Khóa luận Khảo sát khả năng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhận hợp chất anthraquinone

n Cân chính xác khối lƣợng anthraquinone và pha loãng trong methanol tuyệt đối thành các nồng độ sau 14 ppm, 28 ppm, 42 ppm, 56 ppm, 70 ppm. Tiến hành sắc ký để thu đƣợc các peak chuẩn ở các nồng độ trên. Xây dựng đƣờng chuẩn tuyến tính biểu hiện sự biến thiên của nồng độ anthraquinone theo diện tích peak. 3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣợng hợp chất anthraquinone Mục đích - Tìm cách xử lý mẫu thích hợp cho qui trình chạy HPLC. Bố trí nghiệm thức - Hai mẫu đƣợc xử lý theo hai cách A và B (Sơ đồ 3.2) đƣợc đem định lƣợng bằng HPLC. Chỉ tiêu theo dõi - Theo dõi khả năng tạo tín hiệu trong sắc ký đồ của 2 mẫu đƣợc xử lý theo quy trình A và B. Phƣơng pháp tiến hành - Cây D. Burmanni Vahl in vitro đƣợc chia thành hai nhóm. - Một nhóm đƣợc xử lý theo quy trình A, một nhóm xử lý theo qui trình B trƣớc khi chạy HPLC (Sơ đồ 3.2). 42 u Sơ đồ 3.2. Quy trình xử lý mẫu [32]. 43 3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro Mục đích - Xác định bộ phận cho lƣợng anthraquinone nhiều nhất. Bố trí thí nghiệm Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro Chỉ tiêu theo dõi - Ghi nhận sắc ký đồ và so sánh hàm lƣợng anthraquinone (% so với troṇg lƣơṇg khô) trong mẫu thân lá và mẫu rễ, theo công thƣ́c: m1 Hàm lƣợng anthraquinone (%) = x 100 m2 Với: m1: trọng lƣợng hợp chất anthraquinone trong dung dịch mẫu đem đo (mg). m2: trọng lƣợng khô mẫu đem đo (mg). Phƣơng pháp tiến hành - Cây in vitro đƣợc chia thành hai phần: phần thân lá và phần rễ. - Cây tƣơi mỗi loại đƣợc xử lý theo quy trình thích hợp tìm đƣợc từ thí nghiệm 6. - Tiến hành định lƣợng bằng HPLC. Mẫu định lƣợng Mẫu thân lá Mẫu rễ Nghiêṃ thƣ́c X1 X2 44 3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ Mục đích - Bƣớc đầu tìm hiểu mối liên hệ giữa sắc tố đỏ của cây và hàm lƣợng hợp chất quinone. Bố trí nghiệm thức Bảng 3.7: Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu cây có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ Mẫu phân tích Mẫu có sắc tố đỏ Mẫu không có sắc tố đỏ Nghiêṃ thƣ́c Y1 Y2 Chỉ tiêu theo dõi - Ghi nhận sắc ký đồ và so sánh diện tích peak, hàm lƣợng anthraquinone của hai mẫu cây có và không có sắc tố đỏ. Phƣơng pháp tiến hành - Cây D. burmanni đƣợc chia làm 2 loại: loại có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ. - Cây tƣơi mỗi loại đƣợc xử lý theo quy trình xử lý mẫu thích hợp tìm đƣợc từ thí nghiệm 6. - Tiến hành định lƣợng bằng HPLC 45 3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 Mục đích. - Định lƣợng sơ bộ anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù. Cách xử lý mẫu Sơ đồ 3.3: Quy trình xử lý dịch huyền phù. 3.4. Xử lý thống kê Số liệu thu đƣợc từ tất cả các thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Stagraphic 7.0. Dịch huyền phù Sinh khối tế bào và mô sẹo Dịch môi trƣờng Xác tế bào và mô sẹo Dịch chiết Định lƣợng bằng HPLC Lọc qua đầu lọc 0,2 m Định lƣợng bằng HPLC Lọc qua đầu lọc 0,2 m Đánh sóng siêu âm 30 phút Nghiền trong methanol tuyệt đối 3 lần Ly tâm 46 Chƣơng 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4. 4.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù 4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng Tỷ lệ sống của các mẫu lớp mỏng từ cây D. burmanni trên các môi trƣờng khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy đƣợc ghi nhận ở bảng 4.1, và biểu đồ 4.1. Bảng 4.1: Tỷ lệ mẫu sống ở các nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy Loại môi trƣờng Nồng độ đƣờng (g/l) 5 10 20 30 MS 16,67 11,67 11,67 10 MS 1/2 8,33 18,33 11,67 18,33 Gamborg’s B5 13,33 20 36,67 13,33 Kết quả trích từ phu ̣luc 2.1 Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ mẫu lớp mỏng sống trên các loại môi trƣờng khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 Nghiệm thức Tỷ lệ m ẫu s ốn g (% ) 47 Nhận xét Từ kết quả ở bảng 4.1, chúng tôi tiến hành phân tích thống kê cho từng yếu tố nhƣ sau: Về thành phần khoáng Thống kê bảng 4.2 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa việc sử dụng môi trƣờng Gamborg’s B5 với 2 loại môi trƣờng MS và MS 1/2. Môi trƣờng Gamborg’s B5 cho tỷ lệ mẫu sống trung bình cao nhất (20,83%) và thấp nhất là môi trƣờng MS, với tỷ lệ mẫu sống trung bình là 12,5%. Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới chọn môi trƣờng Gamborg’s B5 là môi trƣờng cơ bản để tạo mô sẹo ở một số loài Drosera [12], [23]. Bảng 4.2: Ảnh hƣởng thành phần khoáng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng Loại môi trƣờng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu sổng MS MS 1/2 Gamborg’s B5 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 8 9,10,11, 12 12,50 a 14,17 a 20,83 b Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05). Về nồng độ đƣờng Qua bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ đƣờng 20 g/l mẫu lớp mỏng sống và phát triển đƣợc (20% mẫu sống) trong khi ở nồng độ đƣờng quá cao và quá thấp mẫu mô đều chết. Một đặc điểm thƣờng gặp ở phƣơng pháp lớp mỏng tế bào là mẫu mô khá nhạy cảm với áp suất thẩm thấu. Ghi nhận thực tế cho thấy, khi sử dụng nồng độ đƣờng cao các mẫu mô sẽ bị chết đen và có xu hƣớng hơi co lại do mất nƣớc. Bên cạnh đó, kết quả bảng 4.1 và biểu đồ 4.1 cũng cho thấy tỷ lệ mẫu sống thấp nhất ở nghiệm thức A5 (8,33%) (khi kết hợp sử dụng loại môi trƣờng MS 1/2 với nồng độ đƣờng 5 g/l); trong khi tỷ lệ mẫu sống cao nhất ở nghiệm thức A11 (36,67 %) (Môi trƣờng Gamborg’s B5 với nồng độ đƣờng 20 g/l). 