viride-CH.Czech 99 100 89 92 89 89 85 78 84 3:AF348112-T.atroviride-Hoa Kỳ 90 89 100 96 88 89 87 79 86 4:DQ307550-T.atroviride-Sri Lanka 91 92 96 100 90 91 87 85 88 5:DQ288997-T.koningii-Ecuador 89 89 88 90 100 96 84 78 85 6:DQ289002-T.koningii-Brazil 88 89 89 91 96 100 84 78 84 7:AY857274-T.asperellum-Úc 86 85 87 87 84 84 100 92 100 8:T42-T.viride-tef1-Việt Nam 77 78 79 85 78 78 92 100 92 9:AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 84 84 86 88 85 84 100 92 100 Dòng T38: Với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, chúng tôi xác định dòng T38 chỉ có thể 29 là T. virens hay Gliocladium flavofuscum (là một teleomorph của T. virens) hoặc Hypocrea virens (cũng là một teleomorph của T. virens) nhƣng kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái (là T. virens), chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T38 là Trichoderma virens. Bảng 4. 3 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T38 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AY154935-T.spirale-Iran 100 100 99 99 98 98 98 2: DQ083014-T.spira-Thái Lan 100 100 99 99 98 98 98 3: AF099008-T.virens-Hoa Kỳ 99 99 100 100 98 98 98 4: T38-T.virens-ITS_rDNA -Việt Nam 99 99 100 100 98 98 98 5: AF362101-T.inhamatum-Hàn Quốc 98 98 98 98 100 99 99 6: AF455502-T.inhamatum-Úc 98 98 98 98 99 100 99 7: AF057599-T.virens-Hoa Kỳ 98 98 98 98 99 99 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AY750890-T.spirale-Thái Lan 100 97 89 84 89 85 86 2: AY750896-T.spirale-Canada 97 100 89 84 89 86 86 3: AY750894-H.virens-Cote.d'Ivoir 89 89 100 96 99 85 85 4: T38-T.virens-tef1-Việt Nam 84 84 96 100 96 76 76 5: AY750891-G.flavofuscum-Hoa Kỳ 89 89 99 96 100 85 85 6: AF348101-T.harzianum-Hoa Kỳ 85 86 85 76 85 100 93 7: AF348103-T.harzianum-Hoa Kỳ 86 86 85 76 85 93 100 Dòng T19: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. asperellum, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA với các loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T19 là Trichoderma asperellum. Bảng 4. 4 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T19 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:DQ313155-T.viride-New Zealand 100 100 100 99 98 98 98 97 97 2:DQ315439-T.viride-Anh 100 100 99 99 97 97 97 97 97 3:Z48818-T.atroviride-Đức 100 99 100 100 97 97 98 97 97 4:AY585878-T.atroviride-Hungary 99 99 100 100 98 98 98 97 97 5:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 98 97 97 98 100 100 100 99 99 6:T19-T.asperellum-ITS_rDNA-Việt Nam 98 97 97 98 100 100 100 99 99 7:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 98 97 98 98 100 100 100 99 99 8:AJ507086-T.hamatum-Úc 97 97 97 97 99 99 99 100 100 9:Z48816-T.hamatum-Đức 97 97 97 97 99 99 99 100 100 Dòng T33: đƣợc chúng tôi khẳng định tên loài chính xác là Trichoderma asperellum dựa vào kết quả định danh dựa vào hình thái là T. asperellum, kết hợp 30 với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI. Bảng 4. 5 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T33 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 100 100 100 99 99 98 97 97 98 2:T33-T.asperellum-ITS_rDNA-ViệtNam 100 100 100 99 99 98 98 97 98 3:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 100 100 100 99 99 98 98 97 98 4:AJ507086-T.hamatum-Úc 99 99 99 100 100 97 97 97 97 5:Z48816-T.hamatum-Đức 99 99 99 100 100 97 97 97 97 6:DQ313155-T.viride-New Zealand 98 98 98 97 97 100 100 100 99 7:Z48818-T.atroviride-Đức 97 98 98 97 97 100 100 99 100 8:DQ315439-T.viride-Anh 97 97 97 97 97 100 99 100 99 9:AY585878-T.atroviride-Hungary 98 98 98 97 97 99 100 99 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AY857274-T.asperellum-Úc 100 92 100 87 87 86 85 84 2: T33-T.asperellum-tef1-Việt Nam 92 100 92 79 84 78 78 77 3: AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 100 92 100 86 87 85 84 83 4: AF348112-T.atroviride-Hoa Kỳ 87 79 86 100 96 90 89 85 5: DQ307550-T.atroviride-Sri Lanka 87 84 87 96 100 91 92 87 6: AF348116-T.viride-Hoa Kỳ 86 78 85 90 91 100 99 84 7: DQ307555-T.viride-CH.Czech 85 78 84 89 92 99 100 84 8: AY750893-T.hamatum-Canada 84 77 83 85 87 84 84 100 Dòng T2: Tƣơng tự đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. asperellum hoặc T. harzianum, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T2 là Trichoderma asperellum. Bảng 4. 6 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T2 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:DQ313155-T.viride-New Zealand 100 100 97 97 98 98 98 92 90 2:DQ315439-T.viride-Anh 100 100 97 97 97 97 97 92 90 3:AJ507086-T.hamatum-Úc 97 97 100 100 99 99 99 91 90 4:Z48816-T.hamatum-Đức 97 97 100 100 99 99 99 91 90 5:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 98 97 99 99 100 100 100 92 91 6:T2_T.asperellum/harzianum-ITS_rDNA 98 97 99 99 100 100 100 92 91 7:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 98 97 99 99 100 100 100 92 90 8:AF055218-T.inhamatum-New Zealand 92 92 91 91 92 92 92 100 94 9:AF362101-T.inhamatum-Hàn Quốc 90 90 90 90 91 91 90 94 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AF348116-T.viride-Hoa Kỳ 100 99 87 80 85 84 71 71 2: DQ307555-T.viride-CH.Czech 99 100 85 80 85 84 67 67 3: AY857274-T.asperellum-Úc 87 85 100 92 100 84 76 75 4: T2-T.asperellum/harzianum-tef1 80 80 92 100 92 77 60 59 5: AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 85 85 100 92 100 83 73 72 6: AY750893-T.hamatum-Canada 84 84 84 77 83 100 70 69 7: AF348101-T.harzianum-Hoa Kỳ 71 67 76 60 73 70 100 93 8: AF348103-T.harzianum-Hoa Kỳ 71 67 75 59 72 69 93 100 31 Dòng T14: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. harzianum, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA với các loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T14 là Trichoderma harzianum. Bảng 4. 