Khóa luận Khảo sát quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm trichoderma reesei

loại Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 500ml Gía đựng ống nghiệm Ống đong 100ml, 250ml Xi lanh Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-rad, Mỹ Các dụng cụ chạy điện di Tủ lạnh Hình 3.1 Máy đo pH Hình 3.2 Cân phân tích Hình 3.3 Máy đo quang UV Hình 3.4 Máy ly tâm Hình 3.5 Bể ổn nhiệt 3.1.2. Hóa chất Triton X-100 Tween-20 Tweeen-80 Sodium carboxymethyl cellulose Coomassie Brilliant Blue Hóa chất để tủa enzyme: Cồn 960, muối ammonium sulphate, acetone Dung dịch đệm phosphate: NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4 Hóa chất xác định hàm lượng protein: Thuốc thử Bradfosd CaCl2 0,02M Acid acetic 1% Chế phẩm 3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô (quy mô công nghiệp) Dịch ↓ (Trộn tỷ lệ nước) ↓ Khuấy ↓ Lọc ↓ Thu Dịch ↓ Ly tâm (8000 vòng/p) ↓ Dịch ↓ Tủa (bằng : cồn, aceton, muối amoni sunfat) Ly tâm ↓ Enzyme thô ↓ Tinh sạch ↓ 3.2.1. Thuyết minh quy trình Chủng nấm Trichoderma Reesei được nuôi cấy trên môi trường BM:CM (bã mía:cám mì), sau quá trình nuôi cấy ta thu được chế phẩm enzyme thô từ môi trường. Cân 5 g chế phẩm enzyme thô cho vào cốc thủy tinh, thêm vào 20 ml nước cất. Khuấy đều dịch enzyme trong khoảng thời gian 30 phút (có thể khuấy trong khoảng thời gian 40, 50 phút, nhưng khoảng thời gian khuấy 30 phút là phù hợp nhất). Lọc lấy dịch chiết được thể tích khoảng 17,5 ml. Đem dịch lọc được đi ly tâm. Thu dịch ly tâm. Tủa dịch ly tâm (bằng cồn, acetone, hoặc muối amoni sulphate), trong trường hợp này ta tủa dịch ly tâm bằng cồn 960, với tỷ lệ 1:3, tức là: 17,5 ml dịch chiết enzyme thô với 52,5 ml cồn 960. Tách lấy phần tủa ở dưới đem đi ly tâm. Thu dịch ly tâm đem cân phân tích thu được khoảng 20,1g enzyme thô. Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme cellulase ở 400 C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương). Sau đó ta đem enzyme thô đi tinh sạch bằng quá trình lọc gel hay sử dụng phương pháp cố định enzyme để thu được enzyme cellulase thành phẩm. Hình 3.6 Dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm 3.3. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase 3.3.1. Xác định hàm lượng enzyme cellulase theo phương pháp Bradford Các Protein khi phản ứng xanh với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian. Hóa chất, thiết bị: Dung dịch mẫu enzyme cellulase cần xác định. Dung dịch albumine 0.1mg/ml: Cân chính xác 10mg albumin pha trong 100ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200 C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumine có nồng độ 0.01mg/ml. Dung dịch thuốc thử Bradford: Coomassie Brilliant Blue: 0.001g. Ethanl tuyệt đối: 4,7g Acid phosphoric 85%: 8.5g Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Thiết bị: Máy quang phổ Lập đồ thị chuẩn Để dung dich albumin chuẩn có các nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau: Bảng 3.1 Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn Ống số 1 2 3 4 5 6 Nồng độ albumin (µg) 0 10 20 30 40 50 Dung dich albuine(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại 2, 3, 4, 5, 6 các ống cách nhau 1 phút. Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành 1 cách tương tự như trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn. Đo ở bước sóng 595nm. Tính kết quả Trị số mật độ quang (OD) của những ống chứng (ống 2 đến ống 6) sau khi trừ đi trị số của ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml). Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi chiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml). Tổng hàm lượng protein trong M (g) chế phẩm thô được tính theo công thức: mg protein = b x 10-3 x m x M Với: b: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (µg/ml) m: hệ số pha loãng M: khối lượng chế phẩm enzyme thô (g) 3.3.2. Xác định hoạt tính enzyme cellulose bằng phương pháp đường chuẩn glucose Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5,0 và 400 C. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540 nm. Dụng cụ, thiết bị Máy ly tâm. Bộ ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy Vortex, pH kế, cân phân tích. Bếp điện. Chậu nước lạnh. Que khuấy thủy tinh. Hóa chất Cồn 960 . Sodium acetate. NaOH 1N. Bảng 3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme cellulase Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd glucose (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 Ml dd DNS-Lactose 2 2 2 2 2 2 2 Ml nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540 nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm. Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) Ống nghiệm 1: Chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0. Hút 1ml dung dịch đệm Na-acetac 50Mm, pH 5.0 cho vào ống nghiệm. Thêm 2ml dung dịch DNS-Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chưa enzyme và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm bằng 0. Ống nghiệm 2: Phản ứng enzyme Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 400 C/5 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 400 C/5 phút. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Để phản ứng ở 400 C chính xác 10 phút. Thêm 2ml dung dịch DND-Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Ống nghiệm 3: Không có phản ứng enzyme Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi từ 5 đến 10 phút để bất hoạt enzyme. Thêm 2ml dung dịch DNS-Lactose và lắc đều. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% chứa dung dịch enzyme và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Định lượng đơn vị hoạt tính Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phóng đường khử như glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng. 3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường, độ ẩm, thời gian, nhiệt độ tối ưu, độ pH tối ưu 3.4.1. Nghiên cứu thành phần môi trường Chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm với các thành phần môi trường tương ứng như sau.Cố định thành phần cám 75% và thành phần (NH4)2SO4 1%, thay đổi thành phần trấu. Trấu là tác nhân kích thích sinh tổng hợp cellulase. Ta có bảng thành phần môi trường thí nghiệm được bố trí như sau. Bảng 3.3 Thành phần môi trường thí nghiệm theo phần trăm Đơn Vị Tính Phần Trăm (%) Môi Trường Số 1 2 3 4 5 6 Cám 75 75 75 75 75 75 Trấu 22 20 18 16 14 12 (NH4)2SO4 1 1 1 1 1 1 Thêm nước điều chỉnh độ ẩm 60%. Cấy giống vào và nuôi cấy ở nhiệt độ phòng khoảng 28-300C. Thời gian khảo sát đối với Trichoderma.viride là 72 giờ. Sau đó xác định hoạt tính enzyme cellulase (đối với Trichoderma.viride) bằng cách đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 540 nm cho cellulase. Trong thành phần môi trường nhân giống, chúng tôi cố định hàm lượng cám và muối sunphat amôn ((NH4)2SO4), thay đổi thành phần trấu . Trấu là tác nhân làm cho môi trường thoáng xốp, tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tốt. Ban đầu nấm mốc sẽ tận dụng những chất dễ tiêu trong môi trường như các loại đường nhưng khi môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt thì nấm mốc phải tiết ra những enzyme để phân hủy cơ chất khác thành đường để tiếp tục tồn tại và phát triển. Tuy nhiên, cũng tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất nhiều hay ít mà nấm mốc sẽ tiết ra lượng enzyme khác nhau. Sự tổng hợp của enzyme còn phụ thuộc vào khả năng tiết tối đa của từng loại vi sinh vật có nghĩa là nếu tăng hàm lượng cơ chất vượt quá một giới hạn nhất định thì hoạt tính enzyme sẽ giảm do 2 nguyên nhân, thứ nhất do cơ chất tạo áp lực làm giảm quá trình sinh tổng hợp, thứ hai do cơ chất tăng trong khi năng lực tiết tối đa không đổi làm hoạt tính enzyme giảm. 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian Kết quả của thí nghiệm trên được áp dụng để tiếp tục cho thí nghiệm này. Sau khi chọn được môi trường tốt nhất cho sinh tổng hợp enzyme cellulase (đối với Trichoderma. viride), ta tiến hành bố trí thí nghiệm nuôi cấy nấm mốc và lấy mẫu ở các thời điểm khác nhau. Thời gian khảo sát từ 28 – 32 – 36 – 40 – 44 – 48 – 52 giờ, giữ nguyên độ ẩm 60%. Khi cấy nấm mốc vào môi trường, chúng sẽ không tiết ngay ra enzyme mà sẽ tiết kiệm năng lượng đến mức tối đa và sử dụng ngay những chất dễ sử dụng nhất là các đường đơn, khoáng chất có sẵn. Sau đó chúng sẽ tiết ra enzyme tùy vào thành phần các chất có trong môi trường. Nấm mốc phát triển được chia ra thành 4 giai đoạn như sau: thích nghi, phát triển, cân bằng và tử vong. Ở giai đoạn thích nghi và phát triển, nấm mốc sẽ tìm cách thích nghi và tiết ra loại enzyme nào và số lượng bao nhiêu để có thể tồn tại và phát triển. Theo thời gian thì lượng enzyme tiết ra sẽ tăng dần và đến một mức độ ổn định, sau đó sẽ giảm đi khi môi trường dinh dưỡng cạn kiệt dần. Quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase cũng tăng tương ứng theo thời gian. Ở Trichoderma. viride, thời gian tăng trưởng chậm hơn nhưng tạo ra hệ enzyme cellulase rất tốt. Sản phẩm của hệ enzyme cellulase là cellobiose, một chất kìm hãm hoạt tính của exo - β -glucanase. Do đó mà quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase ở Trichoderma. viride tăng trưởng mạnh trong khoảng thời gian từ 4 ngày. 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm Cũng giống như thí nghiệm trên, những kết quả khảo sát được áp dụng như thành phần môi trường và thời gian cho thí nghiệm này. Thay đổi độ ẩm theo các giá trị như sau: 50% - 54% -68% - 62% - 66% - 70%. Các quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc đều có liên quan đến độ ẩm. Độ ẩm là yếu tố quan trọng trong môi trường. Nếu độ ẩm quá thấp thì xảy ra hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào nấm mốc và làm cho tế bào bị chết. Điều này sẽ làm hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Nếu độ ẩm quá cao thì cũng không tốt cho sự sinh trưởng và phát triển. Ở một độ ẩm nhất định, khi đó hoạt động trao đổi chất diễn ra tốt nhất thì sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc sẽ diễn ra tốt nhất. Ở môi trường thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy ở độ ẩm 58% thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase có hoạt tính cao nhất ở Trichoderma. viride. Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy để nấm mốc sinh trưởng và phát triển tốt và sản sinh ra từng loại enzyme cực đại thì tùy thuộc vào từng loại giống mà chúng ta bố trí độ ẩm thích hợp. 3.4.4 Xác định độ pH tối ưu Để xác định pH phản ứng tối ưu cho phản ứng xúc tác của enzyme nghiên cứu, dịch enzyme tinh sạch (0.002 mg protein) được ủ với cơ chất CMC pha trong đệm 100 mM sodium acetate, pH từ 3.5-5.5 và 100 mM potassium phosphate, pH từ 6.0-8.0, hỗn hợp phản ứng được ủ ở 500C trong 20 phút. Để đánh giá độ bền pH của enzyme nghiên cứu, trước hết cellulase (0.002 mg protein) được ủ trong các đệm có pH thay đổi trong khoảng 3.5-8.0, trong 2 giờ ủ ở 370 C. Sau đó, chọn ra khoảng pH thích hợp để tiếp tục xác định độ bền pH theo thời gian: 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ. Tốt nhất ở pH 5.0. 3.4.5. Xác định nhiệt độ tối ưu Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu, chủng nấm nghiên cứu được nuôi trong môi trường: urea: 0.3, (NH4)2SO4: 1.4, KH2PO4: 2.0, CaCl2: 0.3, MgSO4.7H2O: 0.3, peptone: 1, cao nấm men: 10, tween 80: 1, CMC: 10, các yếu tố vi lượng: 0.1% (v/v) bao gồm các muối: FeSO4: 18 mM, MnSO4: 6.6 mM, ZnSO4: 4.8 mM, CoCl2: 15 mM, pH: 7.0 cơ bản cho sinh tổng hợp cellulase, lắc 200 vòng/phút ở 250C, 280C; 300C, 320C và 370C, pH 7.0. Dịch canh trường được thu sau 96 giờ nuôi cấy và xác định hoạt tính cellulase, tốt nhất ở 300 C. 3.5. Khảo sát tác nhân trợ tủa 3.5.1. Tủa protein-enzyme bằng muối, dung môi hữu cơ hoặc polymer Thường được sử dụng như là bước tinh sạch đầu tiên, bởi chúng có độ chọn lọc không cao, dễ thay đổi. Ở nồng độ muối thấp, độ hòa tan của protein tăng với nồng độ muối gia tăng, gọi là staling in. Khi nồng độ muối tăng cao hơn, thì độ hòa tan của protein giảm và tạo tủa, gọi là staling out. Chủ yếu các cation và anion của muối tương tác với nước bao quanh phân tử protein, làm tăng tính kỵ nước của protein, dẫn đến tạo tủa. Trong đó, các muối trung tính như muối sulphate và phosphate, đặc biệt là muối (NH4)2SO4 là thông dụng hơn cả. 3.5.2 .Tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau Chế phẩm enzyme cellulase thô dạng bột của nấm Trichoderma reesei được chiết bằng nước cất, thu được dịch chiết enzyme thô. Dịch chiết thô này được tủa với muối (NH4)2SO4 so ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60, 65, 70 và cồn 960 ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme: cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 cặn tủa thu được hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính cellulase nhằm tìm ra nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa cellulase. Từ đó khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của cellulase từ dịch tủa enzyme thu được từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm được chạy qua sắc ký lọc gel và xác định trọng lượng phân tử cellulase bằng điện di. Kết quả thu được như sau: Ở nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1:4 là tối ưu để tủa cellulase. Cellulase hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 470 C. Tủa protein-enzyme bằng phức hợp nước và dung môi hữu cơ Thường được sử dụng ở giai đoạn đầu tinh sạch enzyme. Có trở ngại là phải thực hiện ở nhiệt độ thấp (khoảng 200 C), vì dung môi hữu cơ gây biến tính protein ở nhiệt độ phòng. Ethanol và acetone là 2 dung môi thường được sử dụng nhiều nhất. Kết tủa bằng dung môi hữu cơ ưu điểm hơn kết tủa bằng muối, vì có độ chọn lọc cao hơn, ít tạo tủa vô định hình, dễ dàng thu nhận bằng ly tâm. Tủa tạo thành nhờ tương tác tĩnh điện giữa các phân tử protein với nhau, kể cả sự có mặt tương tác hấp dẫn Van de Waals, làm giảm hằng số điện môi giữa chúng. Tủa protein-enzyme bằng các polymer trung tính Các polymer trung tính tạo tương tác giữa các protein với nhau, nhờ ưu thế loại bỏ bọc nước, dẫn đến tạo tủa protein và tách phase. Khác với dung môi hữu cơ, các polymer trung tính như polyethylene glycol (PEG), không gây biến tính protein, nên có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng. Ngoài 3 phương pháp tạo tủa phân đoạn protein kể trên, một số phương pháp tạo tủa khác cũng được sử dụng. Đó là tạo tủa phân đoạn protein bằng cách gây biến tính bởi nhiệt độ, độ pH, dung môi hữu cơ, tạo tủa loại protein gây nhiễm. Để tăng tủa đặc hiệu, người ta bổ sung các tay nối (ligand) đặc hiệu vào các polymer tạo “tủa ái lực protein” cho phép làm sạch đáng kể protein-enzyme dịch. 3.5.5. Tủa enzyme bằng điểm đẳng điện Dựa trên tính chất protein có độ hoà tan thấp ở điểm đẳng điện. Ở điểm đẳng điện độ hydrate-hoá của protein là cực tiểu làm tăng tương tác giữa các phân tử protein, dẫn đến tạo tủa. Khó khăn của phương pháp này là do protein chỉ có khoảng giá trị pH đẳng điện giới hạn. Phương pháp này cho hiệu quả không cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ. 