Khóa luận Hạt nano từ tính Fe3O4: tính chất và ứng dụng để đánh dấu tế bào và xử lí nước bị nhiễm bẩn

nhiệt độ Curie sắt từ (Tc). Dưới nhiệt độ Tc tương tác giữa các mô men từ thắng được kích thích nhiệt do đó vật liệu thể hiện tính sắt từ. Trên nhiệt độ Tc năng lượng kích thích nhiệt đủ lớn để phá vỡ trạng thái liên kết sắt từ giữa các mô men từ làm cho phân bố các mô men từ trở lên hỗn loạn và vật liệu thể hiện tính chất thuận từ. Ngày nay rất nhiều loại vật liệu có tính sắt từ đã được tìm ra và ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật và đời sống như: các kim loại (các kim loại chuyển tiếp và kim loại đất hiếm), các hợp kim (hợp kim Fe-Si, Fe-Ni hay còn gọi là hợp kim permalloy,..v.v.), các ôxít. Vật liệu sắt từ với từ tính mạnh và khả năng ứng dụng lớn là đối tượng nghiên cứu được quan tâm hàng đầu trong lĩnh vực từ học. 1.2. Tính chất siêu thuận từ Đối với một vật liệu sắt từ thì khi ở kích thước lớn các hạt có xu hướng phân chia thành các domain từ để giảm năng lượng dị hướng hình dạng và ta có các hạt đa domain. Khi kích thước hạt giảm xuống dưới một giá trị nào đó (thông thường khoảng 100 nm) thì mỗi hạt là một domain từ nói cách khác ta có các hạt đơn domain có mô men từ sắp xếp theo các phương dễ từ hoá dưới tác dụng của năng lượng dị hướng từ. Tiếp tục giảm kích thước hạt qua một giới hạn tiếp theo (thông thường giới hạn này cỡ 20 nm) sẽ xảy ra tình huống trong đó năng lượng kích thích nhiệt (có xu hướng phá vỡ sự định hướng mô men từ của các hạt) trở nên trội hơn năng lượng dị hướng từ (có tác dụng định hướng mô men từ của các hạt). Khi đó mô men từ của các hạt sẽ định hướng một cách hỗn do đó mô men từ tổng cộng bằng không. Chỉ khi có từ trường ngoài tác dụng thì mới có sự định hướng của mô men từ của các hạt và tạo ra mô men từ tổng cộng khác không. Tính chất này là đặc trưng cho các vật liệu thuận từ nhưng ở đây mỗi hạt nanô có chứa hàng vạn nguyên tử nên cũng có mô men từ hàng vạn lần lớn hơn mô men từ nguyên tử vì vậy tính chất này được gọi là tính chất siêu thuận từ.Đường cong từ hoá siêu thuận từ cũng tuân theo hàm Langevin như trường hợp thuận từ. Đường cong này có hai đặc điểm đó là: lực kháng từ Hc = 0, từ độ dư Mr = 0 nghĩa là không có hiệu ứng trễ. Điều này là hoàn toàn khác so với đường cong từ trễ sắt từ khi hạt có kích thước lớn. Hình 1.1 diễn tả sự thay đổi đường cong từ hoá của vật liệu sắt từ khi kích thước hạt giảm. Trong giới hạn đơn domain khi kích thước hạt giảm thì Hc giảm cho đến khi Hc = 0, kích thước tại đó Hc = 0 chính là giới Hình 1.1: Đường cong từ hoá sắt từ (---) và siêu thuận từ (---) hạn siêu Hc dp ds dm Đa domain Đơn domạin Siêu thuận từ Hình 1.2: Hc phụ thuộc vào đường kính hạt thuận từ. Hình 1.2 biểu diễn sự thay đổi của Hc khi đường kính hạt giảm [14]. Do sự cạnh tranh giữa năng lượng dị hướng và năng lượng kích thích nhiệt mà các hạt thể hiện tính chất siêu thuận từ khi kích thước thoả mãn điều kiện (1.1): [14] (1.1)với Vp là thể tích hạt, kB là hằng số Boltzmann (kB = 1,38.10-23 J/mol.K), T là nhiệt độ của mẫu, K là hằng số dị hướng từ. Dựa vào điều kiện (1.1) ta có thể đánh giá giới hạn kích thước để hạt thể hiện tính chất siêu thuận từ ở nhiệt độ phòng khi biết giá trị của K. Ngược lại với các hạt có kích thước xác định (có Vp xác định) tồn tại nhiệt độ chuyển pha sắt từ - siêu thuận từ còn gọi là nhiệt độ Blocking (TB): [14] (1.2)Trên nhiệt độ TB điều kiện (1.1) được thoả mãn hạt thể hiện tính chất siêu thuận từ, dưới nhiệt độ này điều kiện đó không được thoả mãn và hạt thể hiện tính chất sắt từ. Trong thực nghiệm có thể xác định nhiệt độ TB bằng cách đo đường cong từ hoá ZFC (Zero Field Cooling) của các mẫu. 1.3. Ôxít sắt từ Ôxít sắt từ có công thức phân tử Fe3O4 là vật liệu từ tính đầu tiên mà con người biết đến. Từ thế kỷ thứ tư người Trung Quốc đã khám phá ra rằng Fe3O4 tìm thấy trong các khoáng vật tự nhiên có khả năng định hướng dọc theo phương Bắc Nam địa lý. Đến thế kỉ mười hai họ đã sử dụng vật liệu Fe3O4 để làm la bàn, một công cụ giúp xác định phương hướng rất có ích. Trong tự nhiên oxít sắt từ không những được tìm thấy trong các khoáng vật (như hình 1.3) mà nó còn được tìm thấy trong cơ thể các sinh vật như: vi khuẩn Aquaspirillum magnetotacticum, ong, mối, chim bồ câu..v..v [14]. Chính sự có mặt của Fe3O4 trong cơ thể các sinh vật này đã tạo nên khả năng xác định phương hướng mang tính bẩm sinh của chúng. Hình 1.3: Fe3O4 tìm thấy trong khoáng vật Trong phân loại vật liệu từ, Fe3O4 được xếp vào nhóm vật liệu ferít là nhóm vật liệu từ có công thức tổng quát MO.Fe2O3 và có cấu trúc spinel, trong đó M là một kim loại hoá trị 2 như Fe, Ni, Co, Mn, Zn, Mg hoặc Cu. Trong loại vật liệu này các ion oxy có bán kính khoảng 1,32Ǻ lớn hơn rất nhiều bán kính ion kim loại (0,60,8 Ǻ) nên chúng nằm rất sát nhau và sắp xếp thành một mạng có cấu trúc lập phương tâm mặt xếp chặt [9]. Trong mạng này có các lỗ hổng thuộc hai loại: loại thứ nhất là lỗ hổng tứ diện (nhóm A) được giới hạn bởi 4 ion oxy, loại thứ hai là lỗ hổng bát diện (nhóm B) được giới hạn bởi 6 ion oxy. Các ion kim loại M2+ và Fe3+ sẽ nằm ở các lỗ hổng này và tạo nên hai dạng cấu trúc spinel của nhóm vật liệu ferít. Trong dạng thứ nhất, toàn bộ các ion M2+ nằm ở các vị trí A còn toàn bộ các ion Fe3+ nằm ở các vị trí B. Cấu trúc này đảm bảo hoá trị của các nguyên tử kim loại vì số ion oxy bao quanh các ion Fe3+ và M2+ có tỷ số 3/2 nên nó được gọi là cấu trúc spinel thuận. Cấu trúc này được tìm thấy trong ferít ZnO.Fe2O3. Dạng thứ hai thường gặp hơn được gọi là cấu trúc spinel đảo. Trong cấu trúc spinel đảo một nửa số ion Fe3+ cùng toàn bộ số ion M2+ nằm ở các vị trí B, một nửa số ion Fe3+ còn lại nằm ở các vị trí A. Oxít sắt từ Fe3O4 FeO.Fe2O3 là một ferít có cấu trúc spinel đảo điển hình. Cấu trúc spinel của Fe3O4 được minh hoạ trên hình 1.4 Fe3+ Fe2,5+ O2- Hình 1.4: Cấu trúc spinel của Fe3O4 (Fe2,5+ là Fe2+ và Fe3+ ở vị trí B) Chính cấu trúc spinel đảo này đã quyết định tính chất từ của Fe3O4, đó là tính chất feri từ. Mô men từ của các ion kim loại trong hai phân mạng A và B phân bố phản song song điều này được giải thích nhờ sự phụ thuộc góc của tương tác siêu trao đổi : AÔB = 125°9΄, AÔA = 79°38΄, BÔB = 90° do đó tương tác phản sắt từ giữa A và B là mạnh nhất [9, 13]. Trong Fe3O4 bởi vì ion Fe3+ có mặt ở cả hai phân mạng với số lượng như nhau nên mô men từ chỉ do Fe2+ quyết định. Mỗi phân tử Fe3O4 