7 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T14 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AF362101-T.inhamatum-Hàn Quốc 100 99 100 99 99 91 91 91 91 2:AF455502-T.inhamatum-Úc 99 100 99 99 99 91 90 90 90 3:T14_T.harzianum-ITS_rDNA-Việt Nam 100 99 100 99 99 91 91 91 91 4:AY154932-T.tomentosum-Iran 99 99 99 100 100 91 91 91 91 5:DQ085432-T.tomentosum-Canada 99 99 99 100 100 91 91 91 91 6:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 91 91 91 91 91 100 100 99 99 7:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 91 90 91 91 91 100 100 99 99 8:AJ507086-T.hamatum-Úc 91 90 91 91 91 99 99 100 100 9:Z48816-T.hamatum-Đức 91 90 91 91 91 99 99 100 100 Dòng T85: kết hợp kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI với kết quả định danh dựa vào hình thái là T. harzianum, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T85 là Trichoderma harzianum. Bảng 4. 8 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T85 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AY154932-T.tomentosum-Iran 100 100 99 98 98 92 91 91 91 2:DQ085432-T.tomentosum-Canada 100 100 99 98 98 92 91 91 91 3:AF362101-T.harzianum-Hàn Quốc 99 99 100 99 99 91 91 91 91 4:AF455502-T.harzianum-Úc 98 98 99 100 100 91 90 90 90 5:T85-T.harzianum-ITS_rDNA-Việt Nam 98 98 99 100 100 91 91 90 91 6:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 92 92 91 91 91 100 100 99 99 7:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 91 91 91 90 91 100 100 99 99 8 AJ507086-T.hamatum-Úc 91 91 91 90 90 99 99 100 100 9 Z48816-T.hamatum-Đức 91 91 91 90 91 99 99 100 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AF348103-T.harzianum-Hoa Kỳ 100 92 93 91 75 76 71 2: T85-T.harzianum-tef1-Việt Nam 92 100 87 87 63 63 59 3: AF348101-T.harzianum-Hoa Kỳ 93 87 100 90 75 76 71 4: AY750882-T.tomentosum-Canada 91 87 90 100 72 75 70 5: AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 75 63 75 72 100 100 86 6: AY857274-T.asperellum-Úc 76 63 76 75 100 100 87 7: AY750893-T.hamatum-Canada 71 59 71 70 86 87 100 32 Dòng T88: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. asperellum, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T88 là Trichoderma asperellum. Bảng 4. 9 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T88 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AJ507086-T.hamatum-Úc 100 100 99 99 99 97 97 97 97 2:Z48816-T.hamatum-Germany 100 100 99 99 99 97 97 97 97 3:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 99 99 100 100 100 98 97 97 98 4:T88-T.asperellum-ITS_rDNA-ViệtNam 99 99 100 100 100 98 98 97 98 5:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 99 99 100 100 100 98 98 97 98 6:DQ313155-T.viride-New Zealand 97 97 98 98 98 100 100 100 99 7:Z48818-T.atroviride-Đức 97 97 97 98 98 100 100 99 100 8:DQ315439-T.viride-Anh 97 97 97 97 97 100 99 100 99 9:AY585878-T.atroviride-Hungary 97 97 98 98 98 99 100 99 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AY857274-T.asperellum-Úc 100 92 100 87 87 86 85 84 2: T88-T.asperellum-tef1-Việt Nam 92 100 92 80 84 78 78 77 3: AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 100 92 100 86 87 85 84 83 4: AF348112-T.atroviride-Hoa Kỳ 87 80 86 100 96 90 89 85 5: DQ307550-T.atroviride-Sri Lanka 87 84 87 96 100 91 92 87 6: AF348116-T.viride-Hoa Kỳ 86 78 85 90 91 100 99 84 7: DQ307555-T.viride-CH.Czech 85 78 84 89 92 99 100 84 8: AY750893-T.hamatum-Canada 84 77 83 85 87 84 84 100 Dòng T6: kết hợp kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T6 là Trichoderma asperellum. Bảng 4.10 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T6 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AY380912-T.asperellum-USA 100 100 100 99 99 98 97 97 98 2:T6- T.asperellum-ITS_rDNA-ViệtNam 100 100 100 99 99 98 98 97 98 3:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 100 100 100 99 99 98 98 97 98 4:AJ507086-T.hamatum-Úc 99 99 99 100 100 97 97 97 97 5:Z48816-T.hamatum-Đức 99 99 99 100 100 97 97 97 97 6:DQ313155-T.viride-New Zealand 98 98 98 97 97 100 100 100 99 7:Z48818-T.atroviride-Đức 97 98 98 97 97 100 100 99 100 8:DQ315439-T.viride-Anh 97 97 97 97 97 100 99 100 99 9:AY585878-T.atroviride-Hungary 98 98 98 97 97 99 100 99 100 33 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AF348112-T.atroviride-USA 100 96 90 89 85 86 81 87 2: DQ307550-T.atroviride-Sri Lanka 96 100 91 92 87 87 84 87 3: AF348116-T.viride-USA 90 91 100 99 84 85 78 86 4: DQ307555-T.viride-CH.Czech 89 92 99 100 84 84 79 85 5: AY750893-T.hamatum-Canada 85 87 84 84 100 83 76 84 6: AY376058-T.asperellum-USA 86 87 85 84 83 100 100 100 7: T6-T.asperellum-tef1-Việt Nam 81 84 78 79 76 100 100 99 8: AY857274-T.asperellum-Úc 87 87 86 85 84 100 99 100 Dòng T68: định danh dựa vào hình thái là T. atroviride nhƣng kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA với dữ liệu trên NCBI chỉ giúp kết luận tên loài dòng T68 không phải là T. strigosum và với T. viride (là loài rất dễ nhằm lẫn với T. atroviride khi định danh bằng hình thái) không kết luận đƣợc. Nên chúng tôi chỉ xác định tên loài của dòng T68 là Trichoderma atroviride Bảng 4. 