48 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng Nồng đồ đƣờng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu sổng 5 10 20 30 1, 5, 9 2, 6, 10 3, 7, 11 4, 8, 12 12,78 a 16,67 b 20,00 c 13,89 ab Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05). Nhƣ vậy khi kết hợp cả hai yếu tố ảnh hƣởng đến mẫu mô chúng tôi chọn đƣợc môi trƣờng tốt nhất cho mẫu cấy lớp mỏng cây bắt ruồi là môi trƣờng Gamborg’s B5 với nồng độ đƣờng 20 g/l. 4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo Sau 2 tuần nuôi cấy, kết quả sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cây D. burmanni vahl trên môi trƣờng có nồng độ đƣờng và thành phần khoáng chọn từ thí nghiệm 1, bổ sung các loại hormone khác nhau đƣợc ghi nhận và trình bày trong bảng 4.4. Bảng 4.4: Tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trƣờng có kết hợp 2 loại hormone khác nhau Các loại hormone kết hợp (mg/l) NAA (0,2) 2,4-D (0,1) NAA (0,5) IBA (1) NAA (1) BA (0,2) Tỷ lệ mẫu tạo sẹo 25,17 c 2,93 b 0 a Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (p < 0,05). Nhận xét Kết quả từ bảng 4.4 cho thấy có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức sử dụng hormone NAA/2,4-D; NAA/IBA; NAA/BA. Trong đó sự kết hợp 2 loại NAA/BA cho kết quả thấp nhất (không có sự tạo thành mô sẹo mà chỉ có sự hình thành chồi trực tiếp từ các mẫu thân) và sự kết hợp 2 loại hormone NAA/2,4-D cho kết quả tạo mô sẹo tốt nhất (25,56%). 49 Sự kết hợp cùng lúc 2 loại auxin để tạo mô sẹo ở một số loài Drosera đã đƣợc ghi nhận trong một số nghiên cứu cả trong và ngoài nƣớc [12], [23], [28]. Thông thƣờng mô sẹo đƣợc tạo thành khi có sự tác động đồng thời của cả 2 loại hormone auxin và cytokinin, trong đó hàm lƣợng auxin nhiều hơn. Tuy nhiên ở một số đối tƣợng, lƣợng auxin nội sinh thấp, mẫu mô cần lƣợng lớn hơn auxin để cảm ứng hình thành mô sẹo. Tổng hợp các ghi nhận và phân tích, chúng tôi chọn sự kết hợp 2 loại hormone NAA/2,4-D cho việc cảm ứng hình thành mô sẹo từ lớp mỏng các bộ phân cây D. burmanni Vahl. 4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo Bảng 4.5: Tỷ lệ mẫu tạo sẹo trên các môi trƣờng khác nhau sau 21 ngày nuôi cấy Loại vật liệu đầu Nghiệm thức Nồng độ 2,4-D (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo sẹo Hình thái mô sẹo Phát hoa C1 0 5,53 Mô sẹo hơi phình, đặc. (Hình 4.1A) C2 0,1 22,23 Mô sẹo xốp, đỏ, ít. (Hình 4.1B) C3 0,2 52,77 Mô sẹo xốp, vàng xanh, phình to (Hình 4.1C). C4 0,3 36,10 Mô sẹo xốp, vàng xanh. C5 0,4 19,47 Mô sẹo hơi chai. C6 0,5 22,23 Mô sẹo chai cứng (Hình 4.1D). Thân C1’ 0 0 Mẫu cấy hóa nâu. C2’ 0,1 38,90 Mô sẹo vàng xanh, phần mẫu cảm ứng ít (Hình 4.2A). 50 C3’ 0,2 72,23 Mô sẹo xốp , vàng trắng có ít đốm đỏ, phình to (Hình 4.2 B, E). C4’ 0,3 55,53 Mô sẹo xốp, vàng xanh vài mẫu có đốm đỏ C5’ 0,4 50 Mô sẹo vàng trắng, có đốm đỏ hơi đặc . (Hình 4.2C). C6’ 0,5 22,23 Mô sẹo vàng xanh, hơi chai cứng (Hình 4.2D). Lá C1” 0 8,30 Mô sẹo đỏ, phần mâũ cảm ƣ́ng ít (Hình 4.1E) C2” 0,1 16,70 Mô sẹo xốp, màu vàng xanh nhƣng ít. C3” 0,2 27,77 Mô sẹo xốp, màu vàng xanh, phình to (Hình 4.1F). C4” 0,3 22,23 Mô sẹo đăc̣, màu vàng xanh xen đốm đỏ (Hình 4.1G) C5” 0,4 13,90 Mô sẹo vàng xanh có đốm đỏ , hơi chai cứng. C6” 0,5 13,90 Mô sẹo đỏ, chai cứng. (Hình 4.1H) Kết quả được trích từ phụ lục 2.3 Nhận xét Kết quả bảng 4.5 cho thấy, đối với cả 3 loại vật liệu đầu tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đều thấp nhất ở nghiệm thức có môi trƣờng chỉ bổ sung NAA (0,2 mg/l). Trong khi ở nghiệm thức bổ sung NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l) tỷ lệ tạo sẹo lớn nhất ở cả 3 loại mẫu: 52,77% ở mẫu phát hoa TCL, 72,23% ở mẫu thân TCL, 27,77% ở mẫu lá TCL. 51 Các auxin đƣợc biết đến là có khả năng kích thích mạnh sự phân chia tế bào, nên chúng thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ loại hormone sơ cấp để sản xuất mô sẹo. Các auxin thông dụng hiện nay bao gồm IAA, IBA, NAA, 2,4-D có mức độ ảnh hƣởng tăng dần, trong đó 2,4-D là chất sử sụng hiệu quả nhất trong trong việc hình thành mô sẹo [16]. Các kết quả thực nghiệm cũng cho thấy 2,4-D thƣờng cảm ứng tạo mô sẹo xốp hơn là NAA. Điều này có lẽ là do 2,4-D cảm ứng sự phân chia tế bào mạnh, các tế bào phân chia liên tục trong thời gian ngắn không kịp để tổng hợp vật chất nên nó thƣờng lỏng lẻo. Vì mục đích thí nghiệm là tạo mô sẹo để nuôi dịch huyền phù về sau (cần mô sẹo xốp) và do không đủ thời gian để dò nồng độ của cả hai loại hormone, chúng tôi chọn 2,4-D là loại hormone chính để tạo mô sẹo. Bên cạnh đó bảng kết quả 4.5 cũng cho thấy, các mẫu lớp mỏng từ lóng thân cho tỷ lệ tạo sẹo lớn nhất trong khi các mẫu lá thấp nhất. Kết quả này có lẽ là do đặc điểm hình thái của cây D. burmanni Vahl: bề mặt lá