Khóa luận Khảo sát khả năng sinh axít lactic và tính kháng của Lactobacillus acidophilus đối với vi khuẩn E. coli dùng để sản xuất chế phẩm probiotic

ân axít lactic L (+) axít lactic: được chuyển hoá hoàn toàn và nhanh chóng trong quá trình tổng hợp glycogen. D (-) axít lactic: được chuyển hoá ít hơn và phần không chuyển hoá sẽ được bài tiết dưới dạng urine. Sự hiện diện của axít không được chuyển hoá trong ống tiêu hoá sẽ gây tình trạng nhiễm axít trong trao đổi chất ở trẻ sơ sinh. Ngoài ra, axít lactic còn làm hạ pH đường ruột còn 4 – 5. Do đó, sự phát triển của vi sinh vật gây thối và E. coli (thích nghi ở pH 6 – 7) bị ức chế. Sản xuất bacteriocin và các cơ chất kháng khuẩn Bacteriocin là protein hay hợp chất protein do vi khuẩn sản xuất có hoạt tính diệt khuẩn trực tiếp. Cơ chất này giúp vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hoạt tính ức chế đối với các vi sinh vật gây thối trong hệ tiêu hoá. CH3 D (-) axít lactic CCCH3 - - - 7 - Bảng 2.1 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus Tên bacteriocin Loài sản xuất Acidolin Acidophilin Lactacin B Lactacin F Bulgarin Plantaricin A Lactolin Plantaricin B Lactolin 27 Helveticin J Reuterin Lactobrevin Lactobacillin L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. bulgaricus L. plantarum L. plantarum L. plantarum L. plantarum L. herveticus L. reuteri L. brevis L. brevis Vi khuẩn Lactobacillus còn có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây thối nhờ vào những sản phẩm trao đổi chất khác như: H2O2, CO2 và diacetyl (Trần Hạnh Triết, 2005). 2.2.3 Ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. Trong chăn nuôi thú y Lactobacillus có hiệu quả trong phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ. Nhờ vào sự giảm nồng độ NH3 và hạn - - - 8 - chế vi sinh vật gây thối nhiễm vào đường ruột, Lactobacillus có hiệu quả kích thích tăng trưởng ở thú nuôi. Ngoài ra, người ta còn dùng Lactobacterium casei và Lactobacterium plantarium để ủ rơm, rau, cỏ cho gia súc ăn. Trong quá trình lên men vi khuẩn lactic sản sinh ra một số sản phẩm có giá trị như vitamin, chất thơm, kháng sinh làm cho thức ăn gia súc ủ chua có giá trị dinh dưỡng cao làm tăng năng suất vật nuôi. Trong y học - Về mặt trị liệu: Nhờ vào khả năng sản xuất axít lactic và bacteriocin trong đường ruột, Lactobacillus cải thiện được tình trạng tiêu chảy, tăng nhu động ruột, chữa được chứng táo bón. Lactobacillus duy trì pH âm đạo khoảng 4 – 4,5 nhờ vào hoạt động lên men glycogen thành axít lactic. Môi trường này không thích hợp cho mầm bệnh phát triển như Trichomoncisvaginaleic (protozoa k‎í sinh) và Candida albicans (nấm men)... Trong nha khoa có hai chế phẩm được sử dụng nhiều là Puramex và Puracal. Puramex gồm có: almulinium lactat, Fe-lactat (được sử dụng để điều trị bệnh thiếu máu), Mg-lactat, Zn-lactat. Còn Purical chỉ có lactat canxi. Các chế phẩm này thường làm cho răng khoẻ hơn. Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị những rối loạn và viêm nhiễm bao gồm: viêm ruột kết, đầy hơi, ung bướu, làm hạ cholesterol trong máu, đau đầu, viêm âm đạo không điển hình và cải thiện được tình trạng không sử dụng được lactose. - Về mặt dinh dưỡng: Bổ sung lactat canxi vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh nướng hay bánh ngọt để tăng hàm lượng canxi cho cơ thể. Thiếu canxi ảnh hưởng đến hoạt động cơ tim, sự tạo huyết và đông máu, là nguyên nhân gây còi xương ở trẻ em và giòn xương xốp ở người già. - - - 9 - Trong công nghiệp Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu axít lactic. Có vị chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt. Chúng được dùng để axít hóa rượu vang và hoa quả nghèo axít, ngoài ra còn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo. Trong nông nghiệp và môi trƣờng Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium- loại nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu đi và đây là cơ hội gây bệnh cho cây trồng. Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu, nó bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm Trong bảo quản và chế biến thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng để làm dưa chua, làm chua quả mà không làm mất màu tự nhiên của quả. Dùng sản xuất tương, đậu phụ hay lên men sữa chua (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005). 2.3 Sơ lƣợc về Lactobacillus acidophilus 2.3.1 Đặc điểm và phân loại Giới : Bacteria Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Lactobacillaceae Giống : Lactobacillus Loài : Lactobacillus acidophilus ( Moro, 1900 ; Hansen và Mocquoc, 1970) ( - - - 10 - Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. Ông đã mô tả được các đặc điểm trao đổi chất, phân loại cũng như chức năng của vi khuẩn này. Lactobacillus acidophilus là một trong những vi khuẩn phổ biến thuộc giống Lactobacillus. Ở một vài quốc gia, nó được sử dụng thương mại cùng với Streptococcus salivarius và Lactobacillus delbrueckii spp. Bulgaricus trong sản xuất yaourt. Tuy nhiên không phải tất cả các chủng vi khuẩn L. acidophilus đều có tác dụng chữa trị, do đó người ta chỉ chọn những chủng có tác dụng tốt để sản xuất ra các chế phẩm vi sinh probiotic mà thành phần thường chỉ có vi khuẩn L. acidophilus hay phối hợp chung với vi khuẩn khác như Bacillus subtilis, Echerichia coli...hoặc nấm men Saccharomyces boulardii... (Nguyễn Vĩnh Phước, 1976). L. acidophilus có ở ruột người và động vật, miệng, âm đạo. L. acidophilus lên men lactose thành axít lactic. Giống như nhiều loài vi khuẩn, L. acidophilus có thể bị chết ở nhiệt độ cao, ẩm độ cao, hoặc ánh sáng trực tiếp. Trong tự nhiên, vi khuẩn L. acidophilus thường có trong đường ruột, trong phân và sữa của hầu hết các loài động vật có vú và động vật không xương sống khác. 2.3.2 Đặc tính nuôi cấy Theo tài liệu Tô Minh châu (2000): Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus thường có đặc tính vi hiếu khí khi vừa mới phân lập. Vi khuẩn phát triển tốt ở 37 – 40ºC (không phát triển hay phát triển rất yếu ở nhiệt độ thấp hơn 20ºC), không sinh sắc tố hay độc tố, pH thích hợp là 5,5 – 6 (có thể phát triển ở pH ≤ 5). Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường có glucose, nước chiết nấm men. Vi khuẩn cũng có thể mọc được trong môi trường có 2% muối NaCl (không mọc trong môi trường có 4% NaCl) hay có 2% muối mật. Trên môi trường thạch MRSA có chứa 2% glucose thì vi khuẩn phát triển tốt. Sau 48 giờ nuôi cấy ở 37ºC xuất hiện những khuẩn lạc nhỏ, hình cầu rìa dẹt, đều, - - - 11 - đường kính khoảng 0,25 mm. Sau 72 – 96 giờ khuẩn lạc khoảng 1 mm, có màu vàng nhạt, ở chính giữa có tâm sậm màu. Trong môi trường canh dinh dưỡng MRSB, sau 48 giờ ủ ở 37ºC, vi khuẩn phát triển rất tốt. Môi trường trở nên đục, có cặn lắng ở đáy, đôi khi thấy bám vào thành ống nghiệm. Vi khuẩn không phát triển được trên môi trường khoai tây. Trên môi trường bổ sung gelatin: không hoá lỏng gelatin ở 20ºC do men phân giải lipid và protic yếu. Trong môi trường sữa: vi khuẩn làm đông vón sữa thành khối, không lợn cợn, lên men lactose sinh axít lactic dạng D – L hay dạng L. Sức đề kháng: vi khuẩn Lactobacillus acidophilus không có sức đề kháng đặc biệt. Vi khuẩn dễ dàng bị tiêu diệt trong hơi nước nóng 56ºC trong 30 phút. Nhưng vi khuẩn có sức đề kháng mạnh với axít nên chúng có thể sống trong môi trường canh có chứa 0,5 – 1% axít lactic hay axít acetic trong khoảng 1 – 3 tuần. Trong môi trường canh bổ sung 2% glucose ở 37ºC vi khuẩn có thể sống được 15 ngày. L. acidophilus có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật tinh khiết, 8 ngày trong dịch tràng. 2.3.3 Đặc tính sinh hoá 2.3.3.1 Phản ứng lên men đƣờng của Lactobacillus acidophilus Thông thường vi khuẩn có enzyme phân giải một số loại đường và tạo ra các axít hữu cơ làm giảm pH của môi trường, ngoài ra còn có thể tạo ra các chất khí như H2 và CO2. - - - 12 - Bảng 2.2 Các phản ứng lên men đƣờng của Lactobacillus acidophilus Loại đường Lên men sinh axít Sinh hơi Arabinose _ _ Dextrin _ Glucose + _ Lactose + _ Maltose + _ Mannitol _ _ Sacharose + _ Salicin + _ Raffinose _ Xylose _ _ 2.3.3.2 Các phản ứng sinh hoá khác Bảng 2.3 Phản ứng sinh hoá của Lactobacillus acidophilus Phản ứng sinh hoá khác Kết quả Sinh indol _ MR + VP _ Citrat _ Arginin _ Nitrat _ Gelatin _ Di động _ Đông vón sữa + Catalase _ - - - 13 - 2.3.4 Lợi ích sức khoẻ Một vài dòng của L. acidophilus có thể được sử dụng làm probiotic hoặc vi khuẩn “thân thiện”. Những vi khuẩn có lợi cho sức khoẻ này sống ở ruột và âm đạo, có khả năng chống lại một vài loài vi sinh vật có hại cho sức khoẻ. L. acidophilus sản xuất axít lactic, hydrogen peroxide và những sản phẩm khác chống lại vi sinh vật có hại. Trong quá trình lên men, L. acidophilus sản xuất niacin, axít folic và pyridoxine. Một vài nghiên cứu đã được báo cáo là L. acidophilus có lợi cho sức khoẻ, bao gồm cải thiện chức năng dạ dày và bệnh tiêu chảy. Nghiên cứu của đại học Nebraska dùng L. acidophilus bổ sung vào thức ăn và cho gia súc ăn, kết quả là làm giảm 61% Escherichia coli 0157:H7. Một báo cáo khác, L. acidophilus có thể làm giảm cholesterol trong máu. L. acidophilus là phần của hệ vi sinh vật ở âm đạo. Axít lactic được sản xuất bởi L. acidophilus ở âm đạo hạn chế sự phát triển của nấm Candida albicans, giúp ngăn cản sự xâm nhập của những nấm khác vào âm đạo. Chất diệt tinh trùng và ngừa thai có thể làm chết L. acidophilus ở âm đạo. Sau một khoá điều trị bằng kháng sinh, bệnh nhân thường được cung cấp thêm L. acidophilus để ổn định lại hệ tiêu hoá. Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn quan trọng trong lên men thực phẩm, từ sản phẩm sữa đến trái cây và rau quả. ( L. acidophilus sản xuất axít lactic và các chất diệt khuẩn như lactocidin, ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự tăng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, giúp cho cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột. L. acidophilus đóng vai trò sinh lí quan trọng nhờ tổng hợp các vitamin. L. acidophilus có khả năng bền vững với 40 loại kháng sinh. ( - - - 14 - 2.3.5 Tính chất đối kháng của Lactobacillus acidophilus Những nghiên cứu của đại học Nebraska chỉ ra rằng việc chọn những dòng Lactobacillus acidophilus, một vi khuẩn phổ biến được sử dụng trong lên men sữa chua, được thêm vào làm probiotic để làm giảm vi khuẩn E. coli O157:H7. Kết quả thí nghiệm Lactobacillus làm giảm 80% E. coli O157:H7 trong hệ tiêu hoá của gia súc. Chiến lược phát triển của các nhà khoa học tại đại học Nabraska là làm giảm số lượng E. coli ở gia súc trước khi đem giết mổ. Việc sử dụng Lactobacillus làm probiotic chứa những hứa hẹn to lớn trong việc kiểm soát sự phát triển của E. coli ( Một nghiên cứu khác tại đại học Texas cho thấy việc phân lập những vi khuẩn có trong sữa chua, phô mai, thịt lên men làm probiotic giúp bò chống lại E. coli O157:H7. Việc trộn Lactobacillus acidophilus vào thức ăn giúp chống lại trên 60% vi khuẩn E. coli ở gia súc, giảm tác hại của Salmonela. ( Hoạt động đối kháng bởi vi khuẩn lactic có liên quan chặt chẽ với sản phẩm cuối của quá trình trao đổi chất. Hàng loạt các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất do Lactobacillus có khả năng có hoạt động đối kháng (trong phòng thí nghiệm). Các sản phẩm phụ được biết tới nhiều nhất là các axít hữu cơ như axít lactic, axít acetic và hydroperoxid. Các axít lactic, axít acetic ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh Gram âm. Hoạt động của các axít này phụ thuộc vào pH. Nếu độ pH thấp sẽ tăng mức độ axít ở dạng không hòa tan. Tuy nhiên có nhiều yếu tố cần phải lưu ý nếu muốn nhận được kết quả tốt khi sử dụng probiotic. Trong đa số các trường hợp cần phải biết chắc chắn rằng các vi sinh vật cần phải sống sót và phát triển trong đường ruột phải có khả năng sống trong môi trường pH thấp và có khả năng chống lại tác dụng của mật. Để sống được trong đường ruột, các chủng vi sinh vật cần có khả năng đính vào và sinh sôi nảy nở ở trên bề mặt của ruột non. Mặc dù một vài tác giả đưa ra một số cơ chế giải thích tại sao vi sinh vật có lợi trong đường ruột có thể ức chế sự xâm nhập của vi sinh vật có hại nhưng cơ chế chính xác của sự loại trừ cạnh tranh của vi sinh vật gây bệnh bằng - - 15 probiotic vẫn chưa được khẳng định. Trong số các cơ chế này có sự cạnh tranh về vị trí, cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh về khối lượng các chất sinh ra bởi vi sinh vật (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005). 