11 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T68 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: DQ313155-T.viride-New Zealand 100 100 99 100 100 98 2: DQ315439-T.viride-Anh 100 100 99 99 99 98 3: AY585878-T.atroviride-Hungary 99 99 100 100 99 98 4: Z48818-T.atroviride-Đức 100 99 100 100 100 98 5: T68_T.atroviride-ITS_rDNA-Việt Nam 100 99 99 100 100 98 6: AY387661-T.strigosum-Hoa Kỳ 98 98 98 98 98 100 Bảng 4. 12 Kết quả định danh tên loài các dòng Trichoderma của đề tài Kí hiệu Tên loài định danh dựa vào hình thái Tên loài đƣợc định danh chính xác dựa vào phân tử T37 T. sinensis T. longibrachiatum T42 T. viride T. asperellum T38 T. virens T. virens T19 T. asperellum T. asperellum (* ) T33 T. asperellum T. asperellum T2 T. asperellum/ T. harzianum T. asperellum T14 T. harzianum T. harzianum (* ) T85 T. harzianum T. harzianum T88 T. asperellum T. asperellum T6 Chƣa xác định T. asperellum (*** ) T68 T. atroviride T. atroviride (**) 34 (*): tên loài được định danh chính xác bằng cách kết hợp kết quả định danh bằng hình thái với trình tự vùng ITS – rDNA.(**): tên loài được xác định dựa vào hình thái và trình tự vùng ITS – rDNA. (***): tên loài được khẳng điṇh dựa vào trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 Từ kết quả định danh trên, cho thấy kết quả định danh tên loài bằng cách kết hợp kết quả định danh dƣạ vào hình th ái với trình tự vùng bảo tồn ITS – rDNA và một phần vùng chức năng tef1 thực hiện trong đề tài là hoàn toàn đáng tin cậy do tỉ lệ tƣơng đồng di truyền của các loài khảo sát với các loài tƣơng ứng với nó là cao nhất (ITS – rDNA: 99 – 100 %, tef1: 92 – 100 %) và cao hơn hẳn các loài khác (tef1: 5 – 24 %), đồng thời nó hoàn toàn phù hợp với kết quả định danh dƣạ vào hình thái. Kết quả định danh dƣạ vào hình thái không hoàn toàn chính xác do hệ thống định danh và phân loại dựa vào hình thái của Trichoderma vẫn chƣa hoàn chỉnh (Gary J. Samuels, 2004) và một vài loài Trichoderma có đặc điểm hình thái khá giống nhau, chỉ khác nhau vài đặc điểm rất khó xác định. Trình tự vùng bảo tồn ITS – rDNA kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái không phải lúc nào cũng có thể khẳng định chính xác tên loài của Trichoderma (T. atroviride (T68)). Khi đa ̃khẳng điṇh tên dòng là Trichoderma, đồng thời có tỉ lệ tƣơng đồng di truyền vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với loài tƣơng ứng với nó là cao nhất và cao hơn hẳn các loài khác thì mới có thể khẳng điṇh tên loài chính xác của chúng (T. asperellum (T6)). Vì nếu không có đầy đủ các điều kiện này thì rất dễ xảy ra sai sót trong viêc̣ xác điṇh tên loài chính xác của chúng . Do giƣ̃a Trichoderma và các teleomorph của nó (Gliocladium hoặc Hypocrea) có tỉ lệ tƣơng đồng di truyền vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 là ít có sự khác biệt , đồng thời trong quá trình sinh sản vô tính có thể xảy ra hiện tƣợng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện sinh thái, địa lý, môi trƣờng sống khác nhau nên sẽ dẫn đến nhiều sai khác và đa dạng trong kiểu gen của cùng loài Trichoderma. Vì thế, trong trƣờng hợp của Trichoderma không thể khẳng định chính xác tên 35 loài chỉ dựa riêng lẻ vào trình tự vùng ITS – rDNA hoặc một phần vùng tef1 hay đặc điểm hình thái. 4.4. Kết quả phân nhóm tạo phổ hệ di truyền 4.4.1. Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 Với dữ liệu về trình tự vùng ITS – rDNA (11 dòng) và một phần vùng tef1 (8 dòng) nằm trong 5 loài Trichoderma: longibrachiatum, asperellum, virens, harzianum, atroviride. Chúng tôi tiến hành so sánh các trình tự này với nhau bằng phần mềm Clustal X 1.83, kết quả đƣợc đọc bằng phần mềm TreeView 1.6.6, từ đó phân nhóm và xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng. 36 H ìn h 4 . 5 K ết q u ả p h ân n h ó m t ừ t rì n h t ự v ù n g I T S – r D N A ( A ) v àm ộ t p h ần v ù n g t ef 1 ( B ), (k í h iệ u d ò n g -t ên l o ài -v ù n g l ấy m ẫu ( tỉ n h )- đ ố i tƣ ợ n g l ấy m ẫu ) 37 Từ kết quả phân nhóm trên, cho thấy các dòng T. harzianum và T. asperellum có quan hệ di truyền phù hợp ở mức độ loài, nên kết quả định danh là chính xác. Ở kết quả phân nhóm vùng ITS – rDNA, các dòng T. asperellum chia thành hai nhóm riêng biệt, cho thấy có sự đột biến và đột biến này không phụ thuộc vào vùng địa lý, đối tƣợng lấy mẫu. Điều này có thể đƣợc giải thích là do trong quá trình sinh sản vô tính đã xảy ra đột biến hoặc sai sót trong quá trình phân chia tế bào. T. longibrachianum có quan hệ di truyền khá tách biệt với các loài khác và T. harzianum có quan hệ di truyền gần với T. virens nhất so với các loài khác. Tƣơng tự, T. asperellum có quan hệ di truyền gần với T. atroviride nhất. Điều này hoàn toàn phù hợp với mối quan hệ về đặc điểm hình thái giữa 5 loài này. Chứng tỏ, đặc điểm về hình thái có mối quan hệ mật thiết với trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1, do đó, trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 có tác động lớn đến biểu hiện về kiểu hình. Ngoài ra, mối quan hệ giữa 5 loài này cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả phân nhóm của Christian P. Kubicek và cs (2002), Christopher R. Thornton và cs (2002) (mục 2.6), cho thấy mối quan hệ di truyền giữa 5 loài này là bền vững và không phụ thuộc vào sự phân bố về sinh thái, địa lý và đối tƣợng lấy mẫu. 4.4.2. Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS1, 5.8S và ITS2 – rDNA Trình tự vùng ITS1, 5.8S và ITS2 – rDNA của 11 dòng Trichoderma đƣợc so sánh với nhau bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Để so sánh mức độ bảo tồn của từng vùng và xác định vùng có ý nghĩa quyết định kết quả phân nhóm của toàn vùng ITS – rDNA. Nhận thấy, trình tự vùng 5.8S của 11 dòng khảo sát giống nhau hoàn toàn, vùng ITS1 có sự khác biệt nhiều nhất trong toàn vùng ITS – rDNA. Chứng tỏ 5.8S là vùng bảo tồn nhất và vùng ITS2 bảo tồn hơn vùng ITS1. 