có mô men từ tổng cộng là 4μB (μB là magneton Bohr nguyên tử, trong hệ đơn vị chuẩn quốc tế SI thì μB = 9,274.10-24 J/T). Hình 1.5 là cấu hình spin của phân tử Fe3O4. Giống như các vật liệu sắt từ thì vật liệu feri từ cũng có sự chuyển pha sang trạng thái thuận từ tại một nhiệt độ gọi là nhiệt độ Curie (Tc), mà nhiệt độ này với Fe3O4 là 850 K [14]. Riêng đối với Fe3O4 còn có thêm một sự chuyển pha khác đó là chuyển pha cấu trúc tại nhiệt độ 118 K còn gọi là nhiệt độ Verwey [14]. Dưới nhiệt độ này Fe3O4 chuyển sang cấu trúc tam tà làm tăng điện trở suất của vật liệu này vì vậy nhiệt độ Verwey thường được dùng để phân biệt Fe3O4 với các ôxít sắt khác. Hình 1.5: Cấu hình spin của Fe3O4 Ôxít sắt từ có phạm vi ứng dụng hết sức rộng rãi như ghi từ, in ấn, sơn phủ,..v..v. Các ứng dụng này thì đều tập trung vào vật liệu Fe3O4 dạng hạt. Hiện nay người ta đang đặc biệt quan tâm nghiên cứu ứng dụng hạt Fe3O4 có kích thước nanô bởi vì về mặt từ tính thì khi ở kích thước nhỏ như vậy vật liệu này thể hiện tính chất hoàn toàn khác so với khi ở dạng khối đó là tính chất siêu thuận từ. Phần tiếp theo sẽ trình bày kỹ hơn về tính chất này của các hạt nanô. CHƯƠNG 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.1. Các phương pháp chế tạo mẫu Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu thử nghiệm để chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4, sau đây là một số phương pháp chúng tôi đã thực hiện để chế tạo hạt nano từ tính. 2.1.1 Phương pháp đồng kết tủa Phương pháp đồng kết tủa được lựa chọn để chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4 vì đây là phương pháp đơn giản, dễ chế tạo, cho kết quả nhanh và chi phí thấp. Việc chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa dựa vào phản ứng hóa học [10]: 2FeCl3 + FeCl2 + 8NH3 + H2O = Fe3O4 + 8NH4Cl (2.1) Các hạt Fe3O4 được tạo thành khi cho dung dịch hỗn hợp hai muối sắt là FeCl2 và FeCl3 có cùng tốc độ kết tủa với tỷ lệ mol tương ứng là: FeCl2 : FeCl3 = 1 : 2. Dung dịch hai muối sắt được phản ứng với dung dịch kiềm mạnh NH4OH 35%, ở nhiệt độ phòng. Máy khuấy từ được sử dụng để phản ứng xảy ra triệt để hơn. Phản ứng xảy ra trong môi trường khí N2. Hạt nano được tạo thành dưới dạng kết tủa màu đen và sau phản ứng được rửa bằng 4-5 lần bằng nước cất để đảm bảo loại bỏ hết các chất không mong muốn như muối NH4Cl mới tạo thành hay các muối sắt và NH4OH còn dư sau phản ứng. Nước cất trong thí nghiệm đều được sục khí N2 trong vòng từ 15-30 phút trước khi sử dụng. Sau khi rửa ta thu được các hạt Fe3O4 ở trong nước. Thời gian đầu các hạt Fe3O4 phân tán trong nước tạo thành một thể huyền phù. Tuy nhiên sau một thời gian thì các hạt này sẽ kết tụ và lắng đọng làm cho hệ không còn ở trạng thái như trước nữa. Ngoài ra các hạt nano Fe3O4 còn dễ bị ôxi hóa ở điều kiện bình thường do Fe2+ tác dụng với oxi. Hạt nano từ tính có kích thước 10-15nm được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa ion Fe3+ và Fe2+ bằng OH- tại nhiệt độ phòng trong môi trường khí N2 để có thể tránh việc hạt nano bị ô xi hóa. Quy trình chế tạo được tiến hành như sau: Lấy 2,33 g FeCl3.6 H2O và 0,86 g FeCl2.4H2O (tức tỉ phần mol Fe3+ / Fe2+ = 2 ) hòa trong 80 ml dung dịch nước cất 2 lần (nồng độ của Fe2+ là 0,1M) bằng máy khuấy từ. Sau đó lọc dung dịch thu được bằng giấy lọc định lượng để loại bỏ hết các tạp chất không mong muốn, dung dịch sau khi lọc được đựng trong bình 250 ml. 13,4 ml NH4OH 25% NH3 được pha loãng thành 50 ml và được đổ vào bình triết. Sau đó nhỏ dung dịch NH4OH từ từ vào hỗn hợp 2 muối sắt với tốc độ 1 giọt/1 giây trong điều kiện có sử dụng máy khuấy từ để khuấy hỗn hợp 2 muối sắt đồng thời với quá trình nhỏ dung dịch NH4OH. Sau khi dung dịch NH4OH được nhỏ hết thì tiếp tục khuấy trong vòng 10-15 phút để phản ứng xảy ra triệt để. Toàn bộ quá trình phản ứng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ phòng. Ngoài ra để giảm thiểu các tác nhân bên ngoài mẫu có thể được chế tạo trong môi trường khí N2, toàn bộ quy trình tương tự như trên chỉ khác là phản ứng xảy ra trong môi trường khí N2 và mẫu sau khi phản ứng cũng được giữ trong môi trường khí N2. Sau khi phản ứng xảy ra hoàn tất chúng tôi tiến hành lọc rửa mẫu từ 4-5 lần bằng nước cất, khuấy đều hỗn hợp sau phản ứng rồi đặt một miếng nam châm ở đáy cốc, các hạt Fe3O4 bị từ tính hút sẽ lắng đọng xuống dưới, sau một thời gian thì loại bỏ phần dung dịch ở trên để loại bỏ các tạp chất đồng thời giữ lại hạt Fe3O4. Sau đó lại lặp lại như vậy cho đủ 4-5 lần. Kết quả cuối cùng ta thu được các hạt Fe3O4 phân tán trong nước. 2.1.2. Phương pháp hóa học để chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4 Phương pháp này dựa trên phản ứng thủy phân muối FeSO4 để tạo ra hạt nano sắt từ. Quy trình thực hiện tiến hành theo các bước cụ thể sau. Sau khi rửa sạch các dụng cụ thí nghiệm thì dung dịch muối FeSO4 được pha chế bằng cách cho 17,71 g muối FeSO4 hòa với 200 ml nước cất, tương tự 10,11 KNO3 hòa vào 100 ml nước cất, và 13,81 g KOH pha với 50 ml nước cất, ba dung dịch trên được pha chế ở ba cốc thí nghiệm khác nhau, sau khi pha xong các dung dịch trên được lọc bằng giấy lọc định lượng trước khi được đưa vào tiến hành thí nghiệm. Các dung dịch đã được chuẩn bị như trên được đổ vào một bình thủy tinh 1L theo thứ tự ở trên và được khuấy bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt tới 90oC và được giữ trong vòng 2h, toàn bộ thí nghiệm được tiến hành trong môi trường khí nitơ. Sau 2h, khí nitơ được tắt và bình thủy tinh chứa hỗn hợp sau phản ứng được đưa ra khỏi máy khuấy từ và để ở nhiệt độ phòng trong một giờ. Tiếp theo, hỗn hợp này được rửa 2 lần bằng nước cất (2L), 1 lần với axit nitric 1M (1L), và cuối cùng là rửa với 2 lần nữa với nước cất (2L). Phần chất rắn màu đen được tách xuống dưới bằng cách sử dụng một miếng nam châm, sau đó loại bỏ đi phần dung dịch ở trên, tiếp tục quá trình rửa bằng nước cất nếu thấy cần thiết cho tới khi dung dịch ở phía trên đã trở nên sạch. Cuối cùng, toàn bộ sản phẩm được giữ trong 1L nước, thông thường phương pháp này cho ta 10 g sản phẩm. Theo phân tích thì các hạt được tạo ra là Fe3O4 nhưng với kích thước lớn hơn so với phương pháp đồng kết tủa và các hạt nano Fe3O4 sau khi được tạo thành rất dễ bị kết đám lại với nhau chỉ sau thời gian ngắn. 2.1.3. Phương pháp vi nhũ tương Ngoài việc sử dụng phương pháp đồng kết tủa để chế tạo hạt nano, chúng tôi có thử nghiệm