Khóa luận Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α

ơng pháp là khảo sát plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích. Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGEM và các plasmid có nguồn gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E. coli chứa những trình tự điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn vào đoạn này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β-galactosidase E. coli (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal 19 (5-Bromo- 4- chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt nó bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kích hoạt là IPTG (đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kích hoạt của gen lacZ. Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng. 2.4.3 Chiết tách DNA plasmid Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình tách chiết đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ: - Phƣơng pháp nhiệt độ cao - Phƣơng pháp Lythium - Phƣơng pháp SDS-kiềm 2. 5 Điện di (Electrophoresis) Kỹ thuật điện di trên gel rất quan trọng đối với ngƣời làm kỹ thuật di truyền, vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn nucleic acid hiển thị trực tiếp. Phƣơng pháp này dựa trên một đặc tính của nucleic acid là ở pH trung tính chúng mang điện tích âm nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleotide. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dƣơng khi đặt chúng vào điện trƣờng. Kỹ thuật này đƣợc tiến hành trên một dung dịch đệm gel có tác dụng phân tách các phân tử nucleic acid theo kích thƣớc. 20 Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel. Có hai loại gel đƣợc sử dụng phổ biến là agarose và polyacryamid. Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thƣờng dùng để phân tách những đoạn có kích thƣớc trong khoảng 0,5 – 20 kb. Gel đƣợc đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di đƣợc thực hiện theo phƣơng nằm ngang. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dƣới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng xen vào giữa các base của acid nucleic và dƣới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Gel polyacrylamide dùng để tách các đoạn có kích thƣớc nhỏ, tức là dƣới 1000 cặp base. Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose. Do đó, gel này chỉ đƣợc sử dụng cho những mục đích đặc hiệu. Các ứng dụng chủ yếu của loại gel này là: - Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp - Xác định trình tự DNA - Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dƣới 500 cặp base. Gel đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phƣơng của điện di là phƣơng thẳng đứng. Thực hiện nạp mẫu điện di Điện di đƣợc thực hiện bằng cách đƣa các mẫu nucleic acid đã đƣợc trộn đều với loading buffer bơm vào các giếng của miếng gel trong dung dịch đệm TAE 0,5X hoặc TBE 0,5X và đặt một điện áp vào đó. Trạng thái đó đƣợc duy trì cho đến khi vạch cuối của loading buffer chạy tới đầu cuối của gel. Sau đó, bản gel đƣợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide và xem dƣới UV. 2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc 2.6.1 Ngoài nƣớc Cohen và cộng sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phƣơng pháp Calcium chloride. Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả nạp, biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đƣa ra công thức tính hệ số biến nạp N = A x10 n x OV/PV 21 N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc n: hệ số pha loãng OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl) OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl) Inoue và cộng sự(1990), đƣa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp nhƣ sau: 10mM Pipes, 55mM MnCl2, 15mM CaCl2, 250mM KCl Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E. coli khác nhau. Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hƣởng rất lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp. Giá trị OD600 thích hợp của dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn nhƣ sau: XL-blue là từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45. Nồng độ của CaCl2 sử dụng trong dung dịch TB tối ƣu là 75mM. Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy thời gian lƣu trữ tế bào khả nạp ở -20oC là 7 ngày, ở -70oC là 15 ngày. 2.6.2 Trong nƣớc Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng Đại Học Nông Lâm TPHCM, đã thực hiện thành công đề tài : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp, quy trình tách chiết plasmid, tiến hành phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ sản phẩm PCR, thiết lập phản ứng nối cho đoạn DNA trên với plasmid, thực hiện phản ứng PCR trên plasmid đã chèn. 22 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp Thời gian : Khoá luận đƣợc tiến hành từ ngày 14 tháng 02 năm 2006 đến ngày 14 tháng 08 năm 2006. Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid. Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1. Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tƣợng α-complementation với tiểu phần mang đầu amino của β-galactosidase đƣợc mã hoá bởi plasmid họ pUC (Hanahan 1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986) 3.2.2 pBluescript II SK(+/-) pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự. pBluescript chứa MCS với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn. Bên ngoài vùng MCS là T7, T3 RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro. Trình tự của T7, T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phƣơng pháp đọc trình tự. pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase. Việc phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MCS so với trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter. Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và ngƣợc lại. 23 Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-) 3.2.3 Đoạn DNA Hai đoạn DNA đƣợc chọn nghiên cứu trong khoá luận này là Đoạn DNA (900bp) của nấm Phytophthora trên cây địa lan Đoạn DNA (223bp) trong vùng Tef của nấm Trichorderma 3.3 Dụng cụ và hóa chất 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm Đĩa petri lớn, nhỏ Ống nghiệm lớn, nhỏ Eppendorf: 1.5ml, 200μl Pipet : 0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl Đầu tip : xanh, vàng, trắng Lọ thủy tinh đƣng hóa chất Đầu lọc hóa chất : 0.22μm, 0.45μm Bình tam giác : 100ml, 200ml, 500ml Que trang thủy tinh 3.3.2 Các thiết bị máy móc Tủ cấy vô trùng (micro flow) Bồn ổn nhiệt (water bath) Máy ly tâm (Mikio 22) Tủ định ôn Máy lắc vi khuẩn Tủ 40C, - 200C, - 800C Tủ sấy dụng cụ Thiết bị điện di (Bio - Rad) Máy chụp gel (Bio - Rad) Lò vi sóng (Microway) Nồi hấp (Autoclave - Tomy) 3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Môi trƣờng LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua ) Môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, ampicillin) 24 Môi trƣờng LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar ) Môi trƣờng LB agar, kháng sinh ampicillin, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar. Ampicillin, X-gal, IPTG) 3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm Hóa chất để chuẩn bị tế bào khả nạp : CaCl2 100mM, glycerol 98%. Hóa chất biến nạp : Ampicillin 100μg/ml, X-gal 20mg/ml, IPTG 300mg/ml. Hóa chất ly trích plasmid Dung dịch I (50mM glucose, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA) Dung dịch II (0,2N NaOH, 1% SDS, nƣớc cất) Dung dịch III (5M Potassium acetate, glacial acetic acid, nƣớc cất) Phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) Chloroform / isoamyl alcohol (24 :1) Isopropanol, Ethanol 70 %, TE 1X (pH = 8) Hóa chất điện di và nhuộm: Loading dye, TAE 0.5X, Ethdium bromide 3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm Tên enzyme Trình tự nhận biết Buffer Mã hàng Nhà sản xuất BamHI G /GATCC B (10X) Cat. No. 220 612 Roche EcoRV GAT/ATG B (10X) Cat. No. 667 145 Roche HindIII A/AGCTT B (10X) Cat. No. 656 313 Roche DNA T4 ligase NEbuffer 10X Product No. 70005Y usb DNA fragment Klenow T4 reaction buffer Code number M0210S BioLabs 25 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Vi khuẩn E. coli sau khi xử lí CaCl2 sẽ làm cho màng tế bào trở nên khả nạp giúp cho DNA xâm nhập tế bào E.coli dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (420C trong 45 giây) để kích thích sự chuyển của phân tử plasmid vào trong tế bào. Môi trƣờng dƣỡng chất đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào hồi phục và plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tƣơng ứng. Một trong các tính trạng do các gen này qui định đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt nhữnng tế bào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận DNA plasmid. Vi khuẩn Ecoli Xử lí CaCl2 Sốc nhiệt ở 420C trong 45 giây Cấy lên đĩa Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli 26 3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra Vi khuẩn E. coli DH5α Khả nạp + CaCl2 Plasmid Bluescript II SK (+/-) Vi khuẩn mang plasmid Bluescript Sốc nhiệt Chiết tách plasmid Tinh sạch Đoạn DNA Cắt plasmid bằng HindIII Blunt - end Tinh sạch Phản ứng nối Biến nạp vào khả nạp Chọn lọc khuẩn lạc màu xanh Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng Chiết tách plasmid Cắt plasmid bằng BamHI, HindIII Phản ứng PCR với primer T3, T7 Blunt - end 27 3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E. coli DH5α trên môi trƣờng LB Từ dòng vi khuẩn E. coli DH5α gốc hút 20µl dịch vi khuẩn sang ống nghiệm có chứa môi trƣờng LB lỏng. Đem nuôi cấy lắc ở 370C, 150 vòng/phút trong vòng 36-48h. Hút 1ml dịch vi khuẩn sau khi đã nuôi cấy vào ống eppendorf 1.5ml, thêm 150µl glycerol 98% vào và cất ống eppendorf vào tủ âm 70 để giữ giống. Dịch còn lại tiếp tục cấy sang các ống nghiệm để chuẩn bị tế bào khả nạp. 3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp Bƣớc 1: Hút 20µl dịch vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng. Bƣớc 2: Nuôi cấy lắc trong vòng 3-4 giờ. Bƣớc 3: Chuyển ống nghiệm chứa vi khuẩn vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút. Bƣớc 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Bƣớc 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này đến khi hết dịch nuôi cấy. Bƣớc 6: Cho 1ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để hòa tan phần kết tủa. Bƣớc 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Bƣớc 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 9: Cho 150µl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên. Thêm 20µ glycerol vào và trữ ở -700C. Khả nạp đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp CaCl2 kết hợp với sốc nhiệt sau đó đƣợc bảo quản ở -700C. Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp việc bảo quản khả nạp đƣợc lâu hơn. Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng. 3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Chúng tôi tiến hành biến nạp theo 3 qui trình sau. Lƣợng DNA không lớn hơn 50ng trong một thể tích là 10μl hoặc ít hơn. 28 Quy trình 1 - Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5ml, thêm 1.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. - Thêm 500µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 100µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. - Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C. - Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng. Quy trình 2 - Hút 3µl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. - Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 100µl (đã pha loãng ½) dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. -Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C. - Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng. Quy trình 3 Lập lại quy trình 2 nhƣng không pha loãng khi hút 100µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X- gal, IPTG. 29 3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra 3.4.6.1 Chiết tách plasmid Có nhiều phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid nhƣ: Phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ cao, phƣơng pháp SDS – kiềm. Nhƣng chúng tôi chọn phƣơng pháp SDS – kiềm để chiết tách plasmid sử dụng cho khóa luận này. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng. Sau khi màng tế bào bị vỡ , dƣới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh đƣợc sự phân hủy của DNAse. Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách chiết, làm cho DNA của genome và DNA của plasmid bị biến tính. Sau đó trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA sẽ đƣợc phục hồi nhanh chóng. DNA của bộ gen có kích thƣớc lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA của plasmid. Vì vậy DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein của tế bào và DNA của bộ gen sẽ bị tủa xuống. Nhƣ vậy ta có thể tách plasmid ra khỏi tế bào chủ mà không bị lẫn DNA của bộ gen. DNA của plasmid đƣợc tủa dƣới tác dụng của isopropanol nên ta thu hồi lại dễ dàng. Phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid sử dụng SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau: Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Cho 150μl dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. Bƣớc 4: Thêm 200μl dung dịch II, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần, sau đó thêm tiếp 150μl dung dịch III, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần. 30 Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 370C trong1 giờ. Bƣớc 7: Cho vào mỗi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, và ủ ở -200C trong 1 giờ, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa. Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 11: Cho TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Tùy lƣợng mẫu mà thêm vào. Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 1% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách. Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách trên gel agarose, thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid tách chiết và DNA plasmid đối chứng. Thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid và DNA plasmid đối chứng bằng enzym EcoRV, sau đó kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose sẽ cho biết DNA plasmid chiết tách đƣợc có phải là plasmid mà mình mong muốn hay không. Qui trình li trích plasmid sử dụng AurumTM Plasmid Mini Kit (Bio-Rad) Thành phần của AurumTM Plasmid Mini Kit Resuspension solution (dung dịch hòa tan) Lysis solution (dung dịch phân giải) Neutralization solution (dung dịch trung hòa) Wash solution (dung dịch rửa) 31 Elution solution (dung dịch tách rửa) Plasmid mini columns 100 2ml capless wash tubes 100 Vi khuẩn sau khi tăng sinh trong môi trƣờng LB lỏng (theo tỉ lệ 1:20) trong vòng 16 giờ hoặc xác định mật độ tế bào bằng cách đo OD ở bƣớc sóng 600 nm đến khi OD600= 6. Bƣớc 1: Chuyển dịch vi khuẩn đã nuôi cấy vào ống eppendorf (1.5-2.0ml). Li tâm trong 1 phút 13000 vòng/phút ở 40C. Loại bỏ dịch nổi bằng việc gạn hay hút. Bƣớc 2: Thêm 250µl dung dịch resuspension và vortex hoặc hút lên hút xuống đến khi cặn tế bào tan hoàn toàn. Bƣớc 3: Thêm 250µl dung dịch lysis và trộn bằng cách đảo ngƣợc eppendorf nhanh, mạnh 6-8 lần. Không vortex hoặc lắc mạnh. Dung dịch sẽ trở nên nhớt và mỏng. Bƣớc 4: Thêm tiếp 350µl dung dịch neutralization và trộn bằng cách đảo ngƣợc eppendorf 6-8 lần. Không vortex hoặc lắc mạnh. Kết tủa đã đƣợc hình thành. Bƣớc 5: Li tâm trong vòng 5 phút 13000 vòng/phút ở 40C hỗn hợp trên. Cặn đặc trắng sẽ hình thành dọc theo cạnh hoặc dƣới đáy của ống eppendorf. Dịch nổi chứa DNA plasmid. Bƣớc 6: Trong khi li tâm, chèn 1 cột plasmid mini column vào ống capless wash 2ml. Bƣớc 7: Bằng việc hút hay gạn, chuyển dịch nổi từ bƣớc 5 vào cột plasmid mini column. Li tâm 1 phút 13000 vòng/phút ở 40C. Bƣớc 8: Dung