38 H ìn h 4 . 6 K ết q u ả p h ân n h ó m t ừ t rì n h t ự v ù n g I T S 1 – r D N A ( A ) v à IT S 2 – r D N A ( B ), (k í h iệ u d ò n g -t ên l o ài -v ù n g l ấy m ẫu ( tỉ n h )- đ ố i tƣ ợ n g l ấy m ẫu ) 39 Kết quả phân nhóm trên 2 vùng ITS1 và ITS2 – rDNA cho thấy vùng ITS2 có kết quả phân nhóm đúng với kết quả phân nhóm của toàn vùng ITS – rDNA và phù hợp với mối quan hệ về đặc điểm hình thái hơn so với vùng ITS1. Do đó, kết quả phân nhóm vùng ITS2 đáng tin cậy hơn vùng ITS1. Vì vậy, vùng ITS2 là vùng quyết định kết quả phân nhóm của toàn vùng ITS – rDNA và vùng ITS2 chi phối biểu hiện hình thái Trichoderma nhiều hơn vùng ITS1. Vùng 5.8S không có ý nghĩa trong việc phân nhóm do chúng quá bảo tồn, ít có sự khác biệt giữa các loài. 4.5. So sánh vùng ITS1 và ITS2 – rDNA với dữ liệu của chúng trên NCBI Vùng ITS – rDNA 11 dòng Trichoderma phân lập ở Việt Nam đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Từ kết quả so sánh trên cho thấy, kết quả phân nhóm của vùng ITS1 không hoàn toàn chính xác và vùng ITS2 cho kết quả phân nhóm rất đáng tin cậy. Chứng tỏ, trình tự vùng ITS2 có sự phân hóa di truyền đặc trƣng cho từng loài hơn vùng ITS1 và một lần nữa chứng minh kết quả phân nhóm vùng ITS2 đáng tin cậy hơn vùng ITS1 và vùng ITS2 là vùng quyết định kết quả phân nhóm vùng ITS – rDNA. 40 H ìn h 4 .7 K ết q u ả so s án h t rì n h t ự v ù n g I T S 1 (A ) v à IT S 2 – r D N A ( B ) củ a 1 1 d ò n g T ri ch o d er m a V iệ t N am v ớ i d ữ l iệ u c ủ a ch ú n g t rê n th ế g iớ I, ( m ã số t ru y c ập / k í h iệ u d ò n g -t ên l o ài -v ù n g l ấy m ẫu ( q u ố c g ia ) H ìn h 4 . 6 41 4.6. Xác định mối quan hệ di truyền của vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với dữ liệu của chúng trên thế giới Hình 4.8 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS – rDNA của 11 dòng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới (mã số truy cập/ kí hiệu dòng-tên loài-vùng lấy mẫu (quốc gia)) 42 H ìn h 2 .9 K ết q u ả so s án h t rì n h t ự m ộ t p h ần v ù n g t ef 1 c ủ a 1 1 d ò n g T ri ch o d er m a V iệ t N am v ớ i d ữ l iệ u c ủ a ch ú n g t rê n t h ế g iớ I, ( m ã số t ru y c ập / k í h iệ u d ò n g -t ên l o ài -v ù n g l ấy m ẫu ) (q u ố c g ia )) H ìn h 4 . 7 43 Kết quả so sánh trên cho thấy các dòng có mối quan hệ di truyền phù hợp ở mức độ loài nên có thể khẳng định kết quả định danh của chúng tôi là đúng so với kết quả định danh dựa vào vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 trên thế giới. Do đó, trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma sẽ hổ trợ cho việc định danh và so sánh sự đa dạng di truyền giữa các dòng Trichoderma Việt Nam với các dòng Trichoderma trên thế giới. Đối với vùng ITS – rDNA, dòng T. atroviride (T68), T. harzianum (T14, T85) và T. virens (T38) có quan hệ di truyền khá xa so với các dòng trên thế giới. Ở một phần vùng tef1 điều này xảy ra trên tất cả các dòng khảo sát (trừ T. asperellum (T6)). Nhƣ vậy, các dòng Trichoderma Việt Nam có quan hệ di truyền khá xa so với các dòng phân lập ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới. Điều này có thể đƣợc lý giải là do tác động của điều kiện sinh thái, địa lý sống khác nhau nên dẫn đến nhiều sai khác và đa dạng về kiểu gen trong cùng loài. Do đó, có thể thấy rằng, trong 11 dòng phân lập ở Việt Nam, 10 dòng có nguồn gốc bản địa và dòng T. asperellum (T6) có thể là dòng ngoại lai du nhập vào nƣớc ta. Điều này mở ra triển vọng nhằm sử dụng vùng ITS – rDNA và nhất là một phần vùng tef1 để phân biệt giữa dòng Trichoderma bản địa (Việt Nam) với các dòng ngoại lai nhằm ngăn ngừa ô nhiễm sinh học có thể xảy ra trong tƣơng lai và xác định nguồn gốc dòng Trichoderma. 44 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 1. Đã thiết lập và hoàn thiện qui trình phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA (ITS1– 5.8S – ITS2) bằng cặp primer ITS4 và ITS5 và một phần vùng tef1 (4 th large intron) bằng cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R. 2. Khẳng định tên loài chính xác của 10 dòng Trichoderma khảo sát và dòng T68 tên loài đƣợc xác định là T. atroviride. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả định danh dựa vào vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 trên thế giới. 3. Thiết lập đƣợc mối quan hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma thuộc 5 loài T. longibrachiatum, T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum, T. virens. Các dòng Trichoderma Việt Nam có quan hệ di truyền khá xa so với các dòng trên thế giới. Trong 11 dòng phân lập ở Việt Nam có 10 dòng có nguồn gốc bản địa, dòng T. asperellum (T6) có thể là dòng ngoại lai du nhập vào nƣớc ta. Mối quan hệ di truyền giữa 5 loài này là bền vững, không phụ thuộc vào sự phân bố về sinh thái, địa lý, đối tƣợng lấy mẫu và phù hợp với mối quan hệ về hình thái. 4. Tạo đƣợc nguồn dữ liệu về trình tự vùng ITS – rDNA của 11 dòng và một phần vùng tef1 của 8 dòng thuộc 5 loài Trichoderma. Dữ liệu này sẽ đóng góp nguồn gen, hổ trợ cho công tác định danh, phân nhóm, trao đổi thông tin di truyền và nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các dòng Trichoderma Việt Nam với dữ lệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới. 5.2. Đề nghị 1. Tăng số dòng và số loài nghiên cứu do chỉ có 5 loài đƣợc nghiên cứu và số dòng của T. longibrachiatum (T37), T. virens (T38) và T. atroviride (T68) sử dụng trong đề tài chỉ có 1 dòng đại diện nên không thể nhận xét quan hệ di truyền giữa các dòng trong cùng một loài, T. harzianum chỉ có 2 dòng T14 và T85 nên không thể hiện chân thực mối quan hệ di truyền giữa chúng và điều này giúp thể hiện rõ hơn mối quan hệ di truyền ở mức độ vùng địa lý và đối tƣợng lấy mẫu (đất nông 45 nghiệp, đất rừng, đất khai hoang, sầu riêng, dứa, đậu phụng, trà…). 