một phương pháp khác để chế tạo hạt Fe3O4, đó là phương pháp vi nhũ tương. Trước hết thì vi nhũ tương là hệ nhũ tương đặc biệt và trong thành phần của nó có chứa ít nhất bốn cấu tử bao gồm: - Hai thành phần cơ bản tạo nhũ tương là nước và dầu. - Hai chất hoạt động bề mặt bao gồm chất hoạt động bề mặt mạnh và chất hoạt động bề mặt yếu: như C17H33COOH và C2H5OH. Vi nhũ tương có kích thước bé cỡ 10-9 ¸ 10-7 m. Vi nhũ tương thuận là vi nhũ tương mà pha dầu được phân tán trong pha nước (O/W) Vi nhũ tương nghịch là vi nhũ tương mà pha nước được phân tán trong pha dầu (W/O) Vi nhũ tương rất bền vững về mặt nhiệt động, khi điều chế không cần cung cấp năng lượng, pha trộn thành vi nhũ tương. Vi nhũ tương có thể tồn tại độc lập cân bằng với pha nước hoặc pha dầu do sức căng bề mặt rất bé. Phương pháp tổng hợp từ hệ vi nhũ tương hay còn gọi là phương pháp Mixel đảo (inverse micelle). Các Mixel về cơ bản giống như những vi phản ứng. Chính vì thế mà phương pháp vi nhũ tương cho phép tạo ra các hạt rất nhỏ cỡ một vài nano, và kích thước các hạt tạo ra là khá đồng đều. Mặt khác ta có thể điều chỉnh kích thước hạt bằng cách điều chỉnh hàm lượng chất tham gia phản ứng, các loại dung môi, nồng độ chất hoạt động bề mặt trong dung dịch. Tuy nhiên phương pháp vi nhũ tương cũng có một số nhược điểm như những hạt tạo ra có một lượng khá lớn chất hoạt động bề mặt bám trên bề mặt của chúng, hoá chất sử dụng đòi hỏi độ tinh khiết cao và cần một lượng lớn hơn so phương pháp đồng kết tủa với cùng một mức độ sản xuất, điều kiện phản ứng cũng yêu cầu khắt khe và phức tạp hơn nhiều so với phương pháp đồng kết tủa. Quy trình chế tạo thử nghiệm hạt nano Fe3O4 sử dụng phương pháp vi nhũ tương được tiến hành như sau. Chuẩn bị hai cốc thủy tinh 250 ml được rửa sạch và tráng bằng nước cất, cồn và acetone. +Cốc thứ nhất: Cho 4,28 g Span 80 và 100 ml Heptane vào và khuấy bằng máy khuấy từ trong vòng 10 phút. Tiếp đó cho 2 ml dung dịch hỗn hợp gồm 85,88 mg FeCl2.4 H2O và 235,5 mg FeCl3.6 H2O, khuấy tiếp trong vòng 10 phút. +Cốc thứ hai: Cho 4,28 g Span 80 và 100 ml Heptane vào và khuấy bằng máy khuấy từ trong vòng 10 phút. Tiếp theo cho 2 ml nước và 2 ml NH4OH vào, khuấy tiếp trong vòng 10 phút. Sau đó đổ toàn bộ hỗn hợp dung dịch trong cốc thứ nhất vào cốc thứ hai và tiếp tục khuấy thêm một thời gian. Tiếp theo tiến hành nung thủy nhiệt ở 180oC trong vòng từ 3-5 h toàn bộ dung dịch hỗn hợp vừa khuấy. Kết quả thu được sau thí nghiệm là một dung dịch có màu nâu đỏ với các hạt lắng ở phía dưới đáy cốc, tuy nhiên từ tính của những hạt này còn rất yếu. Do hạn chế về mặt thời gian nên chúng tôi chưa hoàn thiện quy trình thực hiện thí nghiệm, trong thời gian tới chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu kĩ hơn phương pháp này với hy vọng tạo ra được hạt nano từ tính Fe3O4 với kích thước đồng nhất. 2.2. Các phương pháp phân tích 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tính chất từ bằng hệ từ kế mẫu rung (VSM) Các tính chất từ của mẫu đã được đo bằng thiết bị từ kế mẫu rung DMS 880 của hãng Digital Measurement Systems (Mỹ) tại trung tâm khoa học vật liệu (TT KHVL) trường Đại học Khoa học tự nhiên.. Nguyên lý của hệ đo từ kế mẫu rung : Thiết bị từ kế mẫu rung (Vibrating Sample Magnetometer - VSM) là một thiết bị dùng để xác định tính chất từ của mẫu. Nguyên lý hoạt động của thiết bị này dựa trên cơ sở hiện tượng cảm ứng điện từ. Bằng cách thay đổi vị trí tương đối của mẫu có mô men từ M với cuộn dây thu, từ thông qua tiết diện ngang của cuộn dây sẽ thay đổi theo thời gian làm xuất hiện trong nó một suất điện động cảm ứng. Các tín hiệu đo được (tỷ lệ với M) sẽ được chuyển sang giá trị của đại lượng từ cần đo bằng một hệ số chuẩn của hệ đo. Hình 2.1 và 2.2 ở dưới đây trình bày nguyên lý hoạt động của thiết bị VSM. Để thực hiện được phép đo này, mẫu được rung với tần số xác định trong vùng từ trường đồng nhất của một nam châm điện. Từ trường này sẽ từ hoá mẫu và khi mẫu rung sẽ tạo ra hiệu điện thế cảm ứng trên cuộn dây thu tín hiệu. Tín hiệu được thu nhận, khuyếch đại rồi được xử lý trên máy tính và cho ta biết giá trị từ độ của mẫu. Cuộn dây thu tín hiệu Mẫu Thiết bị rung Nam châm điện Hình 2.2: Sơ đồ nguyên lý thiết bị VSM Hình 2.1: Từ kế mẫu rung DMS 880 tại TT KHVL 2.2.2. Phân tích cấu trúc bằng nhiễu xạ tia X Nguyên tắc chung của phương pháp phân tích cấu trúc tinh thể bằng nhiễu xạ tia X (X ray Diffraction- XRD) dựa vào hiện tượng nhiễu xạ tia X trên mạng tinh thể khi thoả mãn điều kiện phản xạ bragg: 2dsin=k, với d là khoảng cách giữa các mặt phẳng nguyên tử phản xạ, là góc tới tạo bởi giữa tia X và mặt phẳng nguyên tử phản xạ, là bước sóng của tia X và n là bậc phản xạ.Tập hợp các cực đại nhiễu xạ bragg dưới góc 2 khác nhau được ghi nhận bằng phim hoặc detector cho ta phổ nhiễu xạ tia X . Từ phổ nhiễu xạ tia X chúng ta có thể khai thác được nhiều thông tin về cấu trúc tinh thể. Nếu mẫu tồn tại ở dạng bột mịn thì ta còn có thể xác định được kích thước của hạt bằng công thức scherrer: D=(2.2) Các mẫu trong khoá luận đã được phân tích cấu trúc bằng nhiễu xạ kế tia X D5005 của hãng Bruker (Đức) tại Trung tâm Khoa học Vật liệu (TT KHVL) sử dụng bước sóng tia X tới từ bức xạ Kα của Cu là : λCu = 1,54056 Ǻ. Dưới đây là hệ đo nhiễu xạ tia X tại trung tâm Khoa học vật liệu. Hình 2.3: Hệ đo nhiễu xạ tia X 2.2.3. Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Hình 2.4: Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Kính hiển vi điện tử truyền qua được phát triển từ năm 1930 là công cụ kỹ thuật không thể thiếu được cho nghiên cứu vật liệu và y học. Dựa trên nguyên tắc hoạt động cơ bản của kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử truyền qua có ưu điểm nổi bật nhờ bước sóng của chùm điện tử ngắn hơn rất nhiều so với bước sóng ánh sáng nhìn thấy nên có thể quan sát tới những kích thước cỡ 0,2 nm. Các điện tử từ catot bằng dây tungsten đốt nóng đi tới anot và được hội tụ bằng “thấu kính từ” lên mẫu đặt trong chân không. Tác dụng của tia điện tử tới mẫu có thể tạo ra chùm điện tử thứ cấp, điện tử phản xạ, điện tử Auger, tia X thứ cấp, phát quang catot và tán xạ không đàn hồi với đám mây điện tử truyền qua mẫu được khuếch đại và ghi lại dưới dạng ảnh huỳnh quang hoặc ảnh kỹ thuật số. Nhiễu xạ điện tử có thể cung cấp những thông tin rất cơ bản về cấu trúc tinh thể và đặc trưng vật liệu. Chùm điện tử nhiễu xạ từ vật liệu phụ thuộc vào