của chúng mang nhiều tua cuốn khiến chúng khó tiếp xúc với môi trƣờng; các tua cuốn này lại chứa chất nhầy và nhiều loại enzyme thƣờng gây ảnh hƣởng không tốt đến các mẫu mô. Với những nhận xét trên, chúng tôi chọn nồng độ kết hợp tối ƣu cho việc tạo mô sẹo là NAA 0,2 mg/l và 2,4-D 0,2 mg/l cho mọi loại vật liệu đầu từ lớp mỏng cây D. burmanni Vahl. 52 Phát hoa TCL A: 2,4-D (0 mg/l) B: 2,4-D (0,1 mg/l) C: 2,4-D (0,2 mg/l) D: 2,4-D (0,5 mg/l) Lá TCL E: 2,4-D (0 mg/l) F: 2,4-D (0,2 mg/l) G: 2,4-D (0,3 mg/l) H: 2,4-D (0,5 mg/l) Hình 4.1: Mô sẹo đƣợc hình thành từ mẫu lớp mỏng cây D. burmanni Vahl trên môi trƣờng Gamborg’s B5, bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng độ thay đổi: 53 Hình 4.2: Mô sẹo đƣợc hình thành từ mẫu lớp mỏng lóng thân cây D. burmanni Vahl trên môi trƣờng Gamborg’s B5, bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng độ thay đổi: A: 0,1 mg/l B: 0,2 mg/l C: 0,4 mg/l D: 0,5 mg/l E: 0,2 mg/l (quan sát dƣới KHV 10 X) 54 4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù Bảng 4.6: Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg mô sẹo ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy trên các kiểu nuôi cấy khác nhau Kiểu nuôi cấy Rắn Bán rắn Lỏng tĩnh Lỏng lắc Độ tăng khối lƣợng mô sẹo (mg) 2,01 a 2,35 b 1,97 a 2,91 c Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0.05) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 D1 D2 D3 D4 Kiểu nuôi cấy Độ tă ng k hố i l ượ ng m ô sẹ o (m g) Nhận xét Bảng 4.6 và biểu đồ 4.2 cho thấy có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tăng khối lƣợng mô sẹo trên 4 kiểu nuôi cấy khác nhau. Độ tăng khối lƣợng mô sẹo ở kiểu nuôi cấy lỏng lắc là tốt nhất 291% khối lƣợng ban đầu, kế đến là kiểu nuôi cấy bán rắn 235%, môi trƣờng rắn 201%, cuối cùng là môi trƣờng lỏng tĩnh 197%. Biểu đồ 4.2: Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy. 55 Hình 4.3. A: Mô sẹo nuôi trong môi trƣờng lỏng lắc. B: Cụm tế bào quan sát dƣới kính hiển vi 40X. C: Tế bào đơn quan sát dƣới kính hiển vi 40X. Nhƣ vậy, ở các môi trƣờng dạng lỏng mô sẹo dễ hấp thụ chất dinh dƣỡng hơn môi trƣờng dạng rắn. Tuy nhiên môi trƣờng ở dạng lỏng tĩnh do các mẫu mô sẹo hoàn toàn ngập trong dịch môi trƣờng, thiếu oxi nên sau một thời gian chúng ngừng tăng trƣởng và có dấu hiệu bị hóa đen. Trái lại, ở kiểu nuôi cấy lỏng lắc, mô sẹo vừa hấp thu chất dinh dƣỡng dễ dàng vừa có sự trao đổi khí tốt hơn nên trọng lƣợng mô sẹo tăng lớn nhất. Bên cạnh đó, nhận thấy rằng khi mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng mà có thêm chuyển động lắc liên tục, các mô sẹo xốp sẽ bị tách rời, tạo các cụm tế bào và tế bào đơn trong dịch nuôi cấy. Đây chính là dạng khởi đầu của dịch huyền phù tế bào (Hình 4.3). Tuy nhiên do giới hạn về thời gian thực hiện chúng tôi chƣa nghiên cứu đƣợc những yếu tố khác để tối ƣu hóa dịch huyền phù này mà mới chỉ ở bƣớc đầu tạo đƣợc dịch huyền phù. Tóm lại qua thí nghiệm trên chúng tôi chọn kiểu nuôi cấy lỏng lắc là kiểu nuôi cấy tốt nhất để tăng sinh khối mô sẹo cũng nhƣ tạo dịch huyền phù tế bào. . A C B 56 4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hiǹh thành sắc tố đỏ của mô sẹo Bảng 4.7: Kết quả ảnh hƣởng ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo Điều kiện nuôi cấy Chiếu sáng 16h/ngày Ủ tối hoàn toàn Tỷ lệ mẫu mô sẹo có sắc tố đỏ 100 a 0 b Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (p < 0.05). Nhận xét Kết quả ở bảng 4.7 và hình 4.4 cho thấy 100% các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng đều có sắc tố đỏ trong khi nuôi hoàn toàn trong tối thì không thấy có sự hình thành sắc tố đỏ. Kết quả này bƣớc đầu cho thấy mối liên hệ giữa ánh sáng với sắc tố đỏ ở cây bắt ruồi và giải thích đƣợc một phần lý do ngoài tự nhiên cây D. burmanni thƣờng có màu đỏ hơn so với cây nuôi cấy mô. Các loại sắc tố ở thực vật ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp nhuộm, màu thực phẩm và cả dƣợc phẩm. Do vậy, việc tìm ra điều kiện hình thành sắc tố đỏ trên mô sẹo cây bắt ruồi sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu sau trong việc điều khiển sắc tố đỏ ở cây bắt ruồi với nhiều ứng dụng hữu ích. 57 Hình 4.4: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo cây D. burmanni. A, C, E: Mô sẹo đƣợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. B, D, F: Mô sẹo nuôi trong điều kiện ủ tối hoàn toàn. A B C D E F B 58 Sắc ký cột ƣớt Hệ dung môi ether dầu hỏa:chloroform (95:5) 4.2. Ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl Sơ đồ 4.1: Quy trình ly trích và cô lập hợp chất anthraquinone. Thuốc thử Borntraeger Sắc ký cột khô với dung môi benzene Định tính anthraquinone trong các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng -Sấy ở 500C, xay thành bột mịn -Ngầm dầm trong ethanol -Cô quay Cây D. burmanni in vitro Cao thô ethanol Phân đoaṇ cao benzene Sắc ký điều chế nhiều lần với hệ dung môi benzene:chloroform (3:7) Hợp chất anthraquinone 59 Hợp chất anthraquinone sau khi đƣợc cô lập từ sơ đồ 4.1, sẽ đƣợc sử dụng nhƣ chất tham chiếu cho các thí nghiệm định lƣợng bằng HPLC về sau, với độ tinh khiết ƣớc tính đạt khoảng 70%. 4.