Khóa luận Khảo sát hàm lượng progesterone trong sữa bằng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán mang thai sớm, chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu trên bò cho sữa tại Công ty Cổ Phần bò sữa Long Thành và các hộ lân cận tỉnh Đồng Nai

có thai này sẽ tránh đƣợc sự bỏ lỡ cơ hội phối giống tiếp theo (Chung Anh Dũng, 2002). 2.6.5.2 Xác nhận động dục Bò cái thƣờng không có dấu hiệu động dục rõ ràng dẫn đến việc quyết định phối giống sai. Vào thời điểm phối tinh có tới 15 – 20% bò sữa không động dục. Ở một số trang trại, tỷ lệ phát hiện động dục sai có thể cao tới 50% hoặc hơn. Progesterone trong sữa có thể dùng để xác định động dục ở bò. Nếu mẫu sữa kiểm tra cho thấy hàm lƣợng progesterone cao thì có thể bò không động dục và cần đƣợc theo dõi cẩn thận cũng nhƣ kiểm tra lại các mẫu lấy vào thời điểm muộn hơn. Có thể tiến hành đơn giản bằng cách giữ lại mẫu sữa vào thời điểm bò đƣợc đƣa ra để phối tinh cho đến khoảng 2 tuần hoặc một tháng sau. Nếu nhiều hơn 10% số bò đƣợc phối tinh vào thời điểm có hàm lƣợng progesterone cao thì có thể chứng minh đƣợc là việc phát hiện động dục không chính xác. Các stress với môi trƣờng có tác động rất lớn đến hiệu quả sinh sản. Đặc biệt, stress nhiệt là nguyên nhân dẫn đến việc giảm nghiêm trọng tỷ lệ có thai, tăng tỷ lệ chết phôi sớm, giảm độ dài và cƣờng độ của các biểu hiện động dục và làm giảm thể trọng bé sinh ra. Ngày nay ngƣời ta đã sử dụng progesterone trong sữa để trợ giúp cho các chƣơng trình phối giống trong điều kiện gia súc bị stress do môi trƣờng (Chung Anh Dũng, 2002). 2.7 Nguyên lý kỹ thuật ELISA (Progesterone – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Phản ứng ELISA thƣờng kết hợp kháng nguyên – kháng thể không thể phát hiện bằng mắt thƣờng, kỹ thuật ELISA đã lợi dụng đặc tính hấp thụ tự nhiên của protein lên polyethylen đã gắn kháng nguyên hoặc kháng thể lên giá rồi cho kháng nguyên hoặc kháng thể tƣơng ứng có đánh dấu enzyme và tạo phản ứng. 23 Bỏ chất đánh dấu không kết hợp, cho thêm vào hỗn hợp chất hiện màu. Cũng nhờ hoạt tính xúc tác của enzyme giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O từ oxy hóa hiện màu làm thay đổi màu của hỗn dịch. Nhƣ vậy, kỹ thuật ELISA gồm có 3 thành phần tham gia phản ứng (kháng nguyên, kháng thể và chất hiện diện màu) đồng thời thực hiện có 2 bƣớc: Trong phản ứng miễn dịch: là sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể. Trong phản ứng hóa học:nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng [O] vì chính [O] này oxi hoá chất chỉ thị màu. Chất chỉ thị thay đổi màu có nghĩa là chứng minh sự có mặt của enzyme và chứng minh sự kết hợp giữa kháng nguyên với kháng thể. Có 2 loại kỹ thuật ELISA chính: kỹ thuật ELISA trực tiếp và kỹ thật ELISA gián tiếp. – Kỹ thuật ELISA trực tiếp: khi kháng nguyên đƣợc gắn vào đáy giếng phản ứng sau đó phủ lên kháng thể đặc hiệu gắn enzyme, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Khi rửa để loại bỏ kháng thể gắn enzyme không kết hợp với kháng nguyên và cho vào giếng chất hiện màu. Đọc kết quả bằng phổ kế sau 10 phút. Kết quả có 2 trƣờng hợp xảy ra: Kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì sẽ có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể gắn enzyme không bị rửa trôi. Enzyme sẽ giải phóng [O] từ H2O2 để oxy hóa chất hiện màu, kết quả làm thay đổi màu hỗn dịch trong giếng. Kháng nguyên không đặc hiệu với kháng thể thì không xảy ra sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể, enzyme bị rửa trôi, kết quả là hỗn dịch trong giếng phản ứng không thay đổi màu. – Kỹ thật ELISA gián tiếp: Theo nguyên tắc kỹ thuật ELISA trực tiếp và gián tiếp không khác nhau, nhƣng kỹ thuật gián tiếp có thêm một bƣớc phản ứng. Conjugate trong kỹ thuật trực tiếp là kháng thể đặc hiệu gắn với enzyme, trong khi đó, conjugate của phản ứng gián tiếp là kháng thể khác với enzyme và đọc kết quả xảy ra 2 trƣờng hợp: 24 Nếu nhƣ kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể, sẽ có sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể và sự kết hợp giữa conjugate với phức hợp kháng nguyên kháng thể, trong giếng hỗn dịch có enzyme để giải phóng [O] từ H2O2, oxy hoá chất hiện màu làm thay đổi màu hỗn dịch (phản ứng dƣơng tính). Khi kháng nguyên không đặc hiệu với kháng thể thì không có sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể bị rửa trôi, đồng thời, conjugate không kết hợp với kháng nguyên cũng bị rửa trôi, hỗn dịch không có sự kết hợp với kháng nguyên với kháng thể, kháng thể bị rửa trôi và conjugate không kết hợp với kháng nguyên cũng bị rửa trôi, hỗn dịch sẽ không có enzyme để giải phóng enzyme [O] từ H2O2, chất hiện màu không bị oxy hoá, hỗn dịch không thay đổi màu (phản ứng âm tính). (Ngô Phƣơng Nghị, 2003) 25 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1 Thời gian Từ tháng 03/2007 đến tháng 07/2007. 3.1.2 Địa điểm Đề tài thực hiện tại các hộ chăn nuôi bò sữa và Công ty Cổ Phần Bò Sữa huyện Long Thành, tỉnh Đồng Nai. Mẫu sữa xét nghiệm đƣợc phân tích tại Trung Tâm Phân Tích Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Đối tƣợng khảo sát – 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) nhóm máu 50 và 75% HF thuộc các lứa 1, 2, 3 và 4 sinh sản bình thƣờng. – 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) nhóm máu 50 và 75% HF sau khi sinh từ 90 ngày trở lên thuộc các lứa 1, 2, 3 và 4 không động dục hoặc phối giống nhiều lần không đậu. 3.3 Nội dung khảo sát Lấy mẫu sữa của bò đƣợc phân theo nhóm máu, lứa đẻ ở các ngày thứ nhất lúc gieo tinh; ngày thứ 7, ngày thứ 14, ngày thứ 21 và ngày thứ 24 sau khi gieo tinh để khảo sát hàm lƣợng progesterone trong sữa. 3.4 Phƣơng pháp tiến hành Khảo sát 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) sinh sản bình thƣờng và 20 con bò sữa chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu 50 và 75% HF thuộc các lứa đẻ 1, 2, 3 và 4. 