bước sóng của chùm điện tử tới và khoảng cách mặt mạng trong tinh thể, tuân theo định luật phản xạ Bragg như đối với nhiễu xạ tia X: 2dsinq = nl, khác với nhiễu xạ tia X, do bước sóng của chùm điện tử thường rất nhỏ nên ứng với các khoảng cách mặt mạng tinh thể thì góc nhiễu xạ rất bé, cỡ dưới 0,010. Tuỳ thuộc vào bản chất cảu vật liệu mà ảnh nhiễu xạ điện tử thường là những vùng sáng tối gọi là trường sáng - trường tối. Vùng sáng là ảnh của vật liệu vô định hình còn vùng tối là ảnh của vật liệu có dạng tinh thể. 2.2.4. Phương pháp xác định nống độ Asenic bằng máy đo phổ háp thụ nguyên tử (AAS) Cơ sở lý thuyết của phép đo AAS là sự hấp phụ năng lượng (Bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi (khí) khi chiếu chum tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấy trong môi trường hấp thụ. Sự phụ thuộc của cường độ một vạch phổ hấp thụ của một nguyên tố và nồng độ C trong mẫu phân tích, lí thuyết và thực nghiệm cho thấy rằng: trong một vùng nồng độ C nhỏ, mối quan hệ giữa cường độ vạch phổ hấp thụ và nồng độ của nguyên tố đó trong đàm hơi cũng tuân theo định luật Bugơ – Lămbe – Bia (2.3): [2] D=0,43.K.C.l (2.3) K: Hệ số hấp thụ,phụ thuộc vào chiều dài sóng C: Nồng độ nguyên tố cần xác định có trong ngọn lửa l: Chiều dày của lớp hấp thụ D: Mật độ quang của ngọn lửa (D=lg) Dựa vào giá trị mật độ quang , người ta xác định nồng độ nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong thể tích mẫu. 2.2.5. Kính hiển vi huỳnh quang Khi các mẫu vật, sống hay không sống, hữu cơ hoặc vô cơ, hấp thụ rồi tái phát xạ ánh sáng, quá trình được gọi là hiện tượng phát sáng quang hóa. Nếu sự phát xạ ánh sáng vẫn kéo dài tới vài giây sau khi năng lượng (ánh sáng) kích thích thôi tác dụng, thì hiện tượng được gọi là lân quang. Còn hiện tượng huỳnh quang mô tả sự phát xạ ánh sáng chỉ tiếp tục diễn ra khi đang hấp thụ ánh sáng kích thích. Khoảng thời gian giữa lúc hấp thụ ánh sáng kích thích và lúc tái phát xạ ánh sáng trong hiện tượng huỳnh quang là cực kì ngắn, thường dưới một phần triệu giây. Hiển vi huỳnh quang là một phương pháp tiên tiến để nghiên cứu vật chất có thể làm cho phát huỳnh quang, hoặc dưới dạng tự nhiên (gọi là sự tự phát huỳnh quang, hoặc huỳnh quang sơ cấp), hoặc sau khi xử lí với các hóa chất có khả năng huỳnh quang (gọi là huỳnh quang thứ cấp). Hiển vi huỳnh quang là sáng chế vào đầu thế kỉ 19 của August Kor, Carl Reichert, và Heinrich Lehmann, và nhiều người khác. Tuy nhiên, tiềm năng của thiết bị này không được nhận ra trong nhiều thập kỉ, và kính hiển vi huỳnh quang hiện nay là một công cụ quan trọng (có lẽ là không thể thiếu) trong ngành sinh học tế bào. Công việc chính của hiển vi huỳnh quang là cho phép ánh sáng kích thích chiếu sáng mẫu vật, và rồi tách ánh sáng huỳnh quang phát xạ yếu hơn nhiều ra khỏi ánh sáng kích thích mạnh hơn. Như vậy, chỉ có ánh sáng phát ra từ mẫu vật đi tới mắt hoặc một máy dò khác nào đó (thường là một camera kĩ thuật số hoặc camera phim thông thường). Những vùng huỳnh quang thu được chiếu sáng rực rỡ trên nền tối với độ tương phản đủ để phát hiện được. Phông nền phía sau chất không huỳnh quang càng tối thì thiết bị càng có hiệu quả. Hình dưới biểu diễn một hình dung có tính hình học về sự kiện xảy ra khi một mẫu vật huỳnh quang được quan sát bằng một kính hiển vi huỳnh quang. Ánh sáng tử ngoại có bước sóng hoặc tập hợp bước sóng nhất định được tạo ra bằng cách cho ánh sáng phát ra từ nguồn phát tử ngoại đi qua bộ lọc kích thích. Ánh sáng tử ngoại được lọc sẽ chiếu sáng mẫu vật, trong trường hợp này là tinh thể fluorite, chất sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang khi được rọi sáng bằng ánh sáng tử ngoại. Ánh sáng khả kiến phát ra từ mẫu vật, có màu đỏ trong hình 2.5, sau đó được lọc qua một tấm lọc chắn không cho ánh sáng tử ngoại phản xạ đi qua. Cần chú ý rằng đây là phương thức hiển vi duy nhất trong đó mẫu vật, sau khi bị kích thích, tạo ra ánh sáng riêng của nó. Ánh sáng phát xạ tỏa ra theo mọi hướng (góc 360 độ), không cần biết đến hướng của ánh sáng kích thích. Hình 2.5: Nguyên lí kích thích và phát xạ Hiển vi huỳnh quang là công cụ nghiên cứu vô giá và phổ biến nhanh chóng. Lợi thế của nó dựa trên những thuộc tính mà các công nghệ hiển vi quang khác không dễ gì có được. Việc sử dụng fluorochrome khiến nó có thể nhận dạng được các tế bào và các thành phần tế bào hạ hiển vi và những thực thể khác có mức độ đặc trưng cao nằm giữa vật chất không huỳnh quang. Hơn nữa, hiển vi huỳnh quang có thể phát hiện sự có mặt của chất huỳnh quang với độ nhạy tinh vi. Một số lượng rất nhỏ phân tử huỳnh quang (cỡ 500 phân tử trên micro mét khối) có thể được phát hiện. Trong một mẫu vật cho trước, qua việc sử dụng phẩm nhuộm bội, các đầu dò khác nhau sẽ phát hiện sự có mặt của từng phân tử mục tiêu một. Mặc dù kính hiển vi huỳnh quang không cho độ phân giải không gian dưới giới hạn nhiễu xạ của mẫu vật tương ứng, nhưng sự có mặt của các phân tử huỳnh quang ở dưới giới hạn đó vẫn có thể nhìn thấy rõ rệt. 2.2.6. Máy đo phổ hấp thụ (UV-Vis) Phương pháp quang phổ hấp thụ là phép đo quang dựa trên khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ rọi vào dung dịch của chất nghiên cứu trong một dung môi nhất định. Các bước sóng hấp thụ cực đại đặc trưng cho từng chất, hoặc tỷ lệ độ hấp thụ giữa các bước sóng là cơ sở của việc định tính. Độ hấp thụ các bức xạ phụ thuộc vào nồng độ của chất nghiên cứu trong dung dịch cần đo là cơ sở của phép định lượng. Ngoài ra việc đo quang trong một điều kiện quy định về dung môi, nồng độ, bước sóng... còn có thể làm cơ sở cho phép thử độ tinh khiết. Máy đo quang phổ UV-Vis gồm có các bộ phận cơ bản sau: - Nguồn sáng: cung cấp các bức xạ điện từ - Bộ phận tán sắc: có nhiệm vụ chọn từ nguồn bức xạ một bước sóng đặc trưng - Bộ phận đựng mẫu đo - Bộ phận detector dùng để đo cường độ tia bức xạ Ngoài ra còn có các bộ phận khác như là thấu kính hoặc gương có nhiệm vụ chuyển tiếp các tia sáng qua thiết bị. CHƯƠNG 3 NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT VÀ ỨNG DỤNG CỦA HẠT NANO TỪ TÍNH Fe3O4 3.1. Một số tính chất của hạt nano từ tính Fe3O4 Trong phạm vi của khóa luận này chúng tôi có sử dụng một số phương pháp khác nhau để chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4, tuy nhiên do giới hạn về mặt thời gian chúng tôi chọn phương pháp đồng kết tủa làm phương pháp chủ yếu để chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4, bởi