3.6. Cố định enzyme cellulase trên chất mang Natriaginatel Tạo dung dịch Natrialginate 3%: Cân 0.75g Natrialginate hòa tan trong 25 ml dung dịch đệm acetate pH 5. Khuấy đến khi tất cả Natrialginate hòa tan hoàn toàn là được. Tiến hành cố định: Cân 0.5g ezyme cellulase hòa tan trong dung dịch Natrialginate 3%. Dùng ống xilanh có đầu kim tiêm, hút dung dịch enzyme hòa tan này nhỏ từ độ cao 20cm vào trong 100ml dung dịch 0.2m CaCl2 để tạo gel. Qúa trình tạo gel xảy ra trong 2 giờ, ở nhiệt độ phòng. Sau cố định, dùng giấy lọc, lọc enzyme đã được cố định. Kết quả thu được hạt gel enzyme cellulase đã được nhốt trong khuôn gel. Dịch lọc thu được đem đi xác định hàm lượng theo phương pháp Bradford và xác định hoạt tíh theo phương pháp của công ty Shin Nihon Chemical Co, Ltd. Cách tính: HL Protein cố định (mg) = HL Protein trước cố định – HL Protein còn lại Hiệu suất gắn Protein được tính theo công thức sau: HS cố định Protein = HL Protein cố định/HL Protein trước cố định x 100 Hiệu suất hoạt tính enzyme cellulase cố định so với hoạt tính enzyme cellulase ban đầu: ∑ ĐVHT E cellulase cố định HS hoạt tính enzyme cố định (%) = X 100 ∑ ĐVHT E cellulase trước cố định Trong đó: ∑ ĐVHT E cellulase cố định: Số đơn vị hoạt tính enzyme cellulase cố định (UI/g). ∑ ĐVHT E cellulase trước cố định: Số đơn vị hoạt tính enzyme cellulase trước cố định (UI/g). Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cellulase cố định trên Natrialginate Sau khi hạt gel đã được cố định ta bọc bằng giấy lọc, thu dịch nước tiến hành khảo sát hoạt tính và hàm lượng lần 1 và rửa lại bằng CaCl2, tiếp tục khảo sát hoạt tính và hàm lượng lần 2 cứ như thế ta khảo sát được lần 3, lần 4,…. Vẽ đồ thị số lần tái sử dụng giảm 50% so với enzyme ban đầu. . Tinh sạch enzyme 3.7.1. Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ 3.7.1.1. Dụng cụ và thiết bị Phễu đổ gel Bình hút chân không Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1,5 cm, thể tích 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3,14 (π) = 30 x (1.5/2)2 x 3,14 . Bình đựng dung dịch đệm Ống nghiệm: 20 cái Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch. 3.7.1.2. Hóa chất Gel “Sephadex G-100”, có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90 µm, khả năng ngậm nước: 12ml/1 g gel khô, phạm vi phân tách: 5.000-100.000 Daltons. Đệm Acetate 50 Nm, pH 5.0: khử bọt khí trước khi dùng 3.7.1.3. Tinh sạch enzyme Dịch enzyme sau khi được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, được đưa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100 với tổng thể tích 10 ml. Cột có kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM potassium phosphate, pH 7.5. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn. Dịch enzyme thô Dịch enzyme sau khi qua cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, chọn những phân đoạn có hoạt tính endo- β -1,4-glucanase cao được đưa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Cột có kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, thôi mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1000 mM NaCl. Tốc độ dòng chảy là 3320 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định cho mỗi phân đoạn. Quá trình tinh sạch endoglucanase có thể được tóm tắt như sơ đồ: Ly tâm 10000 vòng/10 phút ↓ Dịch trong ↓ Cột Sephadex G100 ↓ Cột DEAE ↓ Enzyme tinh sạch ↓ . Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di trên gel Polyacrylamide 3.8.1. Giới thiệu về gel Polycrylamide Gel polycrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử acrylamide và N, N’-methylene-bis-acrylamide. Qúa trình polymer hóa được xúc tác bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS), N, N ,N’ ,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED). Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước của ỗ gel. Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide: nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kĩ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptooethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương, và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường. Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết. Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp: Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng. Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein có xuất phát ban đầu. Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí. Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10.000-200.