26 3.4.1 Bố trí số mẫu sữa khảo sát theo nhóm máu Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò sinh sản bình thƣờng theo nhóm máu đƣợc trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1 Số mẫu sữa khảo sát trên bò sinh sản bình thƣờng Nhóm máu Số bò (n) Số mẫu sữa thu thập (N) 50% 10 40 75% 10 40 Tổng cộng 20 80 Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu đƣợc trình bày ở Bảng 3.2 Bảng 3.2 Số mẫu sữa khảo sát trên bò chậm động dục Nhóm máu Số bò (n) Số mẫu sữa thu thập (N) 50% 10 40 75% 10 40 Tổng cộng 20 80 3.4.2 Bố trí số mẫu sữa khảo sát theo các lứa đẻ Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò sinh sản bình thƣờng theo lứa đẻ đƣợc trình bày ở Bảng 3.3. Bảng 3.3 Số mẫu sữa khảo sát theo lứa đẻ ở bò sinh sản bình thƣờng Lứa đẻ Số bò (n) Số mẫu thu thập (N) 1 4 16 2 7 28 3 4 16 4 5 20 Tổng cộng 20 80 27 Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không dậu theo lứa đẻ đƣợc trình bày ở Bảng 3.4. Bảng 3.4 Số mẫu sữa khảo sát theo lứa đẻ ở bò chậm động dục Lứa đẻ Số bò (n) Số mẫu thu thập (N) 1 4 16 2 7 28 3 4 16 4 5 20 Tổng cộng 20 80 3.4.3 Lấy mẫu sữa và ly tâm 3.4.3.1 Lấy mẫu Vệ sinh lọ đựng sữa có thể tích khoảng 50 ml. Rửa sạch và lau khô bầu và núm vú của bò sữa. Vắt sữa bò bình thƣờng đƣợc khoảng vài lít, sau đó hứng sữa cho vào lọ để đạt thể tích khoảng 50 ml. Sữa đƣợc lấy vào buổi chiều đối với cả hai nhóm bò sinh sản bình thƣờng và bò chậm sinh. 3.4.3.2 Ly tâm và trữ mẫu Mẫu sữa đƣợc ly tâm 3000 vòng/phút. Phần màu vàng đục và đặc ở trên là béo và phần cặn sữa ở dƣới đáy ống nghiệm phải đƣợc loại bỏ. Sử dụng kim chích đâm xuyên qua phần béo rồi hút phần sữa trong bên dƣới cho vào ống đựng mẫu ghi số hiệu và bảo quản trong tủ đông -300C. 3.4.4 Kỹ thuật ELISA Chuẩn bị xét nghiệm: Bộ kít progesterone (Bovine progesterone ELISA Test. Endocrine technologies, INC. USA ) đƣợc bảo quản ở 2 đến 80C nếu không sử dụng. Tuyệt đối không trữ đông, các mẫu sữa xét nghiệm đƣợc đƣa về nhiệt độ phòng để chuẩn bị pha dung dịch pha loãng và TBM theo tỷ lệ 1A/1B trong một ống nghiệm sạch trƣớc khi xét nghiệm từ 5 đến 10 phút. Những chất xét nghiệm dƣ phải đƣợc loại bỏ. 28 3.4.4.1 Thành phần bộ kít – 96 lỗ giếng đƣợc phủ sẵn kháng thể IgG của thỏ. – Nồng độ progesterone chuẩn: 0; 0,5; 3,0; 10; 25 và 50 ng/ml chất lỏng pha sẵn, mỗi chai là 0,5 ml. – Dung dịch pha loãng mẫu, 25 ml. – Thuốc thử màu TMB, 12 ml. – Dung dịch chuẩn độ (2N HCL), 6 ml. – Chất đệm rửa 20 X, 20 ml. – Stop Solution (3N HCL): 10 ml. 3.4.4.2 Dụng cụ thực hiện – Máy ly tâm 3000 vòng/phút. – Ống nghiệm bằng nhựa (5 ml). – Bông thấm nƣớc. – Thùng đá bảo quản mẫu. – Pipette chính xác hút đƣợc 25, 50, 100, 200 μl và 1 ml – Nƣớc cất. – Ống nghiệm bằng thủy tinh để pha chất nền màu A, B. – Giấy thấm. – Băng keo trong. – Máy đọc đĩa vi chuẩn độ. – Giấy vẽ đồ thị tuyến tính. – Tủ sấy 370C. – Parafine để bịt kín đĩa. – Đầu hút gắn vào pipette sử dụng một lần. 29 3.4.4.3 Các bƣớc xét nghiệm – Trƣớc khi xét nghiệm lấy các mẫu sữa ra, để rã đông ở nhiệt độ phòng rồi mới tiến hành xét nghiệm. – Tất cả thuốc thử phải đạt tới nhiệt độ phòng 180C đến 250C trƣớc khi sử dụng. – Lấy pipette chuẩn độ 50 μl hút mẫu vật xét nghiệm và mẫu đối chứng vào các lỗ giếng thích hợp. – Lấy 100 μl dung dịch kết hợp enzyme progesterone vào mỗi lỗ giếng (ngoại trừ những lỗ giếng để trống, lắc lỗ giếng 30 giây, ủ ở 370C trong 1giờ. Nên dùng parafin để che những lỗ giếng hoặc sử dụng túi thích hợp để cất giữ những đĩa trong suốt quá trình ủ ấm. – Bỏ những chất còn tồn đọng bên trong lỗ giếng và rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa (250 đến 300 μl/giếng). Lật ngƣợc đĩa, kiểm tra bằng giấy thấm để lấy đi nƣớc ẩm còn xót lại. – Thêm 100 μl dung dịch TMB vào tất cả các giếng theo thứ tự. – Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng từ 18 đến 280C trong 10 phút, không đƣợc di chuyển. – Dừng phản ứng bằng cách cho thêm 50 μl chất chuẩn độ vào các giếng theo thứ tự giống nhau để cơ chất thêm vào tác động từ từ. – Đọc bƣớc sóng hấp thu ở 450 nm với máy đọc vi lƣợng. Chú ý: Ủ cơ chất phải đƣợc giữ trong nhiệt độ từ 25 đến 280C. Nếu ngoài nhiệt độ giới hạn này, thời gian ủ ấm phải đƣợc tính lại cho đúng. 3.4.4.4 Tính toán kết quả – Tính độ hấp thu trung bình mỗi loại: Mẫu chuẩn, mẫu đối chứng, mẫu sữa xét nghiệm. – Vẽ đƣờng cong chuẩn trên giấy vẽ đồ thị tuyến tính. Độ hấp thu của chuẩn để ở trục tung (Y). Nồng độ chuẩn tƣơng ứng ở trục hoành (X). – Tính toán nồng độ progesterone của mẫu sữa dựa vào đƣờng cong chuẩn trên. 30 3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu – Số liệu đƣợc trình bày dƣới dạng trung bình và sai số của mẫu ( X ± SE). – Trung bình cộng: N X ... XX N2 1X Trong đó: X1, X2, … XN là hàm lƣợng progesterone của mẫu sữa khảo sát N: là số mẫu sữa khảo sát – Độ lệch chuẩn: SX = 1 - N x( - i 22 )ix 31 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Qua thời gian khảo sát hàm lƣợng progesterone trong sữa của 20 bò sinh sản bình thƣờng và 20 bò chậm động dục bằng kỹ thuật ELISA ở các thời điểm lấy mẫu lúc phối giống; 7; 14; 21 và 24 ngày sau khi phối giống, đồng thời sau đó 60 ngày khám thai qua trực tràng để chẩn đoán bò đƣợc mang thai hay không sau khi phối đã cho các kết quả sau. 4.1 Hàm lƣợng progesterone trong sữa bò sinh sản bình thƣờng Kết quả khảo sát hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa qua các thời điểm kiểm tra của 20 bò sinh sản bình thƣờng đƣợc trình bày qua Bảng 4.1 và Hình 4.1. Bảng 4.1 Hàm lƣợng progesterone sữa bò sinh sản bình thƣờng Hàm lƣợng progesterone theo nhóm n Hàm lƣợng progesterone (ng/ml) của ngày Chẩn đoán mang thai 60 ngày khám qua trực tràng 0 7 14 21 