phương pháp này như đã nói ở trên là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, mặt khác phương pháp này cho những hạt nano từ tính có kích thước trung bình vào cỡ 10-16 nanomet, phù hợp với kích thước hạt yêu cầu trong những ứng dụng được thực hiện ở phần tiếp sau của khóa luận. Các phép đo nhiễu xạ tia X, chụp ảnh TEM, đo đường cong từ hóa… đều được thực hiện với mẫu được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa. 3.1.1. Kết quả đo phổ nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4 Mục đích chính của phép đo này là xác định được cấu trúc và kích thước hạt của mẫu Fe3O4. Mẫu Fe3O4 sau khi được chế tạo thì được rửa bằng nước cất vài lần, tiếp theo được tiến hành sấy khô thành dạng bột. Sau đó mẫu được đem đi ghi phổ nhiễu xạ tia X(XRD). Hình 3.1 là kết quả đo XRD của mẫu hạt Fe3O4. Phổ nhiễu xạ được so sánh với PDF 790418 với bước sóng Cu Kα1. Kết quả này cho thấy các đỉnh nhiễu xạ thuộc về Fe3O4 chứng tỏ các mẫu chứa phần lớn là Fe3O4. Đồng thời các đỉnh nhiễu xạ cực đại, do đó mẫu được tạo thành ở dạng tinh thể. Các đỉnh nhiễu xạ cực đại tương ứng với các đỉnh chuẩn của cấu trúc oxit sắt từ dạng nano. Trong kết quả đo nhiễu xạ tia X không thấy có xuất hiện đỉnh nhiễu xạ cực đại nào lạ, chứng tỏ rằng chỉ có pha ôxit sắt từ cấu trúc tinh thể. Sự mở rộng của các đỉnh nhiễu xạ nguyên nhân chính là do trạng thái cấu trúc của bản thân hạt từ gây nên. Kích thước trung bình của hạt được tính từ đỉnh nhiễu xạ có cường độ mạnh nhất trong phổ nhiễu xạ tia X, vị trí 2θ vào cỡ 35o sử dụng công thức Scherrer (3.1): D= (3.1) với D là đường kính hạt trung bình, λ là bước sóng tia X tới (λ = 1,54056 Ǻ) , B là độ rộng phổ (B=0,62o), θ là vị trí đỉnh nhiễu xạ (17,5o). Kết quả tính toán thu được: D=13,51 nm Từ đây có thể khẳng định được rằng, chúng tôi đã chế tạo được hạt nano từ tính Fe3O4 với đường kính vào khoảng cỡ vào khoảng 10-16 nm. Hình 3.1: Phổ nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4 3.1.2. Ảnh TEM của mẫu hạt nano từ tính Fe3O4 Sau khi mẫu Fe3O4 được tiến hành ghi phổ nhiễu xạ tia X để có thể khẳng định rằng chúng tôi đã chế tạo được hạt nano từ tính Fe3O4 và xác định được cấu trúc và kích thước hạt dựa trên các tính toán lý thuyết thì chúng tôi tiếp tục tiến hành chụp ảnh TEM cho mẫu Fe3O4 với mong muốn có thể xác định rõ hơn về kích thước cũng như cấu trúc hạt nano từ tính Fe3O4. Trước khi đem đi chụp ảnh TEM thì mẫu Fe3O4 được rửa nhiều lần bằng nước cất và được đánh siêu âm trong vòng 15-30 phút để cho các hạt phân tán đều trong nước. Bằng cảm quan chúng tôi có thể thấy rằng khi các hạt nano từ tính Fe3O4 được phân tán đều trong nước thì dung dịch đó có màu đen, và các hạt là có từ tính bởi theo một cách đơn giản là dùng một miếng nam châm nhỏ đặt ở đáy cốc thì sau chừng 10-15 phút các hạt sẽ bị lắng xuống phía dưới đáy cốc, sau một thời gian để ở ngoài không khí thì dung dịch có chuyển sang màu hơi nâu. Hình 3.2: Ảnh TEM của mẫu hạt nano Fe3O4 Hình 3.2 trên đây là kết quả chụp ảnh TEM của mẫu được đem đi phân tích. Từ ảnh TEM thu được ta có thể thấy có những mảng sáng tối khác nhau. Đây chính là các hạt nano từ tính Fe3O4 , những chỗ tối chính là hình ảnh của các hạt nano từ tính Fe3O4. Ở phía dưới của ảnh TEM có thang đo chỉ 50 nm, ta có thể chọn một hạt nano bất kỳ trong ảnh TEM, sau đó đem so sánh về kích thước với thang đo chuẩn của ảnh thì ta có thể thấy kích thước của các hạt nano từ tính Fe3O4 tương đương bằng 1/5 của thang đo chuẩn, tức là các hạt nano từ tính có kích thước vào khoảng 10-16 nm, phù hợp với kết quả tính toán lý thuyết dựa trên phổ nhiễu xạ tia X. Ngoài ra có thể thấy rằng các hạt đều là hình cầu và phân tán với kích thước thấp. Vậy có thể kết luận mẫu chế tạo gồm các hạt nano từ tính Fe3O4 với kích thước hạt trung bình vào khoảng 13±3 nm. 3.1.3. Tính chất từ Tiến hành đo đường cong từ hóa của mẫu Fe3O4 dạng bột sấy khô ở nhiệt độ phòng sử dụng hệ đo là thiết bị từ kế mẫu rung. Mục đích của phép đo là xác định tính chất từ và từ độ bão hòa của mẫu Fe3O4. Kết quả thu được thể hiện trên hình 3.3: Hình 3.3: Đường cong từ hóa của mẫu Fe3O4 Kết quả này cho ta thấy rằng lực kháng từ Hc=0, mặt khác có thể thấy rằng từ độ dư Mr=0, tức là không có hiệu ứng trễ hầu như không đáng kể, vậy có thể nhận xét được rằng các hạt nano từ tính Fe3O4 có tính chất siêu thuận từ. Đường cong là một đường đối xứng, từ độ bão hòa (tính theo emu/g) là tương đối cao, cụ thể trên đồ thị ta có thể thấy MS=80 emu/g, trong khi đó từ độ bão hòa của mẫu khối là 90 emu/g, như vậy có thể thấy từ độ bão hòa của hạt nano từ tính Fe3O4 là tương đối cao, tuy nhiên vẫn thấp hơn giá trị từ độ bão hòa của mẫu khối. 3.2. Ứng dụng hạt nano từ tính Fe3O4 trong đánh dấu và tách chiết tế bào 3.2.1. Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4 Để có thể ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải được chức năng hóa bề mặt để gắn kết với các đối tượng sinh học như DNA, kháng thể, enzyme. Các nhóm chức thường gặp là nhóm amino, biotin, steptavidin, cacbonxyl, thiol. Để có được các nhóm chức trên bề mặt hạt nano, người ta sử dụng nguyên tắc thủy phân organosilane để tạo ra môt lớp polymer trên bề mặt hạt nano [5]. Organosilane là các phân tử có hai nhóm chức có công thức tổng quát là: X-(CH2)n-SiRn(OR’)3-n. Trong đó thì X là nhóm chức cần thiết để có thể gắn kết với các đối tượng sinh học, (CH2)n là nhóm đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm này có thể dày hay mỏng. SiRn là nhóm liên kết với nhóm hydroxyl của bề mặt hạt nano. Alkoxysilane với rất nhiều nhóm chức X khác nhau đã được thương mại hóa. Trong các ứng dụng về sinh học thì nhóm chức amino được sử dụng nhiều nhất. Trong công trình này chúng tôi cũng đặt mục đích tạo ra nhóm chức amino NH2 để có thể gắn hạt nano từ tính với kháng thể antiCD4, và ứng dụng nó để phân tách tế bào bạch cầu trong máu [5]. Trong quá trình chức năng hóa bề mặt, với phân tử organosilane, xảy ra hai phản ứng đồng thời, đó là quá trình thủy phân các nhóm silane alkoxy n thành các nhóm silanol hoạt tính và quá trình hóa rắn của các silanol với nhóm OH tự do trên bề mặt của hạt nano từ tính Fe3O4 để tạo ra các liên kết Si-O-Si bền vững. Trong quá trình tiến hành chức năng hóa bề mặt thì điều kiện của môi trường phản ứng có ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình chức năng hóa bề mặt. Ví dụ như cồn thì thường làm gia tăng quá trình thủy phân và động học hóa rắn do đó làm tăng cường quá trình chức năng hóa bề mặt, tuy nhiên cồn cũng cạnh tranh với nhóm silane trên bề mặt bằng liên kết hydro. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS, n=2) để tạo ra nhóm chức amino trên bề mặt hạt nano. Quy trình chức năng hóa bề mặt gồm các bước như sau: Lấy 400 mg hạt nano từ tính cho vào 100 ml nước cất hai lần. Dùng máy siêu âm để phân tán hạt và dụng dịch để được một thể huyền phù ổn định. Nhỏ 1 ml dung dịch APTS vào trong dung dịch huyền phù nói trên và dùng máy khuấy từ để khuấy trong vòng 8 giờ cho quá trình chức năng hóa bề mặt xảy ra hoàn toàn. Kết thúc quá trình này ta thu được sản phẩm, đem lọc rửa 5 lần bằng lần bằng nước cất và lọc từ sẽ thu được hạt nano từ tính Fe3O4 có bề mặt là các nhóm amino. Lúc này hạt ta có thể gắn hạt nano với kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang của tế bào bạch cầu T. Kháng thể anCD4 là kháng thể có khả năng đối ứng với kháng nguyên CD4 trên bề mặt tế bào bạch cầu CD4+ T, nhờ khả năng phát huỳnh quang của kháng thể giúp cho việc đếm tế bào bạch cầu được dễ dàng hơn với độ chính xác cao [5]. Hình 3.4: Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4 bằng nhóm amino sử dụng APTS (Hạt nano sau khi được chức năng hóa bề mặt được gọi tắt là Amino-NP). Chúng tôi có tiến hành xác định số mol NH2 trên bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4 đã được chức năng hóa bề mặt bằng APTS để xuất hiện nhóm chức NH2. Nguyên tắc của phép xác định này là dùng 4-Nitrobenzaldehyde (C7H5NO3) cho phản ứng với các hạt nano Fe3O4 có nhóm chức NH2 trên bề mặt, sau đó đo dung dịch sau phản ứng bằng phép đo phổ hấp thụ (UV Vis), phép đo sẽ xác định số lượng 4-Nitrobenzaldehyde (C7H5NO3) ở trong dung dịch, từ đó có thể xác định được số nhóm amino trên bề mặt hạt nano. Trong cấu tạo phân tử của 4-Nitrobenzaldehyde có tồn tại cấu trúc vòng benzen 6 cạnh, vì vậy khi đo phổ hấp thụ UV-Vis sẽ cho các đỉnh hấp thụ tương ứng với các nồng độ khác nhau. Phổ hấp thụ cho thấy ở bước sóng 270 nm thì có các đỉnh hấp thụ như hình 3.5: Hình 3.5: Phổ hấp thụ của dung dịch chứa 4-Nitrobenzaldehyde với các nồng độ khác nhau. Sau khi tiến hành đo phổ hấp thụ xong có thể xây dựng một đường miêu tả sự phụ thuộc của nồng độ 4-Nitrobenzaldehyde có trong dung dịch với cường độ phổ hấp thụ và đem so sánh với một đường chuẩn của 4-Nitrobenzaldehyde với các nồng độ tương ứng. Hình dưới là đồ thị miêu tả sự so sánh đó. Hình 3.6: Đường cong mô tả mối liên hệ giữa nồng độ 4-Nitrobenzaldehyde và cường độ phổ hấp thụ trong trường hợp thực nghiệm và chuẩn. Từ các đỉnh hấp thụ đo được trong thực tế và so sánh với đường chuẩn của 4-Nitrobenzaldehyde mà có thể xác định được nồng độ tương ứng với các đỉnh hấp thụ đó và có thể thấy rằng các nồng độ này bằng và cao hơn một số nghiên cứu khác. Bảng 3.1: Cường độ phổ hấp thụ và nồng độ tương ứng với các mẫu Cường độ Nồng độ (µg/ml) 0,683 13,182 0,939 18,044 1,377 26,988 1,873 36,592 2,089 40,794 2,408 46,577 3.2.2. Đánh dấu tế bào và tách chiết tế bào 3.2.2.1 Quá trình gắn kết hạt nano từ tính Fe3O4 với kháng thể antiCD4 Quá trình gắn với kháng thể antiCD4 được thực hiện như sau: Lấy 0,4 g hạt nano từ tính đã được chức năng hóa bề mặt bằng nhóm amino sử dụng APTS (amino-NP) đem rửa và tách từ hai lần bằng 1ml dung dịch đệm 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid (MES) có pH bằng 6 và nồng độ là 0,1M. Sau đó amino-NP được phân tán trong 0,25 ml dung dịch đệm chứa MES và 2mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ở dạng bột bằng cách khuấy đều tại nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút. Tách rửa bằng từ trường hai lần trước khi nhỏ 1 µg–100 µg kháng thể đơn dòng antiCD4 (antiCD4, Invitrogen). Tách rửa từ bốn lần bằng nước cất ta thu được hạt nano gắn kháng thể antiCD4, gọi tắt là antiCD4-NP. Trong một số mẫu, chúng tôi có sử dụng 20 µl kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang (gọi tắt là *antiCD4, bước sóng kích thích là 480 nm, bước sóng phát xạ 520 nm của hãng Exiobio) trộn với antiCD4 có các nồng độ khác nhau. Sau hai giờ các hạt nano được bọc bởi các kháng thế đơn dòng antiCD4 và *antiCD4 được tách rửa từ 3 lần bằng 1ml dung dịch đệm phosphate saline (PBS) [5]. Kết quả cuối cùng ta thu được hạt nano từ bọc bởi 2 loại kháng thể đơn dòng antiCD4: một loại thường (gọi tắt là antiCD4-NP) và loại kia phát huỳnh quang (gọi tắt là *antiCD4-NP) và chúng được bảo quản trong PBS bổ sung thêm albumin huyết thanh bò (BSA). Hình 3.7: Quy trình gắn kết hạt nano được chức năng hóa với kháng thể antiCD4. Phản ứng (A) Hạt nano từ tính được chức năng hóa EDC. Phản ứng (B) Gắn kết kháng thể antiCD4 với hạt nano từ tính được bao phủ bởi EDC. 3.2.2.2. Gắn kết với tế bào bạch cầu: Lấy 200 µl máu người bình thường được li tâm trong ống nghiệm Eppendorf 1,5 ml với tốc độ 1000 vòng / phút trong vòng 10 phút để loại bỏ huyết thanh rồi hòa vào 200 µl PBS bổ sung 1% BSA. Sau đó được ủ với 0,2 mg antiCD4-NP và *antiCD4-NP trong vòng 20 phút ở nhiệt độ phòng. Bổ sung 1,3 ml dung dịch đệm nhược trương (5 mM Tris pH 7.0, 10% glycerol) để đột ngột phá tung màng tế bào máu làm tế bào trở thành dạng ko có bào quan và bào tương hay còn gọi là tế bào ma. Lúc này các antiCD4-NP và *antiCD4-NP sẽ gắn đặc hiệu lên các tế bào bạch cầu CD4+ T thông qua tương tác kháng nguyên -kháng thể và được tách lọc bằng từ trường, giúp loại bớt các tế bào ma. Trong thí nghiệm được tiến hành để đối chứng, chúng tôi tiến hành gắn trực tiếp 20 µl kháng thể đơn dòng antiCD4 phát huỳnh quang với 200 µl máu để nhuộm tế bào bạch cầu CD4+ T, quá trình xử lí tiếp theo cũng được tiến hành tương tự như trên chỉ khác là không có tuyển từ. Các tế bào sau khi phản ứng gắn đặc hiệu với kháng thể được bảo quản trong 50 µl PBS lạnh, bổ sung 1% ABS và 10% glycerol. 