2.3.6 Một số chế phẩm đƣợc sản xuất từ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Hiện nay có nhiều dược phẩm được bào chế từ các chủng vi sinh vật sống hoặc chết, hoặc chất chuyển hoá của chúng, dịch cấy vi khuẩn, nấm men…được trình bày dưới nhiều dạng khác nhau: viên nén, viên bọc đường, ống nước, đông khô. Chế phẩm từ vi khuẩn sống: - Một loại vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus: có Bacid, Dofus (Mỹ); Antibioplus, Proflor, Vivacidol (Pháp); Antibio granules (Hàn Quốc). - Hai loại vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus: có Lactines (Mỹ). Lactobacillus acidophilus, Escherichia coli: có Coliphilus (Mỹ). - Ba loại vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactic: có Biolactyl (Pháp). Lactobacillus acidophilus, Streptococcus feacalis, Bacillus subtilis: có Biofermin (Nhật). (Tô Minh Châu, 2000) - - 16 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1 Thời gian Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 7/2007 3.1.2 Địa điểm Tại phòng Vi sinh , khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. 3.2 Vật liệu thí nghiệm 3.2.1 Mẫu khảo sát Chế phẩm sinh học Antibio do Hàn Quốc sản xuất: 3 mẫu. Sữa chua Vinamilk: 5 mẫu. 3.2.2 Môi trƣờng Môi trường canh tăng sinh chọn lọc MRSB. Môi trường phân lập MRSA. Môi trường nuôi cấy và thử sinh hoá. Môi trường giữ giống: môi trường MRSA, môi trường MRSB, môi trường sữa tươi tiệt trùng. 3.2.3 Hoá chất Thuốc nhuộm Gram. Thuốc thử Kowac’s; Methyl Red; NaOH 40%; H2O2 30%... 3.2.4 Thiết bị và dụng cụ Thiết bị: Kính hiển vi, tủ ấm, tủ lạnh, cân điện tử, tủ sấy, nồi hấp cao áp autolave… - - 17 Dụng cụ: Giá đỡ ống nghiệm, ống nghiệm, đèn cồn, đĩa petri, pipette, đầu típ vô trùng, đũa thuỷ tinh, ống Durham… 3.3 Nội dung đề tài Đề tài được thực hiện với các nội dung lần lượt như sau: - Phân lập và định danh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. - Khảo sát khả năng sinh axít lactic của các chủng phân lập được. - Khảo sát khả năng sinh axít lactic của các chủng phân lập được sau khi bổ sung saccharose vào môi trường sữa tươi. - Tìm hiểu tính kháng của Lactobacillus acidophilus đối với vi khuẩn E. coli. 3.4 Phƣơng pháp thực hiện 3.4.1 Phân lập và định danh Lactobacillus acidophilus 3.4.1.1 Lấy mẫu Mẫu Antibio do Hàn Quốc sản xuất và sữa chua Vinamilk được mua ở các cửa hàng trong khu vực Thủ Đức. 3.4.1.2 Phân lập Mẫu Pha loãng với NaCl 9‰ Môi trường MRSA, ủ 370C/48-72 giờ Chọn khuẩn lạc đặc trưng Nhuộm Gram Thử các phản ứng sinh hoá Môi trường MRSB, ủ 370C/24 giờ Môi trường sữa để giữ giống Sơ đồ 3.3 Quy trình phân lập Lactobacillus acidophilus Cách thực hiện Cho 1g chế phẩm Antibio (hay 1 ml sữa chua Vinamilk) vào ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh l‎í vô trùng, pha loãng mẫu để đạt được nồng độ là 10-6. - - 18 Sau khi pha loãng, dùng micropipette với đầu típ vô trùng hút 0,2 ml dịch khuẩn ở các nồng độ 10-6, 10-5 và 10-4 đã được pha loãng cho vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ hút vào 2 đĩa). Tiếp theo đổ môi trường MRSA đã được hấp khử trùng vào các đĩa petri trên. Sau đó để các đĩa vào tủ ấm ở 37ºC trong 48 - 72 giờ. Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch MRSA có CaCO3 nuôi cấy 37ºC trong 48 giờ. Sau thời gian 48 - 72 giờ để trong tủ ấm ở 37ºC: khuẩn lạc tròn, màu vàng nhạt, có vòng sáng phân giải CaCO3. Quan sát đặc điểm hình thái của tế bào vi khuẩn trên môi trường canh MRSB, nuôi cấy ở 37ºC/24 giờ. Sau khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng, dùng que cấy vòng lấy một khuẩn lạc cho vào môi trường canh MRSB có chất chỉ thị bromocresol. Sau 24 giờ quan sát sự đổi màu của môi trường MRSB. Tiến hành nhuộm Gram xem hình thái chung của vi khuẩn : vi khuẩn hình que đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, bắt màu tím (Gram dương). 3.4.1.3 Khảo sát các phản ứng sinh hoá 1. Khả năng lên men các loại đường 2. Phản ứng methyl – red 3. Phản ứng Voges-Proskauer 4. Khả năng sử dụng citrat 5. Khả năng khử nitrat 6. Khả năng tạo indol 7. Phản ứng catalase (Xem phần phụ lục) 3.4.2 Khảo sát khả năng sinh axít lactic của Lactobacillus acidophilus Xác định độ chua Therner : Sau khi cấy giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus vào môi trường sữa vô trùng (với tỷ lệ 10% thể tích môi trường), để yên và ủ 37ºC/24 giờ. Sau đó lấy - - 19 10 ml môi trường sữa đã nuôi cấy vi khuẩn + 90 ml nước muối sinh lí + 2-3 giọt phenolphthalein cho vào bình tam giác 250 ml rồi lắc đều. Dùng burret chuẩn độ NaOH 0,1N cần thiết dùng để chuẩn độ 100 ml sữa. Công thức tính độ chua Therner: T = (n x 100)/V Công thức tính hàm lượng axít lactic trong 100 ml dịch mẫu: A = (n x 100 x 0,09)/V T: độ chua Therner cần xác định A: số gam axít lactic trong 100 ml n: số ml dung dịch NaOH dùng để chuẩn độ V: thể tích dịch mẫu 3.4.3 Khảo sát khả năng sinh axít lactic của các chủng phân lập đƣợc sau khi bổ sung saccharose vào môi trƣờng sữa Bố trí thí nghiệm: theo bảng 3.1 Bảng 3.1 Khảo sát khả năng sinh axít lactic của các chủng phân lập đƣợc sau khi bổ sung saccharose vào môi trƣờng sữa Sau khi cho các chủng phân lập được vào môi trường sữa đã bổ sung saccharose, ta đem ủ ở hai khoảng thời gian trên và đem đo hàm lượng axít lactic. 