Khóa luận Khảo sát, phân tích và so sánh chất lượng mùi thơm của một số giống lúa thơm trồng ở Đồng bằng sông Cửu Long bằng phương pháp SPME - GC

VD20, ST3, OM3536. - Hoá chất sử dụng: ethanol (Merck), acetone (Merck), methanol (Merck), 2,4,6- collidine (2,4,6-trimethyl pyridine) (Merck), nonanal (Merck), hexanal (Merck), hexanol (Merck), tetradecane (Merck), octanol (Merck), decanal (Merck), pentanol (Merck), KOH (Merck). - Dụng cụ và thiết bị: Tủ mát, Darling (Việt Nam). Tủ lạnh, Hitachi (Japan). Máy bóc vỏ trấu TR200 (Nhật) Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức). Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Agilent Technologies (Mỹ). Máy sắc ký khối phổ HP 6890 N (G1530N) – Agilent Technologies (Mỹ). Kim SPME (SupelcoTM SPME fiber holder) – Bellefonte, PA (Mỹ). Máy nhiệt từ, Ikamag (Đức). Bồn siêu âm Power sonic 510 – Hwashin Technology Co. (Hàn Quốc). Tủ sấy, Memmert (Đức). 23 23 Kìm đóng nắp, Mỹ. Micropippet loại 10 – 100 μl, đầu típ 100 μl, cá từ, nắp nhôm. Lọ bi 10ml, Agilent (Mỹ). Bình tam giác 250 ml (Trung Quốc). Kéo, đĩa petri, khay nhựa, xô nhựa (loại 10 lít), giấy lọc Walkman, bao plastic, bình định mức 25 ml, 10ml, 50ml. 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát sự biến đổi các hợp chất thơm ở cây lúa qua các thời kì sinh trƣởng. So sánh hàm lƣợng các hợp chất thơm giữa 4 giống Jasmine, OM3536, ST3, VD20. Xác định lại hệ số phản hồi của 2 – acetyl – 1 - pyrroline theo nồng độ 8 chất chuẩn: 2,4,6-collidine (2,4,6-trimethyl pyridine), nonanal, hexanal, hexanol, tetradecane, octanol, decanal, pentanol. 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phƣơng pháp trồng lúa - Xử lí hạt: Ngâm hạt giống 24 giờ, để qua đêm ở nhiệt độ phòng. - Chuyển hạt sang đĩa petri có lót giấy lọc, giữ ẩm. - Sau 3 ngày, khi hạt đã nhú rễ và mầm, chuyển hạt sang cát, giữ ẩm. - Khi cây có 2-3 lá mầm, chuyển sang chậu đất (5cây/xô) và đặt trong nhà lƣới, tƣới nƣớc thƣờng xuyên (giữ lớp nƣớc khoảng 2cm). - Sau 45 ngày, tiến hành bón phân cho cây theo tỉ lệ N/P/chậu là 0.5g/0.25g/xô. 24 3.4.2. Chiết xuất hợp chất bay hơi có trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME 3.4.2.1. Dụng cụ sử dụng cho kỹ thuật SPME Hình 3.1. Cấu tạo sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME Sợi chiết đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SPME là một đoạn sợi quang học có chứa silica biến tính, ngắn và mỏng (dài khoảng 1 cm, đƣờng kính ngoài cỡ 0,11 mm), đƣợc bao phủ bên ngoài bởi một lớp polymer mỏng (ví dụ polydimethylsiloxane) (hình 3.1). Sợi chiết này khá ổn định cả ở nhiệt độ cao và có cấu tạo hóa học tƣơng nhƣ phía bên trong của cột mao quản silica biến tính sử dụng trong phƣơng pháp sắc ký khí. Sợi chiết đƣợc gắn với một cần kim loại, tất cả đƣợc đặt trong ống kim loại bảo vệ. Để thuận tiện khi sử dụng, toàn bộ hệ sợi chiết và các bộ phận phụ trợ đƣợc bố trí theo kiểu xyranh (hình 3.2). 25 25 Hình 3.2. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME Nhiều loại pha tĩnh tẩm cho sợi chiết đƣợc nghiên cứu với mục đích chiết các nhóm chất khác nhau. Giống nhƣ qui tắc khi lựa chọn cột sắc ký khí “các chất giống nhau dễ hòa tan trong nhau”, pha tĩnh tẩm sợi chiết cũng đƣợc lựa chọn trên cơ sở độ chọn lọc đối với các chất cần phân tích đã định và khả năng bay hơi của những chất này. Các pha tĩnh không phân cực (ví dụ: polymethylsiloxan) lƣu giữ hydrocacbon rất tốt. Ngƣợc lại, pha tĩnh phân cực (nhƣ polyacrylat và cacbowax) lại chiết đƣợc các hợp chất phân cực nhƣ phenol, acid cacboxylic rất hiệu quả. Ái lực của pha tĩnh đối với chất cần phân tích có tính chất quyết định trong việc lấy mẫu theo SPME vì cả nền mẫu và pha tĩnh đều cạnh tranh trong tƣơng tác với chất phân tích. Ví dụ, một pha tĩnh đƣợc lựa chọn để chiết các chất phân cực ra khỏi nƣớc phải có ái lực với chất phân tích mạnh hơn ái lực của nƣớc với chất đó thì mới có thể thực hiện đƣợc quá trình chiết theo yêu cầu. 26 3.4.2.2. Các bƣớc thực hiện trong kỹ thuật vi chiết xuất trên pha rắn Kỹ thuật chiết SPME gồm 2 giai đoạn: (1) phân bố chất phân tích giữa mẫu và pha tĩnh của sợi chiết, (2) chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp từ pha tĩnh của sợi chiết và chuyển vào thiết bị phân tích [34]. Hình 3.3. Các kỹ thuật chiết dùng trong phƣơng pháp SPME Để thực hiện quá trình chiết, mẫu nƣớc chứa chất hữu cơ hoặc mẫu rắn chứa chất hữu cơ dễ bay hơi cần phân tích đƣợc đặt trong lọ, đóng kín bằng nút có septum. Khi lấy mẫu, ống kim loại bảo vệ chứa sợi chiết SPME đâm xuyên qua septum, sau đó pittông sẽ đẩy sợi chiết lộ ra khỏi ống kim loại bảo vệ. Sợi chiết đƣợc nhúng vào mẫu lỏng hoặc nằm trong không gian hơi phía trên pha mẫu (headspace) (hình 3.3). Chất phân tích đƣợc chiết từ mẫu vào pha tĩnh của sợi chiết. Sau thời gian hấp phụ, sợi chiết đƣợc kéo vào trong lòng ống bảo vệ, rồi rút ra khỏi lọ đựng mẫu. Sau đó ống bảo vệ chứa sợi chiết đƣợc đƣa vào bộ phận bơm mẫu của sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng cao áp, pittông lại đẩy sợi chiết ra khỏi ống bảo vệ. Lúc này, sợi chiết tiếp xúc với môi trƣờng nhiệt độ cao trong bộ phận bơm mẫu của GC, các chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp nhiệt và chuyển vào cột sắc ký khí. Trong HPLC, dung môi đƣợc sử dụng để giải hấp chất phân tích khỏi sợi chiết. Sau các 27 27 quá trình giải hấp này, sợi chiết lại đƣợc kéo vào lòng ống bảo vệ và rút ra khỏi bộ phận bơm mẫu. 3.4.