5 µl dung dịch chứa tế bào được nhỏ lên một tấm kính (slide glass) rồi được phủ lên bằng một phiến kính mỏng (cover glass) để tiến hành quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Carl Zeiss Axio. Cường độ phát huỳnh quang được xử lý bằng phần mềm Scion Image. Một số hình ảnh về các tế bào được chụp từ kính hiển vi huỳnh quang Hình 3.8 là ảnh chụp các tế bào trong máu từ kính hiển vi dưới ánh sáng thường (3.8A, 3.8C) và dưới chế độ phát huỳnh quang với ánh sáng kích thích là 480nm và ánh sáng huỳnh quang 520nm (3.8B, 3.8D). Đối với các mẫu được chụp trên hình 3.8 chưa được tuyển từ nên dưới ánh sáng thường (3.8A, 3.8C) có thể nhìn thấy tế bào hồng cầu và nhiều loại tế bào bạch cầu. Có thể nhận biết được loại tế bào dựa vào hình dạng của chúng. Khi chụp dưới chế độ phát huỳnh quang (3.8B, 3.8D) thì chỉ quan sát thấy tế bào bạch cầu CD4+ T mà không quan sát thấy các tế bào hồng cầu và các tế bào bạch cầu dạng khác. Lý do là vì các kháng thể đơn dòng antiCD4 phát huỳnh quang rất đặc hiệu, chỉ gắn với kháng nguyên CD4 trên bề mặt tế bào bạch cầu CD4+ T và làm cho các tế bào này phát sáng. Hình 3.8: Hình ảnh các tế bào bạch cầu CD4+ T riêng lẻ được chụp bằng kính hiển vi dưới ánh sáng thường (A, C ) và dưới ánh sáng kích thích (480 nm) (B, D) sau khi chúng được gắn kết với kháng thể đơn dòng phát huỳnh quang antiCD4.Mũi tên chỉ các tế bào bạch cầu CD4+ T. Còn trong hình 3.9 cũng là hình ảnh các tế bào bạch cầu CD4+ T được chụp bằng kính hiển vi dưới ánh sáng thường (3.9A, 3.9C) và dưới chế độ phát huỳnh quang với ánh sáng kích thích là 480nm (3.9B, 3.9D) nhưng khác so với mẫu ở hình 3.8 là các tế bào này được được gắn kết với các hạt nano từ tính được chức năng hóa bề mặt bởi kháng thể phát huỳnh quang antiCD4 (*antiCD4-NP) và đã được tuyển từ. Không giống như hình 3.8 trong hình 3.9 không thấy xuất hiện nhiều các tế bào hồng cầu hay tế bào bạch cầu loại khác. Hơn nữa tín hiệu thu được dưới chế độ ảnh chụp huỳnh quang (3.9B, 3.9D) cho thấy cường độ phát huỳnh quang của tế bào bạch cầu CD4+ T mạnh hơn cường độ phát huỳnh quang của tế bào được gắn kết với kháng thể huỳnh quang mà không có hạt nano. Hình 3.9: Hình ảnh các tế bào bạch cầu CD4+ T được chụp bằng kính hiển vi dưới ánh sáng thường (A, C) và dưới ánh sáng kích thích (480nm) (B, D) sau khi được gắn kết với hạt nano đã được chức năng hóa bề mặt bởi kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang. Mũi tên chỉ các tế bào bạch cầu CD4+ T. 3.2.2.3. Nhận xét: Độ sáng của tế bào bạch cầu trong trường hợp không có hạt nano từ tính là (137±45)x103 (đơn vị tùy ý), trong khi đó nếu có hạt nano từ tính thì độ sáng của tế bào bạch cầu đo được là (356±64)x103 (đơn vị tùy ý ), như vậy là gấp 2,6 lần. Như vậy có thể thấy rằng quá trình tách lọc tế bào sử dụng tương tác kháng nguyên - kháng thể đã thành công, ngoài ra còn có thể tăng cường độ phát huỳnh quang của tế bào bạch cầu bằng cách sử dụng hạt nano từ tính Fe3O4, có thể giải thích điều này như sau: khi không có hạt nano từ tính thì chỉ có một lớp kháng thể huỳnh quang bám được trên bề mặt của tế bào nên cường độ phát huỳnh quang của tế bào chỉ do một lớp này quyết định, ngược lại trong trường hợp có hạt nano từ tính, sẽ có nhiều kháng thể huỳnh quang hơn gắn với hạt nano trước khi gắn kết trên bề mặt tế bào bạch cầu, tạo nên nhiều lớp kháng thể huỳnh quang nên có được độ sáng lớn hơn so với trường hợp không có hạt nano. Ngoài ra dựa trên diện tích các hình nghiên cứu vào khoảng 104 µm2, chúng tôi ước tính được số lượng tế bào bạch cầu CD4+ T trong máu của 2 người trưởng thành 670 và 810 tế bào/µl. Giá trị này nằm trong khoảng an toàn đối với người khỏe mạnh (600 đến 1200 tế bào/µl). Với những người bị nhiễm HIV, số lượng tế bào bạch cầu giảm đi rất nhiều, thậm chí là ít hơn 150 tế bào/µl nên việc lấy thống kê theo diện tích trên hình quan sát trên kính hiển vi là không được chính xác. Chính vì vậy chúng tôi đã ứng dụng hạt nano từ tính được chức năng hóa bề mặt bằng kháng thể antiCD4 để làm giàu tế bào bạch cầu trước khi đếm bằng kính hiển vi huỳnh quang. Sau khi thử nghiệm ở các nồng độ antiCD4 khác nhau từ 1µg – 100 µg thì thấy rằng ở 20 µg là đủ để chức năng hóa bề mặt của 0,4 g hạt nano. Việc đếm tế bào cũng sẽ trở nên dễ dàng hơn vì không bị lẫn với các tế bào khác và có nhiều tế bào trên một đơn vị diện tích nên thống kê được chính xác hơn. Phương pháp đánh dấu tế bào kết hợp với tuyển từ như vậy rất hiệu quả trong việc đếm tế bào bạch cầu CD4+ T cho các bệnh nhân bị nhiễm HIV. 3.3. Ứng dụng hạt nano Fe3O4 trong xử lý nước bị nhiễm bẩn 3.3.1. Chế tạo mẫu Các hạt nano ôxit sắt với diện tích bề mặt lớn hứa hẹn có thể tách bỏ được asenic. Các hạt nano từ tính thì có từ độ bão hòa cao cỡ 90 emu/g so với các ôxit sắt, do đó các hạt nano từ tính có thể được sử dụng để hấp thụ asenic và tách lọc bằng từ tính. Một số ôxit và hydroxit sắt khác cũng được nghiên cứu để hấp thụ asenic song tính chất từ của những hợp chất này thì không bằng được so với hạt nano từ tính. Tuy nhiên có một khó khăn đặt ra là sự ôxi hóa của oxit sắt làm giảm đi từ độ bão hòa [4]. Vì vậy chúng tôi có nghiên cứu một phương án là thay thế ion Fe2+ trong Fe3O4 bằng ion Co2+ để nâng cao khả năng chống oxi hóa của hợp chất. Khả năng chống oxi hóa là một thông số quan trọng để loại bỏ asenic trong điều kiện thông thường. Trong khóa luận này chúng tôi nghiên cứu khả năng hấp thụ asen của hạt nano Fe1-xCoxFe2O4 (Co-ferrites) với x=0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5. Tương tự như trong trường hợp chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4 thì các hạt nano Fe1-xCoxFe2O4 (Co-ferrites) cũng được chế tạo tương tự nhưng thay vì sử dụng ion Fe2+ chúng ta thay bằng ion Co2+ với CoCl2.6H2O tương ứng, và các quy trình tạo mẫu được thực hiện trong môi trường khí N2. Các mẫu Fe1-xCoxFe2O4 (Co-ferrites) sau khi được chế tạo ở các lượng Co2+(x) khác nhau thì chúng tôi có tiến hành xác định từ độ bão hòa của các mẫu bằng hệ từ kế mẫu rung, hình sau cho thấy mối liên hệ giữa giá trị x và từ độ bão hòa tương ứng. Hình 3.10: biểu diễn giá trị từ độ bão hòa của Co-ferrite theo các giá trị của lượng Co2+(x) 3.3.2. Ứng dụng trong nước bị nhiễm asenic Dung dịch asenic (0.1 mg/l của As3+) thu được bằng cách hòa As2O3 vào dung dịch nước cất hai lần. Quá trình hấp thụ được thực hiện khi 0,25-1,5 g hạt nano từ tính được khuấy với 1L dung dịch asenic trong vòng từ 1-60 phút. Sau đó các hạt nano từ tính được tách ra ngoài sử dụng một miếng nam châm. Dung dịch còn lại được đo nồng độ asenic bằng máy đo phổ hấp thụ nguyên tử (Atomic Absorption Spectroscopy (AAS)). Khả năng hấp thụ asenic của hạt nano từ tính được nghiên cứu ở các điều kiện khác nhau về thời gian khuấy, nồng độ hạt từ và độ pH. Nồng độ asen ban đầu là 0,1 mg/l được giảm xuống khoảng 10 lần tới giá trị MPC (maximum permissible concentration-là nồng độ tối đa cho phép) là 10 mg/l sau thời