24 n % Cao 10 0,61 0,25 1,08 0,24 1,69 0,42 2,31 0,46 2,55 0,41 8 80 Thấp 10 0,34 0,26 0,58 0,39 1,12 0,43 0,87 0,53 0,80 0,49 0 0 32 2,55 0,800,61 1,08 1,69 2,31 0,34 0,58 1,12 0,87 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.1 Hàm lƣợng progesterone sữa bò sinh sản bình thƣờng Qua khảo sát chúng tôi nhận thấy tỷ lệ đậu thai trên bò sinh sản bình thƣờng là 40%. Kết quả này thấp hơn kết quả tỷ lệ thụ thai của Lê Xuân Cƣơng và ctv (1999) là 68%, Chung Anh Dũng (2002) là 68,4%, Nguyễn Văn Tìm và ctv (1997) là 55,5% - 58,8%. Kết quả nêu trên chứng tỏ còn nhiều yếu tố hạn chế hiệu quả trong gieo tinh nhân tạo và khả năng thụ thai của bò sữa tại nơi khảo sát. Qua Bảng 4.1 và Hình 4.1 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,61 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,08 và 1,69 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,31 và 2,55 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và kỹ thuật khám thai qua trực tràng đã cho thấy tỷ lệ đậu thai là 80%. Trong lúc đó bằng kỹ thuật khám thai qua trực tràng đã cho thấy hoàng thể tồn lƣu là 2 bò chiếm tỷ lệ là 20% trong nhóm có hàm lƣợng progesterone cao. Kết quả này thấp hơn kết quả của Phan Văn Kiểm và ctv (2006) khi chẩn đoán mang thai sớm bằng ELISA với hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa ở bốn thời điểm tƣơng ứng lần lƣợt là 0,17; 1,45; 2,64 và 2,88 ng/ml và tỷ lệ đậu thai là 84,84% trong nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao. Điều này cho thấy, bò động dục có rụng trứng, đậu thai, thể vàng phát triển tốt. Trong lúc đó có hai bò không đậu thai do hoàng thể hình thành nhƣng 33 không tiêu biến mà vẫn còn tồn tại làm cho hàm lƣợng progesterone cao trong sữa. Khi khám qua trực tràng chúng tôi nhận thấy bò này có hoàng thể to, cứng. Ngoài ra, kết quả khám thai qua trực tràng sau 60 ngày đã cho thấy tỷ lệ này tƣơng đƣơng với khoảng biến thiên so với kết quả khảo sát của Nakao và ctv (1982) khi chẩn đoán mang thai sớm bằng ELISA với độ chính xác biến thiên từ 80 đến 85%. Từ những kết quả mà chúng tôi khảo sát so với kết quả của các tác giả trƣớc đó đã cho thấy rằng việc sử dụng kỹ thuật ELISA kiểm tra hàm lƣợng progesterone sữa dễ dàng xác định bò có hàm lƣợng progesterone thấp ở ngày thứ 21 là những bò không đậu thai nhƣng đối với những bò có hàm lƣợng progesterone sữa cao đã cho thấy rất khó xác định là chúng đã mang thai hay tồn lƣu hoàng thể. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 và 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,34; 0,58; 1,12; 0,87 và 0,80 ng/ml. Ở nhóm này, bò có động dục, có rụng trứng, thể vàng hình thành, song thể vàng bị tiêu biến. Kết quả này tƣơng đƣơng với kết quả của Phan Văn Kiểm (2006) khi xác định hàm lƣợng progesterone trong sữa bằng kỹ thuật ELISA đối với trƣờng hợp bò không mang thai có hàm lƣợng progesterone trung bình lần lƣợt là 0,12; 1,15; 2,48 và 0,25 ng/ml. Ở nhóm bò này, sau khi gieo tinh hợp tử đƣợc tạo thành nhƣng bị chết. Nguyên nhân hợp tử chết có thể do tử cung bị viêm, rối loạn kích thích tố ví dụ hàm lƣợng LH thấp đã không duy trì đƣợc sự phát triển của hoàng thể trên bò sau khi phối, nhu cầu dinh dƣỡng chƣa hợp lý, ảnh hƣởng của nhiệt độ, strees, chăm sóc nuôi dƣỡng chƣa tốt… Theo Homeida et al (2000), Kamonpatana (1988), Nakao (1981), Bulman (1978) nhận thấy vào ngày động dục hàm lƣợmg progesterone rất thấp là 0,2 ng/ml, sau đó tăng dần từ ngày thứ 5 của chu kỳ, đạt đỉnh cao từ ngày thứ 9 đến ngày thứ 18 của chu kỳ, giảm nhanh sau ngày thứ 18, xuống thấp nhất vào ngày thứ 21 của chu kỳ với mức nhỏ hơn 1 ng/ml. 34 4.1.1 Hàm lƣợng progesterone sữa bò theo nhóm máu Kết quả khảo sát hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa qua các thời điểm kiểm tra của bò theo nhóm máu 50 và 75% HF đƣợc trình bày ở Bảng 4.2 và Hình 4.2, 4.3. Bảng 4.2 Hàm lƣợng progesterone sữa bò theo nhóm máu Nhóm máu Hàm lƣợng progesterone theo nhóm n Hàm lƣợng progesterone (ng/ml) của ngày Chẩn đoán mang thai 60 ngày khám qua trực tràng 0 7 14 21 24 n % 50% Cao 6 0,63 0,25 1,21 0,24 1,90 0,42 2,41 0,58 2,66 0,50 5 83,3 3 Thấp 4 0,26 0,20 0,42 0,35 0,92 0,54 0,82 0,81 0,75 0,76 0 0 75% Cao 4 0,58 0,29 0,90 0,06 1,39 0,14 2,16 0,14 2,39 0,18 3 75 Thấp 6 0,39 0,30 0,69 0,42 1,25 0,32 0,91 0,31 0,83 0,30 0 0 2,66 0,75 2,41 1,90 1,21 0,63 0,820,92 0,26 0,42 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu Hà m lư ợn g p ro ge ste ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.2 Hàm lƣợng progesterone sữa bò theo nhóm máu 50% 35 Qua Bảng 4.2 và Hình 4.2 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,63 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,21 và 1,90 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,41 và 2,66 ng/ml. Tỷ lệ khám thai qua trực tràng trong nhóm bò 50% có hàm lƣợng progesterone cao là 83,33%, kết hợp với việc xác định hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và kiểm tra thai qua trực tràng cho thấy nhóm bò này có rụng trứng, thể vàng phát triển tốt. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 và 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,26; 0,42; 1,92; 0,82 và 0,75 ng/ml. Kết hợp với việc xác định hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và kiểm tra thai qua trực tràng cho thấy nhóm bò này buồng trứng không rụng trứng, dẫn đến không có thể vàng nên hàm lƣợng progesterone thấp. Có thể bò đã động dục nhƣng không rụng trứng, hoặc đã động dục, xuất noãn, gieo tinh, tạo hợp tử nhƣng hợp tử không phát triển do tử cung bị viêm làm hợp tử không định vị hay dinh dƣỡng kém làm hợp tử không phát triển; hoặc rối loạn kích thích tố LH làm hoàng thể không còn yếu tố duy trì phát triển, LH tiếp tục phát triển. 