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp SPME trong chiết xuất hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline Grimm và ctv (2001) đã ứng dụng kỹ thuật SPME để khảo sát qui trình phân tích hàm lƣợng 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong gạo thơm [33]. Theo họ, lƣợng 2 – AP thu đƣợc sẽ tăng gấp đôi khi tăng nhiệt độ từ 60oC lên 85oC. Ngƣợc lại, hàm lƣợng chất chuẩn 2,4,6 – trimethylpyridine sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. Không có sự khác biệt đáng kể về hàm lƣợng 2 – AP khi chiết xuất mẫu ở 80°C và 85°C, do đó, 80 °C đƣợc xem là điểm nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết suất. Khoảng thời gian từ 10 – 15 phút đủ để thu nhận hầu hết các chất bay hơi, trong khi những thành phần ít bay hơi hơn nhƣ acid hữu cơ hay ester phải tốn hàng giờ mới có thể thu nhận đƣợc. Sau khi so sánh lƣợng 2 – AP thu đƣơc sau khoảng thời gian hấp phụ là 10, 15, 20 phút, họ đã rút ra kết luận thời gian chiết xuất mẫu phù hợp nhất là 15 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc thêm nƣớc vào mẫu gạo sẽ giúp tăng hàm lƣợng 2 – AP thu nhận đƣợc, đồng thời giảm đƣợc yêu cầu phải nghiền mẫu, góp phần đơn giản hóa quá trình chuẩn bị mẫu. Lƣợng nƣớc cất tối ƣu sử dụng cho quá trình chiết suất là 200 µl. Để xác định lƣợng 2 – AP hấp thu, diện tích peak đƣợc chuyển thành khối lƣợng bằng cách dựng đƣờng chuẩn dựa trên chuẩn 2 – AP pha loãng trong CHCl3. Theo kết quả nghiên cứu của Casey và ctv (2001), hàm lƣợng 2 – AP trung bình thu đƣợc trong mẫu gạo Jasmine khi phân tích bằng phƣơng pháp SPME là 2,2 ng trong 0,75 g gạo, tƣơng đƣơng với 2,9 ppb. Phƣơng pháp SPME phù hợp cho việc so sánh mối tƣơng quan về nồng độ 2 – AP giữa các mẫu gạo khác nhau. Nhìn chung, trong tất cả các trƣờng hợp, phƣơng pháp SPME có thể phân biệt giữa gạo thơm và gạo thông thƣờng. Cấu tử 2 – AP đƣợc phân tách ở 5 phút 42 giây, và chỉ chiếm 1 lƣợng nhỏ trong tổng số các chất bay hơi, nhƣng lƣợng này đủ để chiếm ƣu thế trong thành phần chất thơm có trong cơm gạo. 28  Cách tiến hành: - Tiến hành thu mẫu lá (3 tuần/lần, 3cây/giống). - Lấy toàn bộ cả phần rễ cây, rửa sạch đất, cho vào bao plastic với một ít nƣớc ngập rễ. Bảo quản ở nhiệt độ mát. - Phân tích hàm lƣợng 2AP trong lá, hạt theo phƣơng pháp vi chiết xuất trên pha rắn SPME (theo Ringuet J., 2005 và Phan Phƣớc Hiền, 2005) [50, 48]: + Chuẩn bị mẫu: cắt bỏ rễ, thân, cắt nhỏ 0,5g ± 0,01g lá (hoặc 1,0g ± 0,01g hạt) cho vào vial, thêm 200µl KOH 0,1N, đậy nắp. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ mát, khi phân tích phải rã đông trƣớc 30 phút. + Thực hiện qui trình phân tích SPME-GC với chu trình nhiệt nhƣ sau: Qui trình SPME-GC Cân 0,5g lá/ 1g hạt Ủ ở 80oC trong 5phút Nhúng sợi chiết vào lọ bi trong 15phút ở 80oC Bơm mẫu vào máy GC Sơ đồ 3.1. Qui trình phân tích hợp chất bay hơi trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME 29 29  Thuyết minh qui trình: Cân 0,5 ± 0,01g lá (hoặc 1,0g ± 0,01g hạt) cho vào lọ bi 10 ml, thêm 200 μl KOH 0,1N vào lọ, đậy nắp. Cho vào bộ giữ nhiệt của máy khuấy từ đã đƣợc thiết lập ở nhiệt độ 80 0C, 250 vòng/phút trong 5 phút. Đây là giai đoạn ủ để các chất bay hơi trong lá/ hạt và phần không khí có trong lọ đạt đƣợc pha cân bằng trƣớc khi tiến hành chiết xuất. Sau 5 phút, nhúng sợi chiết vào lọ bi. Đây chính là giai đoạn chiết xuất các chất bay hơi có trong lá/ hạt. Giai đoạn hấp phụ này kéo dài trong 15 phút ở 800C. Trong giai đoạn này các chất bay hơi trong lá/ hạt sẽ đƣợc hấp phụ vào sợi chiết. Sau khi kết thúc giai đoạn chiết xuất, bơm mẫu vào máy GC để bắt đầu giai đoạn phân tích các cấu tử bay hơi có trong lá/ hạt. Hình 3.4. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME (DVB/CAR/PDMS) 3.4.3. Định tính và định lƣợng hợp chất thơm 2 – AP trong lá và hạt lúa bằng GC và GC/MS 2 – acetyl – 1 – pyrroline đƣợc định danh bằng hệ thống máy GC/MS và định lƣợng trên GC. Chƣơng trình nhiệt và các thông số thực nghiệm đƣợc điều chỉnh trên GC, các thông số này đƣợc tối ƣu hóa và áp dụng trên GC/MS. 30 3.4.3.1. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí Hình 3.5. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa FID Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và detector. Nhờ có khí mang, mẫu từ buồng bay hơi đƣợc dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lƣợt đi vào detector, tại đó chúng đƣợc chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này đƣợc khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu đƣợc xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lƣu kết quả . Trên sắc đồ nhận đƣợc, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử đƣợc tách gọi là peak. Thời gian lƣu của peak là đại lƣợng đặc trƣng (định tính) cho chất cần tách. Còn diện tích của peak là thƣớc đo định lƣợng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu. 31 31 3.4.3.2. Detector Hình 3.6. Sơ đồ cấu tạo hình học của detector ion hóa ngọn lửa Detector có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lƣợng không điện (trong trƣờng hợp này là nồng độ của các chất đƣợc tách khỏi cột sắc ký) thành đại lƣợng điện. Ngày nay, đã có gần 30 loại detector khác nhau. Trong đó, 3 loại detector phổ biến nhất là: detector dẫn nhiệt (TCD), detector ion hóa ngọn lửa (FID) và detector cộng kết điện tử (ECD). Detector FID (hình 3.6) là một trong những detector có độ nhạy cao. Nguyên tắc làm việc của nó dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa hydro đặt trong một điện trƣờng khi có chất hữu cơ cần tách chuyển qua. Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ từ cột tách đi vào detector bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có oxy của không khí để tạo thành các ion trái dấu tƣơng ứng. Các ion tạo thành đƣợc chuyển về các bản điện cực trái dấu nằm ở hai phía của ngọn lửa. Dòng ion đó đƣợc giảm áp trên một điện trở có trị số rất cao (108 – 1012 Ω) và độ giảm hiệu điện thế này đƣợc khuếch đại và ghi lại trên máy tự ghi. Số lƣợng ion tạo thành (chính là độ nhạy của detector) phụ thuộc vào các yếu tố sau: Cấu trúc hình học của detector Tỉ lệ thành phần hydro/không khí Nhiệt độ của ngọn lửa 32 Cấu trúc của các phân tử mẫu cần xác định Các hợp chất hữu cơ đƣợc đốt cháy bằng ngọn lửa hydro – không khí tạo thành các ion. Khí mang từ cột sẽ đƣợc trộn trƣớc với hydro và đốt cháy bằng ngọn lửa ở buồng đốt. Một điện cực hình trụ đƣợc đặt cách vài milimet phía trên ngọn lửa để thu thập các ion sinh ra. Dòng ion này sẽ đƣợc đo bằng cách đặt một hiệu điện thế giữa đầu phun của ngọn lửa và điện cực hình trụ. Để hạn chế đến mức tối đa sự tái kết hợp của các ion, phải đặt điện thế chọn lọc vào vùng bão hòa (vùng mà khi tăng điện thế sẽ không làm tăng dòng ion). Các tín hiệu tạo thành sẽ đƣợc khuếch đại bằng bộ khuếch điện tử rồi qua bộ xử lý và ghi tín hiệu. Detector FID sử dụng thích hợp nhất đối với các hợp chất chứa cacbon. 