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200.000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2.5%. Ngoài kĩ thuật SDS-PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein (Denaturing condition), người ta còn dùng một số kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính (Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính của protein như tạo lien kết (cross-linkes) giữa các protein với nhau. Một số protein không có sự tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng với những protein khác người ta sử dụng kĩ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện (Isoelectric focusing gel electrophoresis). Vật liệu . Dụng cụ và thiết bị Bộ điện di chứng Bộ nguồn chạy điện di (electrophoresis power supply) Biorad Pipetteman 1000 µl. Pipetteman 200 µl. Pipetteman 10µl. Típ xanh: 1 hộp. Típ vàng: 1 hộp. Típ trắng: 1 hộp. Giấy lọc. Giấy thấm. Găng tay: 1 đôi. Phao. Eppendorf. pH kế . Hóa chất N, N, N’, N’-tetramethylenediamide [C6H16N2-TEMED] Dung dịch Acryamide/Bisacryamide 40% (29:1) (3,3 % C) β-Mercaptoethanol [HSCH2CH2OH] Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-Rad), gồm các protein chuẩn có kích thước xác định sau: Phosphorylase b 97.400 Daltons Bovine serum albumin 66.200 Daltons Ovalbumin 45.000 Daltons Carbonic anhydrase 31.000 Daltons Soybean trypsin inhibitor 21.500 Daltons Lysozyme 14.400 Daltons Sodium Dodecyl Sulfate [SDS] Ammonium persulfate [(NH4)2S2O8][APS] Coomassie Brillilant Blue G 250 dạng viên (Bio-Rad) Cồn tuyệt đối [99,5 độ] Methanol [CH3OH] Tris (hydroxymethyl) aminomethane Axit acetic Bromophenol blue Glycerol [C3H8O3] Glycine [C2H5O2N] Axít Clohydric [HCl] Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%: cân 10g SDS cho 100ml nước cất vào khuấy cho tới khi tan hết. Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-Cl 1.5 M, pH 8.8-0,4% SDS: cân 36,3 g Tris pha thêm 100 ml nước cất thêm dần HCl 6 N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 8.8. Hút 8 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 200 ml, lắc đều giữ ở 40 C. Dung dịch gel gom (stacking gel buffer) Tris-Cl 0,5M, pH 6.8-0,4% SDS: cân 6.05g Tris pha trong 100ml nước cất thêm dần HCl 6N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chi 6.8. Hút 4ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 100ml, lắc đều giữ ở 40 C. Ammoniumperslfate 10% (chỉ pha trước khi dùng): cân 0.1g cho vào một eppendorf 1000µl thêm 1ml nước cất, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng. Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8.3: pha dung dịch me 10X chứa 30g Tris, 144g Glycine, 10g SDS hòa trong 1000ml nước cất. Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer) có thành phần như sau: 2.5ml dung dịch đệm Tris-Cl 0.5M, pH 6.8, 4ml 10% SDS, 2ml Glycerol, 2mg Bromophenol Blue, 0.2 ml mercaptoethanol, thêm nước đủ 10ml. Dung dịch nhuộm gel: chuẩn bị 250ml dung dịch nhuộm gel chứa 0.625g Coomassie Blue G 250, 112.5ml ethanol tuyệt đối, 112.5ml nước cất và 25ml axit acetic, lắc đều, giữ trong chai màu tối. Dung dịch giải nhuộm: 30ml methanol: 10ml acid acetic: 60ml nước cất. Phương pháp Đổ gel Chuẩn bị đổ một gel có kích thước 100 x 100 x 0.75mm có nồng độ acrylamide là 10%. Gel phân tách (separating gel) Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50ml sạch: 40% Acrylamide/Bis (29:1) 2.5ml Tris-HCl 1.5M pH 8.8-0.4% SDS 2.5ml Nước cất 4.445ml TEMED 5µl Ammonium persulfate 10% 50µl Tổng thể tích 10ml Sau khi cho Ammonium persulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipette Pasteur hoặc pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó, nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20-30 phút). Gel gom (Stacking gel) Cho các thành phần sau vào một Becher 50ml khác: 40% Acrylamide/0.85 bisacrylamide 0.5ml Tris-HCl 0.5M pH 6.8-0.4% SDS 1ml Nước cất 2.476ml TEMED 4µl Ammonium persulfate 10% 20µl Tổng thể tích 4ml Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đổ hết nước bên trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipette Pasteur hoặc pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào gel để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sauk hi gel trùng ngưng à tháo lược à lắp đĩa gel vào bộ phận điện di à cho dung dịch điện di vào buồn điện di. Chuẩn bị mẫu và chạy điện di Xử lý mẫu Hút 30µl dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) và 30µl dung dịch mẫu protein vào một eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy 5-10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1-5 giây. Đối với những thang chuẩn protein (Biorad0 hút 2µl vào eppendorf 1ml chứa 8 µl nước cất và 10µl dung dịch nạp mẫu. Tiến hành chạy điện di Dùng pipetteman 10µl nạp mẫu vào các giếng (20µl/giếng). Tiến hành chạy điện di ổn định dòng: 100V Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trước (2-4 giờ) 1 giờ. Sau đó, tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đén khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Sauk hi nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt. Xác định trọng lượng phân tử của protein Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách đến các band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng. Tính giá trị Rf: Khoảng cách di chuyển của protein Rf = Khoảng cách di chuyển của vạch màu Brommophenol Blue Vẽ biểu đồ log10 của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng. Trọng lượng phân tử của các vạch protein chưa biết trọng lượng phân tử có thể xác định thông số giá trị Rf của chúng thông qua phương pháp ngoại suy tử đồ thị. Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cellulase trên Natrialginate Cân 1 g enzyme cố định đem xác định số lần tái sử dụng của enzyme cellulase trên Natrialginate theo phương pháp mục 3.6. Xác định hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp mục 3.2.2. Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hoạt ính enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng Số lần lặp lại Hoạt tính (U/g) Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) 1 136.15 100 2 104.97 77.09 3 73.76 54.18 4 51.08 37.52 5 39.75 29.20 6 31.25 22.96 7 14.21 10.44 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hoạt tính của enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng Nhận xét: Việc tái sử dụng enzyme là đặc tính quan trọng của enzyme cố định. Tuy nhiên qua các lần tái sử dụng hoạt tính của enzyme bị giảm so với hoạt tính ban đầu của enzyme cố định. Sự giảm hoạt tính của enzyme cố định phụ thuộc nhiều yếu tố.Theo đồ thị thì hoạt tính cellulase cố định trên Natrialginate giảm đi rất nhiều so với ban đầu. Ở lần tái sử dụng thứ 4 hoạt tính cellulase chỉ còn 37.52%. Hiệu suất tái sử dụng của cellulase cố định trên Natrialginate không cao có thể là do cơ chất Natrialginate kém bền với nhiệt độ và các điều kiện phản ứng. Sau mỗi lần tái sử dụng, enzyme bị thất thoát nhiều, do đó hoạt tính cellulase cố định giảm rất nhanh. Tuy nhiên sau 4 lần tái sử dụng hoạt tính cellulase cố định giảm đi ít hơn so với những lần đầu tiên. Có thể là do đường kính hạt gel Natrialginate khá lớn nên với những điều kiện phản ứng chỉ tác động đến một phần hạt gel làm cho những lần tái sử dụng sau lượng enzyme trong hạt gel ít thất thoát hơn nên hoạt tính cellulase cố định những lần sau giảm ít hơn và ổn định hơn. Tuy vậy hoạt tính của những lần tái sử dụng sau vẫn thấp (hoạt tính còn giữ lại 10.44% sau 7 lần tái sử dụng). CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Từ những nghiên cứu về quy trình tách chiết enzyme cellulase từ Trichoderma reesei xác định được các yếu tố nhiệt độ, pH, độ ẩm cơ chất ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp cũng như tách chiết enzyme cellulase. Xác định đươc tác nhân của enzyme hiệu quả nhất cho quy trình phân hủy cơ chất và củng như giúp cho quy trình thu hồi enzyme tốt nhất. Xây dựng quy trình tách chiết enzyme cellulase bằng phương pháp sắc ký lọc gel đồng thời xác định trọng lượng của phân tử enzyme tạo thành. 4.2. Đề nghị Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn các dòng nấm Trichoderma Reesei bị đột biến xem dòng nào mang lại hiệu quả sản xuất enzyme cellulase là cao nhất, mà giá thành sản xuất lại ít tốn kém . Ngoài chủng nấm Trichoderma Reesei ra, thì chúng ta nên tiến hành khảo sát thêm khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm mốc khác như : Bacillus subtilis, Apergilus, vi khuẩn, xạ khuẩn…xem khả năng tổng hợp enzyme cellulase của chủng nào là mạnh nhất, mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất . Tận dụng và xử lý có hiệu quả nguồn phế thải hữu cơ từ các nhà máy : mạt cưa, bã mía, cám mì, bã đậu nành... Nó không chỉ góp phần vào bảo vệ môi trường mà còn tạo ra một lượng lớn enzyme cellulase ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất bột giặc, trong dược phẩm… Bên cạnh ứng dụng của các chủng nấm để sản xuất enzyme cellulase thì ta cũng nên nghiên cứu thêm nhũng ứng dụng khác của chủng nấm để phục vụ cho khoa học, cũng như trong đời sống hàng ngày. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh,113 - 114, 2003. [2] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 1- Thí nghiệm hóa sinh học, nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 128 - 129, 2003. [3] Lê Hồng Phú, Nghiên cứu sinh tổng hợp Enzyme Pectinase và Cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ, Luận văn thạc sĩ ngành sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, 2003. [4] Nguyễn Văn Tuân, tuyển chọn nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất của Endo-β-1,4-glucanase, luận văn Thạc sĩ Khoa Học Sinh Học, Trường Đại Học Thái Nguyên . [5] Trần Thạnh Phong, Hoàng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phượng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Thu nhận enzyme cellulase của Trichoderma Reesei trên môi trường bán rắn, Viện Sinh Học Nhiệt Đới-Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam. [6] PGS TS Nguyễn Tiến Thắng, Giaó trình công nghệ Enzyme, TP HCM 2010 Tài liệu tiếng anh Okada G., The growth of Trichoderma viride on media containing cotton fibres, J. Biochem, trang 591 – 607, 1963. Ruy D.D.Y. And Mandels M. – Cellulase, Biosynthesis