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC 4.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn Bảng 4.8: Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak Nồng độ chất tham chiếu (ppm) Diện tích peak (mAU*S) 14 67,75 28 140,87 42 218,84 56 294,46 70 361,14 Kết quả đươc̣ trích từ phụ lục 3 Đồ thị 4.1: Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone tham chiếu và giá trị diện tích peak. y = 5.2884x - 5.5029 R 2 = 0.9994 0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 20 40 60 80 Nồng độ (ppm) D iệ n tíc h pe ak (m A U *S ) 60 Hình 4.9: Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 70 ppm. Hình 4.5: Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm .ppm Hình Error! No text of specified style in document..1. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm Hình 4.6: Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm ppm Hình Error! No text of specified style in document..1. Sắ ký đồ HPLC của anthraqu none tham chiếu ở 14 ppm Hình 4.7: Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm pm Hình Error! No text of specified style in document..1. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm Hình 4.8: Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm pm Hình Error! No text of specified style in document..1. Sắ ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm 61 Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng có hệ số tƣơng quan giữa nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak là R2 ~ 1. Đây là một giá trị đáng tin cậy để khẳng định rằng nồng độ anthraquinone trong một mẫu chất có mối quan hệ tuyến tính với giá trị diện tích peak trong điều kiện chạy HPLC nhất định. Mối quan hệ này đƣợc thể hiện bằng phƣơng trình y = 5,2884x – 5,5029. Do đó đƣờng chuẩn này đƣợc sử dụng để tính hàm lƣợng anthraquinone trong các mẫu cần phân tích ở các thí nghiệm sau. 4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣơṇg hợp chất anthraquinone Hình 4.10: Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình A. Hình 4.11: Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình B. anthraquinone 62 Qua ghi nhận sắc ký đồ (Hình 4.10, 4.11) của hai mẫu cây đƣợc x ử lý theo 2 cách A, B (Sơ đồ 3.2) chúng tôi rút ra các nhận xét sau: Các mẫu cây qua giai đoạn sấy khô trƣớc khi xử lý mẫu sẽ cho các tín hiệu kết quả HPLC rõ ràng hơn các mẫu cây tƣơi: ở các mẫu cây tƣơi có xuất hiện tƣợng peak đôi trong khi các mẫu khô thì không. Nguyên nhân của hiện tƣợng này là do các chất nhớt trong mẫu tƣơi tạo độ nhớt cao cho dung dịch sắc ký. Độ nhớt này ảnh hƣởng đến tốc độ ly giải của cột cũng nhƣ độ hấp thu của mẫu phân tích. Ở các mẫu khô giai đoạn sấy đã làm mất đi phần lớn chất nhớt trong cây nên kết quả ghi nhận cải thiện đáng kể. Do giới hạn đề tài chƣa đủ thời gian để tối ƣu hơn nữa quy trình xử lý mẫu nhằm loại bớt các chất không quan tâm trong mẫu định lƣợng, kết quả sắc ký đồ còn lẫn nhiều tạp chất. Tuy nhiên, quy trình xử lý mẫu B sẽ làm tiền đề để có thể nghiên cứu hơn nữa cách loại tạp sau này. 4.3.3. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro Bảng 4.9: Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro Mẫu phân tích Mẫu thân lá Mẫu rễ Trọng lƣợng khô (mg) 300 300 Thể tích dung dịch phân tích (ml) 60 70 Y= giá trị diện tích peak (mAU*S) 728,70 682,27 X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 138,83 130,05 Hàm lƣợng anthraquinone (% so với trọng lƣợng khô) 2,78 3,03 63 Hình 4.12: Sắc ký đồ HPLC của mẫu rễ cây D. burmanni Vahl. Hình 4.13: Sắc ký đồ HPLC của mẫu thân lá cây D. burmanni Vahl. Kết quả ở bảng 4.9 và sắc ký đồ hì nh 4.12, 4.13 cho thấy hơp̣ chất anthraquinone hiêṇ diêṇ trong tất cả các bô ̣phâṇ của cây D. burmanni với hàm lƣợng tƣơng ứng là 2,78% (so với troṇg lƣơṇg khô ) ở mẫu thân lá và 3,03% ở mẫu rê.̃ So sánh với nhƣ̃ng công bố trƣớc đây về hàm lƣơṇg các hơp̣ chất quinone ở môṭ số loài Drosera thì hàm lƣợng này khá cao : theo Repcák và Galambosi (1994) [27], hàm lƣợng 7-methyljuglone trong cây D. rotundifolia là 2,7% trọng lƣợng khô và trong cây D. anglica là 2,1%; Krenn (1995) [21] cũng cho biết hàm lƣợng plumbagin trong 2 mẫu D. peltata là 0,569% và 0,305% so với trọng lƣợng khô; anthraquinone anthraquinone 64 hàm lƣợng plumbagin trong 11 mẫu D. madagascariensis dao động trong khoảng 0,002 - 0,01% so với trọng lƣợng cây khô. Tóm lạ i, kết quả này cho thấy tiềm năng rất cao của viêc̣ nuôi cấy in vitro cây D. burmanni Vahl trong thu nhâṇ hơp̣ chất quinone. Bên caṇh đó , bảng 4.9 cũng cho thấy hàm lƣợng anthraquinone trong rễ lớn hơn trong thân lá . Kết quả này đa ̃mở ra môṭ hƣớng nghiên cƣ́u có nhiều tiềm năng trong thu nhâṇ hơp̣ chất thƣ́ cấp : nuôi cấy rễ . Kỹ thuật nuôi cấy rễ t hƣc̣ vâṭ , nhằm thu nhâṇ các hơp̣ chất có nhiều trong rễ , đa ̃đƣơc̣ áp duṇg khá thành công trên thế giới, chẳng haṇ nhƣ năm 2001, Verma và ctv đa ̃sƣ̉ duṇg Agrobacterium rhizogenes để kích thích tạo rễ khi nuôi cấy Plumbago zeylanica giúp thu đƣợc hàm lƣợng plumbagin cao gấp 2,5 lần so với khi nuôi cấy ở điều kiêṇ bình thƣờng [30]. 4.3.4. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ Bảng 4.10: Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các mâũ có và không có sắc tố đỏ Mẫu phân tích Mẫu có sắc tố đỏ Mẫu không có sắc tố đỏ Trọng lƣợng khô (mg) 300 300 Thể tích dung dịch phân tích (ml) 60 60 Y= giá trị diện tích peak (mAU*S) 201,13 734,68 X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 39,07 139,96 Hàm lƣợng anthraquinone (% so với trọng lƣợng khô) 0,78 2,80 65 Hình 4.14: Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl có sắc tố đỏ. Hình 4.15: Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl không có sắc tố đỏ. Bảng 4.10 và hình 4.14, 4.15 cho thấy, hàm lƣợng anthraquinone trong các mẫu cây có sắc tố đỏ chỉ chiếm 0,78% so với trọng lƣợng khô, trong khi ở cây không có sắc tố đỏ là 2,8%. Kết quả này cũng trùng hợp với công bố của Repcák và Galambosi (1994) trên cây D. rotundifolia và D. anglica: ở những cá thể có nhiều sắc tố đỏ hàm lƣợng các quinone sẽ rất thấp [29]. Do vâỵ nếu đƣơc̣ nghiên cƣ́u tiếp về muc̣ tiêu thu nhâṇ hơp̣ chất anthraquinone , chúng ta nên tiến hành khảo sát điều khiển viêc̣ ƣ́c chế taọ sắc tố đỏ trong cây. anthraquinone anthraquinone 66 4.3.5. Thí nghiệm 9: Xác định hàm lƣợng anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 Bảng 4.11: Kết quả điṇh lƣơṇg anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù Mẫu phân tích Dịch môi trƣờng Sinh khối tế bào Trọng lƣợng tƣơi (mg) 22.000 600 Thể tích dung dịch phân tích (ml) 20 20 Y= giá trị diện tích peak (mAU*S) 0 21,70 X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 0 5,14 Hàm lƣợng anthraquinone (% so với trọng lƣợng tƣơi) 0 0,02 Hình 4.16: Sắc ký đồ HPLC của mẫu dịch môi trƣờng sau khi lọc sinh khối tế bào. Hình 4.17: Sắc ký đồ HPLC của sinh khối tế bào từ dịch huyền phù. anthraquinone 67 Ghi nhận từ bảng 4.11, hình 4.16, 4.17 cho thấy không có sự hiện diện của anthraquinone trong dịch môi trƣờng mà chỉ có trong sinh khối tế bào, điều này chứng tỏ anthraquinone có lẽ là một hợp chất thứ cấp nội bào. So sánh với một số nghiên cứu trên thế giới về sản xuất các hợp chất quinone bằng nuôi cấy huyền phù tế bào, thì kết quả này khá thấp (chỉ chiếm 0,02% so với trọng lƣợng tƣơi) trong khi ở nuôi cấy huyền phù cây D. muscipula sự sản xuất plumbagin đạt 2,59%, và ở cây D. capensis sự sản xuất 7-methyljuglone cũng đạt 0,33% [23]. Tuy nhiên , kết quả này là do chúng ta chƣa áp duṇg các điều kiêṇ tối ƣu trong nuôi cấy huyền phù nhƣ : ánh sáng, nhiêṭ đô,̣ tốc đô ̣lắc, chƣa điều khiển ƣ́c chế hình thành sắc tố đỏ,… 68 Chƣơng 5 KẾT LUÂṆ - ĐỀ NGHỊ 5. 5.1. KẾT LUẬN Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù Môi trƣờng cơ bản thích hợp nhất để tạo mô sẹo từ mẫu cắt lớp mỏng là môi trƣờng khoáng Gamborg’s B5 và nồng độ đƣờng là 20 g/l. Sự kết hợp hai loại hormone NAA và 2,4-D sẽ thích hợp nhất để cảm ứng tạo mô sẹo. Với nồng độ kết hợp tối ƣu là NAA (0,2 mg/l )/2,4-D (0,2 mg/l). Các mô sẹo xốp khi đƣợc nuôi trong môi trƣờng ở dạng lỏng kết hợp chuyển động lắc liên tục (lỏng lắc) sẽ tạo dịch huyền phù tế bào, đồng thời là kiểu nuôi cấy làm tăng sinh khối mô sẹo nhanh nhất. Khi nuôi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, các mô sẹo đều hóa đỏ. 5.1.2. Định lƣợng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC Mẫu định lƣợng cho kết quả HPLC với các tín hiệu tốt hơn nếu đƣợc sấy khô khi xử lý. Hàm lƣợng anthraquinone trong rễ là 3,03%, lớn hơn trong thân lá: 2,78 % so với troṇg lƣơṇg khô. Hàm lƣợng anthraquinone trong cây có sắc tố đỏ (0,78% so với troṇg lƣơṇg khô) ít hơn trong cây không có sắc tố đỏ (2,8%) Lƣợng anthraquinone đƣợc tạo ra bằng nuôi cấy dịch huyền phù chiếm 0,02 % so với trọng lƣợng khô và tập trung trong sinh khối tế bào, không tiết hoặc tiết rất ít ra môi trƣờng bên ngoài 69 5.2. ĐỀ NGHỊ Khảo sát thêm các điều kiện điều khiển việc tạo sắc tố đỏ trong nuôi cấy D. burmanni Vahl. Cảm ứng tạo rễ D. burmanni Vahl nhằm nghiên cƣ́u taọ nguồn nguyên liêụ có hàm lƣợng hợp chất anthraquinone cao . Tối ƣu hóa các điều kiêṇ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào để thu nhận lƣợng lớn hơn anthraquinone bao gồm các yếu tố: hormone, ánh sáng, tốc độ lắc… Nghiên cƣ́u tƣ ̣đôṇg hóa nuôi cấy sinh khối tế bào D. burmanni Vahl trong các bình nuôi cấy điểu khiển tự động nhƣ bioreactor . Thử nghiệm các phƣơng pháp tăng sinh hơp̣ chất anthraquinone trong nuôi cấy dic̣h huyền phù , tế bào đơn nhƣ: - Chọn lọc dòng tế bào cho năng suất cao. - Bổ sung tiền chất. - Sƣ̉ duṇg các nhân tố cảm ƣ́ng (elicitor). - Gây đôṭ biến,… Tìm các điều kiện để tối ƣu quy trình định lƣợng anthraquinone bằng kỹ thuật HPLC 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: 1. Đỗ Đăng Giáp , 2003. Khảo sát, sưu tập, thuần dưỡng và thử nghiệm in vitro trên những loài cây bắt mồi ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu. Khóa luận cử nhân khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đaị hoc̣ Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 2. Đỗ Tất Lợi , 1999. Cây thuốc và vi ̣thuốc Viêṭ Nam . Nhà xuất bản Y học , TP. Hồ Chí Minh. 3. Hồ Thuỵ Bích Tuyền , 2006. Ly trích và khảo sát hoaṭ tính sinh hoc̣ của hơp̣ chất quinone từ cây Drosera burmanni Vahl nuôi cấy in vi tro. Khóa luận cử nhân khoa hoc̣ . Đaị hoc̣ Khoa hoc̣ Tƣ ̣nhiên , ĐH Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 4. Lê Trần Đƣ́c. Cây thuốc Viêṭ Nam – trồng, hái, chế biến, trị bệnh đau đầu. 5. Nguyêñ Đaị Hải , 2006. Nuôi cấy mô cây bắt ruồi (Drosera burmanni Vahl), khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất chiết thô Plumbagin . Luâṇ văn tốt nghiêp̣ ky ̃sƣ công nghê ̣sinh hoc̣, ĐH Nông Lâm, TP. HCM. 6. Nguyêñ Đƣ́c Lƣơṇg , 1998. Công nghê ̣sinh hoc̣ , Đaị hoc̣ Ky ̃thuâṭ , TP. Hồ Chí Minh. 7. Nguyêñ Đƣ́c Lƣơṇg , Lê Thi ̣ Thủy Tiên , 2002. Công nghê ̣tế bào . Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, TP. Hồ Chí Minh. 376 trang. 8. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2001. Các phương pháp nhận danh, trích ly và cô lập các hợp chất hữu cơ. Giáo trình cao học chuyên ngành Hóa hữu cơ , Đaị học Khoa học Tự nhiên, TP. HCM. 71 9. Nguyễn Thanh Bảo, 2003. Vi khuẩn học, Bộ Y tế , ĐH Y-Dƣợc TP . Hồ Chí Minh, tr. 40-93. 10. Phạm Hoàng Hộ, 1993. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Giáo dục , TP. Hồ Chí Minh. 11. Phạm Hoàng Hộ, 1994. Cây có vị thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Y học , TP. Hồ Chí Minh. 12. Quách Ngô Diễm Phƣơng , 2006. Khảo sát hợp chất naphthoquinone có hoạt tính sinh học được tách chiết từ cây bắt ruồi Drosera indica L . nuôi cấy in vitro. Luâṇ văn thac̣ sỹ khoa hoc̣. Đaị hoc̣ Khoa hoc̣ Tƣ ̣nhiên, Đaị hoc̣ Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 13. Trần Thi ̣ Bích Chiêu , 2004. Khảo sát vòng đời và tái tạo chồi từ phát hoa cây bắt ruồi in vitro (Drosera burmanni Vahl). Khóa luận cử nhân khoa học . Đaị học Khoa học Tự nhiên, TP. Hồ Chí Minh. 14. Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến, 1978. Phân loại thực vật bậc cao, Nhà xuất bản Giáo dục, TP. HCM, tr. 342-346. 15. Võ Văn Chi, Trần Hợp, 1999. Cây cỏ có ích ở Việt Nam. Nhà xuất bản Giáo dục, TP. Hồ Chí Minh, tr. 342-346. 16. Vũ Văn Vụ, 1999. Sinh lý thưc̣ vâṭ ứng duṇg. Nhà xuất bản Giáo dục. Tài liệu tiếng Anh: 17. Crouch I. J., Finnie J. F., van Staden J., 1990. Studies on the isolation of plumbagin from in vivo and in vitro grown Drosera species. Plant Cell Tiss Org Cult 21: 78-82. 72 18. Dicosmo F., Misawa M., 1985. Elicitation secondary metabolismin plant cell cultures.Trends Biotechnol 3: 318-322. 19. Dipanjan G., 2003, Project Lifescape – 11: Hunter Plants. Resonance: 64 – 70. 20. George E. F., 1993. Plant propagation on by tissue culture, Biotechnology exegietics Ltd: 14-25. 21. Harborne J. B., 1967. Comparative biochemistry of flavonoid-IV. Phytochemistry 6: 1415-1428. 22. Hazra B., Sarma D. M., Sanyal U., 2004. Seperation methods of quinonoid constituents of plants used in Oriental traditional medicines. Journal of Chromatography B 812: 259-275. 23. Hook L. I. Ingrid, 2001. Naphthoquinone contents of in vitro cultured plants and cell suspensions of Dionaea muscipula and Drosera species. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 67 (3): 281-285. 24. Jayaram K., Prasad M. N. V., 2005. Rapidly in vitro multipled Drosera as reliable source for plumbagin bioprospection. Current science 89: 447-448. 25. Kawiak A., Krolicka A., LoJkowska E., 2003. Direct regeneration of Drosera from leaf explants and shoot tips. Plant cell, Tissue and Organ Culture 75: 211-214. 26. Ketchum R. E. B., Gibson D. M., Croteau R. B., Shuler M. L., 1999. The kinetics of taxoid accumulation in cell suspension cultures of Taxus following elicitation with methyljasmonate. Biotechnology Bioeng 62: 97- 105. 73 27. Kitanov G. M., Pashankov P. P., 1994. Quantitative investigation on the dynamics of plumbagin in Plumbago europea L. roots and herb by HPLC. Pharmazie 49 (6): 462. 28. Nahálka J ., Blanárik P ., Geimeiner P ., Matúsová E ., Partlová I ., 1996. Production of plumbagin by cell suspension cultures of Drosophyllum lusitanium Link. Journal of Biotechnology 49: 153-161. 29. Samaj J., Blehová A., Repcák M., Ovecka M., and Bobák M., 1999. Drosera Species (Sundew): In vitro culture and the production of plumbagin and other secondary metabolites. Biotechnology in Agriculture and Forestry 43: 105-135. 30. Verma P.C., Singh D., Rahman L.u., Gupta M.M., Banerjee S., 2002. In vitro-studies in Plumbago zeylanica: rapid micropropagation and establishment of higher plumbagin yielding hairy root cultures. Journal of Plant Physiology 159: 547-552. 31. Verpoorte R., Van der Heijden R., Hoge J. H. C., and Hoopen H. J. G., 1994. Plant cell biotechnology for production of secondary metabolites. Pure & Appl. Chem 66: 2307-2310. 32. Wu-Che Weng and Shuenn-Jyi Sheu, 1999. Separation of Anthraquinones by Capillary Electrophoresis and High-Performance Liquid Chromatography. Journal of High Resolution chromatography 23: 134-148. Tài liệu từ internet: 33. Seed Bank.html. 34. result.cfm?Genus=Drosera&Species=burmanni&source=plants&tabname= all~main 74 35. nid=6A16urs1FQA_hM:&tbnh=89&tbnw=134&hl=vi&start=10&prev=/im ages%3Fq%3DDrosera%Burmanni%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%261r %3D%26sa%3DG 36. 37. dew&gwp=8&curtab=2222_1&linktext=Drosera 38. 