3.4.3.3. Cột mao quản Sắc ký khí mao quản là một hình thái đặc biệt của phƣơng pháp sắc ký khí, đƣợc đặc trƣng bởi năng suất tách và hiệu suất phân giải rất cao. Sở dĩ nhƣ vậy là nhờ việc sử dụng các cột mao quản hở với chiều dài khá lớn (25m, 50m, 100m,...). Cột mao quản (hình 3.7) là loại cột tách với đƣờng kính nhỏ hơn 1mm và thành trong của cột đƣợc tẩm pha tĩnh. Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ đƣa mẫu đi qua cột tách rất dài (do vậy năng suất rất cao) mà không gặp trở kháng gì lớn (về độ chênh lệch áp suất), các cấu tử sẽ tƣơng tác với pha tĩnh bám trên thành cột và đƣợc pha tĩnh lƣu giữ lại với mức độ khác nhau,… Hình 3.7. Cột mao quản 33 33  Điều kiện chạy máy GC-FID: Inlet: bơm mẫu ở chế độ không chia dòng Cột Model No: Agilent 19091J – 113 HP-5 5% Phenyl Methyl Siloxane, 30m x 320 μm x 0,5 μm Tốc độ dòng: 2,4ml/phút Nhiệt độ lò: 40oC Detector FID: 2500C Dòng H2: 30ml/phút Dòng không khí: 300ml/phút Dòng N2: 30ml/phút Chƣơng trình nhiệt: nhiệt độ ban đầu 400C giữ trong 5 phút, tăng 30C/1 phút cho đến khi đạt 1150C, tăng 300C/1 phút cho đến khi đạt 2200C, giữ ở 2200C trong 5 phút. Thời gian tổng cộng: 38 phút 30 giây.  Điều kiện chạy máy GC-MS: Inlet: bơm mẫu ở chế độ không chia dòng Cột Agilent 19091J – 413 HP-5, 0,25 mm x 30 m x 0,25 m. Nhiệt độ lò: 40oC Đầu dò MS: 250oC Chƣơng trình nhiệt: nhiệt độ ban đầu 400C giữ trong 5 phút, tăng 30C/1 phút cho đến khi đạt 1150C, tăng 300C/1 phút cho đến khi đạt 2200C, giữ ở 2200C trong 5 phút. Thời gian tổng cộng: 38 phút 30 giây. Hình 3.3 Máy sắc ký khí ghép khối ph Hình 3.9. Máy sắc ký khí ghép khối phổ HP6890N (G1540N) Hình 3.8. Máy sắc ký khí HP6890N (G1540N) 34 3.4.4. Xác định hệ số phản hồi của 2 – AP Hệ số phản hồi là thông số cần thiết để qui đổi từ diện tích peak (pA/s) sang nồng độ (µg/kg) khi định lƣợng một chất thông qua máy GC. Do hợp chất 2 – AP tồn tại ở nồng độ thấp, rất khó tổng hợp, lại không bền nên không đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng. Nếu muốn sử dụng hợp chất 2 – AP để dựng đƣờng chuẩn thì phải tự tổng hợp. Do điều kiện phòng thí nghiệm chƣa đủ để tổng hợp tại chỗ hợp chất 2 – AP nên chúng tôi đã sử dụng 8 chất collidine, nonanal, hexanal, hexanol, tetradecane, octanol, decanal, pentanol (những hợp chất thơm chính có trong gạo thơm) nhƣ chất chuẩn thay thế (Ringuet, 2005). Chuẩn bị 6 dung dịch của mỗi chất chuẩn có nồng độ 0,01 mg/ml. Bơm lần lƣợt 2,0 μl mỗi dung dịch vào máy GC theo chƣơng trình nhiệt phân tích gạo thơm (mục 3.4.2). Xác định hệ số phản hồi (RF) theo công thức: RF [2 – AP] (pA*s/μg) = Trung bình cộng RF [8 chất ngoại chuẩn] 3.4.5. Xác định nồng độ hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong lá lúa và trong hạt lúa Từ kết quả thu nhận khi phân tích sản phẩm chiết xuất trên GC, xác định hàm lƣợng 2 – AP thu đƣợc khi chiết xuất bằng phƣơng pháp SPME theo công thức (Buttery và ctv, 1986) [19]: 3.4.6. Phƣơng pháp xử lí số liệu Các số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic 7.0 và Excel. Diện tích peak chất chuẩn (pA*s) RF theo chất chuẩn (pA*s/μg) = [dd chất chuẩn] (μg/μl) * thể tích bơm (μl) Diện tích peak (pA*s) [2-AP] SPME (μg/kg) = Khối lƣợng gạo (kg) * hệ số phản hồi (pA*s/ μg) 35 35 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. XÁC ĐỊNH HỆ SỐ PHẢN HỒI CỦA 2 - AP THEO 8 CHẤT NGOẠI CHUẨN Phân tích 8 chất ngoại chuẩn (đƣợc pha loảng ở nồng độ 0,01 mg/ml) bằng phƣơng pháp SPME - GC. Mỗi mẫu chuẩn đều đƣợc phân tích lặp lại 6 lần, kết quả phân tích đƣợc nhận trong bảng 4.1 sau đây: Bảng 4.1. Hệ số phản hồi của 8 chất chuẩn Dung dịch chất chuẩn Hệ số phản hồi (pA/μg) Collidine 8533 Nonanal 10963 Hexanal 8451 Hexanol 5141 Tetradecane 9335 Octanol 7056 Decanal 6653 Pentanol 6540 Trung bình 7834 36 collidine Hình 4.1. Sắc ký đồ GC phân tích chất chuẩn collidine (nồng độ 0,01 mg/ml) decanal Hình 4.2. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn decanal (nồng độ 0,01 mg/ml) 37 37 hexanal Hình 4.3. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn hexanal (nồng độ 0,01 mg/ml) hexanol Hình 4.4. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn hexanol (nồng độ 0,01 mg/ml) 38 nonanal Hình 4.5. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn nonanal (nồng độ 0,01 mg/ml) octanol Hình 4.6. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn octanol (nồng độ 0,01 mg/ml) 39 39 pentanol Hình 4.7. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn pentanol (nồng độ 0,01 mg/ml) tetradecane Hình 4.8. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn tetradecane (nồng độ 0,01 mg/ml) 40 Bảng 4.2. Thời gian lƣu của 8 chất chuẩn khi phân tích trên máy GC thực hiện năm 2007 và năm 2006 (Nguyễn Thị Thu Hƣơng) Chất chuẩn Thời gian lƣu (phút) Năm 2007 Năm 2006 Collidine 13,531 13,828 Tetradecane 34,405 33,928 Octanol 18,155 18,111 Nonanal 19,878 19,693 Decanal 25,123 24,845 Hexanol 7,855 7,871 Pentanol 4,321 4,391 Hexanal 5,233 5,403  Nhận xét: Theo bảng 4.1, trung bình cộng hệ số phản hồi của 8 chất chuẩn là 7834. Vì 2 – AP là chất khó tổng hợp, không đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng nên chúng tôi sử dụng trung bình cộng hệ số phản hồi của 8 chất chuẩn nhƣ là hệ số phản hồi của 2 – AP (Ringuet, 2005). Trong quá trình xác định hệ số phản hồi theo 8 chất ngoại chuẩn, thời gian lƣu của các chất chuẩn ổn định và có sự sai lệch so kết quả của các nhà nghiên cứu của viện nghiên cứu CIRAD (theo Ringuet J., 2005 và Phan Phƣớc Hiền, 2005) [50, 48], đồng thời cũng khác với kết quả của Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2006) thực hiện tại RIBET (Viện Công Nghệ Sinh Học và Tài Nguyên Môi Trƣờng – Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM) [1]. Nguyên nhân là do các điều kiện phân tích: loại cột sử dụng, chiều dài cột, độ tinh sạch của cột, độ tinh khiết của khí mang,...giữa 2 phòng thí nghiệm khác nhau. 4.2. ĐỊNH TÍNH HỢP CHẤT 2 – ACETYL – 1 – PYRROLINE Sau khi tiến hành kiểm tra và loại trừ đƣợc tất cả các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phân tích (phụ lục 2), chúng tôi thực hiện phân tích mẫu gạo thơm để xác 41 41 định lại thời gian lƣu của hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tiến hành chiết xuất mẫu gạo thơm sử dụng làm thí nghiệm theo qui trình 3.4.2. Bơm mẫu vào máy GC/MS theo chƣơng trình nhiệt