3.4.4 Thử đối kháng Lactobacillus acidophilus với E. coli trên môi trƣờng sữa Chọn ra 3 chủng L. acidophilus đã phân lập được sinh axít lactic cao nhất thử đối kháng với E. coli. Chuẩn bị: Môi trường sữa tươi vô trùng. Nuôi cấy E. coli trong môi trường TSB, ủ 370C/ 24 giờ. Nuôi cấy L. acidophilus trong môi trường sữa ủ 370C/24 giờ. Thời gian nuôi cấy Saccharose bổ sung vào môi trường sữa tươi 5% 6% 24 giờ 48 giờ - - 20 Hút lần lượt 1 ml dịch sữa đã nuôi cấy L. acidophilus ủ 370C/24 giờ cho vào 3 ống nghiệm chứa môi trường sữa (mỗi ống nghiệm 15 ml sữa). Hút tiếp lần lượt 1 ml, 0,1 ml và 0,01 ml dịch canh khuẩn E. coli đã nuôi cấy 370C/24 giờ cho vào 3 ống nghiệm trên. Đem 3 ống nghiệm này ủ 370C/24 giờ. Tiến hành đếm số lượng vi khuẩn E. coli bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Ống nghiệm đã nuôi cấy L. acidophilus và E. coli ủ 370C/24 giờ Pha loãng mẫu để có 3 nồng độ pha loãng liên tiếp Hút mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 3 ống nghiệm chứa môi trường EC, ủ 44,50C/24 giờ Chọn ống nghiệm dương tính (có bọt khí trong ống durham) Cấy lên thạch EMB, ủ 37ºC/24 giờ (mỗi ống nghiệm dương tính cấy 1 đĩa) Chọn 3 khuẩn lạc điển hình Thử nghiệm IMViC Đếm số ống canh EC (+) và IMViC ++--, tra bảng MPN Sơ đồ 3.2 Đếm số lượng vi khuẩn E. coli bằng phương pháp MPN Mẫu đối chứng không có L. acidophilus được thực hiện như sau : Cấy E. coli vào môi trường TSB ủ 37ºC/24 giờ. Sau đó dùng micropipette với đầu típ vô trùng hút lần lượt 1 ml, 0,1 ml và 0,01 ml dịch canh khuẩn E. coli vào các ống nghiệm chứa môi trường sữa tươi (15 ml) đem ủ 37ºC/24 giờ .Tiến hành - - 21 pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý được các nồng độ pha loãng thích hợp. Từ các nồng độ pha loãng này, dùng micropipette hút 0,1 ml cho vào đĩa chứa môi trường EMB (mỗi nồng độ hút vào 2 đĩa). Tiến hành trang đĩa và đem ủ 37ºC/24 giờ. Áp dụng công thức tính số lượng tế bào để kiểm tra số lượng vi khuẩn E. coli. Công thức tính số lượng tế bào trong 1g hay 1 ml dịch mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng : X = A x 1/h x 1/V Trong đó: X: số lượng khuẩn lạc trong 1g hay 1 ml dịch mẫu. A: số khuẩn lạc trung bình có trong đĩa (trong tổng số 2 đĩa ở cùng nồng độ pha loãng) h: độ pha loãng (10-6, 10-7, 10-8…) V: thể tích dịch cấy trên 1 đĩa Số lượng tế bào trung bình trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp: Y = (Xi + Xj + Xk)/3 Trong đó: Y: số lượng tế bào trung bình ở các nồng độ pha loãng Xi, Xj, Xk: số lượng khuẩn lạc trung bình có trong 1g hay 1 ml dich mẫu ở các nồng độ pha loãng liên tiếp nhau. - - 22 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập và định danh Lactobacillus acidophilus 4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Sau thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi phân lập được tất cả 10 chủng L. acidophilus. Để thuận tiện trình bày chúng tôi tạm thời gọi tên các chủng phân lập được lần lượt theo thứ tự từ 1,2,...10. Việc phân lập L. acidophilus từ mẫu sữa chua Vinamilk không đạt yêu cầu như mong muốn nguyên nhân có thể do : - Trong một số mẫu sữa chua chúng tôi phân lập có rất ít vi khuẩn L. acidophilus vì hầu hết trong các mẫu sữa chua mà chúng tôi đem phân lập không chỉ có vi khuẩn L. acidophilus mà còn có sự hiện diện của rất nhiều loài vi khuẩn lên men lactic khác như : L. bulgaricus, L. casei, Strep. lactic,...Theo Nguyễn Lân Dũng và các nhà nghiên cứu khác (1976) đã cho biết : trong các sản phẩm lên men lactic như sữa chua...thì số lượng loài L. bulgaricus luôn chiếm ưu thế. Loài vi khuẩn này phát triển và sinh ra lượng axít lactic rất nhanh làm giảm pH của môi trường, sự sụt giảm nhanh pH của môi trường đã kiềm hãm sự phát triển của các loài vi khuẩn lên men lactic khác cùng tồn tại, trong đó có loài L. acidophilus. - Một số vi khuẩn và nấm men khác mọc gây khó khăn cho chúng tôi trong quá trình bắt khuẩn lạc của L. acidophilus. Đối với mẫu chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất thì tỉ lệ phân lập được vi khuẩn L. acidophilus của chúng tôi là rất cao (100%).. - - 23 4.1.2 Đặc điểm nuôi cấy và hình thái vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Từ các khuẩn lạc nghi ngờ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus đã phân lập được, chúng tôi tiến hành quan sát các đặc điểm nuôi cấy, hình thái của vi khuẩn và khảo sát các đặc điểm sinh hoá của chúng. 4.1.2.1 Quan sát bằng mắt trần - Trên môi trường thạch MRSA : vi khuẩn L. acidophilus được cấy trên thạch đĩa MRSA (có CaCO3) nuôi cấy ở 37 oC cho thấy : Sau 48 giờ : tạo khuẩn lạc đục, nhỏ li ti, môi trường nuôi cấy xung quanh khuẩn lạc bắt đầu chuyển sang màu vàng. Sau 72 giờ : toàn bộ môi trường trong đĩa chuyển sang màu vàng, khuẩn lạc rõ hơn, có màu vàng nhạt, hình tròn, đường kính khoảng 0,5 - 1 mm, bề mặt láng, xung quanh khuẩn lạc có vòng sáng phân giải CaCO3. - Trên môi trường canh MRSB, vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được nuôi ở 37ºC, quan sát thấy : Sau 24 giờ : môi trường chuyển sang màu nâu vàng, có cặn màu trắng lắng ở dưới đáy ống nghiệm. Sau 48 giờ : môi trường chuyển sang màu vàng, lớp cặn ở duới đáy ống nghiệm dày hơn, có khi bám vào thành ống nghiệm. Hình 4.1 Lactobacillus acidophilus đƣợc nuôi trong môi trƣờng MRSB sau 24 giờ Hình 4. 2: Lactobacillus acidophilus đƣợc nuôi trong môi trƣờng MRSB - - 24 Ống nghiệm có mũi tên là ống chứa Lactobacillus acidophilus được nuôi trong môi trường MRSB/24 giờ. Ống nghiệm không có mũi tên là ống đối chứng trên MRSB. Trên môi trường sữa, sau 24 - 48 giờ nuôi cấy ở 37ºC, môi trường sữa đặc, trở nên lợn cợn, có lớp nhũ thanh trong màu vàng nhạt nằm tách biệt phía trên. Hình 4.2 Lactobacillus acidophilus đƣợc nuôi trong môi trƣờng sữa sau 24 giờ. Ống nghiệm đánh số (1) là ống đối chứng trên môi trường sữa tươi. Hai ống nghiệm còn lại là Lactobacillus acidophilus được nuôi trong môi trường sữa trong 24 giờ. 4.1.2.2 Quan sát dƣới kính hiển vi quang học Trên môi trường MRSB sau khi nuôi cấy 24 giờ, vi khuẩn được nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 1000 lần) cho thấy vi khuẩn L. acidophilus bắt màu tím (Gram dương ), tế bào vi khuẩn dạng trực dài, mảnh, không có bào tử, thường xếp thành từng đôi hay chuỗi dài, kích thước khoảng 0,5 – 0,8 μm x 1 – 3 μm. Lớp nhũ thanh (1) - - 25 4.2 Đặc điểm sinh hoá của các chủng Lactobacillus acidophilus đã phân lập đƣợc 4.2.1 Khả năng lên men các loại đƣờng Khả năng lên men đường là một trong những phản ứng quan trọng để đánh giá nhóm vi khuẩn lên men lactic. Chúng tôi đã khảo sát khả năng lên men đường của tất cả 10 chủng vi khuẩn đã phân lập được. Bảng 4.7 Kết quả phản ứng lên men các loại đƣờng của các chủng phân lập