2. Giải trình tự vùng tef1 (4th large intron) của dòng T. asperellum (T68) để có thể khẳng định tên loài chính xác của nó. 3. Mở rộng nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa trình tự vùng ITS – rDNA, một phần vùng tef1 với khả năng đối kháng các nấm bệnh cây trồng và tiết các enzyme có giá trị thƣơng mại nhƣ cellulase, protease, glucanase của Trichoderma. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Việt Nam 1. Lại Hà Tố Hoa, 2006. Định danh nấm Trichoderma spp. dựa vào trình tự vùng ITS – rDNA và vùng tef1. Luận văn tốt nghiệp kĩ sƣ Công nghệ sinh học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 2. Lâm Thanh Hiền, 1999. Chƣơng 3, Hình thái cấu tạo các vi sinh vật có nhân thật (Eucaryote). Vi sinh vật học đại cương (Tô Minh Châu, Vƣơng Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hƣơng). Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, trang 59 – 61. 3. Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, trang 111-153. 4. Nguyễn Thị Thuần, 1998. Hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh hại cây trồng. Tạp chí Bảo vệ Thực vật 4: 35-38. 5. Nguyễn Thị Thuần, 1999. Phương pháp sản xuất và sử dụng nấm Trichoderma để phòng trừ bệnh hại cây trồng. Tạp chí Bảo vệ Thực vật 4: 33-34. 6. Nguyễn Xuân Thành, 2003. Giáo trình công nghệ vi sinh vật trong sản xuất nông nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. Nƣớc ngoài 7. Berbee M.L., Yoshimura A., Sugiyama J., and Taylor J.W., 1995. Is Penicillium monophyletic an evaluation of phylogeny in the family Trichocomaceae from 18S, 5.8S and ITS ribosomal sequence data. Mycologia 87: 210-222. 8. Bissett J., 1984. A revision of the genus Trichoderma. I. Sec. Longibrachiatum sect. nov. Can J Bot, 62:924-931. 9. Bissett J., 1991a. A revision of the genus Trichoderma. II. Infrageneric classification. Can J Bot, 69:2357-2372 10. Bissett J., 1991b. A revision of the genus Trichoderma. III. Sect. Pachybasium. Can J Bot, 69:2373-2417. 47 11. Bissett J., 1991c. A revision of the genus Trichoderma. IV. Additional notes on section Longibrachiatum. Can J Bot, 69:2418-2420. 12. Bissett J., 1992. Trichoderma atroviride. Can J Bot, 70:639-641. 13. Bissett J., Szakacs G., Nolan C.A., Druzhinina I., Kullnig-Gradinger C.M., Kubicek C.P., 2003. Seven new taxa of Trichoderma from Asia. Can J Bot, 81:570-586. 14. Bruns T.D., White T.J. and Taylor J.W., 1991. Fungal molecular systematics. Annu. Rev. Ecol. Syst. 22: 525-564. 15. Bruns T.D., Vilgalys R., Barns S.M., Gonzalez D., Hibbett D.S., Lane D.J., Simo L., Stickel S., Szaro T.M., Weisburg W.G., and Sogin M.L., 1992. Evolutionary relationships within the fungi: analyses of small subunit ribosomal DNA sequences. Appl. Environ. Microbiol. 61: 681-689. 16. Carbone I. and Kohn L.M, 1999. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes. Mycologia 91(3): 553-556. 17. Chaverri P., Castlebury L.A., Overton B.E., Samuels G.J., 2003b. Hypocrea/Trichoderma: species with conidiophore elongations and green conidia. Mycologia, 95: 1100-1140. 18. Christian P. Kubicek, John Bissett, Irina Druzhinina, Cornelia Kullnig- Gradinger, George Szakacs, 2002. Genetic and metabolic diversity of Trichoderma: a case study on South-East Asian isolates. In website: 19. Christopher R. Thornton, Dennis Pitt, Gavin E. Wakley and Nicholas J. Talbot, 2002. Production of a monoclonal antibody specific to the genus Trichoderma and closely related fungi, and it use to detect Trichoderma spp. in naturally infected composts. Microbiology, 148, 1263-1279 20. Clipson N., Landy E., Otte M., 2001. European register of marine species: a check-list of the marine species in Europe and a bibliography of guides to their identification. Collection Patrimoines Naturels, 50, 15-19 21. Druzhinina I., Koptchinski A., Komon M., Bissett J., Szakacs G., Kubicek C.P., 48 2004b. A DNA-barcode for strain identification in Trichoderma. Manuscript submitted. 22. Gams W., Bissett J., 1998. Morphology and Identification of Trichoderma. In: Kubicek, C.P., Harman, G.E. (Eds.), Trichoderma and Gliocladium. Vol. 1. Basic Biology, Taxonomy and Genetics. Taylor and Francis Ltd., London, p.3-34. 23. Gary E. Harman., 2000. Trichoderma spp., including T. harzianum, T. viride, T. koningii, T. hamatum and other spp. Deuteromycetes, Moniliales (asexual classification system). Cornel University, Geneve, NY 14456. 24. Gary J. Samuels, 2004. Trichoderma a guide to identification and biology. Unit States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA. Blackwell Science, Ltd 25. Gary J. Samuels, 9-2005. Trichoderma: Systematic, the Sexual State, and Ecology. United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705. Acepted for publication. 26. Guarro Josep, Gené Josepa and Stchigel Alberto M., 1999. Developments in fungal taxonomy. Clinical Microbiology Reviews Vol. 12, No. 3, pp. 454- 500. 