39. 40. ://florabase.calm.wa.gov.au/browse/flora%3Ff%3D143%26level%3Ds%26i d%3D3093&h=384&w=512&sz=36&hl=vi&start=2&um=1&tbnid=N4xmzI 41. 42. 43. 44. 45. 75 46. 5LTGBH 47. regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/ Keusch/D-CC-e.htm 48. PHỤ LỤC Phụ lục 1 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy thƣc̣ vâṭ Đơn vị: mg/l Phụ lục 2 Phụ lục 2.1: Thí nghiệm 1 Analysis of Variance for ASTTTHU.KETQUA - Type III Sums of Squares Thành phần MS (Murashige and Skoog, 1962) Gamborg’s B5 (1968) ĐA LƢỢNG NH4NO3 (NH4 )2 SO4 KNO3 CaCl2.2H2 O MgSO4.7H2 O KH2PO4 NaH2PO4.H2O VI LƢỢNG FeSO4.7 H2O NaEDTA MnSO4. 4H2O MnSO.H2O . ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4 .2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O VITAMINS Myo-inositol Nicotinic acid Pyridoxine.HCl Thiamine.HCl Glycine 1.650 1.900 440 370 170 27,8 37,26 22,3 8,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025 100 0,5 0,5 0,1 2,0 134 2.500 150 250 130,5 27,8 37,26 10 2,0 3,0 0,75 0,25 0,025 0,025 100 1,0 1,0 10 -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:ASTTTHU.LOAIMOITRU 466.66667 2 233.33333 25.846 .0000 B:ASTTTHU.NONGDODUON 280.55556 3 93.51852 10.359 .0001 INTERACTIONS AB 1111.1111 6 185.18519 20.513 .0000 RESIDUAL 216.66667 24 9.0277778 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 2075.0000 35 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for ASTTTHU.KETQUA -------------------------------------------------------------------------------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean -------------------------------------------------------------------------------- GRAND MEAN 36 15.833333 .5007710 14.799547 16.867120 A:ASTTTHU.LOAIMOITRU 1 12 12.500000 .8673608 10.709429 14.290571 2 12 14.166667 .8673608 12.376095 15.957238 3 12 20.833333 .8673608 19.042762 22.623905 B:ASTTTHU.NONGDODUON 1 9 12.777778 1.0015420 10.710204 14.845351 2 9 16.666667 1.0015420 14.599093 18.734240 3 9 20.000000 1.0015420 17.932426 22.067574 4 9 13.888889 1.0015420 11.821315 15.956463 AB 1 1 3 16.666667 1.7347217 13.085524 20.247809 1 2 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809 1 3 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809 1 4 3 10.000000 1.7347217 6.418857 13.581143 2 1 3 8.333333 1.7347217 4.752191 11.914476 2 2 3 18.333333 1.7347217 14.752191 21.914476 2 3 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809 2 4 3 18.333333 1.7347217 14.752191 21.914476 3 1 3 13.333333 1.7347217 9.752191 16.914476 3 2 3 20.000000 1.7347217 16.418857 23.581143 3 3 3 36.666667 1.7347217 33.085524 40.247809 3 4 3 13.333333 1.7347217 9.752191 16.914476 ------------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for ASTTTHU.KETQUA by ASTTTHU.NONGDODUON -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 9 12.777778 X 4 9 13.888889 XX 2 9 16.666667 X 3 9 20.000000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -3.88889 2.92399 * 1 - 3 -7.22222 2.92399 * 1 - 4 -1.11111 2.92399 2 - 3 -3.33333 2.92399 * 2 - 4 2.77778 2.92399 3 - 4 6.11111 2.92399 * -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for ASTTTHU.KETQUA by ASTTTHU.LOAIMOITRU -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 12 12.500000 X 2 12 14.166667 X 3 12 20.833333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -1.66667 2.53225 1 - 3 -8.33333 2.53225 * 2 - 3 -6.66667 2.53225 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 2.2: thí nghiệm 2 One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: LOAIHOR.KETQUA Level codes: LOAIHOR.LOAIHORMON Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1136.2867 2 568.14333 504.767 .0000 Within groups 6.7533 6 1.12556 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 1143.0400 8 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for LOAIHOR.KETQUA by LOAIHOR.LOAIHORMON -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 25.166667 .7666667 .6125236 24.106540 26.226793 2 3 2.933333 .7333333 .6125236 1.873207 3.993460 3 3 .000000 .0000000 .6125236 -1.060127 1.060127 -------------------------------------------------------------------------------- Total 9 9.366667 .3536407 .3536407 8.754602 9.978731 Multiple range analysis for LOAIHOR.KETQUA by LOAIHOR.LOAIHORMON -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 3 .000000 X 2 3 2.933333 X 1 3 25.166667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 22.2333 2.12025 * 1 - 3 25.1667 2.12025 * 2 - 3 2.93333 2.12025 * -------------------------------------------------------------------------------- Mục lục 2.3: Thí nghiệm 3 One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: PHATHOA.ketqua Level codes: PHATHOA.nghiemthuc Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 3922.5044 5 784.50089 22.714 .0000 Within groups 414.4533 12 34.53778 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 4336.9578 17 Table of means for PHATHOA.ketqua by PHATHOA.