phân tích gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME (phần 3.4.2) để xác định peak đại diện cho hợp chất 2 – AP. Hình 4.9. Sắc kí đồ GC – MS phân tích các hợp chất bay hơi có trong mẫu gạo thơm sử dụng làm thí nghiệm Dựa vào kết quả hình 4.9, tiến hành xác định thời gian lƣu của 3 hợp chất đặc trƣng cho các giống gạo thơm: hexanal, nonanal, 2 – AP bằng thƣ viện có trong máy GC/MS. 42 Hình 4.10. Kết quả tra cứu thời gian lƣu của 2 hợp chất hexanal và nonanal trong thƣ viện máy GC/MS  Nhận xét: Dựa vào các kết quả hình 4.10 chúng tôi xác định đƣợc thời gian lƣu của hexanal là 4,16 phút (độ tƣơng hợp: 86%); thời gian lƣu của nonanal là 18,40 (độ tƣơng hợp: 76%). Kết quả này có sự sai lệch so với kết quả của Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2006) [1]. Bảng 4.3. Thời gian lƣu của hexanal, 2 – AP, nonanal khi phân tích trên máy GC/MS do Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2006) [1] thực hiện Hợp chất Thời gian lƣu (phút) Hexanal 4,16 2 – AP 9,2 Nonanal 18,45 Tuy nhiên, không xác định đƣợc 2 – AP, nguyên nhân là do sau khi qua buồng MS, hợp chất 2 – AP bị bắn phá thành nhiều mảnh có khối lƣợng khác nhau. Dựa vào nguyên tắc hoạt động của máy GC/MS, một hợp chất sẽ đƣợc chuyển thành trạng thái hơi sau đó chuyển thành những mảnh ion phân tử. Do đó, 43 43 chúng tôi tiến hành kiểm tra những mảnh ion phân tử này từ phút thứ 4,17 đến phút thứ 18,4 (do thời gian lƣu của 2 – AP là 9,2 phút - Bảng 4.3) nhằm xác định các mảnh ion phân tử của 2 – AP. Theo Bergman và CS. (2000), hợp chất 2 – AP có mảnh ion phân tử tại m/z 111 và với sự mất đi HCN sẽ tạo ra mảnh ion tại m/z 83. Theo Yoshihashi và CS. (2001), mảnh ion phân tử tại m/z 111 là hợp chất 2 – AP. Theo Buttery và CS. (1982), hợp chất 2 – AP tồn tại với sự hiện diện của mảnh ion phân tử tại m/z 111 và các mảnh ion phân tử khác tại m/z 43, 55, 67, 69. Hình 4.11. Phổ đồ của hợp chất phân tách ở thời điểm 9,184 phút của mẫu gạo thơm sử dụng thí nghiệm 44 Hình 4.12. Phổ đồ hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline (A: Tanchotikul and Hsieh, 1991; B: Varaporn và Sarath, 1993) [64, 68]  Nhận xét: Dựa vào phổ đồ phân tích mẫu gạo thơm, tra cứu trên thƣ viện máy GC/MS, chúng tôi xác định đƣợc hợp chất phân tách ở thời điểm 9,184 phút của mẫu gạo thơm sử dụng thí nghiệm có phổ tƣơng tự nhƣ phổ của hợp chất 2-AP đã đƣợc Tanchotikul và Hsieh (1991), Varaporn và Sarath (1993) đã phát hiện [64, 68] (hình 4.12). Do đó, có thể kết luận hợp chất 2 – AP xuất hiện ở thời điểm 9,184 phút khi phân tích trên hệ thống GC/MS. Bảng 4.4. Thời gian lƣu (phút) của hexanal, nonanal có trong mẫu gạo thơm khi phân tích trên máy GC/MS và GC Hợp chất GC/MS GC Hexanal 4,16 4,56 Nonanal 18,4 19,8  Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích trên hệ thống GC (hình 4.14) và GC/MS (hình 4.13) của mẫu gạo thơm sử dụng, chúng tôi xác định đƣợc thời điểm xuất hiện của 2 hợp chất hexanal và nonanal trên hệ thống GC lần lƣợt là 4,56 và 19,8 phút. Kết quả 45 45 nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt về thời gian lƣu của 2 hợp chất hexanal, nonanal trong mẫu gạo khi phân tích tại Pháp và tại Việt Nam. Nguyên nhân là do có sự khác biệt về kích thƣớc cột và loại khí mang sử dụng trong phân tích. nonanal hexanal Hình 4.13. Kết quả phân tích mẫu gạo thơm trên máy GC/MS hexanal nonanal Hình 4.14. Kết quả phân tích mẫu gạo thơm trên máy GC 46  Xác định thời gian lưu của 2 – AP trên máy GC Dựa trên kết quả xác định ở phần 4.1, peak của collidine xuất hiện ở thời điểm 13,5 phút khi phân tích trên máy GC. Theo kết quả nghiên cứu của C. J. Bergman (2000), Casey C. Grimm và CS. (2000), hợp chất thơm 2 - AP sẽ xuất hiện trƣớc peak của chuẩn collidine từ 2 – 3 phút, nên có thể dự đoán rằng hợp chất 2 – AP sẽ xuất hiện vào thời điểm khoảng từ 9 đến 11 phút. So sánh sự chênh lệch về thời gian lƣu của 2 hợp chất hexanal và nonanal khi phân tích trên 2 hệ thống GC và GC/MS, chúng tôi nhận thấy khoảng thời gian chênh lệch là 0,4 đến 1,4 phút. Nhƣ vậy, có thể nhận định peak của hợp chất thơm 2-AP sẽ xuất hiện trong khoảng thời điểm từ 9,5 đến 10,5 phút. Dựa vào sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm sử dụng (phụ lục 3 – 10), so sánh với sắc kí đồ phân tích trên GC/MS và GC chúng tôi kết luận đƣợc thời gian lƣu của hợp chất 2 – AP khi phân tách bằng GC là 9,8 phút ở điều kiện phòng thí nghiệm. hexanal nonanal 2 – AP Hình 4.15. Kết quả phân tích mẫu gạo thơm trên máy GC 47 47 Bảng 4.5. Thời gian lƣu của hexanal, 2 – AP, nonanal khi phân tích trên 2 hệ thống GC/MS và GC Hợp chất GC/MS GC Hexanal 4,16 4,56 2 – AP 9,18 9,8 Nonanal 18,40 19,8 4.3. KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH HÀM LƢỢNG 2 – AP CÓ TRONG CÂY LÚA QUA CÁC THỜI KÌ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY LÚA Ở 4 GIỐNG: JASMINE, OM3536, ST3 VÀ VD20 4.3.1. Khảo sát sự biến đổi hàm lƣợng 2 - AP ở cây lúa qua các thời kì tăng trƣởng Bảng 4.6. Nồng độ 2 – AP trong lá lúa theo các thời kì tăng trƣởng của lúa ở 4 giống Jasmine, OM3536, ST3, VD20 Giai đoạn tăng trƣởng Nồng độ 2 – AP (µg/kg) Jasmine OM3536 ST3 VD20 Giai đoạn mọc 0.574 12.583 9.121 12.052 Giai đoạn làm đốt 9.963 15.767 9.387 12.095 Giai đoạn làm đòng 13.085 21.785 14.297 14.974 Giai đoạn nở hoa 13.414 23.573 18.512 16.869 Giai đoạn chín sáp 10.592 18.173 9.750 14.685 48 2-AP Hình 4.16. Sắc kí đồ GC phân tích hàm lƣợng 2 – AP trong lá lúa (mẫu OM3536)  Nhận xét: Dựa vào bảng 4.6, nồng độ 2 – AP trong lá lúa tăng qua các giai đoạn tăng trƣởng, cao nhất là ở giai đoạn nở hoa (thuộc thời kì sinh trƣởng sinh thực của cây lúa), sau đó giảm ở giai đoạn chín sáp (thời kì lúa chín) nhƣng vẫn cao hơn so với nồng độ 2 – AP trong lá lúa ở thời kì sinh trƣởng sinh dƣỡng. Bảng 4.7. Nồng độ 2 – AP trong hạt lúa qua các giai đoạn phát triển từ bông lúa thành hạt lúa Giai đoạn phát triển Nồng độ 2 – AP (µg/kg) Jasmine OM3536 ST3 VD20 Giai đoạn làm đòng 0.772 0.437 0.992 1.473 Giai đoạn nở hoa 0.801 1.369 1.531 1.613 Giai đoạn chín sữa 1.356 2.243 1.690 1.646 Giai đoạn chín sáp 2.516 3.475 1.975 2.244 Giai đoạn chín hoàn toàn 6.928 4.303 4.388 3.674 49 49 2-AP Hình 4.17.Sắc kí đồ GC phân tích hàm lƣợng 2 – AP trong hạt lúa ở