dịch wash solution đƣợc cung cấp ở nồng độ 5X. Thêm vào 4 thể tích (100 ml) ethanol 95-100% trƣớc khi sử dụng. Bƣớc 9: Lấy cột plasmid mini column ra khỏi ồng wash tube. Bỏ phần nƣớc đã lọc từ ống tube, và chuyển plasmid mini column vào ống wash tube khác. Thêm vào 750µl dung dịch wash solution và li tâm 1 phút 13000 vòng/phút ở 40C. 32 Bƣớc 10: Bỏ dung dịch wash solution từ ống tube, và chuyển cột plasmid mini column vào ống wash tube khác. Li tâm thêm 1 phút nữa để loại bỏ dung dịch wash solution còn lại. Bƣớc 11: Chuyển cột plasmid mini column vào ống eppendorf. Thêm 50µl dung dịch elution vào màng hoặc đế của cột và cho phép 1 phút để dung dịch bão hòa màng. Li tâm 1 phút 13000 vòng/phút ở 40C để tách rửa plasmid. Bƣớc 12: Bỏ cột mini column và trữ DNA tinh ở 40C. 3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) Định nghĩa đơn vị enzym cắt: Một đơn vị enzym cắt giới hạn là lƣợng enzym xúc tác phản ứng cắt hết một lƣợng DNA là 1µg trong buffer thích hợp trong thời gian là 1 giờ ở nhiệt độ thích hợp. Thực hiện phản ứng cắt với các thành phần nhƣ sau Buffer 10X 2.5µl DNA plasmid 1µg Enzym EcoRV 1 unit Thêm nƣớc cho tới 25µl Ủ phản ứng ở 37oC trong 1 giờ, biến tính enzym ở 65oC trong 15 phút Điện di 8µl sản phẩm cắt trên gel agrose 1%, với hiệu điện thế 100V, trong 30 phút để kiểm tra. Tƣơng tự thực hiện phản ứng cắt với enzym RsaI và HindIII để kiểm tra sản phẩm sau khi li trích. 3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose Chuẩn bị khuôn đổ gel, gắn lƣợc vào khuôn, cân 0.1g agarose cho vào chai chứa 12.5 ml dung dịch TAE 0.5X, nấu agarose trong lò vi sóng trong 2 phút, 650W. Để nguội đến 40-500C, đổ gel vào khuôn, khi gel nguội, gỡ lƣợc ra khỏi miếng gel, lấy gel ra khỏi khuôn một cách nhẹ nhàng và đặt vào bồn điện di đã có sẵn dung dịch TAE 0.5X. Chuẩn bị một miếng parafilm (kích thƣớc tuỳ vào số mẫu chạy điện di), hút 2μl dung dịch nạp mẫu (loading dye) cho mỗi mẫu cần điện di, hút mẫu cần điện di (thể tích tuỳ thuộc vào nồng độ mẫu) trộn đều với dung dịch nạp mẫu, hút toàn bộ dung dịch vừa trộn nạp vào giếng. 33 Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực, điện di với hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Sau khi điện di xong, cẩn thận lấy gel ra và nhuộm trong Ethium bromide trong 10 phút, rửa kỹ gel và đọc kết quả điện di bằng phần mềm Quantity One (khi nhuộm với ethium bromide phải tuyệt đối cẩn thận). 3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR 3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA Các bƣớc tinh sạch DNA bằng RNAse nhƣ sau: - Cho hỗn hợp DNA pha loãng với nƣớc vào eppendorf (theo tỷ lệ 1:3) - Thêm vào 2 l RNAse vào hỗn hợp trên - Ủ ở 370C khoảng 30 giây - Thêm vào 2 l Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) - Ly tâm lấy phần trên sang ống khác - Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút - Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên - Làm khô DNA và cho vào TE - Điện di và đọc kết quả Phƣơng pháp tinh sạch đƣợc thực hiện theo kit sử dụng cột GFX do hãng Amersham sản xuất, công ty Nguyên Anh cung cấp. Kit tinh sạch GFX cho phép tinh sạch DNA trực tiếp hoặc thông qua phƣơng pháp cắt gel. 3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel Nhằm phân tách và thu nhận duy nhất đoạn DNA mong muốn và DNA plasmid từ bản gel agarose sau khi điện di Bƣớc 1: Gel sau khi chạy điện di, đƣợc đƣa lên hệ thống UV. Bƣớc 2: Dùng dao sắc cắt phần gel chứa band DNA cần đƣợc tinh sạch cho vào eppendoft 1.5ml ( đã cân trọng lƣợng trƣớc). Bƣớc 3: Cho capture buffer vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ 10mg gel ≈ 10µl capture buffer. Bƣớc 4: Đậy nắp lại ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 – 15 phút). Bƣớc 5: Chuẩn bị cột GFX, đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẩu cần tinh sạch. Bƣớc 6: Sau khi ủ, đem ly tâm để tập trung mẩu ở đáy eppendorf. 34 Bƣớc 7: Hút hết mẩu sau khi ly tâm cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Bƣớc 8: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30giây ở 40C. Bƣớc 9: Cho thêm vào cột lƣợng wash buffer tƣơng ứng (tỉ lệ 1:5 theo thể tích mẫu tinh sạch), ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C. Bƣớc 10: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới. Bƣớc 11: Hút 50µl elution buffer nhỏ vào cột GFX. Bƣớc 12: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Bƣớc 13: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C, lấy cột ra, đậy nắp lại. Bƣớc 14: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose 0.8 %, hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra kết quả tinh sạch. 3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX Bƣớc 1: Chuẩn bị cột tinh sạch GFX đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch. Bƣớc 2: Hút capture buffer cho vào các cột với tỷ lệ thể tích giữa capture buffer và sản phẩm PCR là 5:1. Bƣớc 3: Cho sản phẩm PCR vào các cột chứa capture buffer đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Bƣớc 4: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C. Bƣớc 5: Cho thêm vào cột một lƣợng wash buffer bằng với lƣợng capture buffer cho vào ở trên, ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C Bƣớc 6: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới. Bƣớc 7: Hút elution buffer nhỏ vào cột GFX, tùy vào mục đích sử dụng sản phẩm tinh sạch mà lƣợng elution buffer có thể thay đổi. Bƣớc 8: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Bƣớc 9: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C, lấy cột ra, đậy nắp eppendorf lại. Bƣớc 10: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả tinh sạch. 35 3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta sẽ thu đƣợc sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính. Do điều kiện của thí nghiệm phải thiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA với enzym DNA polymerase I large fragment (Klenow). Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần nhƣ sau: NEbuffer 10X 2µl DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg) dNTPs (33µmol) 1µl DNA fragment Klenow 1 unit (1µl) Thêm nƣớc cho tới 20µl Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút. Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid Plasmid sau khi cắt bằng HindIII, và thực hiện phản ứng phủ đầu bằng theo qui trình sau: NEbuffer 10X 2µl DNA plasmid 6µl (1µg) dNTPs (33µmol) 1µl Phản ứng tạo đầu bằng Đầu dính Đầu bằng 36 DNA fragment Klenow 1 unit (1µl) Thêm nƣớc cho tới 20µl Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút 3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) T4 DNA ligase không giống nhƣ E. coli DNA ligase, nó có thể xúc tác phản ứng nối những đoạn DNA đầu bằng (Sgaramella và Khorana 1972, Sgaramella và Ehrlych 1978). Tuy nhiên phản ứng gắn kết sẽ không có đƣợc hiệu suất cao và cần phải có các yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti và Sgaramella 1981), nồng độ enzym ligase cao (50unit/ml), lƣợng DNA insert và vector cao, tỉ lệ về số mol của vector và đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10. Trong phản ứng nối blunt-end có thể thêm vào các chất có phân tử lƣợng cao nhƣ PEG hay Hexamminecobalt chloride. Các chất này có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng ligation từ 1-3 lần, điều đó cho phép lƣợng DNA và nồng độ ligase giảm xuống và không ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử đƣợc ngăn chặn, khi đó chỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy ra. Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn (ng)DNA chèn = Căn cứ vào tỉ lệ về số mol giữa vector và DNA chèn rồi dựa vào đó để tính ra lƣợng DNA cần sử dụng Thực hiện phản ứng nối với các thành phần nhƣ sau: T4 reaction buffer 1µl DNA từ sản phẩm PCR 2µl (100ng) DNA plasmid 1µl (50ng) T4 ligase 1 unit Thêm nƣớc cho tới 10µl Ủ phản ứng ở 160C qua đêm, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụng cột tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer. Vector (ng) x DNA chèn (kb) Vector (kb) Tỉ lệ DNA chèn (bp) Vector X 37 3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) Thực hiện biến nạp theo quy trình sau: - Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 3µl DNA plasmid tái tổ hợp vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. - Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 200µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. - Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370 C (khoảng 14 - 16 giờ). - Quan sát khuẩn lạc trên đĩa petri, bắt những khuẩn lạc trắng cấy sang môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ. Thực hiện biến nạp theo quy trình trên plasmid chƣa tái tổ hợp để làm đối chứng. Bắt những khuẩn lạc xanh cấy sang môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ. Thực hiện tách chiết plasmid theo qui trình ở mục 3.4.6.1. 38 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5 (A) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 10:1.5 phục hồi trong 500µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (B) Hình chụp gần; (C) Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid (thể tích là 10µl tế bào khả nạp) phục hồi trong 500µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100 µl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C. C A B 39 Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5 (A)Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 3:0.5 phục hồi trong 200µl môi trường LB lỏng trong 1giờ, cấy 10 µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (B) Hình chụp gần; (C) Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid (thể tích là 10µl tế bào khả nạp) phục hồi trong 200µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X- gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (D) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 3:0.5 phục hồi trong 200 µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X- gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C. A B C D 40 Chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 2 (ở thể tích biến nạp là 3:0.5, và dịch biến nạp đã pha loãng ½ khi trang lên đĩa) cho kết quả tốt hơn chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 1 (ở thể tích biến nạp 3:0.5, và dịch biến nạp không pha loãng khi trang lên đĩa) và chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 3 (ở thể tích biến nạp là 10:1.5). Biến nạp theo quy trình 1 cho kết quả chỉ vài khuẩn lạc xanh xuất hiện và có rất nhiều khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờng. Điều này có thể giải thích là do trong quá trình làm thí nghiệm đã có một số tế bào tự bản thân nó có khả năng kháng lại với kháng sinh hoặc là do thao tác trang X-gal không đều ở xung quanh đĩa nên các tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng không có X-gal để phân hủy vì vậy chỉ cho khuẩn lạc trắng hoặc tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng quá trình phục hồi và biểu hiện của gen LacZ diễn ra chậm (đối với khuẩn lạc này khi quan sát kỹ sẽ thấy màu xanh nhạt). Kết quả biến nạp theo quy trình 2 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và khuẩn lạc trắng ít hơn rất nhiều so với biến nạp theo quy trình 1. Nhƣ vậy cho thấy quy trình 2 hiệu quả biến nạp tốt hơn và thể tích biến nạp nhƣ vậy là hợp lí. Khuẩn lạc mọc rời rạc, dễ cho thao tác chọn khuẩn lạc để cấy chuyền sang môi trƣờng lỏng nhân sinh khối để li trích đƣợc plasmid. Kết quả biến nạp theo quy trình 3 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và cũng cho nhiều khuẩn lạc trắng hơn so với biến nạp theo quy trình 2. Khuẩn lạc xanh tuy nhiều nhƣng mọc dày rất khó cho việc chọn khuẩn lạc tăng sinh trong môi trƣờng lỏng. Nhƣ vậy, qua kết quả chọn lọc thể biến nạp trên môi trƣờng LB agar/Amp/X- gal/IPTG chúng tôi thấy biến nạp theo quy trình 2 là thích hợp. 4.2 Tách chiết DNA plasmid. 4.2.1 Tách chiết DNA plasmid Bắt những khuẩn lạc xanh trên môi trƣờng đĩa và tiến hành cấy sang ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh là 60µg/ml nuôi cấy lắc ở 370C qua đêm, chọn ống có sinh khối và tiến hành tách chiết plasmid thu đƣợc kết quả nhƣ sau: 41 Kết quả tách chiết plasmid lần 1 còn lẫn rất nhiều DNA của genome vi khuẩn. Có thể điều này là do khi thêm dung dịch III vào để lâu nên cả DNA plasmid và DNA của bộ gen đều hoàn tính. Với nhận định trên tôi đã tiến hành tách chiết plasmid lần 2 để khẳng định lại quy trình. Nhờ khắc phục những sai sót của lần 1 kết quả của lần tách chiết này cho thấy đã loại đƣợc DNA của genome, thu đƣợc plasmid. Nhƣ vậy, đây là quy trình tách chiết plasmid chuẩn, mọi sai sót xảy ra đều có thể khắc phục. Kết quả tách chiết chủ yếu phụ thuộc nhiều vào thao tác, hóa chất sử dụng đơn giản. Sản phẩm tách chiết có thể dùng để thực hiện phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn, đây là cơ sở để kiểm tra kết quả biến nạp. DNA genome DNA plasmid 3.0kb Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 1) DNA plasmid 3.0kb Hình 4.4 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 2) 42 Những điểm cần lƣu ý khi chiết tách plasmid Khi thêm dung dịch II chỉ đảo ngƣợc eppendorf khoảng 5-6 lần sau đó phải thêm dung dịch III ngay để trung hòa dung dịch II. Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ phục hồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen. Ở bƣớc 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ nhàng và cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không đƣợc hút xuống phần bên dƣới. 4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid Mini Kit Tách chiết plasmid bằng Kit cho hiệu quả tách chiết cao hơn, lƣợng plasmid thu đƣợc nhiều hơn, tinh sạch hơn, thao tác đơn giản, nhanh. Sản phẩm tách chiết không cần phải qua bƣớc tinh sạch để sử dụng cho các bƣớc tiếp theo trong quá trình cloning. 4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV DC1 EcoRV 1 EcoRV 2 DC2 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel 1% (lần 1) (DC1) sản phẩm li trích plasmid bằng kit; (EcoRV 1) sản phẩm cắt đươc bằng enzyme EcoRV; (DC2) sản phẩm li trích plasmid bằng kit; (EcoRV 2) sản phẩm không cắt được bằng EcoRV. DNA plasmid 3.0kb Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid bằng Kit trên gel agarose 1% 43 Kết quả ở hình trên cho thấy plasmid đã cắt hoàn toàn đúng kích thƣớc, vector đã đƣợc mở vòng tại vùng MCS trở thành dạng thẳng, nhƣng chỉ có sản phẩm tách chiết plasmid ở mẫu đối chứng 1 là đƣợc cắt. Do đó chúng tôi tiến hành phản ứng cắt lần 2 để kiểm tra hoạt tính cắt của enzyme EcoRV thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Mẫu (1) và (2) sản phẩm tách chiết plasmid đã không bị cắt bởi enzyme EcoRV trong khi mẫu (3), (4) đƣợc cắt hoàn toàn. Vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng cắt với enzyme HindIII để kiểm tra sản phẩm tách chiết có phải là plasmid mong muốn hay không thì thu đƣợc kết quả nhƣ sau: DC DC 1 2 Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% (1), (2): sản phẩm cắt bằng HindIII; (DC): sản phẩm tách chiết plasmid. DC DC 1 2 3 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% (1), (2), (3): sản phẩm cắt bằng HindIII; (DC): sản phẩm tách chiết plasmid. DC 4 3 2 1 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (lần 2) (DC): sản phẩm đã cắt bằng EcoRV ở lần 1; (1), (2): sản phẩm cắt bằng EcoRV; (3), (4): sản phẩm cắt bằng RsaI. 44 Plasmid đã cắt hoàn toàn và đúng nhƣ kích thƣớc của plasmid đối chứng. Do đó có thể suy ra rằng, trong quá trình làm thí nghiệm plasmid đã bị hƣ site cắt EcoRV trên vùng MCS hoặc enyme EcoRV bị giảm hoạt tính nên không thể nhận biết đƣợc vị trí site cắt EcoRV trên vùng MCS. Vì vậy để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi quyết định chọn sản phẩm cắt bằng HindIII, phủ đầu bằng để thực hiện phản ứng nối. Một số điều cần chú ý khi thực hiện phản ứng cắt RE sẽ giữ đƣợc hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn luôn đƣợc bảo quản ở -200C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng tốt trƣớc khi cất trở lại vào -200C. Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất. Tuy nhiên để đảm bảo RE không vƣợt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme. 4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII 4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA Trong đề tài này, chúng tôi thực hiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào plasmid vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA sau đó tinh sạch đoạn DNA trên. Kết quả điện di cho thấy quá trình tinh sạch đã loại hết các thành phần tạp trong sản phẩm PCR. Tuy nhiên, phƣơng pháp tinh sạch trực tiếp đoạn DNA từ sản phẩm PCR chỉ nên sử dụng khi sản phẩm PCR muốn tinh sạch không có band phụ, nếu sản phẩm PCR có band phụ thì phải tinh sạch từ gel. Phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA bằng enzyme Klenow Fragment không kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose, kết quả này chỉ có thể kiểm tra khi đã chèn vào đƣợc plasmid và biến nạp vào vi khuẩn. 45 Một số điều cần lƣu ý khi thực hiện tinh sạch đoạn DNA : Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một, khi rửa hoặc thêm capture buffer nhỏ trên thành của cột, cân eppendorf trƣớc khi để gel cắt vào, gel phải đƣợc cắt vụn ra sau khi cân, sau quá trình ủ 60oC agarose phải tan hết, sử dụng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting agar). Chuẩn bị trƣớc khi tinh sạch: máy điện di cần đƣợc rửa sạch, bảng gel cần đƣợc rửa sạch, sử dụng dung dịch dệm TAE riêng, sau mỗi lần chạy điện di thay buffer mới. Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thƣờng, phải đựng hộp riêng, phải thay mới khi nhuộm mẩu, tính toán số mẩu trƣớc khi chạy điện di, đổ gel tƣơng ứng số mẫu và giữ trong buffer. 4.4.2 Tinh sạch plasmid Plasmid sau khi dùng enzyme HindIII cắt mở vòng mới tinh sạch. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm sau khi tinh sạch đã loại hết tạp trong sản phẩm. Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX (1), (2): sản phẩm PCR kích thước 900bp; (3): ladder 100bp. Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX (1): sản phẩm PCR kích thước 223bp; (2), (3): sản phẩm PCR kích thước 900bp. 46 Từ sản phẩm trên tiến hành phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid và tinh sạch lại bằng qui trình tinh sạch sử dụng RNAse. Sau đó tiến hành pha loãng chuẩn bị cho phản ứng nối. 4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp Thực hiện phản ứng phủ đầu bằng cho sản phẩm PCR và plasmid sau khi cắt HindIII, tinh sạch sản phẩm, nối 2 đoạn sản phẩm PCR vào plasmid. Biến nạp plasmid đã nối này vào vi khuẩn E. coli DH5α khả nạp,và thực hiện tƣơng tự với plasmid chƣa tái tổ hợp để làm đối chứng thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Cả hai trƣờng hợp biến nạp đọan DNA 900bp và 223bp đều cho toàn khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờng LB agar/Amp/X-gal/IPTG. TS DC Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch trên gel agarose1% (DC) plasmid cắt bằng HindIII chưa tinh sạch; (TS) plasmid cắt bằng HindIII tinh sạch bằng cột GFX. Hình 4.13 Biến nạp plasmid tái tổ hợp (A) Biến nạp plasmid đã chèn đoạn 223bp; (B) Biến nạp plasmid đã chèn đoạn 900bp; (C) Biến nạp plasmid chưa tái tổ hợp. C A B 47 Kết quả trên có thể là đã biến nạp hoàn toàn plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn hoặc những khuẩn lạc màu trắng trên là do các tế bào vi khuẩn bị đột biến kháng kháng sinh tạo thành. Còn trên đĩa đối chứng xuất hiện cả khuẩn lạc màu xanh và trắng. 4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp Chọn lọc những khuẩn lạc trắng, mọc rời rạc cấy sang môi trƣờng LB lỏng/ampicillin (60µg) nhân sinh khối qua đêm tiến hành tách chiết theo qui trình ở mục 3.4.6.1. Chạy điện di chỉ thu đƣợc toàn genome của vi khuẩn. Còn kết quả li trích plasmid của khuẩn lạc xanh trên đĩa đối chứng thì thu đƣợc DNA plasmid. Nhƣ vậy biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α chƣa thành công. Điều này có thể là do nồng độ plasmid sau khi cắt và nối sử dụng để biến nạp là chƣa phù hợp, vì chúng tôi đã không thể tính toán đƣợc nồng độ plasmid hao hụt sau khi thực hiện phản ứng cắt và nối. Hoặc cũng có thể thời gian sốc nhiệt quá ngắn nên plasmid không thể biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Do đó, trong quá trình phủ đầu bằng cho đoạn DNA và plasmid phải luôn chú ý cẩn thận tính toán các thành phần trong phản ứng cho phù hợp. Còn trong quá trình thiết lập phản ứng nối phải chú ý đến việc tính toán tỉ lệ thể tích giữa vector và đoạn DNA, nhiệt độ ủ của phản ứng sao cho phù hợp và nên thêm các chất xúc tác cho phản ứng nối nhƣ: PEG hay Hexamminecobalt chloride. Biến nạp vào vi khuẩn nên sốc nhiệt ở thời gian lâu hơn, thử nghiệm nhiều qui trình khác nhau về thời gian sốc nhiệt và kèm theo đối chứng. Vì thời gian giới hạn chúng tôi đã không thử nghiệm nhiều quy trình khác nhau nên đã không cho ra đƣợc kết quả nhƣ mong muốn. 48 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: - Hoàn thiện quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phƣơng pháp hóa học, tế bào khả nạp có thể tế bào khả nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng. - Hoàn thiện đƣợc quy trình biến nạp plasmid pBluescript SK(+/-) vào vi khuẩn E. coli DH5α và chọn lọc thể biến nạp trên môi trƣờng chứa Ampicillin/X-gal/IPTG. - Đã đƣa ra quy trình tách chiết plasmid chuẩn bằng phƣơng pháp SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần. Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 370C trong1 giờ. Bƣớc 7: Cho vào mồi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. 49 Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, và ủ ở -200C trong 1 giờ, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa. Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 11: Cho TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Tùy lƣợng mẫu mà thêm vào. Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 1% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách. - Đã thiết lập đƣợc phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn để kiểm tra kết quả tách chiết. 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện các quy trình cắt bằng HindIII, nối đoạn DNA từ phản ứng PCR vào plasmid pBluescript SK(+/-) và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α. - Thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sản phẩm nối giữa plasmid pBluescript SK(+/-) đã cắt bằng HindIII và đoạn DNA từ phản ứng PCR, giải trình tự sản phẩm nối trên. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục. 2. Lê Đình Lƣợng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa Học Kỹ Thuật. 3. Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh và Cao Cƣờng, 2002, Công nghệ gen, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM. 4. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005, Sinh học phân tử - Giới thiệu phương pháp và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp TP. HCM. 5. Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái, 2005, Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α, Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại Học Nông Lâm TP. HCM. 6. Phạm Thành Hổ, 8-2003, Di truyền học, NXB Giáo Dục. 7. Tô Minh Châu, Vƣơng Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp và Nguyễn Thúy Hƣơng, 1999, Vi sinh vật học đại cương, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. HCM. 8. Trần Linh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo và Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo trình thực tập kỹ thuật di truyền I, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM 29 trang. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài. 9. T.A. Brown, 1997, Gen cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall. 10. Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan. 11. Sambrook and Russell, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, Vol I, Vol II, Vol III, CSH. 12. Sambrook J, E. F. Fritsch and T. Maniatis, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, second edition, CSH. 13. Wolgang Schumann, 1995, Genetic Engineering Techniques. Các website 51 52 PHỤ LỤC 1. Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm  Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút  Môi trƣờng LB agar Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút.  Môi trƣờng LB + Ampicillin Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút, sau đó để nguội đến 40-450c bổ sung Ampicillin nồng độ cuối 100µg/ml  Môi trƣờng LB + Ampicillin + X-gal + IPTG ( môi trƣờng chọn lọc thể biến nạp E.coli) Cho 20 µl X-gal (20mg/ml) vào mỗi đĩa petri chứa môi trƣờng LB + Ampicillin, dùng que trang, trang đều trên đĩa, để cho mặt thạch khô. Thêm tiếp 20µl IPTG (300mg/ml), trang đều trên đĩa và để cho khô mặt thạch 53 2. Các dung dịch dùng cho chiết tách DNA plasmid Dung dịch I Tris – HCl 25mM pH8 Glucose 50mM EDTA 10mM Dung dịch II (nên pha trƣớc khi dùng) Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 100 µl NaOH 5N 40µl Nƣớc cất 2 lần 860µl Dung dịch III Glacial acetic 0.2M Potassium acetat 0.2M Dung dịch TE (pH8) Tris – HCl (pH8) 10mM EDTA (pH8) 1mM Dung dịch TAE 1X Tris – acetat 40mM EDTA (pH8) 1mM Loading dye Bromophenol blue 0.25% Glycerol trong TAE 1X 40% Dung dịch Lysozyme: Hoà tan 10mg trong 1ml dung dich Tris-HCl 10mM pH 8.0. Dung dịch X-gal 20mg/ml Cân 20 mg X-gal hoà tan trong 1ml dung dịch dimethylformamide (dung dịch này rất độc, phải cẩn thận khi thao tác) Dung dịch IPTG 20mg/ml (stock) Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan trong 1 ml nƣớc khử ion, sau đó lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,2μm 54 Dung dịch kháng sinh Ampicillin 100mg/ml Cân 100mg ampicillin dạng bột, hoà tan trong 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,45μm. 3. Các loại buffer  Buffer SuRE 10X pH 8.0(buffer enzym cắt) Tris-HCl 100mM NaCl 1M MgCl2 50mM 2-Mercaptoethanol 10mM  NEBuffer 1X pH 7.9 (buffer của enzym DNA polymerase I large fragment) NaCl 50mM Tris-HCl 10mM MgCl2 10mM DTT 1mM  Ligation buffer 10X Tris-HCl pH 7.6 660mM MgCl2 66mM DTT 100mM ATP 660μM 55 Hình 1 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) 56 Hình 2 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-)