and applications - Enzyme Microbiology Technology, 1980. Gary J. Samuels, Trichoderma a guide to identification and biology. Unit States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA, 2004. Science & Technology Development, Vol 12, No.13 – 2009. PHỤ LỤC Phụ lục A. Bảng 1.1: Đại diện vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase Vi Sinh Vật Vi Khuẩn Nấm Acremonium cellulolyticus Actinomycetes Thermoactinomyces sp. Chrysosporium Aspergillus acculeatus Actinomycetes Thermomonospora curvata Schizophyllum xã Aspergillus fumigates Sclerotium rolfsii Aspergillus niger Sporotrichum cellulophilum Fusarium solani Talaromyces emersonii Irpex lacteus Thielavia terrestris Penicillium funmiculosum Trichoderma koningii Phanerochaete Trichoderma reesei Clostridium thermocellum Trichoderma viride Ruminococcus albus Streptomyces sp. Phụ lục B. Môi trường nuôi cấy các chủng Vi Sinh Vật Môi trường nuôi cấy: Môi trường (MT) nuôi cấy vi khuẩn: CMC 1%, peptone 0,05%, cao thịt 0,1%, NaCl 0,1%). MT nuôi cấy xạ khuẩn: CMC 1%, tinh bột 0,1%, cao nấm men 0,02%. MT nuôi cấy nấm sợi: CMC 1%, cao malt 0.02%. MT nuôi cấy nấm men: CMC 1%, glucose 0,1%, peptone 0,05%, cao nấm men 0,03%, cao malt 0,03%. MT nuôi cấy các chủng vi sinh vật sinh cellulase được sưu tập từ phòng thí nghiệm của trường Đại học khoa học Tự nhiên: CMC 1%, tinh bột 0,1%, MgSO4 0,02 %, NaHCO3 0.02%, K2HPO4 0,5%, CaCl2 0.02%, NaCl 0,02%, peptone 0,02%. Môi trường AN: KH2PO4 0,1g, NaNO3 0,3g, MgSO4 .H2O 0,05g, KCl 0,05g, FeSO4 7H2O 0,01g, Cao bắp 0,5g, giấy lọc 2g, nước cất 1l. MT Zapek, Cell. Phụ lục C. Gel “Biogel-P-“Hãng Bio-Rad C.1.Giới thiệu Các loại gel “Bio-Gel P” là các hạt polyacrylamide tạo lỗ, được điều chế bằng quá trình đồng hóa polymer hóa acrylamide và N, N’ –methylene-bis-acrylamide. Các gel này rất ưa nước và không mang điện tính, giúp việc lọc các hợp chất nhạy cảm qua gel đạt hiệu quả. Độ phân giải cao được xác định bằng 2 yếu tố (1) sự phân bố hẹp và consistent của đường kính hạt, (2) sự phân tách tốt theo trọng lượng phân tử. Gel “Bio-Gel P” thích hợp với các acid hữu cơ yếu, urê 8M, guanidine 6M, các tác nhân chatropic, các tác nhân khử như dithiothreitol và mercaptoethanol, các tác nhân tẩy như SDS, CHAPS, và Triton X-100, Bio-Gel P có thể được dùng với nước cất, tuy nhiên các dung dịch đệm có cường độ ion > 50Mm sẽ mang lại hiệu quả phân tách protein tốt nhất. Có thể cho dung môi hữu cơ miscible vào chất giải hấp được dùng với gel “Bio-Gel P”. Cồn (có thể đến 20%) không làm thay đổi đặc tính phân tách của gel, và trong một vài trường hợp nó còn làm tăng quá trình phân tách các hỗn hợp phức tạp của các phân tử hòa tan kém trong nước như các nucleotide, peptide, tamin. Có thể dùng dung môi formamide ở cường độ mạnh vì gel “Bio-Gel P” swell hoàn toàn bởi dung môi này. Gel “Bio-Gel P” có thể khử trùng ở pH 5.5-6.0 trong các dung dịch đệm như HEPES 50Mm, MES, hoặc citrate ở 1200 C trong 15-30 phút. Ở nhiệt độ phòng, phạm vi pH nên điều chỉnh từ 2 đến 10. Gel “Bio-Gel P” nhạy cảm với sự thủy phân các nhóm amide ở pH cao hoặc thấp. Tốc độ dòng và độ phân giải gia tăng khi nhiệt độ trong phạm vi 4-800 C. C.2. Các thông số kĩ thuật Bảng 3.1 Các thông số của sản phẩm gel “Bio-Gel-P” Thông Số Đặc Tính Chất nền (Matrix) Gel-Bio-Gel polyacrylamide Kích thước hạt Trung bình 90-180 µm Mịn 45-90 µm Rất mịn < 45 µm Shipping medium Shipped dry Phạm vi hoạt động tốt pH 2-10 Áp suất 15 psi Các dung môi hữu cơ < 200 C Phạm vi nhiệt độ vận hành 4-800 C Phạm vi nhiệt độ cho phép Khử trùng bằng autoclave, pH 5.5-6.5 ở nhiệt độ 1200 C trong 30 phút. Bảo quản Khô, ở nhiệt độ phòng, trong nước cất hoặc dung dịch đệm ở 40 C với sodium azide 0.02%. Bảng 3.2 Các dặc tính của gel “Bio-Gel P” Gel Phạm vi kích thước hạt, các hạt đã bị ngậm nước(µM) Thể tích nền đã hydrated điển hình, ml/g gel khô Tốc độ dòng điển hình (cm/hr) Phạm vi phân tách tiêu biểu/giới hạn phân tách thong thường (Daltons) Bio-Gel P-2 Gel, mịn Bio-Gel P-2, rất mịn 45-90 < 45 3 5.0-10 < 10 100-1.800 100-1.800 Bio-Gel P-4 Gel, trung bình Bio-Gel P-4 Gel, mịn Bio-Gel P-4 Gel, rất mịn 90-180 45-90 < 45 4 15-20 10-15 < 10 800-4.000 800-4.000 800-4.000 Bio-Gel p-6 Gel, trung bình Bio-Gel P-6 Gel, mịn Bio-Gel P-6 Gel, rất mịn 90-180 45-90 < 45 6.5 15-20 10-15 < 10 1.000-6.000 1.000-6.000 1.000-6.000 Bio-Gel P-6DG Gel 90-180 6.5 15-20 1.000-6.000 Bio-Gel P-10 Gel, trung bình 90-180 7.5 15-20 1.500-20.000 Bio-Gel P-10 Gel, rất mịn 45-90 10-15 1.500-20.000 Bio-Gel P-30 Gel, trung bình Bio-Gel P-30 Gel, mịn 90-180 45-90 9 15-20 10-15 2.500-40.000 2.500-40.000 Bio-Gel P-60 Gel, trung bình Bio-Gel P-60 Gel, mịn 90-180 45-90 11 15-20 10-15 3.000-60.000 3.000-60.000 Bio-Gel P-100 Gel, trung bình Bio-Gel P-100 Gel, mịn 90-180 45-90 12 15-20 10-15 5.000-100.000 5.000-100.000 Lưu ý: Tốc độ dòng xác định ở cột 1.5 x 70 cm. Phạm vi phân tách trên 40.000 daltons đối với các phân tử hình cầu. Đối với mục đích kiểm soát chất