giai đoạn chín (mẫu Jasmine)  Nhận xét: Bảng 4.7 cho thấy nồng độ 2 – AP trong hạt lúa tăng dần qua các giai đoạn phát triển và cao nhất là ở giai đoạn chín hoàn toàn. Ở giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng và giai đoạn sinh trƣởng sinh thực, các chất dinh dƣỡng có trong cây lúa đều tập trung nuôi dƣỡng, phát triển thân và lá lúa nên hàm lƣợng 2 – AP trong lá cao (cao nhất là ở giai đoạn sinh trƣởng sinh thực). Sau đó, đến giai đoạn chín, bông lúa bắt đầu nở hoa và hình thành hạt, tất cả các dƣỡng chất có trong cây lúa đều đƣợc sử dụng để nuôi hạt nên hàm lƣợng 2 – AP trong hạt lúa sẽ tăng dần theo sự phát triển của hạt. 50 4.3.2. So sánh hàm lƣợng 2 - AP qua các thời kì sinh trƣởng, phát triển của cây lúa ở 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 0 5 10 15 20 25 mọc làm đốt làm đòng nở hoa chín sáp Giai đoạn sinh trƣởng Nồ ng độ 2 - AP (µ g/ kg ) Jasmine OM3536 ST3 VD20 Biểu đồ 4.1. So sánh nồng độ 2 – AP trong lá qua các thời kì tăng trƣởng ở 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20  Nhận xét: Kết quả phân tích ở bảng 4.6 và biểu đồ 4.1 cho thấy giống OM3536 có nồng độ 2 – AP trong lá lúa cao nhất so với 3 giống còn lại, kế đến là ST3 và VD20, Jasmine có nồng độ 2 – AP trong lá lúa thấp nhất trong 4 giống phân tích. Nồng độ 2 – AP trong lá lúa ở cả 4 giống đều tăng qua các thời kì tăng trƣởng và cao nhất là ở giai đọan nở hoa (thời kì sinh trƣởng sinh thực) và giảm ở giai đọan chín sáp (thời kì chín), trong đó ST3 có mức giảm nồng độ 2 – AP trong lá lúa cao nhất so với 3 giống Jasmine, VD20 và OM3536, VD20 có mức giảm nồng độ 2 – AP trong lá lúa thấp nhất trong 4 giống, kế đến theo thứ tự lần lƣợt là Jasmine và OM3536. 51 51 0 1 2 3 4 5 6 7 8 làm đòng nở hoa chín sữa chín sáp chín hoàn toàn Giai đoạn phát triển Nồ ng độ 2 - A P (µ g/ kg ) Jasmine OM3536 ST3 VD20 Biểu đồ 4.2. So sánh nồng độ 2 – AP trong hạt qua các giai đoạn phát triển hạt của giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20  Nhận xét: Bảng 4.7 và biểu đồ 4.2 cho thấy giống lúa Jasmine có nồng độ 2 – AP trong hạt cao nhất so với 3 giống còn lại, OM3536 và ST3 có nồng độ 2 – AP trong hạt lúa xấp xỉ bằng nhau, VD20 có nồng độ 2 – AP trong hạt thấp nhất. Nhìn chung, các giống lúa đều có nồng độ 2 – AP trong hạt tăng dần qua các giai đoạn phát triển. 4.4. SO SÁNH HÀM LƢỢNG 2 - AP CÓ TRONG LÁ LÚA VÀ LÁ DỨA Dựa trên kết quả phân tích hàm lƣợng 2 - AP có trong lá dứa do Nguyễn Thị Thu Hƣơng thực hiện (2006) tiến hành so sánh hàm lƣợng 2 – AP có trong lá dứa với hàm lƣợng 2 - AP có trong lá lúa 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 ở giai đoạn lúa nở hoa (giai đoạn hàm lƣợng các hợp chất thơm có trong lá lúa cao nhất). 52 2 – AP Hình 4.18. Sắc kí đồ GC phân tích hàm lƣợng 2 – AP có trong lá dứa (Nguyễn Thị Thu Hƣơng, 2006) Bảng 4.8. Hàm lƣợng 2 – AP có trong lá dứa và trong lá của 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 Lá Nồng độ 2 – AP (µg/kg) Dứa 1270,9 Jasmine 13,414 OM3536 23,573 ST3 18,512 VD20 16,869 53 53 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Dứa Jasmine OM3536 ST3 VD20 nồ ng độ 2 - AP (µ g/ kg ) Biểu đồ 4.3. So sánh hàm lƣợng 2 – AP có trong lá dứa và trong lá lúa của 4 giống Jasmine, OM3536, ST3, VD20  Nhận xét: Dựa vào bảng 4.8 và biểu đồ 4.3, nồng độ 2 – AP trong lá dứa cao hơn rất nhiều lần so với nồng độ 2 – AP có trong lá lúa. Điều này giải thích đƣợc cho thói quen bỏ lá dứa vào khi nấu cơm, nhằm làm tăng hƣơng thơm của gạo sau khi nấu. 54 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 5.1.1. Định tính 2 – AP Xác định đƣợc hệ số phản hồi của 2 – AP theo 8 chất ngoại chuẩn là 7834. Xác định lại thời gian lƣu của 2 – AP khi phân tích trên máy GC theo điều kiện phòng thí nghiệm là 9,8 phút. 5.1.2. Phân tích hàm lƣợng 2 – AP có trong lá và trong hạt của 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 Nồng độ 2 – AP có trong lá lúa tăng theo các giai đoạn phát triển của cây lúa và đạt cao nhất khi lúa ở giai đoạn nở hoa, sau đó giảm khi lúa bắt đầu tạo hạt nhƣng vẫn cao hơn so với các giai đoạn tăng trƣởng ban đầu. Nồng độ 2 – AP có trong hạt lúa tăng theo các giai đoạn hình thành hạt, cao nhất khi hạt lúa ở giai đoạn chín. Giống lúa OM3536 có nồng độ 2 – AP trong lá cao nhất so với 3 giống lúa còn lại, kế đến lần lƣợt theo thứ tự là giống lúa VD20 và Jasmine, ST3 là giống lúa có nồng độ 2 – AP trong lá thấp nhất trong nhóm 4 giống lúa đƣợc phân tích. Jasmine có nồng độ 2 – AP trong hạt cao nhất, OM3536 và ST3 có nồng độ 2 – AP trong hạt xấp xỉ bằng nhau, VD20 có nồng độ 2 – AP trong hạt thấp nhất trong 4 giống lúa thử nghiệm. Nồng độ 2 – AP trong lá lúa thấp hơn rất nhiều (0,014%) so với trong lá dứa. Vì vậy, có thể nghiên cứu sử dụng lá dứa để chiết xuất 2 – AP. 55 55 5.2. ĐỀ NGHỊ Thử nghiệm việc tổng hợp chuẩn 2 – AP nhằm đánh giá khách quan và chính xác hơn hợp các hợp chất thơm có trong gạo thơm. Tiếp tục xây dựng và thực hiện phƣơng pháp SDE (Simultaneous steam Distillation and solvent Extraction) để so sánh với phƣơng pháp SPME. Khảo sát các đặc điểm hóa sinh quan trọng khác nhƣ: hàm lƣợng amylose, nhiệt độ hóa hồ, độ bền thể gel để có đƣợc đánh giá tốt hơn về chất lƣợng gạo thơm. Thử nghiệm sử dụng phƣơng pháp SPME để tiến hành chọn lọc các giống lúa thơm chất lƣợng cao. Xác định nguồn gốc sinh tổng hợp 2 – acetyl – 1 – pyrroline ở lúa. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Thị Thu Hƣơng, 2006. Khảo sát đặc điểm hoá lý - hóa sinh và phân tích chất lượng mùi thơm của gạo Nàng thơm Chợ Đào bằng phương pháp SPME – GC. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. PGS. TS. Nguyễn Thị Lang, GS. TS. Bùi Chí Bửu, 2005. Cây giống và sản xuất hạt giống tốt. Nhà xuất bản Nông nghiệp. tr. 18 – 25. 3. Lê Doãn Diên, 1990. Vấn đề chất lượng lúa gạo. Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật và Quản Lý Kinh Tế, NN – CNTP 2/90. tr. 96 – 98. 4. Trần Văn Đạt, 2002. Tiến trình phát triển sản xuất lúa gạo tại Việt Nam từ thời nguyên thủy đến hiện đại. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. 5. PTS. Trƣơng Đích, ThS Đỗ Khắc Thịnh, KS Nguyễn Quốc Lý, 1994. Giống lúa thơm đặc sản, giống lúa xuất khẩu và chất lượng cao. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. tr. 21 – 22. 6. Nguyễn Thị Hiền, Vũ Thị Thƣ, 2000. Hóa sinh học nông nghiệp. Nhà xuất bản Giáo Dục. tr. 168 – 172. 7. Nguyễn Văn Hoan, 2003. Cây lúa và kỹ thuật thâm canh. Nhà xuất bản Nghệ An. tr. 10. 8. Đỗ Khắc Thịnh, 2001. Tình hình sản xuất các giống lúa thơm đặc sản Việt Nam và một số nƣớc trên thế giới. Báo cáo Hội nghị giống lúa ĐBSCL lần VII, 2/2001. 9. Đỗ Khắc Thịnh, 2003. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố canh tác và yếu tố môi trường đối với năng suất và phẩm chất lúa thơm ở đồng bằng sông Cửu Long. Luận án Tiến Sĩ Nông Nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 175 trang. 10. Nguyễn Trung Vãn, 2001. Lúa gạo việt nam trước thiên niên kỷ mới – hướng xuất khẩu. Nhà xuất bản Chính trị quốc gia, Hà Nội. 57 57 11. Phạm Hùng Việt, 2004. Sắc ký khí – Cơ sở lý thuyết và khả năng ứng dụng. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. 264 trang. 12. Federic GAY, Phan Phuoc Hien, Christian Mestres, M. Languerre, J. Ringuet. Nghiên cứu phát triển các phƣơng pháp kết hợp phân tích mùi thơm của gạo. Tuyển Tập các công trình Hội nghị Khoa học và Công nghệ Hóa Hửu cơ Toàn Quốc lần thứ 3 Hà nội 11-2005 (tr. 450-455). TIẾNG NƢỚC NGOÀI 13. Adair C. R., Beachell H. M., Jodon N. E., Johnston T. H., Thysell J. R., Green V. E. Jr., Webb B. D. and Atkins J. G., 1996. Rice breeding and testing methods in the U.S. In: U.S. dept. of Agric. Rice in the U.S.: Varieties and production. USDA Agr. Res. Serv. Handbook 289. p. 19 – 64. 14. Ayano K. and Tsuzuki E., 1976. Components of aroma, in chapter 3 Inher. Physio. Ch. 437 – 440. Science of the rice plant. Vol 3. Genetics, Food and Agri. Policy Res. Center, 1997. Tokyo, Japan. 15. Bangwaek C., Vergara B. S. and Robles R. P., 1994. Effect of temperature regime on grain chalkiness in rice. IRRI 19 (4). p. 8. 16. Bergman C. J., Delgado J. T., Bryant R., Grimm C.; Cadwallader K. R., and Webb B. D., 2000. Rapid gas chromatographic technique for quantifying 2 – acetyl – 1 – pyrroline and hexanal in rice (Oryza sativa, L.). Cereal Chemistry 77 (4). p. 454 - 458. 17. Bhattacharya K. R., 1980. Breakage of rice during milling: A review. Trop. Sci. 22. p. 255 – 276. 18. Bullard R.W. and Holguin G., 1977. Volatile components of unprocessed rice (Oryza sativa). J. Agric. Food Chem. 25. p. 99. 19. Buttery R. G. and Ling L. C., 1982. 2- acetyl – 1 – pyrroline: an important aroma component of cooked rice. Chemistry and Industry. p 958. 20. Buttery R. G., Ling L. C., Juliano B. O., and Turnbaugh J. G.; 1983a. Cooked rice aroma and 2 – acetyl – 1 – pyrroline. J. Agric. Food Chem 31. p 823 – 826. 21. Buttery R. G., Juliano B. O., and Ling L. C., 1983b. Identification of rice aroma compound 2 – acetyl – 1 – pyrroline in pandan leaves. Chem. Ind. (Lond.) 23. p. 478 – 479. 22. Buttery R. G., Ling L. C., and Mon T. R., 1986. Quantitative analysis of 2 – acetyl – 1 – pyrroline in rice. J. Agric. Food Chem. 34. p. 112 – 114. 58 23. Buttery R. G., Turnbaugh J. G. and Ling L. C., 1988. Contributions of volatiles to rice aroma. J. Agric. Food Chem. 36. p. 1006 – 1009. 24. Canellas L. P., Santos G., and Merchezan E., 1997. Effect of management practices on yield and commercial quality of grains of irrigated rice. Ciencia Rural 27. p. 375 – 379. 25. Central Food Technological Research Institute (CFTRI), 1985. Annual Report for 1984 – 1985, Mysore, India. 26. Chang T. T. and Somrith B., 1979. Genetic studies on the grain quality of rice. Proceeding of the workshop on chemical aspects of rice grain quality,.IRRI, Los Banos, Philippines. p. 49 – 58. 27. Daniels M. J., Marks P. P., Meullenet J. F., and Siebenmorgen T. J., 1997. Effects of rice storage history on the end use quality of long grain rice. Research Series – Arkansas Agricultural Experimental Station 456. p. 152 – 157. 28. De Datta S. K., Obeemea W. N, and Jana R. H, 1972. Protein content of rice grain as affected by nitrogen fertilizer and triazines and substituted ureas. J. Agron 64. p. 785 – 788. 29. Del Rosario A. R., Briones V. P., Vidal A. J. and Juliano B. O., 1968. Composition and endosperm structure of developing and mature rice kernel. Ceral Chem. 45. p. 225 – 235. 30. Do Thu Hien, Michel Jacobs, Geert Angenon, Christian Hermans, Tran Thanh Thu, Le Van Son, Nancy Helene Roosens, 2003. Proline accumulation and Δ1- pyrroline-5-carboxylate synthetase gene properties in three rice cultivars differing in salinity and drought tolerance. Plant science 165. p. 1059 – 1068. 31. Ericksson J. R., 1968. Annual report, Rice Genet. Invest., Rice Expt. Sta. Biggs, California. 32. Food Agriculture Organization, 2005. Summary of world food and agriculture statistics 2003. Food Agriculture Organization, Rome. p. 101 33. Gay F., Mestres C., Phan Phuoc Hien, Laguerre M. and Ringuet J. Development of semi-quantative methods to analyse rice aroma. International Workshop on Biotechnology in Agriculture, hosted by University of Agriculture and Forestry October 20 th 2006 HCMC Viet nam (p. 178-181) 59 59 34. Gomez K. A. and De Datta S. K., 1975. Influence of environment on protein content of rice. J. Agron. 67. p. 565 – 568. 35. Grimm Casey C., Christine Bergman, Janis T. Delgado, and Rolfe Bryant, 2001. Screening for 2 – acetyl – 1 – pyrroline in the headspace of rice using SPME/GC – MS. J. Agric. Food Chem 49. p. 245 – 249. 36. Gyorgy Vas and Karoly Vekey, 2004. Solid-phase microextraction: a powerful sample preparation tool prior to mass spectrometric analysis. Journal of mass spectrometry 39. p. 233 – 254. 37. Hussain A., Naqvi S., Hammerschmidt F.J., 1987. Isolation and identification of volatile flavor components from Basmati rice. In: Martens M., Dalen G.A., Russwurm H. (ed.). Flavour science and technology. p. 95 – 100. John Wiley and sons, NewYork. 38. Huysmans A. C., 1965. Milling quality of paddy rices as influenced by timing of the harvest. Inst. Rice Comm. Newsl. 14(3). p. 4. 39. Juliano B. O, 1972. Physicochemical properties of starch and protein in relation to grain quality and nutrition value of rice. In: Rice breeding, IRRI, Manila, Philippines. p. 389 – 404. 40. Juliano B. O., 1985. Rice: chemistry and technology. 