đƣợc Ghi chú : +: phản ứng lên men đường dương tính. -: phản ứng lên men đường âm tính. Tất cả 10 chủng vi khuẩn nghi ngờ L. acidophilus chúng tôi phân lập được đều lên men không sinh hơi đường glucose và không lên men đường mannitol. So với kết quả khảo sát Chu Việt Cường (2005) và Nguyễn Đức Duy Anh (2005) kết quả khảo sát của chúng tôi cho thấy phù hợp. Chủng phân lập Glucose Mannitol 1 + - 2 + - 3 + - 4 + - 5 + - 6 + - 7 + - 8 + - 9 + - 10 + - - - 26 4.2.2 Các phản ứng sinh hoá khác Để khẳng định các chủng vi khuẩn phân lập được là vi khuẩn L. acidophilus sau khi khảo sát khả năng lên men đường, chúng tôi tiến hành thử thêm một số phản ứng sinh hoá khác. Kết quả được trình bày qua bảng 4.2. Bảng 4 8 Kết quả phản ứng sinh hoá khác của vi khuẩn Chủng Indol MR VP Sử dụng citrat Khử nitrat Catalase 1 - - + - - - 2 - - + - - - 3 - - + - - - 4 - - + - - - 5 - - + - - - 6 - - + - - - 7 - - + - - - 8 - - + - - - 9 - - + - - - 10 - - + - - - Ghi chú : +: phản ứng dương tính - : phản ứng âm tính MR: phản ứng Methyl-Red VP: phản ứng Voges-Proskauer Kết quả trình bày ở bảng 4.2 cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn đã phân lập được đều cho các phản ứng sinh hoá giống nhau. Kết quả phản ứng VP dương tính, tất cả các phản ứng khác đều âm tính. Với các kết quả khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, khả năng lên men các loại đường và một số phản ứng sinh hoá cần thiết khác, chúng tôi có thể - - 27 kết luận rằng tất cả 10 chủng đã phân lập được đều là chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. 4.2.3 Khả năng sinh axít lactic của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Chúng tôi tiến hành đo hàm lượng axít lactic của 10 chủng vi khuẩn L. acidophilus phân lập được sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy trong môi trường sữa. Kết quả được trình bày qua bảng 4.3. Bảng 4.9 Kết quả đo hàm lƣợng axít lactic của vi khuẩn L. acidophilus trong môi trƣờng sữa sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy Qua kết quả trình bày ở bảng 4.3, tất cả các chủng vi khuẩn L. acidophilus phân lập được từ chế phẩm Antibio sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy trong môi trường sữa đều có khả năng sinh axít lactic cao. Chủng số 7 sinh axít lactic cao nhất: 0,8055 g axít lactic/100 ml (24 giờ) và 1,404 g axít lactic/100 ml (48 giờ), chủng sinh axít lactic thấp nhất là chủng số 3: 0,513 g axít lactic/100 ml (24 giờ) và 0,9315 Chủng 24 giờ 48 giờ Độ chua Therner (ºT) Hàm lượng axít lactic (g/100 ml) Độ chua Therner (ºT) Hàm lượng axít lactic (g/100 ml) 1 76 0,711 128,5 1,1565 2 75,5 0,6795 133 1,197 3 57 0,5130 103,5 0,9315 4 81,5 0,7335 135 1,215 5 74,5 0,6705 127 1,143 6 66 0,594 133 1,197 7 89,5 0,8055 156 1,404 8 69,5 0,6255 132 1,188 9 79 0,711 151 1,359 10 70,5 0,6345 165,1 1,4859 - - 28 g axít lactic/100 ml (48 giờ). Trong môi trường sữa, vi khuẩn L. acidophilus đã chuyển hoá nguồn đường lactose và saccharose sẵn có trong sữa thành axít lactic. Đường lactose trong sữa được thuỷ phân thành 2 đường đơn là glucose và galactose, đường saccharose thành glucose và fructose. Vi khuẩn L.acidophilus chuyển hoá các loại đường này theo chu trình EMP (Embden-Mayerhoff-Parnas) tạo thành axít pyruvic, giải phóng năng lượng ATP và enzyme NAD.H2 dạng khử. Enzyme NAD.H2 sẽ được hoàn nguyên trở lại thành NAD dạng oxi hoá. Do đó, giải phóng H2 kết hợp với axít pyruvic tạo ra axít lactic (Tô Minh Châu, 2000). Theo ghi nhận của Nguyễn Vĩnh Phước (1976): vi khuẩn L. acidophilus thuộc loài sản sinh axít lactic rất cao, có thể độ chua đạt tới 300ºT (tương đương 2,7 g axít lactic/100 ml). Đối với các chủng vi khuẩn L. acidphilus phân lập từ chế phẩm Antibio có khả năng sinh axít lactic cao là hoàn toàn hợp lí vì các chủng vi khuẩn này đã được kiểm tra và được chọn lọc trước khi đưa vào sản xuất. 4.3 Kết quả đo hàm lƣợng axít lactic trong môi trƣờng sữa tƣơi có bổ sung 5% và 6% saccharose Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh axít lactic của 10 chủng vi khuẩn L. acidophilus phân lập được sau khi bổ sung thêm saccharose vào môi trường sữa tươi sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy. Kết quả được trình bày ở bảng 4.4. - - 29 Bảng 4.4 Kết quả đo hàm lƣợng axít lactic của vi khuẩn L. acidophilus sau khi bổ sung saccharose vào môi trƣờng sữa tƣơi trong 24 giờ và 48 giờ. Đơn vị axít lactic là g/100 ml. Hàm lượng axít lactic được sinh ra từ 10 chủng vi khuẩn L. acidophilus phân lập được khi không bổ sung đường saccharose dao động trong khoảng 0,6705 – 0,8055 g/100 ml (nuôi cấy ở 24 giờ). Trong khi đó, sau khi bổ sung 5% saccharose vào môi trường sữa tươi hàm lượng axít lactic sinh ra dao động trong khoảng 0,576 – 1,008 g/100 ml (nuôi cấy ở 24 giờ) và bổ sung 6% saccharose là 0,63 – 0,9 g/100 ml (nuôi cấy ở 24 giờ). Nhìn chung khả năng sinh axít lactic sau khi bổ sung saccharose có gia tăng nhưng không đáng kể. Sau khi bổ sung saccharose, hàm lượng axít lactic được sinh ra thay đổi theo từng chủng. Chủng số 5 cho hàm lượng axít lactic cao nhất khi bổ sung 5% saccharose 1,008 g/100 ml (112ºT). Chủng số 4 cho hàm lượng axít lactic cao nhất Chủng Bổ sung 5% saccharose Bổ sung 6% saccharose 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ Therner (ºT) Axít lactic Therner (ºT) Axít lactic Therner (ºT) Axít lactic Therner (ºT) Axít lactic 1 62 0,558 86 0,774 83 0,747 130 1,17 2 86 0,774 141 1,269 93 0,837 120 1,08 3 100 0,9 148 1,132 84 0,756 115 1,035 4 91,5 0,8235 124 1,116 100 0,9 160 1,44 5 112 1,008 165 1,485 85 0,765 127 1,143 6 65 0,585 106 0,954 70 0,63 138 1,242 7 74 0,666 134 1,206 85 0,765 143 1,287 8 85 0,765 90 0,81 88 0,792 150 1,35 9 64 0,576 110 0,99 80 0,72 119 1,071 10 64 0,576 108 0,972 70 0,63 106 0,954 - - 30 khi bổ sung 6% saccharose 0,9 g/100 ml (100ºT). Trong khi đó khi không bổ sung saccharose thì chủng số 7 sinh axít lactic cao nhất 0,8055 g/100 ml (89,5ºT). Nguyên nhân có thể là do mỗi chủng thích hợp với những nồng độ đường khác nhau. Kết quả cũng cho thấy rằng có sự khác biệt giữa hai mức thời gian đo hàm lượng axít lactic (24 giờ và 