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 5.533333 2.7666667 3.3930212 .304514 10.762153 2 3 22.233333 2.7666667 3.3930212 17.004514 27.462153 3 3 52.766667 2.7666667 3.3930212 47.537847 57.995486 4 3 36.100000 2.8000000 3.3930212 30.871181 41.328819 5 3 19.466667 2.7666667 3.3930212 14.237847 24.695486 6 3 22.233333 5.5333333 3.3930212 17.004514 27.462153 -------------------------------------------------------------------------------- Total 18 26.388889 1.3851951 1.3851951 24.254232 28.523545 Multiple range analysis for PHATHOA.ketqua by PHATHOA.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 5.533333 X 5 3 19.466667 X 2 3 22.233333 X 6 3 22.233333 X 4 3 36.100000 X 3 3 52.766667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -16.7000 10.4576 * 1 - 3 -47.2333 10.4576 * 1 - 4 -30.5667 10.4576 * 1 - 5 -13.9333 10.4576 * 1 - 6 -16.7000 10.4576 * 2 - 3 -30.5333 10.4576 * 2 - 4 -13.8667 10.4576 * 2 - 5 2.76667 10.4576 2 - 6 0.00000 10.4576 3 - 4 16.6667 10.4576 * 3 - 5 33.3000 10.4576 * 3 - 6 30.5333 10.4576 * 4 - 5 16.6333 10.4576 * 4 - 6 13.8667 10.4576 * 5 - 6 -2.76667 10.4576 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: THAN.ketqua Level codes: THAN.nghiemthuc Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 9890.8050 5 1978.1610 128.438 .0000 Within groups 184.8200 12 15.4017 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 10075.625 17 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for THAN.ketqua by THAN.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 .000000 .0000000 2.2658087 -3.491727 3.491727 2 3 38.900000 2.8000000 2.2658087 35.408273 42.391727 3 3 72.233333 2.7666667 2.2658087 68.741606 75.725060 4 3 55.533333 2.7666667 2.2658087 52.041606 59.025060 5 3 50.000000 .0000000 2.2658087 46.508273 53.491727 6 3 22.233333 2.7666667 2.2658087 18.741606 25.725060 -------------------------------------------------------------------------------- Total 18 39.816667 .9250125 .9250125 38.391175 41.242158 Multiple range analysis for THAN.ketqua by THAN.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 .000000 X 6 3 22.233333 X 2 3 38.900000 X 5 3 50.000000 X 4 3 55.533333 X 3 3 72.233333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -38.9000 6.98345 * 1 - 3 -72.2333 6.98345 * 1 - 4 -55.5333 6.98345 * 1 - 5 -50.0000 6.98345 * 1 - 6 -22.2333 6.98345 * 2 - 3 -33.3333 6.98345 * 2 - 4 -16.6333 6.98345 * 2 - 5 -11.1000 6.98345 * 2 - 6 16.6667 6.98345 * 3 - 4 16.7000 6.98345 * 3 - 5 22.2333 6.98345 * 3 - 6 50.0000 6.98345 * 4 - 5 5.53333 6.98345 4 - 6 33.3000 6.98345 * 5 - 6 27.7667 6.98345 * -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: LA.ketqua Level codes: LA.nghiem_thu Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 714.60667 5 142.92133 9.224 .0008 Within groups 185.93333 12 15.49444 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 900.54000 17 Table of means for LA.ketqua by LA.nghiem_thu -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 8.300000 .0000000 2.2726229 4.797772 11.802228 2 3 16.700000 .0000000 2.2726229 13.197772 20.202228 3 3 27.766667 2.7666667 2.2726229 24.264438 31.268895 4 3 22.233333 2.7666667 2.2726229 18.731105 25.735562 5 3 13.900000 2.8000000 2.2726229 10.397772 17.402228 6 3 13.900000 2.8000000 2.2726229 10.397772 17.402228 -------------------------------------------------------------------------------- Total 18 17.133333 .9277944 .9277944 15.703555 18.563112 Multiple range analysis for LA.ketqua by LA.nghiem_thu -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 8.300000 X 5 3 13.900000 XX 6 3 13.900000 XX 2 3 16.700000 XX 4 3 22.233333 XX 3 3 27.766667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -8.40000 7.00446 * 1 - 3 -19.4667 7.00446 * 1 - 4 -13.9333 7.00446 * 1 - 5 -5.60000 7.00446 1 - 6 -5.60000 7.00446 2 - 3 -11.0667 7.00446 * 2 - 4 -5.53333 7.00446 2 - 5 2.80000 7.00446 2 - 6 2.80000 7.00446 3 - 4 5.53333 7.00446 3 - 5 13.8667 7.00446 * 3 - 6 13.8667 7.00446 * 4 - 5 8.33333 7.00446 * 4 - 6 8.33333 7.00446 * 5 - 6 0.00000 7.00446 -------------------------------------------------------------------------------- Phụ lục 2.4: thí nghiệm 4 One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: SG4KIEU.ketqua Level codes: SG4KIEU.nghiemthuc Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.7196917 3 .5732306 42.858 .0000 Within groups .1070000 8 .0133750 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 1.8266917 11 Table of means for SG4KIEU.ketqua by SG4KIEU.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 2.0100000 .0208167 .0667708 1.9010937 2.1189063 2 3 2.3466667 .0676593 .0667708 2.2377604 2.4555729 3 3 1.9666667 .0726483 .0667708 1.8577604 2.0755729 4 3 2.9133333 .0868588 .0667708 2.8044271 3.0222396 -------------------------------------------------------------------------------- Total 12 2.3091667 .0333854 .0333854 2.2547135 2.3636198 Multiple range analysis for SG4KIEU.ketqua by SG4KIEU.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 3 1.9666667 X 1 3 2.0100000 X 2 3 2.3466667 X 4 3 2.9133333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.33667 0.21781 * 1 - 3 0.04333 0.21781 1 - 4 -0.90333 0.21781 * 2 - 3 0.38000 0.21781 * 2 - 4 -0.56667 0.21781 * 3 - 4 -0.94667 0.21781 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 3