2nd ed. Am. Associ. Cereal chemists. St. Pant, MN. p. 774. 41. Kaul A. K., 1970. Early generation testing for quality characteristics. Rice Indian J. Genet. Plant breed. 30 (2). P. 237 – 243. 42. Khush G. S., Paule C. M and Dela Crus N. M, 1979. Rice grain quality evaluation and improvement at IRRI. Proceeding of the workshop on chemical aspects of rice grain quality, IRRI, Los Banos, Philippines. p. 21 – 31. 43. Kim C. Y., 1999. A study on the Growth Characteristics and Analysis of Chemical Compounds of Grains as Affected by Cultivation Method in Coloured and Aromatic Rice Varieties. Ph.D. Thesis submitted to Chungnam National University, Taejeon Korea. p. 112. 44. Krupp H. K., Abilay W. P, and Alvarez E. I, 1972. Some water stress effects on rice. p. 663 – 675 in International Rice Research Institute. Rice Breeding, Los Banos, Philippines. 60 45. Lorieux M., Petrov M., Huang N., Guiderdou E., Ghesquiere A., 1996. Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait. Theor. Appl. Genet. 93. p. 1145 – 1151. 46. Mann R. F., 1987. Basmati rice: wonder of Pakistan’s agriculture. IRRC Newslt. 36. p. 23 – 28. 47. Paillard N., 1981. Factors influencing flavor formation in fruits. In: Schreier P. (ed.), Flavour 81. p. 478 – 493, de Gruyter W., Co., Berlin. 48. Paule C. M. and Powers J. J., 1989. Sensory and chemical examination of aromatic and nonaromatic rices. Journal of food science 54 (2). p. 343 – 346. 49. Petrov M., Marc Danzart, Pierre Giampaolo, Jacques Faure, Hubert Richard, 1996. Rice aroma analysis: discrimination between a scented and a non – scented rice. Sciences Des Aliments 16. p. 347 – 360. 50. Phan Phuoc Hien, 2005. Methodes d’analysis des arômes du riz.. CIRAD, Montpeller, France. 39 pages. 51. Rahim M. A, Sultan M. K., and Siddique A. K., 1995. Study on rice grain quality affected by time of harvest. Bangladesh J. Sci. Indust. Res 30. p. 111 – 119. 52. Ringuet J., 2005. Optimisation d’une méthode de dosage de l’arôme du riz par SPME. Research Msc report. Montpeller University, France. 38 pages. 53. Romanczyk L. J., McClelland C. A., Post L. S., Aitken M., 1995. Formation of 2 – acetyl 1 – pyrroline by several Bacillus cereus strains isolated from cocoa fermentation boxes. J. Agric. Food Chem. 43. p. 469 – 475. 54. Sarkarung S., Somrith B., and Chitrakorn S., 2000. Aromatic rices of Thailand, Aromatic rices (Singh R. K., Singh, U. S., Khush G. S.). Oxford and Publishing Co. Pvt. Ltd., Chaman Enterprises, 1603, Pataudi House, darya Ganj, new Delhi- 110 002. p. 180 – 183. 55. Schieberle P., 1989. Formation of 2 – acetyl 1 – pyrroline and other important flavor compounds in wheat bread crust. In: Parliment T. H., McGorrin R. J., Ho C. T. (ed), Thermal generation of aromas. p. 269 – 275, ACS Symposium series 409, Washington. 56. Schieberle P., 1990. The role of free amino acids present in yeast as precursors of the odorants 2 – acetyl – 1 – pyrroline and 2 – acetyltetrahydropyridine in wheat bread crust. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 191. p. 206 – 209. 61 61 57. Simon P. W., Peterson C. E., Lindsay R. C., 1980. Genetic and environmental influences on carrot flavor. J. Am. Soc. Hort. Sci. 105. p. 416 – 420. 58. Singh M. V., Tripathi H. N. and Tripathi H. P., 1997. Effect of nitrogenous and planting date on yield and quality of scented rice (Oryza sativa). Indian J. Agro. 42. p. 602 – 606. 59. Singh R. K., Singh U. S, and Khush G. S., 1998. Indian indigenous aromaric rices. Indian farming 21. p. 1 – 6. 60. Singh R. K., Singh, U. S., Khush G. S., 2000. Aromatic rices. Oxford & IBH Pulishing, New Delhi, India. 292 pages. 61. Singh V. P., 1997. Present status in breeding rice varieties with particular reference to Basmati rice. In: Plant breeding and crop improvement, vol. I, CBS Publishers and Distributors 4596//1 – A. 11, New Delhi. 62. Srinivas T. and Bhashyam M. K, Mune Gowda M. K and Desikacha H. S. R., 1978. Factors affecting crack formation in rice seeds. IRRI 15(3). p. 21. 63. Suvarnalatha G., Narayan M. S., Ravishankar G. A., and Venkataraman L. V., 1994. Flavour production in plant cell cultures of Basmati rice. J. Sci. Food Agric. 66. p. 439 – 442. 64. Suwanarit A., Kreetapirom S., Buranakarn S., Suriyapromchoi P., Varanyanond W., Tungtrakul P., Somboonpong S., Rattapat S., Ratanasupa S., Romyen P., Wattanapryapkul S., Naklang K., Rotjanakusal S., and Pornurisnit P., 1996. Effect of nitrogen fertilizer on grain qualities of Khao Dawk Mali – 105. Kasetsart j. Nat. Sci. 30. p. 458 – 474. 65. Suwanarit A., Kreetapirom S., Buranakarn S., Suriyapromchoi P., Varanyanond W., Tungtrakul P., Rattapat S., and Wattanapryapkul S., 1997b. Effect of potassium fertilizer on grain qualities of Khao Dawk Mali – 105. Kasetsart j. Nat. Sci. 31. p. 175 – 191. 66. Tanchotikul U. and Hsieh T. C. Y., 1991. An improved method for quatification of 2 – acetyl – 1 – pyrroline, a “popcorn” – like aroma, in aromatic rice by high – resolution gas chromatography/mass spectrometry/selected ion monitoring. J. Agric. Food Chem 39. p. 94 – 97. 62 67. Tressl R., Helak B., Martin N., Rewicki D., 1985. Formation of flavor components from L-proline. Topics in flavour research (Berger R., Nitz S., Schreier P.). Eichhorn H., D-8051 Marzling – Hangenham 25, p. 139 – 159. 68. Tsugita T., 1985 – 1986. Aroma of cooked rice. Food Rev. Intl. 1. p. 497 – 520. 69. Tsuzuki E., Tanaka K. and Shida S., 1981. Bull. Fac. Agric. Miyazaki Univ. 28. p. 31 – 37. 70. Varaporn Laksanalamai and Sarath Ilangantileke, 1993. Comparison of aroma compound (2 – acetyl – 1 – pyrroline) in leaves from pandan (Pandanus amaryllifolius) and Thai fragrant rice (Khao Dawk Mali - 105). Cereal chemistry 70 [4]. p. 381 – 384. 71. Widjaja R., Craske J. D. and Wootton M., 1996. Comparative studies on volatile components of non – fragrant and fragrant rices. J. Sci. Food Agric. 70. p. 151 – 161. 72. Wongpornchai, S., Sriseadka, T., & Choonvisase, S. (2003). Identification and quantitation of the rice aroma compound, 2-acetyl-1-pyrroline, in bread flowers (Vallaris glabra Ktze). Journal of Agricultural and Food Chemistry 51. p. 457– 462. 