27. Kubicek C.P., Bissett J., Druzhinina I., Kullnig-Gradinger C.M., Szakacs G., 2003. Genetic and metabolic diversity of Trichoderma: a case study on South East Asian isolates. Fungal Genet Biol, 38:310-319. 28. Kullnig-Gradinger C.M., Szakacs G., Kubicek C.P., 2002. Phylogeny and evolution of the fungal genus Trichoderma-a multigene approach. Mycol Res, 106:757-767. 29. Kuhls K., Lieckfeldt E., Samuels G.J., Kovacs W., Meyer W., Petrini O., Gams W., Börner T., Kubicek C.P., 1996. Molecular evidence that the asexual 49 industrial fungus Trichoderma reesei is a clonal derivative of the ascomycete Hypocrea jecorina. Proc. Natl Acad Sci USA, 93:7755-7760. 30. Kuhls K., Lieckfeldt E., Samuels G.J., Meyer W., Kubicek C.P., Börner T., 1997. Revision of Trichoderma section Longibrachiatum including related teleomorphs based on an analysis of ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences. Mycologia, 89:442-460. 31. Leclerc M.C., Philippe H. , and Guého E., 1994. Phylogeny of dermatophytes and dimorphic fungi based on large subunit ribosomal RNA sequence comparisons. J. Med. Vet. Mycol. 32: 331-341. 32. Muthumeenakshi S., Mills P.R., Brown A.E., and Seaby D.A., 1994. Intraspecific molecular variation among Trichoderma harzianum isolates colonizing mushroom compost in the British Isles. Microbiology 140: 769- 777. 33. Palmer, Makaroff C.A., Apel I.J., and Shirzadegan M., 1990. Fluid structure of plant mitochondrial genomes: evolutionary and functional implications. In M. T. Clegg and S. J. O'Brien [eds.], Molecular evolution, 85–96. Alan R. Liss, New York, NY 34. Prasun K. Mukherjee and Kanthadai Raghu, 1997. Effect of temperature on antagonistic and biocontrol pontential of Trichoderma sp. on Sclerotium rolfsii. Mycopathologia. 139: 151-155. 35. Rifai M.A., 1969. A revision of the genus Trichoderma. Mycol Pap, 116:1-116. 36. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 37. Samuels G.J., 1996. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycol Res, 100:923-935. 38. Samuels G.J., Petrini O., Kuhls K., Lieckfeldt E., Kubicek C.P., 1998. The Hypocrea schweinitzii complex and Trichoderma sect. Longibrachiatum. Stud Mycol, 41:1-54. 50 39. Siu-Wai Chiu & David Moore, 2001. Deciphering Fungal Morphogenesis. Website: 40. Szymanski Maciej, Barciszewska Miroslawa Z., Erdmann Volker A. and Barciszewski Jan, 2001. 5S Ribosomal RNA Database. Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 1: 176-178. 41. Turner D., Kovacs W., Kuhls K., Lieckfeldt E., Peter B., Arisan-Atac I., Strauss, J., Samuels G.J., Börner T., Kubicek C.P., 1997. Biogeography and phenotypic variation in Trichoderma sect. Longibrachiatum and associated Hypocrea species. Mycol Res, 101:449-459. 42. Van de Peer Y., Chapelle S., and De Wachter R., 1996. A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA. Nucleic Acids Research. 24:3381-3391. 43. Virginia Bioinformatics Institute Core Facilities Laboratory, 2002. DNA sequencing protocols. 44. Wakefield A.E., Peters S.E., Banergi S., Bridge P.D., Hall G.S., and Hawksworth D.L., 1992. Pneumocystis carinii shows DNA homology with the ustomycetous red yeast fungi. Mol. Microbiol. 6:1903-1911. 45. Wang C.S., Li Z.Z., and Butt T.M., 2002. Molecular studies of co-formulated strains of the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana. 46. White T.J., Bruns T.M, Lee S. and Taylor J., 1989. Genetics and Evolution (part three). Amplication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for Phylogenetics. pp.315 – 320. 47. White T.J., Bruns T., Lee S. and Taylor J., 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: M.A., Innis et al. (Eds). PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. Academic Press, San Diego, pp. 315-322. Website 48. PHỤ LỤC 1. Phụ lục 1: Kết quả giải trình tự vùng ITS – rDNA với primer ITS4 và ITS5 ở công ty Macrogen, Hàn Quốc. Dòng T37 – T. longibrachianum 576bq 18S 1..9 ITS1 10..232 5.8S 233..390 ITS2 391..559 28S 560..576 1 GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCT 61 CGGCGGGATTCTCTTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAG 121 GACCAACTCCAAACTCTTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCTCCCGTCGCGGCTCTGTTTTATT 181 TTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTC 241 AACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATG 301 TGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATT 361 CTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCG 421 TTGGGGATCGGCCCCTCACCGGGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCT 481 CTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCACAGCCGTAAAAC 541 ACCCCAAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGT Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T37 với primer ITS4 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T37 với primer ITS5 Dòng T42 – T. asperellum 540bq 18S 1..9 ITS1 10..191 5.8S 192..349 ITS2 350..523 28S 524..540 1 61 121 181 241 301 361 421 481 GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTC GGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCA ACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTC AAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA CATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAA CCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAAT ACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAG CGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGT Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T42 với primer ITS4 