48 giờ). Theo kết quả của chúng tôi, khi đo hàm lượng axít lactic của vi khuẩn L. acidophilus sau 48 giờ nuôi cấy cao hơn khi đo ở mức thời gian là 24 giờ. Sau 24 giờ số lượng vi khuẩn tăng sinh chưa đủ để chuyển hoá hết đường lactose. Sau 48 giờ số lượng vi khuẩn sẽ tăng nhiều hơn. Do đó, lượng axít lactic sinh ra sẽ cao hơn. Theo ghi nhận của Nguyễn Lân Dũng và ctv (1976): yếu tố thời gian nuôi cấy cũng sẽ có ảnh hưởng đến việc tăng số lượng tế bào vi khuẩn L. acidophilus. Để chuyển hoá được hết nguồn dinh dưỡng thành axít lactic vi khuẩn cần phải có một khoảng thời gian nhất định nhưng khoảng thời gian này quá dài sẽ tác động ngược trở lại làm giảm số lượng vi khuẩn và lượng axít lactic được sinh ra. Tóm lại, khi bổ sung saccharose vào môi trường sữa tươi đã tăng khả năng sinh axít lactic của vi khuẩn L. acidophilus. Tuy nhiên sự gia tăng này là không lớn. 4.4 Khả năng kháng của vi khuẩn Latobacillus acidophilus đối với E. coli trên môi trƣờng sữa tƣơi Chọn 3 chủng số 4,7 và 9 đem thử đối kháng với E. coli do 3 chủng này sinh axít lactic cao. Chúng tôi tiến hành nuôi chung vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và E. coli trong môi trường sữa tươi, ủ 37ºC/24 giờ. Sau đó đem pha loãng mẫu được các nồng độ 10-8, 10-7, 10-6 và cấy vào môi trường EC (hút 0,1 ml dịch mẫu). Kết quả số ống nghiệm dương tính trong môi trường EC được trình bày ở bảng 4.5 (xem phần phụ lục). Qua bảng 4.5 ta thấy đa số các ống nghiệm có phản ứng dương tính (có hiện tượng bọt khí trong ống Durham). - - 31 Hình 4.3 Số ống nghiệm dƣơng tính trên môi trƣờng EC Từ các ống nghiệm dương tính này, ta cấy trên môi trường EMB, ủ 37ºC/24 giờ. Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli đem thử nghiệm IMViC. Kết quả thử nghiệm IMViC được trình bày ở bảng 4.6 (xem phần phụ lục). Dựa vào số ống EC dương tính và kết quả thử nghiệm IMViC ++-- tra bảng MPN. - - 32 Bảng 4.7 Số lƣợng vi khuẩn E. coli trong thí nghiệm đối kháng với L. acidophilus trên môi trƣờng sữa Từ kết quả của bảng 4.7, ta thấy: - Số lượng vi khuẩn E. coli có trong dịch mẫu đối kháng thay đổi theo từng chủng và từng thể tích dịch mẫu. Số lượng vi khuẩn E. coli thay đổi theo từng chủng nguyên nhân có thể là do các chủng có tính kháng E. coli khác nhau. Trong cùng một chủng, số lượng vi khuẩn E. coli cũng thay đổi theo từng thể tích dịch mẫu. Chủng số 4 ở thể tích dịch mẫu là 0,01 thì số lượng E. coli là 9.107 (CFU/ml), trong khi đó ở thể tích dịch mẫu 1 ml thì số lượng vi khuẩn E. coli là 4.104 (CFU/ml). Chúng tôi thật sự không thể hiểu vì sao kết quả lại như thế. Chủng Số ml dịch canh khuẩn E. coli cho vào môi trường sữa có 1 ml dịch sữa L. acidophilus MPN Số lượng E. coli (tế bào/ml) có trong dịch mẫu sữa đối kháng sau 24 giờ nuôi cấy Số lượng vi khuẩn E. coli (CFU/ml) trong mẫu sữa không có L. acidophilus 4 1 4 4.10 4 4672.10 7 0,1 4 4.10 7 65.10 7 0,01 9 9.10 7 1.10 7 7 1 7 7.10 7 4672.10 7 0,1 9 9.10 7 65.10 7 0,01 29 29.10 7 1.10 7 9 1 23 23.10 7 4672.10 7 0,1 15 15.10 7 65.10 7 0,01 0 0 1.10 7 - - 33 - Đối với mẫu đối chứng: môi trường sữa không có L. acidophilus, số lượng vi khuẩn E. coli rất cao. So sánh mẫu đối chứng với mẫu đối kháng của các chủng, số lượng vi khuẩn E. coli cao hơn rất nhiều lần, cao hơn gấp 203 lần so với số lượng vi khuẩn ở chủng số 9 cùng thể tích dịch mẫu là 1 ml (4672.107 so với 23.107) và gấp 667 lần so với chủng số 7 (7.107 CFU/ml). Số lượng vi khuẩn E. coli ở mẫu đối chứng 0,1 ml cao gấp 4,2; 7; 14 lần lần lượt ở các chủng số 9, 7, 4 (65.107 so với lần lượt 15.107, 9.10 7 , 4.10 7 ). Chúng tôi tiến hành xử lý số liệu trên với phần mềm Minitab. Kết quả là ở thể tích dịch mẫu 1 ml và 0,1 ml (bao gồm cả phần thí nghiệm và phần đối chứng) có sự khác biệt rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P = 0,034< 0,05 và P = 0,006 < 0,05). Còn ở dịch mẫu 0,01 ml không có sự khác biệt về phương diện thống kê học (xem phần phụ lục). Như vậy, ở thể tích dịch mẫu 1 ml và 0,1 ml L. acidophilus kháng rất tốt đối với vi khuẩn E. coli. Còn ở thể tích dịch mẫu là 0,01 ml thì L. acidophilus có kháng nhưng không rõ ràng. Tóm lại, Lactobacillus acidophilus kháng rất mạnh đối với vi khuẩn E. coli. Hình 4.5 Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng EMB (mẫu đối chứng) sau 24 giờ nuôi cấy - - 34 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Qua phân lập, khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh hoá, khả năng sinh axít lactic và tính kháng của Lactobacillus acidophilus đối với vi khuẩn E. coli. Chúng tôi có những kết luận và đề nghị như sau: 5.1 Kết luận - Từ 10 chủng đã phân lập, chúng tôi khảo sát được chủng số 7 có khả năng sinh axít lactic cao nhất là 0,8055 g/100 ml (tương đương 89,5ºT). - Hàm lượng axít lactic tăng không đáng kể khi bổ sung saccharose vào môi trường sữa tươi. Chủng số 5 sinh axít lactic cao nhất khi bổ sung 5% saccharose 1,008 g/100 ml (sau 24 giờ nuôi cấy).Chủng số 4 sinh axít lactic cao nhất khi bổ sung 6% saccharose 0,9 g/100 ml (sau 24 giờ nuôi cấy). - Lactobacillus acidophilus kháng với E. coli rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P = 0,034 và P = 0,006). 5.2 Đề nghị - Tìm hiểu các điều kiện để gia tăng sự sinh trưởng, phát triển, khả năng sinh axít lactic và tính kháng của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus đối với vi khuẩn E. coli. - Sản xuất thử chế phẩm probiotic có chứa vi khuẩn L. acidophilus nhằm ứng dụng vào chăn nuôi thú y. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC 1. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacilulus subtilis, Lactobacillus acidophilus và thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học. LVTN Bộ môn CNSH. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm. 2. Tô Minh Châu, 2000. Vi sinh vật ứng dụng trong chăn nuôi. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm. 3. Chu Văn Cường, 2005. Khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus dùng sản xuất chế phẩm probiotic. LVTN Khoa Chăn nuôi thú y. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm. 4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Nguyên, Phạm Văn Ty, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Phùng Tiến, 1976. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập 1, 2, 3. NXB Khoa học kỹ thuât. 5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 1998. Vi sinh vật học. NXB Giáo Dục. 6. Nguyễn Thành Đạt, 2005. Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 2. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm. 7. Nguyễn Ngọc Hải, 2007. Công nghệ sinh học trong thú y. NXB Nông Nghiệp. 8. Nguyễn Vĩnh Phước, 1976. Vi sinh vật gây bệnh th‎ú y, tập 1, 2, 3, NXB Kim Đồng. 9. Phạm Thị Trúc Phương, 2005. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes nhằm ứng dụng trong sản xuất probiotic. LVTN Khoa Chăn nuôi thú y. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm. 10. Trần Linh Thước, 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo Dục. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 11. W.I.Li, Benjamin G.Brackett and Jaroslava Halper. Culture Supernatant of Lactobacillus acidophilus Stimulates Proliferation of Embryonic Cell. 12. Lievin-Le Moal, V., R. Amsellem, A. L. Servin, and M.-H. Coconnier. 2002. Lactobacillus acidophilus (strain LB) from the resident adult gastrointestinal microflora exerts activity against brush border damage promoted by a diarrhoeagenic Escherichia coli in human enterocyte-like cells. Gut 50:803-811. 13. Bernet-Camard, M.-F., V. Lievin, D. Brassart, J.-R. Neeser, A. L. Servin, and S. Hudault. 1997. The human Lactobacillus acidophilus strain LA1 secretes a non-bacteriocin antibacterial substance(s) active in vitro and in vivo. Appl. Environ. Microbiol. 63:2747-2753. 14. Wagner R.D; Pierson Carey ; Warnet Thomas, 2000.Probiotic effects of feeding heat-killer Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei to Candida albicans-conolized immunodeficient mice. Joural of Food Protection. CÁC TRANG WEB 15. 16. 17. 18. C.edu/scienceed/Lactobacillus acidophilus.html 19. 20. 21. 22. 23. acidophilus.html PHỤ LỤC 1. Cách thực hiện các phản ứng sinh hoá Kiểm tra khả năng lên men đƣờng - Nguyên tắc: Các vi sinh vật sử dụng và len men một số loại đường sinh ra axít làm cho pH của môi trường giảm. Khi đó, chất chỉ thị màu phenol red hiện diện trong môi trường từ màu đỏ sẽ chuyển sang màu vàng. - Chuẩn bị: Môi trường các loại đường cần kiểm tra (glucose, saccharose, mannitol, maltose, lactose…) và ống giống vi khuẩn. - Cách tiến hành: Phân môi trường có các loại đường vào các ống nghiệm (khoảng 5ml) có ống Durham. Hấp khử trùng ở 1150C/10 phút. Sau đó cấy dịch vi khuẩn vào môi trường, ủ 370C/24 giờ. Quan sát sự đổi màu và sinh hơi. - Cách đọc kết quả: Lên men đường có sinh hơi: môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng, ống Durham có hơi. Lên men đường không sinh hơi: môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng, ống Durham không sinh hơi. Không lên men đường: môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ, ống Durham không có hơi. Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus lên men không sinh hơi các loại đường glucose, saccharose, maltose, lactose và không lên men đuờng mannitol. Kiểm tra khả năng sinh Indol - Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có enzyme tryptophanase làm chuyển hoá tryptophan thành indol. Indol sẽ kết hợp với chất para-dimethylaminobenzaldehyde (có trong thuốc thử Kowac’c) sẽ tạo thành phức chất roindol màu đỏ. - Chuẩn bị: Ống giống vi khuẩn, môi trường NB. - Cách tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường canh NB, nuôi cấy ở 370C/24 giờ, sau đó thêm vài giọt thuốc thử Kowac’c vào. Để yên, quan sát hiện tượng rồi đọc kết quả. Phản ứng dương tính: lớp mặt môi trường có màu đỏ. Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng (không đổi màu). Phản ứng MR (Methyl-Red) - Nguyên tắc: Một số vi sinh vật sử dụng và lên men đường glucose có trong môi trường làm cho pH của môi trường giảm (sinh axít). Khi đó, thuốc thử methyl- red vẫn giữ nguyên màu đỏ (MR dương tính). Ngược lại, nếu vi sinh vật không sử dụng nguồn glucose mà chỉ sử dụng nguồn nitrogen trong môi trường làm cho pH môi trường trở nên kiềm và thuốc thử methyl-red chuyển từ màu đỏ sang màu vàng (MR âm tính). - Chuẩn bị: Môi trường Clark Lubs, thuốc thử methyl-red, ống giống vi khuẩn. - Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy một vòng canh khuẩn cấy vào trong ống nghiệm chứa môi trường Clark Lubs, nuôi ở nhiệt độ 370C/24 giờ. Sau đó, nhỏ 2-3 giọt thuốc thử methyl-red vào ống nghiệm và đọc kết quả. Phản ứng MR dương tính: môi trường có màu đỏ. Phản ứng MR âm tính: môi trường màu vàng. Khả năng khử nitrat - Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có khả năng sinh enzyme nitrat-reductase có tác động khử nitrat thành nitrit (NO3- thành NO2-), rồi tiếp tục khử thành NH3 hay N2. - Chuẩn bị: Môi trường thạch nitrat bán lỏng Dung dịch thuốc thử Griess A (axít sulfanilic). Dung dịch thuốc thử Griess B (α-naphthylamine). Ống giống vi khuẩn. - Cách tiến hành: Dùng que cấy thẳng lấy huyễn dịch vi khuẩn cấy sâu vào trong môi trường thạch nitrat bán lỏng, nuôi ở 370C/24 giờ. Sau 24 giờ nhỏ vào môi rường 2 - 3 giọt thuốc thử Griess A, sau đó nhỏ tiếp 2 - 3 giọt thuốc thử Griess B. Đọc kết quả. Kiểm tra hoạt tính catalase - Nguyên tắc: Một số vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối hay hiếu khí tuỳ nghi có khả năng sinh ra enzyme catalase có thể phân giải thành H2O2 thành CO2 và [O]. - Chuẩn bị: Ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường MRSA đã cấy vi khuẩn 24 giờ, ủ 370C. Lam sạch. Lọ H2O2 30% kín. - Cách tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy một ít vi khuẩn, phết lên giữa lame kính. Sau đó nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn. Đọc kết quả sau khoảng 15 giây. Phản ứng catalase dương tính: có hiện tượng sủi bọt. Phản ứng VP (Voges_Proskauer) - Nguyên tắc: Một số vi khuẩn lên men đường tạo ra axít pyruvic, sau đó tiếp tục chuyển hóa thành acetyl metyl carbinol (ACM). Trong môi trường kiềm ACM bị oxi hóa thành diacetyl. Diacetyl sẽ kết hợp với nhóm