gian khuấy khoảng vài phút. Quá trình tách bỏ asen dường như là có phụ thuộc vào nồng độ x trong Co-ferrites. Chúng tôi cũng nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng hạt nano từ tính trong quá trình hấp thụ, thời gian khuấy được cố định là 3 phút, trong khi đó thì khối lượng của mẫu được thay đổi từ 0.25 g/l tới 1.5 g/l với mỗi lần thay đổi là 0.25 g/l. Kết quả thực nhiệm chỉ ra rằng, sau 3 phút thì khối lượng tốt nhất để giảm nồng độ asen xuống dưới giá trị MPC là 0,25 g/l cho sắt từ và 0,5 g/l cho Co-ferrites. Ngoài ra sự hấp thụ asenic còn phụ thuộc vào pH trong khoảng từ 4-10. Ở các giá trị pH cao hơn thì sự hấp thụ giảm tương đối lớn. Sau khi hấp thụ asen thì các hạt nano được khuấy ở pH 13 để nghiên cứu quá trình giải phóng. Các hạt nano được tách ra bởi một nam châm và nồng độ asen trong dung dịch được kiểm chứng bởi ASS. Kết quả cho thấy 90% asenic đã được giải phóng khỏi các hạt nano. Các hạt nano sau khi giải phóng thì không chỉ ra bất cứ khác biệt nào về khả năng hấp thụ và giải phóng asenic. Quá trình hấp thụ và giải phóng được lặp lại bốn lần, chứng tỏ rằng các hạt nano có thể được sử dụng lại trong việc tách bỏ asenic. Những ứng dụng này lần đầu tiên được tiến hành thử nghiệm ở Việt Nam và bước đầu đã cho những thành quả nhất định, lượng asenic mà các hạt nano từ tính hấp thụ được là tương đối cao và triển vọng đưa những ứng dụng tương tự như trong thí nghiệm này vào trong thực tế để xử lý các nguồn nước bị nhiễm bẩn. Bảng 3.2: Nồng độ asenic (µg/l) còn lại trong nước sau khi được tách lọc bởi 1g/L Co-ferrites như là một hàm của thời gian khuấy. Time (min) x = 0.05 x = 0.1 x = 0.2 x = 0.5 1 10 11 6 6.5 3 6 5 8.5 7 7 10 9 4.2 7.8 15 9 12 5 6.9 30 12 4.5 5 11.2 60 4.5 5 8 9.8 Kết luận Các hạt nano từ tính Fe3O4 được chế tạo thử nghiệm với một số phương pháp khác nhau, phương pháp đồng kết tủa tạo ra được các hạt nano kích thước trung bình từ 10-16 nanomet, điều này được chứng tỏ qua phổ nhiễu xạ tia X và ảnh TEM. Đồng thời cũng khẳng định tính chất siêu thuận từ của hạt nano từ tính Fe3O4. Phương pháp hóa học thì cho ra các hạt Fe3O4 với kích thước to hơn các hạt được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa, và đang tiếp tục nghiên cứu thêm một phương pháp khác để chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4 với độ đồng nhất cao hơn, đó là phương pháp vi nhũ tương. Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4 bằng APTS và tạo ra được nhóm chức amino trên bề mặt hạt. Cùng với đó là việc đánh dấu và tách chiết thành công các tế bào bạch cầu CD4+ T ở trong máu bằng các hạt nano từ tính Fe3O4 được bọc bởi kháng thể phát huỳnh quang antiCD4+ T. Các hình ảnh chụp từ kính hiển vi huỳnh quang cho các hình ảnh rõ nét các tế bào bạch cầu này, độ phát huỳnh quang của các tế bào bạch cầu đã được gắn với hạt nano từ tính Fe3O4 được bọc bởi kháng thể phát huỳnh quang antiCD4+ T cũng cao hơn gấp 2,6 lần so với trường hợp chỉ gắn với kháng thế phát huỳnh quang thông thường. Nhờ có các hạt nano từ tính nên có thể tách được các tế bào bạch cầu ra khỏi môi trường chứa chúng mà không bị lẫn các tế bào khác và làm giàu tế bào bạch cầu do đó có thể đếm được số lượng tế bào bạch cầu một cách chính xác hơn. Ứng dụng các hạt nano Fe1-xCoxFe2O4 (Co-ferrites) với x=0; 0,05; 0,1; 0,2; 0.5 trong việc xử lý các nguồn nước bị nhiễm asenic, các kết quả thực nghiệm cho thấy với 0,25-1,5 g hạt nano từ tính sử dụng cho 1L nước nhiễm asenic sẽ làm giảm nồng độ asenic từ 0,1 mg/l xuống còn 10 mg/l, sau đó các hạt nano từ tính còn có thể tái sử dụng được. Tài liệu tham khảo [1]Đào Trần Cao, Cơ sở vật lý chất rắn, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội, 2004. [2]Lê Đức, Một số phương pháp phân tích môi trường, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội, 2004. [3]Nguyễn Hữu Đức, Vật liệu từ liên kim loại, Nhà Xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội, 2003. [4]N. H. Hai, N. D. Phu, N Chau, H. D. Chinh, L. H. Hoang, D. L. Leslie-Pelecky, Machenism for sustainable Magnetic Nanoparticles under Ambient conditions, to be published in J. Korean Phys. Soc. (2007). [5]Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Châu, Nguyễn Hoàng Lương, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa, Mai Anh Tuấn, Ứng dụng của hạt nano ôxit sắt từ để tách chiết DNA, đếm tế bào bạch cầu và cải tiến quá trình xử lý nước nhiễm bẩn, Hội nghị vật lý chất rắn toàn quốc lần thứ 5-Vũng Tàu 12-14/11/2007. [6]N. H. Hai, C. V. Thach, N. Chau, L. H. Hoang, N. T. Khuat, V. T. A. Nguyen and T. N. Phan, Sorting CD4+ T Cells in Blood by Magnetic Nanoparticles Coated with anti - CD4 antibody. [7]N. H. Hai, C. V. Thach , N. T. Ha, N. Chau, N. T. V. Anh, P. T. Nghia, H. D. Chinh, Prepatation of Fe3O4 magnetic fluids and their applications in biology and environment, Proc. Intl. Conf. Engineer. Phys., Hanoi (2006) 95-100. [8]Nguyễn Đăng Phú, Chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4, SiO2/ Fe3O4, nghiên cứu khả năng chống ôxi hóa của hạt nano từ tính SiO2/ Fe3O4 và ứng dụng hạt nano từ tính Fe3O4 trong việc xử lý nước bị nhiễm Asenic, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐHKHTN-ĐHQGHN-2007. [9]Nguyễn Phú Thùy, Vật lý các hiện tượng từ, Nhà xuất bản ĐHQG Hà Nội, 2003. [10]Patricia Berger, Nicolas B. Adelman, Katie J. Beckman, Dean J. Campell, Arthur B. Ellis and George C. Lisensky, Journal of Chemical Education, Vol. 76, No. 07, July (1999). [11]Ian J. Bruce, James Taylor, Michael Todd, Martin J. Davies, Enrico Borioni, Claudio Sangregorio, Tapas Sen, Synthesis, characterisation and application of silica-magnetite nanocomposites, Journal of Magnetism and Magnetic Materials 284(2004) 145-160. [12]I. J. Bruce and Tapas Sen, Surface modification of magnetic nanoparticles with Alkoxysilanes and their application in magnetic bioseparations, Langmuir 21(2005) 7029-7035. [13]S. Chikazumi, Physics of Ferromagnetism, Clacedon Press Oxford, 1997. [14]Silvia Liong, A multifunctional approach to development, fabrication, and charactierization of Fe3O4 composite, PhD thesis, Georga institute of technology, 2005. [15]Rahul P. Bagwe and Kartic C. Khilar, Effects of intermicellar exchange rate on the formation of silver nanoparticles in reverse microemulsions of AOT, Langmuir 2000, 16, 905-910. [16]C. P. Poole, F. J. Owens, Introduction to nanotechnology, Wiley: Hoboken (2003).