73. Wongpornchai S., Dumri K., Jongkaewwattana S., and Siri B., 2004. Effects of drying methods and storage time on the aroma and milling quality of rice (Oryza sativa L.) cv. Khao Dawk Mali 105. Food Chemistry 87. p. 407–414. 74. Yadav T. P and Singh V. P., 1989. Milling quality characteristics of Roman varieties, IRRN 14(6). p. 7. 75. Yajima I., Yanai T., Nakamura M., Sakakibara H., Hayashi K., 1979. Volatile flavor components of cooked Kaorimai (Scented rice, O. sativa japonica). Agri. Biol. Chem. 43. p. 2425 – 2430. 76. Yoshihashi T., Nguyen Thi Thu Huong, and Hideo Inatomi, 2002. Precursors of 2 – acetyl – 1 – pyrroline, a potent flavor compound of an aromatic rice variety. Journal of agriculture and food chemistry 50 (7). p. 2001 – 2004. 77. Yoshihashi T., 2002. Quantitative analysis on 2 – acetyl – 1 – pyrroline of an aromatic rice by stable isotope dilution method and model studies on its formation during cooking. Journal of food science 67. p. 619 – 622. 63 63 78. Yoshihashi T., Thi Thu Huong Nguyen and Nobuyuki Kabaki (2004). Area Dependency of 2-Acetyl-1-Pyrroline Content in an Aromatic Rice Variety, Khao Dawk Mali 105. JARQ 38 (2). p. 105 – 109. 79. Yoshikawa K., Libbey L. M., Cobb W. Y., Day E. A., 1965. 1 – pyrroline: the odor component of Strecker – degraded proline and ornithine. Food Sci. 30. p. 991 -994. TRANG WEB 80. www.riceweb.org/plant.htm 64 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các hợp chất bay hơi có trong gạo thơm Methanal Ethylene Ethanal Ethyl acetate Ethanol Hydrogen sulfide Dimethyl sulfide Dimethyl disulfide Methyl mercaptan n-butyl mercaptan Propanal 2-propanone 1-butanal 2-butanone 1-pentanal 1-hexanal n-nonane n-decane n-butyl acetate 1-butanol 2-heptanone Xylene 1-heptanal d-limonene pyridine 2-methylpyridine n-dodecane ethyl caproate 2-pentyfuran n-pentanal 4-methylpyridine Cyclohexanone 1-octanal 3-methylpyridine Trans-2-heptenal 1-octen-3-ol 2-heptanol Cis-linalool oxide Methone 2,4-heptadienal 3-vinylpyridine 2-ethylhexanol 1-decanal n-pentadecane benzaldehyde trans-2-nonenal linalool 1-octanol 2-undecanone n-hexadecane n-undecanal methyl benzoate phenylacetaldehyde trans-2-decenal methol α-terpineol 2,4-nonadienal Naphthalene Carvone n-heptadecane citral benzyl acetate trans-2-cis-4-decadienal nicotine n-octadecane trans-2-trans-4- decadienal 2-tridecanone Geranyl acetone Β-phenylethyl alcohol γ-decalactone n-heneicosane 6,10,14-trimethyl pentadecan-2-one γ-undecalactone n-docosane methyl palmitate ethyl palmitate farnesol tricosane α-hexylcinnamic aldehyde diethyl phthalate 4-vinylphenol Farnesyl acetone n-tetracosane indole methyl stearate methyl oleate ethyl oleate n-pentacosane methyl linoleate ethyl linoleate dibutyl phthalate myristic acid palmitic acid caproic acid 2-ethylcaproic acid Heptanoic acid Capryric acid Nonanoic acid Furoic acid Succinic acid Capric acid Lauric acid 65 65 Methylheptenone 1-hexanol 1-nonanol Trans-2-hexenol n-tetradecane trans-2-octenal benzyl alcohol trans-linalool oxide Quinoline n-nonadecane benzothiazole 1-dodecanol γ-nonalactone phenol 2-pentadecanone n-eicosane α-pyrrolidone Tridecanoic acid Pentadecanoic acid Stearic acid Oleic acid Linoleic acid Nonadecanoic acid Eicosanoic acid 2-acetyl-1-pyrroline Phụ lục 2. Khống chế các yếu tố ảnh hƣởng Tiến hành phân tích thử nghiệm qui trình phân tích hợp chất tạo mùi thơm trong gạo thơm, chúng tôi nhận thấy, trong hỗn hợp sản phẩm chiết xuất có rất nhiều hợp chất. Điều này dẫn đến việc đặt ra giả thuyết rằng có thể các điều kiện phân tích chƣa tối ƣu, thiết bị, dụng cụ và nƣớc cất sử dụng cho phân tích không đƣợc tinh khiết. Để trả lời cho câu hỏi trên, chúng tôi tiến hành kiểm tra tất cả các yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến kết quả phân tích. Trƣớc tiên chúng tôi cho máy sắc ký khí chạy không tải theo chƣơng trình nhiệt phân tích gạo thơm và thu đƣợc sắc ký đồ. 66 Hình 1. Sắc ký đồ GC chạy không tải Sắc ký đồ ở hình 1 cho thấy cột mao quản dùng để phân tích gạo thơm vẫn phân tách tốt, không bị tạp nhiễm. Vì vậy đã loại trừ đƣợc một yếu tố ảnh hƣởng. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phân tích sợi chiết SPME không chứa mẫu theo chƣơng trình nhiệt phân tích gạo thơm. Kết quả cũng cho thấy, sợi chiết không bị nhiễm bẩn (hình 2). Hình 2. Sắc ký đồ GC kiểm tra chất lƣợng sợi chiết 67 67 Sau khi kiểm soát đƣợc 2 yếu tố ảnh hƣởng, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của nƣớc cất và lọ bi dùng trong phân tích. Trƣớc tiên, chúng tôi phân tích lọ bi chƣa sử dụng đƣợc rửa bằng ethanol và acetone, sấy ở 800C trong 2 giờ và lọ bi chƣa sử dụng nhƣng không đƣợc rửa. kết quả thu đƣợc xác nhận không cần rửa lọ bi chƣa sử dụng trƣớc khi phân tích (hình 3). Hình 3. Sắc ký đồ GC kiểm tra độ tinh sạch của lọ sử dụng trong chiết xuất 68 Phụ lục 3. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 - AP có trong lá của giống lúa Jasmine 2 - AP Phụ lục 4. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 - AP có trong lá của giống lúa OM3536 2 - AP Phụ lục 5. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 - AP có trong lá của giống lúa ST3 69 69 2 - AP Phụ lục 6. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 - AP có trong lá của giống lúa VD20 2 - AP 70 Phụ lục 7. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 - AP có trong hạt của giống lúa Jasmine 2 - AP Phụ lục 8. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 - AP có trong hạt của giống lúa OM3536 2 - AP Phụ lục 9. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 - AP có trong hạt của giống lúa ST3 71 71 2 - AP Phụ lục 10. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 - AP có trong hạt của giống lúa VD20 2 – AP 72 Phụ lục 11. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 – AP có trong lá dứa 2 – AP Phụ lục 12. Sắc ký đồ GC phân tích chất chuẩn tetradecane 34,405 73 73 Phụ lục 13. Sắc ký đồ GC phân tích chất chuẩn pentanol và hexanal pentanol 4,321 hexanal 5,233 Phụ lục 14. Sắc ký đồ GC phân tích các chất chuẩn collidine, octanol, nonanal, decanal,hexanol collidine decanal hexanol 13,531 octanol 25,123 7,855 18,155 nonanal 19,878 74 Phụ lục 15. Sắc ký đồ GC/MS phân tích mẫu gạo Jasmine nonanal hexanal 2-AP