guadinin chứa trong acid amin arginin của thuốc thử α-napton tạo thành hợp chất màu đỏ cam (VP dương tính). - Chuẩn bị: Môi trường Clark Lubs Thuốc thử α-napton 10% NaOH 40% - Cách tiến hành: Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa khoảng 3 ml môi trường Clark Lubs, nuôi ở nhiệt độ 37ºC/24 giờ. Sau đó nhỏ 3 - 5 giọt NaOH 40% và 3 - 5 giọt thuốc thử α-napton 10%. Sau 15 phút đọc kết quả. Phản ứng VP dương tính: môi trường chuyển sang màu đỏ cam. Phản ứng VP âm tính: môi trường màu vàng. Khả năng sử dụng citrat - Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat như một nguồn carbon duy nhất, tạo ra ion Na+ làm cho pH môi trường tăng. Sự thay đổi pH môi trường được nhận biết nhờ chất chỉ thị màu bromothylmol blue. - Chuẩn bị: Môi trường tổng hợp Simmon’s citrate Ống giống vi khuẩn. - Cách tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn trong ống giống cấy sang ống nghiệm thạch nghiêng Simmon’s citrate có chất chỉ thị màu bromothymol blue. Cho vào tủ ấm 370C/24 giờ. Sau đó đọc kết quả. Phản ứng citrat dương tính: môi trường chuyển từ màu xanh lục sang màu xanh dương. Phản ứng citrat âm tính: môi trường vẫn giữ màu xanh lục (không đổi). 2. Phƣơng pháp nhuộm Gram Kỹ thuật nhuộm: Các bước tiến hành Phết canh khuẩn lên phiến kính Cố định mẫu bằng cách hơi qua ngọn lửa đèn cồn 3 lần Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm bằng crystal violet trong 1 phút Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Cố định màu bằng Lugol trong 1 phút Rửa nước, thấm khô Tẩy cồn 96ºC khoảng 15 giây Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm màu bằng dung dịch fuchsine kiềm loãng Rửa nước, thấm khô Xem kính hiển vi ở độ phóng đại x100 (vật kính dầu). 3. Môi trƣờng Môi trƣờng tăng sinh chọn lọc MRSB (De Man, Rogaso, Sharpe) Cao thịt 8 g Pepton bột 10 g Cao nấm men 4 g Acetat natri 5 g K2HPO4 2 g Triamonium citrat 2 g MgSO4 0.2 g MnSO4 0.2 g Twen 80 1 ml Bromocresol 1 ml Nước cất 1000 ml Điều chỉnh pH = 6.2 + 0.2. Đun nhẹ để hoà tan các thành phần môi trường. Sau đó phân vào mỗi ống nghiệm khoảng 10ml. Hấp khử trùng bằng autoclave ở 121ºC/20 phút. Môi trƣờng tăng sinh chọn lọc MRSA Môi trường MRSB 1000 ml CaCO3 32 g Agar 16 g pH = 6.2 + 0.2 Đun sôi để hoà tan các thành phần môi trường. Hấp khử trùng bằng autoclave ở 121ºC/20 phút. Môi trƣờng lên men các loại đƣờng Cao thịt 5 g Pepton bột 10 g Đường 10 g Phenol red 0.01 g Nước cất 1000 ml pH = 7.4 Hấp khử trùng bằng autoclave ở 121ºC/10 phút. Môi trƣờng Clark Lubs Pepton bột 7 g Glucose 5 g KH2PO4 5 g Nước cất 1000 ml pH = 6.9 + 0.2 Hấp khử trùng bằng autoclave ở 121ºC/20 phút. Môi trƣờng thạch nitrat bán lỏng Cao thịt 3 g Pepton bột 5 g KNO3 1 g Agar 5 g Nước cất 1000 ml pH = 7.2 +0.2 Hấp khử trùng bằng autoclave ở 121ºC/20 phút. Môi trƣờng Simmons Citrate Agar Sodium citrate 2g NaCl 5g K2HPO4 1g NH4H2PO4 1g MgSO4 0,2g Bromothymol blue 0,08g Agar 15g Nước cất 1000 ml Đun nóng nhẹ và thỉnh thoảng lắc. Đun sôi 1 - 2 phút cho đến khi hoà tan. Hấp ở 121ºC/15 phút. Trypticase Soy Agar (TSA) Trypticase pepton 15g Phytone pepton 5g NaCl 5g Agar 15g Nước cất 1000 ml Đun nóng để hoà tan agar. Hấp khử trùng ở 121ºC/15 phút. pH 7,3 0,2. EC Broth (canh EC) Trypticase hoặc tryptose 20g Muối mật No. 3 1,5g Lactose 5g K2HPO4 4g KH2PO4 1,5g NaCl 5g Nước cất 1000 ml Rót môi trường vào ống nghiệm có chứa ống durham. Hấp khử trùng ở 121ºC/15 phút. pH 6,9 0,2. 4. Các bảng Bảng 4.5 Đọc kết quả trên môi trƣờng EC Chủng Số ml E.coli cho vào môi trường sữa có L. acidophilus Pha loãng mẫu và cho vào môi trường EC 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 4 1 + - - - - - - - - - - - - - - - - - 0,1 + + + + + + + + + 0,01 + + + + + + + + + 7 1 + + + + + + + + + 0,1 + + + + + + + + + 0,01 + + + + + + + + + 9 1 + + + + + + + + + 0,1 + + + + + + + + + 0,01 - - + + + + - + + Ghi chú: 10-3, 10-4, 10-5… là các nồng độ pha loãng. + phản ứng dương tính - phản ứng âm tính Bảng 4 10 Kết quả thử nghiệm IMViC Chủng Số ml E. coli cho vào môi trường sữa có L. acidophilus IMViC 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 4 1 + - - - - - - - - 0,1 - - + - - - - - - 0,01 - - - + + - + - - 7 1 - - + - - - - - + 0,1 - - - - - - + + + 0,01 + - + + + + - - - 9 1 + + + - - - - - - 0,1 + - - - + + - - + 0,01 - - - - - - Ghi chú: + kết quả thử nghiệm IMViC là ++--. - kết quả thử nghiệm IMViC không phải là ++--. 5. Kết quả xử lý thống kê One-way ANOVA: So luong 1 versus Lo 1 Analysis of Variance for So luong Source DF SS MS F P Lo 1 1 20.91 20.91 10.07 0.034 Error 4 8.31 2.08 Total 5 29.21 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+---- 1-dc 3 10.670 0.000 (---------*--------) 1-tn 3 6.936 2.038 (--------*--------) --+---------+---------+---------+---- Pooled StDev = 1.441 5.0 7.5 10.0 12.5 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0500 Critical value = 3.93 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 1-dc 1-tn 0.466 7.000 One-way ANOVA: So luong 2 versus Lo 2 Analysis of Variance for So luong Source DF SS MS F P Lo 2 1 1,2207 1,2207 29,14 0,006 Error 4 0,1676 0,0419 Total 5 1,3883 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+------- 0.1-dc 3 8,8129 0,0000 (-----*------) 0.1-tn 3 7,9108 0,2895 (-----*------) ---------+---------+---------+------- Pooled StDev = 0,2047 8,00 8,50 9,00 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0,0500 Individual error rate = 0,0500 Critical value = 3,93 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 0.1-dc 0.1-tn 0,4381 1,3661 One-way ANOVA: So luong 3 versus Lo 3 Analysis of Variance for So luong Source DF SS MS F P Lo 3 1 3.5 3.5 0.31 0.607 Error 4 45.0 11.3 Total 5 48.5 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----------+---------+---------+------ 0.01-dc 3 7.000 0.000 (--------------*--------------) 0.01-tn 3 5.472 4.746 (---------------*--------------) ----------+---------+---------+------ Pooled StDev = 3.356 3.5 7.0 10.5 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0500 Critical value = 3.93 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 0.01-dc 0.01-tn -6.080 9.135