2,39 0,83 2,16 0,58 0,90 1,39 0,91 1,25 0,69 0,39 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.3 Hàm lƣợng progesterone sữa bò theo nhóm máu 75% 36 Qua Bảng 4.2 và Hình 4.3 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,58 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 0,90 và 1,39 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,16 và 2,39 ng/ml. Tỷ lệ khám thai qua trực tràng là 75%, kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 cho thấy nhóm bò này có rụng trứng, thể vàng phát triển tốt. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14 và 21 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,39; 0,69; 1,25; 0,91 và 0,83 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 cho thấy nhóm bò này có rụng trứng, thể vàng hình thành và tiết progesterone, song thể vàng bị tiêu biến. Bảng 4.2 cho thấy, nếu tính trên tổng số bò khảo sát thì thấy ở bò nhóm máu 50% có tỷ lệ đậu thai là 50% cao hơn so với bò sữa nhóm máu 75% là 30%. Những kết quả trên là phù hợp với nhận định của Chung Anh Dũng (2002) khi tỷ lệ máu bò Holstein Friesian (HF) tăng lên đã làm giảm tỷ lệ thụ thai một cách rõ rệt (50% HF là 73,1%; 75% HF là 67,0% và 87,5% HF là 63,3%). Điều này chứng tỏ, khi tăng tỷ lệ máu bò HF trong nhóm bò lai thì khả năng thích nghi của nó với môi trƣờng giảm. Tuy nhiên, kết quả khảo sát tỷ lệ đậu thai của chúng tôi là rất thấp, ở nhóm máu 50% HF là 50%, 75% HF là 30%. Kết quả của chúng tôi thấp hơn kết quả của Nguyễn Thanh Linh (2006) khi tỷ lệ thụ thai ở bò nhóm máu 50% HF là 70%, nhóm máu 75% HF là 50%. 4.1.2 Hàm lƣợng progesterone sữa bò theo lứa đẻ Kết quả khảo sát hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa qua các thời điểm kiểm tra của bò theo lứa 1, 2, 3, 4 đƣợc trình bày ở Bảng 4.4 và Hình 4.4, 4.5, 4.6, 4.7. 37 Bảng 4.3 Hàm lƣợng progesterone sữa bò theo lứa đẻ Lứa Hàm lƣợng progesterone theo nhóm n Hàm lƣợng progesterone (ng/ml) của ngày Chẩn đoán mang thai 60 ngày khám qua trực tràng 0 7 14 21 24 n % 1 Cao 1 0,69 1,15 1,83 2,06 2,41 1 100 Thấp 3 0,44 0,33 0,76 0,57 1,13 0,61 1,07 0,92 1,00 0,86 0 0 2 Cao 3 0,64 0,16 0,98 0,05 1,49 0,39 2,15 0,14 2,34 0,11 2 66,66 Thấp 4 0,34 0,31 0,53 0,31 1,18 0,37 0,93 0,27 0,86 0,23 0 0 3 Cao 3 0,60 0,40 1,08 0,40 1,86 0,61 2,69 0,78 2,89 0,70 3 100 Thấp 1 0,16 0,21 0,47 0,34 0,30 0 0 4 Cao 3 0,56 0,31 1,17 0,25 1,68 0,36 2,17 0,04 2,47 0,08 2 66,66 Thấp 2 0,26 0,13 0,59 0,46 1,29 0,11 0,72 0,33 0,64 0,33 0 0 2,41 1,00 2,06 1,83 1,15 0 69 1,07 0,76 1,13 0,44 0 0,5 1 ,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.4 Hàm lƣợng progesterone sữa bò theo lứa 1 38 Qua Bảng 4.3 và Hình 4.4 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,69 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,15 và 1,83 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,06 và 2,41 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và khám thai qua trực tràng cho thấy nhóm bò này có rụng trứng, thể vàng phát triển tốt. Tỷ lệ thụ thai đạt 100%. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh là 0,44 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 0,76 và 1,13 ng/ml, sau đó giảm vào ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 1,07 và 1,00 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 cho thấy nhóm bò này có rụng trứng, thể vàng hình thành và tiết progesterone, song thể vàng bị tiêu biến. 2,34 0,86 0,64 0,98 1,49 2,15 0,34 1,18 0,53 0,93 0 0,5 1 ,5 2 2,5 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu Hà m lư ợn g p ro ge ste ro ne (n g/m l) Cao Thấp Hình 4.5 Hàm lƣợng progesterone sữa bò theo lứa 2 Qua Bảng 4.3 và Hình 4.5 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,64 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 0,98 và 1,49 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,15 và 2,34 ng/ml. Kết hợp 39 với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và khám thai qua trực tràng cho thấy nhóm bò này có rụng trứng, thể vàng phát triển tốt. Tỷ lệ thụ thai đạt 66,66%. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh là 0,34 ng/ml, tăng từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 0,53 và 1,18 ng/ml, sau đó giảm vào ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 0,93 và 0,86 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 cho thấy nhóm bò này có rụng trứng, thể vàng hình thành và tiết progesterone, song thể vàng bị tiêu biến. 2,89 0,30 0,60 1,08 1,86 2,69 0,16 0,47 0,21 0,34 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.6 Hàm lƣợng progesterone sữa bò theo lứa 3 Qua Bảng 4.3 và Hình 4.6 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,60 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,08 và 1,86 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,69 và 2,89 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và khám thai qua trực tràng cho thấy nhóm bò này có rụng trứng, thể vàng phát triển tốt. Tỷ lệ thụ thai đạt 100%. 40 Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 và 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,16; 0,21; 1,47; 0,34 và 0,30 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 cho thấy nhóm bò này buồng trứng không rụng trứng, dẫn đến không có thể vàng nên hàm lƣợng progesterone thấp. Có thể bò đã động dục nhƣng không rụng trứng. 0,64 2,47 0,56 1,17 1,68 2,17 0,26 1,29 0,59 0,72 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.7 Hàm lƣợng progesterone sữa bò theo lứa 4 Qua Bảng 4.3 và Hình 4.7 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,56 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,17 và 1,68 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,17 và 2,47 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và khám thai qua trực tràng cho thấy nhóm bò này có rụng trứng, thể vàng phát triển tốt. Tỷ lệ thụ thai đạt 66,66%. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh là 0,26 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 0,59 và 1,29 ng/ml, sau đó giảm vào ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 0,72 và 0,64 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng 41 progesterone ở ngày thứ 21 và 24 cho thấy nhóm bò này có rụng trứng, thể vàng hình thành và tiết progesterone, song thể vàng bị tiêu biến. Theo Chung Anh Dũng (2002) khi lứa đẻ gia tăng thì tỷ lệ thụ thai cũng tăng lên. Điều này do khi bò cái đẻ từ 2 lứa trở lên, bộ máy sinh sản hoạt động điều hòa giúp bò cái dễ dàng thụ thai hơn. Cavestany (2001, dẫn liệu Chung Anh Dũng, 2002) cho rằng: việc phát hiện động dục ở bò rạ đạt hiệu quả cao hơn so với bò tơ (67,8% và 33,3% tƣơng ứng). Đây là những yếu tố giúp cho phối giống đạt tỷ lệ thụ thai cao hơn ở bò rạ. Tỷ lệ thụ thai đạt mức tốt nhất ở nhóm bò đẻ lứa 5 là 80%. Tuy nhiên, khi bò cái càng lớn tuổi, khả năng sinh sản sẽ giảm dần và do đó khả năng thụ thai sẽ giảm xuống ở nhóm bò đẻ lứa thứ 6 là 62,5%. Qua kết quả khảo sát, chúng tôi thấy bò ở lứa 1 và lứa 3 có tỷ lệ đậu thai là 100%, lứa 2 và lứa 4 có tỷ lệ đậu thai là 66,66%. Kết quả này tƣơng đƣơng với kết quả của Nguyễn Thanh Linh (2006) khi chẩn đoán hàm lƣợng progesterone có thai theo lứa đẻ 1, 2, 3 và 4 lần lƣợt là 100%; 66,66%; 100% và 0%. 4.2 Hàm lƣợng progesterone trong sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu Kết quả khảo sát hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa qua các thời điểm kiểm tra của bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu đƣợc trình bày ở Bảng 4.4 và Hình 4.8. Bảng 4.4 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu Hàm lƣợng progesterone theo nhóm n Hàm lƣợng progesterone (ng/ml) của ngày Chẩn đoán mang thai 60 ngày khám qua trực tràng 0 7 14 21 24 n % Cao 10 0,46 0,20 1,39 0,34 1,82 0,47 2,34 0,46 2,61 0,46 6 60 Thấp 10 0,21 0,17 0,61 0,32 0,87 0,42 0,68 0,36 0,59 0,31 0 0 42 0,59 2,61 2,34 1,82 1,39 0,46 0,68 0,87 0,61 0,21 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.8 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu Qua Bảng 4.4 và Hình 4.8 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã cho hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,46 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,39 và 1,82 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,34 và 2,61 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và kỹ thuật khám thai qua trực tràng đã cho thấy tỷ lệ thụ thai đạt 60%. Trong lúc đó bằng kỹ thuật khám thai qua trực tràng đã cho thấy hoàng thể tồn lƣu là 4 bò chiếm tỷ lệ là 40% trong nhóm có hàm lƣợng progesterone cao. Điều này cho thấy, bò động dục có rụng trứng, đậu thai, thể vàng phát triển tốt. Trong lúc đó có 4 bò không đậu thai do hoàng thể hình thành nhƣng không tiêu biến mà vẫn còn tồn tại làm cho hàm lƣợng progesterone cao trong sữa. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã cho hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 và 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,21; 0,61; 0,87; 0,68 và 0,59 ng/ml. Kết hợp khám qua trực tràng và động thái progesterone đã cho thấy, nhóm bò này có buồng trứng không rụng trứng, dẫn đến không có thể vàng nên hàm lƣợng progesterone thấp. Trong 43 trƣờng hợp trên không rụng trứng có thể buồng trứng chƣa hoạt động trở lại hoặc bị u nang noãn, hoặc đã động dục, xuất noãn, gieo tinh, tạo hợp tử nhƣng hợp tử không phát triển do tử cung bị viêm làm hợp tử không định vị hay dinh dƣỡng kém làm hợp tử không phát triển; hoặc rối loạn kích thích tố LH làm hoàng thể không còn yếu tố duy trì phát triển, LH tiếp tục phát triển. Theo Phan Văn Kiểm và ctv (2006) khi xác định hàm lƣợng progesterone ở bò lai hƣớng sữa bằng kỹ thuật miễn dịch enzyme (ELISA) đối với trƣờng hợp bò chậm sinh có hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa cao ở bốn thời điểm lấy mẫu tƣơng ứng lần lƣợt là 1,48; 1,62; 1,58 và 1,51 ng/ml. Đối với trƣờng hợp bò có hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa thấp ở bốn thời điểm lấy mẫu lần lƣợt là 0,08; 0,1; 0,16 và 0,19 ng/ml. 4.2.1 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu 50% và 75% Kết quả khảo sát hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa qua các thời điểm kiểm tra bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu 50% và 75% đƣợc trình bày ở Bảng 4.5 và Hình 4.9, 4.10. Bảng 4.5 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu Nhóm máu Hàm lƣợng progesterone theo nhóm n Hàm lƣợng progesterone (ng/ml) của ngày Chẩn đoán mang thai 60 ngày khám qua trực tràng 0 7 14 21 24 n % 50% Cao 4 0,56 0,23 1,53 0,29 1,81 0,24 2,39 0,51 2,76 0,48 2 50 Thấp 6 0,17 0,05 0,73 0,21 1,08 0,39 0,84 0,35 0,72 0,30 0 0 75% Cao 6 0,40 0,17 1,29 0,36 1,83 0,60 2,32 0,47 2,51 0,46 4 66,66 Thấp 4 0,28 0,26 0,43 0,39 0,57 0,25 0,45 0,23 0,41 0,23 0 0 44 0,72 0,56 1,53 1,81 2,39 2,76 0,17 0,73 1,08 0,84 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.9 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu 50% Qua Bảng 4.5 và Hình 4.9 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã cho hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,56 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,53 và 1,81 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,39 và 2,76 ng/ml. Tỷ lệ thụ thai khám qua trực tràng trong nhóm bò 50% có hàm lƣợng progesterone cao đạt 50%. Kết hợp với việc xác định hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và kiểm tra thai qua trực tràng cho thấy bò động dục, có rụng trứng, thể vàng hình thành và tiết progesterone. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 v à 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,17; 0,73; 1,08; 0,84 và 0,72 ng/ml. Kết hợp với việc xác định hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và kiểm tra thai qua trực tràng cho thấy nhóm bò này có rụng trứng, thể vàng hình thành và tiết progesterone, song thể vàng bị tiêu biến. 45 0,410,40 1,29 1,83 2,32 2,51 0,28 0,43 0,57 0,45 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.10 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu 75% Qua Bảng 4.5 và Hình 4.10 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã cho hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,40 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,29 và 1,83 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,32 và 2,51 ng/ml. Tỷ lệ thụ thai khám qua trực tràng trong nhóm bò 50% có hàm lƣợng progesterone cao đạt 66,66%. Kết hợp với việc xác định hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và kiểm tra thai qua trực tràng cho thấy nhóm bò này có động dục, rụng trứng, thể vàng hình thành. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 và 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,28; 0,43; 0,57; 0,45 và 0,41 ng/ml. Kết hợp khám qua trực tràng và động thái progesterone đã cho thấy, nhóm bò này có buồng trứng không rụng trứng, dẫn đến không có thể vàng nên hàm lƣợng progesterone thấp. Trong trƣờng hợp trên không rụng trứng có thể buồng trứng chƣa hoạt động trở lại hoặc bị u nang noãn. 46 Bảng 4.5 cho thấy, nếu tính trên tổng số bò khảo sát thì thấy ở bò nhóm máu 50% có tỷ lệ đậu thai là 20% thấp hơn so với bò sữa nhóm máu 75% là 40%. Kết quả khảo sát của chúng tôi cao hơn kết quả của Nguyễn Thanh Linh (2006) khi khảo sát hàm lƣợng progesterone trong sữa để chẩn đoán mang thai ở nhóm bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu là 0%. 4.2.2 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo lứa đẻ Khảo sát hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa qua các thời điểm kiểm tra của bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo lứa 1, 2, 3, 4 đƣợc trình bày ở Bảng 4.6 và Hình 4.11, 4.12, 4.13, 4.14. Bảng 4.6 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo lứa đẻ Lứa Hàm lƣợng progesterone theo nhóm n Hàm lƣợng progesterone (ng/ml) của ngày Chẩn đoán mang thai 60 ngày khám qua trực tràng 0 7 14 21 24 n % 1 Cao 3 0,33 0,13 1,31 0,19 1,62 0,05 2,02 0,02 2,23 0,13 1 33,33 Thấp 1 0,11 0,86 0,92 0,74 0,70 0 0 2 Cao 3 0,53 0,27 1,23 0,46 1,57 0,50 2,43 0,62 2,71 0,62 1 33,33 Thấp 4 0,20 0,09 0,51 0,34 0,92 0,67 0,74 0,53 0,64 0,45 0 0 3 Cao 2 0,66 0,03 1,86 0,02 2,22 0,33 2,44 0,28 2,92 0,13 2 100 Thấp 2 0,13 0,05 0,31 0,25 0,70 0,39 0,57 0,41 0,39 0,19 0 0 4 Cao 2 0,36 0,14 1,27 0,01 2,10 0,76 2,60 0,76 2,72 0,66 2 100 Thấp 3 0,33 0,27 0,86 0,12 0,91 0,05 0,66 0,22 0,63 0,21 0 0 47 0,70 0,33 1,31 1,62 2,02 2,23 0,11 0,86 0,92 0,74 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.11 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo lứa 1 Qua Bảng 4.6 và Hình 4.11 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,33 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,31 và 1,62 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,02 và 2,23 ng/ml. Chứng tỏ bò động dục có rụng trứng, thể vàng hình thành, tỷ lệ thụ thai đạt 33,33%. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 và 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,11; 0,86; 0,92; 0,74 và 0,70 ng/ml. Kết hợp khám qua trực tràng và động thái progesterone đã cho thấy, nhóm bò này có buồng trứng không rụng trứng, dẫn đến không có thể vàng nên hàm lƣợng progesterone thấp. Trong trƣờng hợp trên không rụng trứng có thể buồng trứng chƣa hoạt động trở lại hoặc bị u nang noãn. 48 0,640,53 1,23 1,57 2,43 2,71 0,20 0,51 0,92 0,74 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g p ro ge ste ro ne (n g/m l) Cao Thấp Hình 4.12 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo lứa 2 Qua Bảng 4.6 và Hình 4.12 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,53 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,23 và 1,57 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,43 và 2,71 ng/ml. Chứng tỏ bò động dục có rụng trứng, thể vàng hình thành, tỷ lệ thụ thai đạt 33,33%. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 và 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,20; 0,51; 0,92; 0,74 và 0,64 ng/ml. Kết hợp khám qua trực tràng và động thái progesterone đã cho thấy, nhóm bò này có buồng trứng không rụng trứng, dẫn đến không có thể vàng nên hàm lƣợng progesterone thấp. Trong trƣờng hợp trên không rụng trứng có thể buồng trứng chƣa hoạt động trở lại hoặc bị u nang noãn. 49 0,39 0,66 1,86 2,22 2,44 2,92 0,13 0,31 0,70 0,57 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu Hà m lư ợn g p ro ge ste ro ne (n g/m l) Cao Thấp Hình 4.13 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo lứa 3 Qua Bảng 4.6 và Hình 4.13 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,66 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,86 và 2,22 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,44 và 2,92 ng/ml là 2,17 ng/ml. Chứng tỏ bò động dục có rụng trứng, thể vàng hình thành, tỷ lệ thụ thai đạt 100%. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 và 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,13; 0,31; 0,70; 0,57 và 0,39 ng/ml. Kết hợp khám qua trực tràng và động thái progesterone đã cho thấy, nhóm bò này có buồng trứng không rụng trứng, dẫn đến không có thể vàng nên hàm lƣợng progesterone thấp. Trong trƣờng hợp trên không rụng trứng có thể buồng trứng chƣa hoạt động trở lại hoặc bị u nang noãn. 50 0,63 0,36 1,27 2,10 2,60 2,72 0,33 0,86 0,91 0,66 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.14 Hàm lƣợng progesterone sữa bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo lứa 4 Qua Bảng 4.6 và Hình 4.14 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,36 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,27 và 2,10 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,60 và 2,72 ng/ml. Chứng tỏ bò động dục có rụng trứng, thể vàng hình thành, tỷ lệ thụ thai đạt 100%. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 và 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,33; 0,86; 0,91; 0,66 và 0,63 ng/ml. Kết hợp khám qua trực tràng và động thái progesterone đã cho thấy, nhóm bò này có buồng trứng không rụng trứng, dẫn đến không có thể vàng nên hàm lƣợng progesterone thấp. Trong trƣờng hợp trên không rụng trứng có thể buồng trứng chƣa hoạt động trở lại hoặc bị u nang noãn. Theo Chung Anh Dũng (2002) khi lứa đẻ gia tăng thì tỷ lệ thụ thai cũng tăng lên. Điều này do khi bò cái đẻ từ 2 lứa trở lên, bộ máy sinh sản hoạt động điều hòa giúp bò cái dễ dàng thụ thai hơn. Cavestany (2001, dẫn liệu Chung Anh Dũng, 2002) cho rằng: việc phát hiện động dục ở bò rạ đạt hiệu quả cao hơn so với bò tơ 51 (67,8% và 33,3%, tƣơng ứng). Đây là những yếu tố giúp cho phối giống đạt tỷ lệ thụ thai cao hơn ở bò rạ. Tỷ lệ thụ thai đạt mức tốt nhất ở nhóm bò đẻ lứa 5 là 80%. Tuy nhiên, khi bò cái càng lớn tuổi, khả năng sinh sản sẽ giảm dần và do đó khả năng thụ thai sẽ giảm xuống ở nhóm bò đẻ lứa thứ 6 là 62,5%. Kết quả khảo sát của chúng tôi phù hợp với nhận định này khi lứa đẻ gia tăng thì tỷ lệ thụ thai cũng tăng lên. Tỷ lệ thụ thai của lứa 1, 2, 3 và 4 lần lƣợt là 33,33%; 33,33%; 100% và 100%. Từ những kết quả khảo sát và so sánh với các kết quả kiểm tra của nhiều tác giả trƣớc đó, chúng tôi có thể kết luận kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang ELISA đã xác định hàm lƣợng progesterone sữa có độ chính xác cao giúp tìm hiểu động thái progesterone của thú đồng thời còn giúp chẩn đoán mang thai sớm, chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu, buồng trứng kém phát triển, tồn hoàng thể…để từ đó đề ra khuynh hƣớng điều trị chính xác nhằm hạn chế tình trạng kém sinh sản. 52 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian thực hiện đề tài khảo sát hàm lƣợng progesterone trong sữa bằng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán mang thai sớm, chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu trên bò cho sữa tại Công ty Cổ Phần bò sữa Long Thành và các hộ lân cận tỉnh Đồng Nai, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: Kỹ thuật ELISA xét nghiệm hàm lƣợng progesterone sữa đã đánh giá chính xác tình trạng sinh sản trên bò sữa không và có mang thai. Kỹ thuật đã giúp xác định chính xác các bò không mang thai ở ngày 21 sau khi phối, trong lúc đó kỹ thuật chỉ xác định hàm lƣợng progesterone cao trong sữa đối với bò mang thai hoặc tồn hoàng thể. Do đó muốn biết đƣợc bò tồn hoàng thể phải kiểm tra thai qua trực tràng 60 ngày sau đó. Kết luận lại, kỹ thuật ELISA là công cụ tốt cho quá trình chẩn đoán bò mang thai sớm, chậm lên giống hoặc phối nhiều lần không đậu. Hàm lƣợng progesterone sữa diễn biến nhƣ sau:  Bò sinh sản bình thƣờng Hàm lƣợng progesterone trong sữa trung bình theo nhóm cao của bò ở ngày gieo tinh là 0,61 ng/ml tăng lên 2,31 ng/ml vào ngày thứ 21. Chẩn đoán mang thai 60 ngày khám qua trực tràng đạt 80%; 20% bò bị tồn hoàng thể. Hàm lƣợng progesterone trong sữa trung bình theo nhóm thấp của bò ở ngày gieo tinh là 0,34 ng/ml, tăng từ ngày 7 đến ngày 14 lần lƣợt là 0,58 và 1,12 ng/ml; sau đó giảm xuống vào ngày thứ 21 là 0,87 ng/ml. Hàm lƣợng progesterone trong sữa trung bình theo nhóm cao lứa đẻ dao động từ 0,56 ng/ml đến 2,89 ng/ml và theo nhóm máu dao động từ 0,58 ng/ml đến 2,66 ng/ml. 53 Hàm lƣợng progesterone trong sữa trung bình theo nhóm thấp lứa đẻ dao động từ 0,16 ng/ml đến 1,00 ng/ml và theo nhóm máu dao động từ 0,16 ng/ml đến 1,29 ng/ml.  Bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu Hàm lƣợng progesterone trong sữa trung bình theo nhóm cao của bò ở ngày gieo tinh là 0,46 ng/ml tăng lên 2,34 ng/ml vào ngày thứ 21. Chẩn đoán mang thai 60 ngày khám qua trực tràng đạt 60%; 40% bị tồn hoàng thể. Hàm lƣợng progesterone trong sữa trung bình theo nhóm thấp của bò ở ngày gieo tinh là 0,21 ng/ml, tăng từ ngày 7 đến ngày 14 lần lƣợt là 0,61 và 0,87 ng/ml; sau đó giảm xuống vào ngày thứ 21 là 0,68 ng/ml. Bò có buồng trứng chƣa hoạt động trở lại hoặc bị u nang noãn. Hàm lƣợng progesterone trong sữa trung bình theo nhóm cao lứa đẻ dao động từ 0,33 ng/ml đến 2,92 ng/ml và theo nhóm máu dao động từ 0,40 ng/ml đến 2,76 ng/ml. Hàm lƣợng progesterone trong sữa trung bình theo nhóm thấp lứa đẻ dao động từ 0,11 ng/ml đến 0,92 ng/ml và theo nhóm máu dao động từ 0,17 ng/ml đến 1,08 ng/ml. 5.2 Đề nghị Khuyến cáo ngƣời chăn nuôi lấy mẫu sữa kiểm tra hàm lƣợng progesterone 21 ngày và khám thai qua trực tràng ở ngày 60 sau khi phối nhằm chẩn đoán bò mang thai sớm, chậm lên giống hoặc phối nhiều lần không đậu. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Xuân Cƣơng, 1990. Báo cáo kết quả điều tra cơ bản bò sữa TP.HCM. Chƣơng trình hợp tác nghiên cứu giữa: Viện KHKTNNMN, Công ty trâu bò sữa, thịt miền Nam, Công ty bò sữa TP.HCM và Chi cục thú y TP.HCM. 2. Lê Xuân Cƣơng, Lƣu Văn Tân, Chung Anh Dũng, Trần Tích Cảnh, Nguyễn Duy Hạng, Cao Văn Triều, 1990. Kết quả ứng dụng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ để định lượng progesterone nhằm chẩn đoán sớm có thai ở trâu bò. Việt Nam. 3. Chung Anh Dũng, 2002. Sử dụng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ và một số biện pháp kỹ thuật để nâng cao hiệu quả gieo tinh nhân tạo của bò lai hướng sữa. Luận án Tiến Sĩ Nông Nghiệp. Viện Khoa Học Nông Nghiệp Miền Nam. 4. Chung Anh Dũng, 2002. Nghiên cứu động thái progesterone bằng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán chậm động dục heo hậu bị và biện pháp can thiệp bằng kích thích tố. Luận án Tiến Sĩ Nông Nghiệp. Viện Khoa Học Nông Nghiệp Miền Nam TP. HCM. 5. Nguyễn Văn Dũng, 2005. Điều tra tỷ lệ nhiễm và phân tích một số yếu tố liên quan đối với bệnh do Mycobacterium Bovis, Leptospira và Brucella trên bò sữa tại TP.HCM. Luận án Thạc Sĩ Khoa Học Nông Nghiệp. 