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T42 với primer ITS5 Dòng T38 – T. virens 552 bq 18S 1..9 ITS1 10..208 5.8S 209..366 ITS2 367..535 28S 536..552 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTC GGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCA ACCAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTACTATCTGAGCCATCTCGGCGC CCCTCGTGGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCA TCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCG TCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTTTACGGGGC CGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACT CGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCCAAACTTCTGAAATGTTGAC CTCGGATCAGGT Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T38 với primer ITS4 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T38 với primer ITS5 Dòng T19 – T. asperellum 541 bq 18S 1..9 ITS1 10..192 5.8S 193..350 ITS2 351..524 28S 525..541 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTC GGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCA ACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTTACAGCTCTGAGCAAAAATT CAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCA GCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC ACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGA ACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCTAAA TACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGA GCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGG T Kết quả đọc trình tự dạng peak với T19 với primer ITS4 1 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T19 với primer ITS5 2 Dòng T33 – T. asperellum 540 bq 18S 1..9 ITS1 10..191 5.8S 192..349 ITS2 350..523 28S 524..540 1 61 121 181 241 301 361 421 481 GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTC GGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCA ACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTC AAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA CATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAA CCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAAT ACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAG CGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGT Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T33 với primer ITS4 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T33 với primer ITS5 Dòng T2 – T. asperellum 540 bq 18S 1..9 ITS1 10..191 5.8S 192..349 ITS2 350..523 28S 524..540 1 61 121 181 241 301 361 421 481 GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTC GGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCA ACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTC AAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA CATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAA CCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAAT ACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAG CGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGT Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T2 với primer ITS4 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T2 với primer ITS5 Dòng T14 – T. harzianum 556 bq 18S 1..9 ITS1 10..208 5.8S 209..366 ITS2 367..539 28S 540..556 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTC GGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCA ACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGC CTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCA TCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCG TCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTCCCTTAGCG GGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTG CACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGT TGACCTCGGATCAGGT 1 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng 14 với primer ITS4 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T14 với primer ITS5 2 Dòng T85 – T. harzianum 557 bq 18S 1..9 ITS1 10..208 5.8S 209..366 ITS2 367..540 28S 541..557 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTC GGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCA ACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATGATCTGAGCCTTCTCGGCGC CTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCA TCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCG TCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTCTTGG CGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTT GCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATG TTGACCTCGGATCAGGT Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T85 với primer ITS4 3 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T85 với primer ITS5 Dòng T88 – T.asperellum 540 bq 18S 1..9 ITS1 10..191 5.8S 192..349 ITS2 350..523 28S 524..540 1 61 121 181 241 301 361 421 481 GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTC GGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCA ACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTC AAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA CATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAA CCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAAT ACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAG CGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGT Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T88 với primer ITS4 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T88 với primer ITS5 1 Dòng T6 – T. asperellum 540 bq 18S 1..9 ITS1 10..191 5.8S 192..349 ITS2 350..523 28S 524..540 1 61 121 181 241 301 361 421 481 GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTC GGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCA ACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTC AAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA CATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAA CCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAAT ACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAG CGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGT Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T6 với primer ITS4 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T6 với primer ITS5 2 Dòng T68 – T. atroviride 554 bq 18S 1..9 ITS1 10..194 5.8S 195..352 ITS2 353..528 28S 529..545 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTC GGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCA ACCAAACTCTTTACTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAAA TTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACG CAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAAC GCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTC GAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTCAGACGGGATCCCGGCCCC GAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACC GGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGAT CAGGT Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T68 với primer ITS4 3 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T68 với primer ITS5 2. Phụ lục 2: Kết quả giải trình tự một phần vùng tef1 với primer EF1 – 728F và EF1 – 986R ở công ty Macrogen, Hàn Quốc. Dòng T37 – T. longibrachianum 275 bq 1 61 121 181 241 ATCCCTTCAATTTTCGGACGATTTCCTTTGCCTCTGCCCAACATCTGTCGACCAGGTGGT CTGCGTCGATGGACTTTTTTTCACCACCCCGCTTTCTCCTACCCCTCCTTTGGGCGACGC AAATTTTTTTTGTTGCGTTTCGGGTTTTAGTGGGGATGCACCTCCAGCAAACCACTATCC TCTGCCGCCCTCTGCTCTCGTCTCCAACACCTTTGGCGCTTGCGTCATCAACCTTCCAAC AGTCTGCGCAGCAATGCTAATCATTTCCCCCTCAA 4 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T37 với primer EF1 – 728F Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T37 với primer EF1 – 986R Dòng T42 – T. asperellum 290 bq 1 61 121 181 241 TGCTTTTCCCATCAATTTTTGGCACAATTATATGCCCGACAATTCTGTTCTCAGTTTTGT CTTTCTTTTTTCAGCATCACCCCGCTTTGCCAGCCTACCTACCCCTCCTTTGGCACAGCA AAAAATTTTCTCGCTGCCTTGTTTGGCTTTTAGTGGGGTGTCAATTTTGTTTGACGGCAA CCCCACTATCGCCACTGTACCTCTTTCCATCATCCACCACATGCTTTTGTTCAATCGCAT CGTCTATTTTCAATATCTCTTGTTCATTATGCTGATCATGCTTCAATCAA 5 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T42 với primer EF1 – 728F Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T42 với primer EF1 – 986R Dòng T38 – T. virens 278 bq 1 61 121 181 241 TGCTTTCGCATCAATTTCCCCTTCACATTCAATTGTGCTCGACAATTCTCTTCAGAATCA TCGAAGCAACAATTTTTTTCGTCACCCCGCTTTCGTTCCATTACCCCTCCTTTGCAGCGA CGCAAAATTTTTTGCTGCCTCTGGTTTTTAGTGGGGGTGCACCAGCAACCCCACCACTAC CTCGCTGCTCTTTGCCCTTGTCCTATCACCTCCCAGTCCTCGTCCAACGATCTGTGTCTC GATAATTGCAGCGATGCTAACCACCGTTCCCTCAACAG 6 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T38 với primer EF1 – 728F Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T38 với primer EF1 – 986R Dòng T33 – T. asperellum 290 bq 1 61 121 181 241 TGCTTTTCCCATCAATTTTTGGCACAATTATATGCCCGACAATTCTGTTCTCAGTTTTGT CTTTCTTTTTTCAGCATCACCCCGCTTTGCCAGCCTACCTACCCCTCCTTTGGCACAGCA AAAAATTTTCTCGCTGCCTTGTTTGGCTTTTAGTGGGGTGTCAATTTTGTTTGACGGCAA CCCCACTATCGCCACTGTACCTCTTTCCATCATCCACCACATGCTTTTGTTCAATCGCAT CGTCTATTTTCAATATCTCTTGTTCATTATGCTGATCATGCTTCAATCAA 7 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T33 với primer EF1 – 728F Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T33 với primer EF1 – 986R Dòng T2 – T. asperellum 290 bq 1 61 121 181 241 TGCTTTTCCCATCAATTTTTGGCACAATTATATGCCCGACAATTCTGTTCTCAGTTTTGT CTTTCTTTTTTCAGCATCACCCCGCTTTGCCAGCCTACCTACCCCTCCTTTGGCACAGCA AAAAATTTTCTCGCTGCCTTGTTTGGCTTTTAGTGGGGTGTCAATTTTGTTTGACGGCAA CCCCACTATCGCCACTGTACCTCTTTCCATCATCCACCACATGCTTTTGTTCAATCGCAT CGTCTATTTTCAATATCTCTTGTTCATTATGCTGATCATGCTTCAATCAA 8 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T2 với primer EF1 – 728F Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T2 với primer EF1 – 986R Dòng T85 – T. harzianum 276 bq 1 61 121 181 241 TGATTTTCGCCTCGATTCCTCTTCTTTCATATTCAATTGTGCCCGACAATTCTTCAGAGA CTTTTTGGGTCGACAATTTTTCGTCACCCCGCTTTCCATTACCCCTCCTTTGCAGCGACG CAAATTTTTTTTGCTGCCGTTTGATTTTTAGTGGGGTTCTCTGTGCAACCCCACTAGCTC ACTGCTTTTTTTGTGCTTCATTCACTTCCCAGTCATCATTCAACGTGCTCTGTGTCTTTG GTTATTCAACGATGCTAACCACTTTTCCATCAATAG 9 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T85 với primer EF1 – 728F Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T85 với primer EF1 – 986R Dòng T88 – T.asperellum 290 bq 1 61 121 181 241 TGCTTTTCCCATCAATTTTTGGCACAATTATATGCCCGACAATTCTGTTCTCAGTTTTGT CTTTCTTTTTTCAGCATCACCCCGCTTTGCCAGCCTACCTACCCCTCCTTTGGCACAGCA AAAAATTTTCTCGCTGCCTTGTTTGGCTTTTAGTGGGGTGTCAATTTTGTTTGACGGCAA CCCCACTATCGCCACTGTACCTCTTTCCATCATCCACCACATGCTTTTGTTCAATCGCAT CGTCTATTTTCAATATCTCTTGTTCATTATGCTGATCATGCTTCAATCAA 10 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T88 với primer EF1 – 728F Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T88 với primer EF1 – 986R Dòng T6 – T. asperellum 290 bq 1 61 121 181 241 TGCTTTTCCCATCAATTTTTGGCACAATCATATGCCCGACAATTCTGCTCTCAGTTTTTG TCTTTTTTTTCCAGCGTCACCCCGCTTTGCCAGTCTACCTACCCCTCCTTTGGCACAGCA AAAATTTTCTGGCTGCCTTGTTTGGCTTTTAGTGGGGTGTCAAATTTTTTGGCAGCAACC CCGCTATCGCCACTGCACCTCTTCCATCACCCACCACATGCTATTTGCTCAATCGCGTCG TCTTTTTTTGTTCATTATGCTGATCATGCTTCAATCAA 11 Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T6 với primer EF1 – 728F Kết quả đọc trình tự dạng peak dòng T6 với primer EF1 – 986R