6. Lê Đăng Đảnh, 1996. Nghiên cứu tính năng sản xuất sữa bò lai 1/2, 3/4 và 7/8 máu Holstein Friesian và ảnh hưởng của một số biện pháp chăm sóc nuôi dưỡng đến năng suất của chúng. Luận án Phó Tiến sĩ KHNN. 7. Hoàng Kim Giao, 1997. Công nghệ sinh sản trong chăn nuôi bò. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 8. Nguyễn Ngọc Khánh, 2004. Khảo sát số bò sữa có vấn đề về sinh sản sau khi sinh và biện pháp can thiệp bằng CUE – MATA kết hợp PGF2 , Estradiol tại huyện Củ Chi, TP.HCM. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 9. Phan Văn Kiểm, Đào Đức Thà, Trịnh Quang Phong, Đỗ Hữu Hoan, Nguyễn Thị Hoa, Vũ Ngọc Hiệu, Nguyễn Quý Quỳnh Hoa, 2006. Xác định hàm lượng 55 progesterone ở bò lai hướng sữa bằng kỹ thuật miễn dịch enzyme (ELISA). Tạp chí chăn nuôi 2006. 10. Nguyễn Thanh Linh, 2006. Khảo sát hàm lượng progesterone trong sữa bò bằng kỹ thuật EIA tại Công ty cổ phần bò sữa Đồng Nai. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. 11. Vƣơng Ngọc Long, 2002. Tài liệu tập huấn chăn nuôi bò sữa, hội thi triển lãm giống bò sữa TP.HCM lần II, 2003. 12. Ngô Phƣơng Nghị, 2003. Chẩn đoán Actino Bacillus pleuropneumoniae dựa trên bệnh tích của phổi, kỹ thuật ELISA và nuôi cấy phân lập. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 13. Nguyễn Hữu Ninh và Bạch Đăng Phong, 1994. Bệnh sản khoa gia súc. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 14. Cao Thanh Phú, 2003. Khảo sát động thái progesterone bằng kỹ thuật P – ELISA để ứng dụng chẩn đoán chậm động dục trên bò cái cho sữa. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 15. Nguyễn Minh Thanh, 2005. Khảo sát động thái progesterone bằng kỹ thuật P – ELISA và ứng dụng chẩn đoán chậm động dục trên bò cái cho sữa. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. 16. Nguyễn Văn Thành, 2002. Giáo trình sản khoa. Tủ sách Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 17. Nguyễn Văn Tìm, Lê Xuân Cƣơng, Trịnh Công Thành, 1999. Xây dựng hệ thống quản lý giống bò sữa tại TP.HCM theo quy trình công nghệ tiên tiến để nâng cao phẩm chất giống bò sữa. Chƣơng trình hợp tác nghiên cứu giữa: Sở NN&PTNT TP.HCM, Trung tâm ABC, Đại học Nông Lâm TP.HCM. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 18. Cavestany D., Juanbeltz R., Canclini E., Elhordoy D., Tagle R., Lanzzeri S., Gama S., Martinez E., 2001. “Evaluation of a seasonal-breeding artificial insemination program in Uruguay using milk progesterone radio immunoassay”, Radio immunoassay and related techniques to improve artificial insemination programmes for cattle reared under tropical and sub-tropical conditions, Proceeding of IAEA final research co-ordination meeting in Uppsala, Sweden, FAO-IAEA, pp. 129-146. 56 19. Henshow T.S., D.V.M., 1990. “Reproductive Herd Health” pp. 83-93, and “The estrus cycle of the cow” pp. 31 – 34, Bovine Artificial Insemination Technical Manual, CAAB, First Edition, Canada. 20. Navy M.J. and Cook M.J., 1978. Redistribution of blood flow by PGF2 in the ovary. Am. J. Obst. Gynecol. 117, pp. 381 – 385. 21. Mugerwa E. M., 1989. A review of reproductive performance of female Bos Indicus (Zebu) cattle. International Livestock Centre for Africa. ILCA Monograph No 6. 22. Nakao T; Sugihashi A; Tosa E, 1982. An of milk P4 – EIA for early pregnancy diagnosis in cows. Pages 267 – 272. Tạp chí chăn nuôi 5/2006. 23. Homeida et al, 2002. Progesterone levels in skim milk in cow with conceived and not conceived v/ after Al. Hiroshima University. Journal. Tạp chí chăn nuôi 5/2006. 24. Kamonpatana M; Srisakwattana K; Sophon S, 1988. Pregnancy diagnosis from milk sample. ChualalongKorn University Press. Pages 73 – 126. Thailand. Tạp chí chăn nuôi 5/2006. 57 PHỤ LỤC 1: HÀM LƢỢNG PROGESTERONE SỮA BÕ SINH SẢN BÌNH THƢỜNG Nhóm máu Lứa đẻ Ngày 0 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21 Ngày 24 Tình hình đậu thai 75% 3 0,73 0,85 1,48 2,14 2,34 Có thai 50% 2 0,12 0,43 1,34 0,91 0,85 50% 1 0,53 0,91 1,43 1,92 1,78 75% 2 0,81 0,97 1,26 2,05 2,26 50% 4 0,28 1,14 1,86 2,14 2,28 Có thai 50% 3 0,92 1,55 2,57 3,58 3,67 Có thai 75% 2 0,62 0,93 1,27 2,08 2,30 Có thai 75% 2 0,12 0,46 0,67 0,56 0,55 75% 4 0,35 0,91 1,37 0,95 0,87 50% 1 0,08 0,13 0,42 0,09 0,08 50% 1 0,69 1,15 1,83 2,06 2,41 Có thai 75% 4 0,17 0,26 1,21 0,48 0,40 75% 3 0,16 0,85 1,54 2,35 2,65 Có thai 50% 2 0,49 1,03 1,94 2,31 2,46 Có thai 75% 2 0,11 0,26 1,52 1,17 1,09 75% 2 0,8 0,97 1,2 1,09 0,96 50% 3 0,16 0,21 0,47 0,34 0,30 50% 4 0,89 1,43 1,92 2,21 2,54 Có thai 50% 4 0,52 0,93 1,26 2,17 2,49 75% 1 0,72 1,25 1,53 1,19 1,13 58 PHỤ LỤC 2: HÀM LƢỢNG PROGESTERONE SỮA BÕ CHẬM ĐỘNG DỤC HOẶC PHỐI NHIỀU LẦN KHÔNG ĐẬU Nhóm máu Lứa đẻ Ngày 0 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21 Ngày 24 Tình hình đậu thai 75% 4 0,64 0,96 0,86 0,74 0,71 75% 2 0,48 0,76 1,04 2,01 2,29 75% 1 0,22 1,12 1,68 2,04 2,16 Có thai 50% 2 0,82 1,68 2,04 3,14 3,42 Có thai 75% 2 0,09 0,48 0,67 0,53 0,45 75% 4 0,26 1,26 2,64 3,13 3,19 Có thai 75% 1 0,31 1,49 1,6 2,01 2,15 50% 2 0,29 1,26 1,64 2,15 2,43 50% 2 0,21 0,96 1,86 1,48 1,27 50% 4 0,12 0,9 0,96 0,42 0,39 50% 1 0,11 0,86 0,92 0,74 0,70 75% 3 0,09 0,13 0,42 0,28 0,25 50% 3 0,16 0,48 0,97 0,86 0,52 75% 3 0,68 1,84 2,45 2,64 3,01 Có thai 75% 2 0,31 0,13 0,31 0,24 0,21 50% 2 0,18 0,48 0,82 0,71 0,64 75% 4 0,46 1,28 1,56 2,06 2,25 Có thai 50% 1 0,47 1,31 1,58 2,02 2,38 50% 4 0,23 0,72 0,92 0,83 0,79 50% 3 0,64 1,87 1,99 2,24 2,82 Có thai