lượng, giới hạn phân tách được xác định bằng cách tính giá trị Kd, hoặc hệ số phân bố. Hệ số phân bố là giá trị thời gian lưu của phân tử trong các lỗ gel, được biểu diễn như sau: (Ve – Vo)/ (Vt – Vo) Trong đó: Ve là thể tích giải hấp (thể tích thôi = elution volumn). Vo là thể tích trống (void volumn). Vt là thể tích tổng xác định bằng một phân tử nhỏ như vitamin B12 C.3. Hướng dẫn sử dụng Bio-Gel P C.3.1. Chọn cột Kích thước cột lý tưởng là những kích thước cho phép phân giải vạch ranh giới các chất phân tích mà không cần pha loãng mẫu nhiều. Điển hình, chiều dài cột so với tỷ lệ đường kính ở khoảng pH 5-10, và thể tích lớp nền (bed volumn) gấp 4-20 lần thể tích của mẫu. Hệ số pha loãng tối thiểu có thể thu được đối với một chất đã được tách (excluded substance) khoảng 1,25. Nhìn chung, đối với quá trình phân tách khó thì cần chiều dài lớp nền so với tỷ lệ đường kính là 25-100 hoặc lớn hơn, và thể tích lớp nền gấp 25-100 lần thể tích mẫu. Chọn chất tách Chất tách (chất giải hấp) là chất lỏng dùng để chiết một chất khỏi chất khác trong sắc ký. Chất tách chọn cần tạo tính ổn định tối đa cho các chất tan không ổn định trong mẫu. Nồng độ ion ít nhất là 20mM để loại trừ ảnh hưởng của số lượng nhỏ các nhóm mang điện âm trên gel. Việc sử dụng các dung dịch muối ở nồng độ cao có thể gây ra những thay đổi nhỏ trong thể tích lớp nền gel và giới hạn phân tách (exclusion limits). Bio-Gel P tương thích với các trạng thái hòa tan và làm biến tính (solubilizing and denaturing condition) được sử dụng trong việc xác định trọng lượng phân tử như guanidine-HCl 6M, các tác nhân chaotropic, các tác nhân khử như dithiothreitol và mercaptoethanol, và các thuốc tẩy như SDS, CHAPS, và Triton X-100. Có thể sử dụng các muối đệm dễ bay hơi như pyridine, acetic acid, ammonium formate hoặc ammonium bicarbonate nếu sản phẩm cuối cùng cần phải ở trạng thái không có muối đệm. Có thể loại các chất này ra khỏi phân đoạn dòng chảy (effluent fractions) dễ dàng bằng đông khô. Nên loại các khí hòa tan như CO2 để ngăn chặn sự tạo bọt trong hệ thống. Thực hiện điều này bằng cách hút dung dịch đệm trong một lọ chân không bằng một vòi nước tạo chân không hoặc bằng máy tạo chân không. Nên tránh sử dụng các chất tách có pH trên 10 hoặc nhỏ hơn 2 để ngăn sự thủy phân gel. Tránh dùng các tác nhân 0xy hóa mạnh vì các chất này sẽ phản ứng với gel và làm gia tăng hàm lượng các nhóm tích điện trên chất lớp. Chuẩn bị gel Cho từ từ môi trường Bio-Gel P vào dung dịch đệm đã được đựng trong cốc mỏ (beaker). Có thể ước tính lượng gel Bio-Gel P cần cho vào cột có thể tích đã biết bằng cách sử dụng bảng 2, bảng này cho biết thể tích lớp neenfkhi được hydrat hóa. Lưu ý sự mất gel trong suốt quá trình tiến hành công việc. Dùng dung dịch đệm nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền cần cho trong cột. Đối với các gel từ Bio-Gel P-2 đến Bio-Gel P-10 cần hydrat hóa trong vòng 4 giờ ở nhiệt độ phòng (1 giờ nếu dung dịch đệm đã được làm nóng đến 1000 C và rồi làm lạnh sau khi đã cho gel vào dung dịch đệm). Đối với các gel từ Bio-Gel P-30 đến Bio-Gel P-100 cần 12 giờ ở 200 C để hydrat hóa hoặc 4 giờ nếu bắt đầu ở 1000 C . Sauk hi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định trong suốt quá trình hydrat hóa. Sau khi quá trình hydrat xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình lọc và gắn với nguồn chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình. Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư hại gel. Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ bình. Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định. Gạn hoăc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại > 99% hạt mịn. Cho một cái phễu trên đỉnh cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều chất pha trộn loãng (slurry) vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn (tung tóe) chất pha trộn loãng để đảm bảo việc nhồi cột đều và để tránh việc bẫy các bọt khí. Khi 2-5 cm lớp nền đã hình thàh, cho cột chảy cho đến khi cột được nạp đầy (packed). Khi cột đã được nạp đầy, đóng đầu ra (outlet) của cột và gắn flow adaptor. Mở đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp 2 lần thể tích trên lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy. Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor. Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị. Nếu không dùng flow adaptor thì lấy lớp gel thừa cho đến khi đạt chiều cao lớp nền mong muốn khi mà cột đã được nạp xong và gắn cột vào một reservoir. Cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ dòng chảy. Rút dung dịch đệm xuống bằng lớp nền gel và mẫu nằm trên lớp nền gel, sau đó cho thêm dung dịch đệm để lấy mẫu vào lớp nền. Thay lớp dung dịch đệm nổi trên bề mặt và gắn cột vào reservoir. Thu các phân đoạn để phân tích hoặc theo dõi bằng một thiết bị dòng liên tục (continuous flow equipment) như UV/Vis, các máy đo độ dẫn (conductivity) và chỉ số khúc xạ (refractive index). Mẫu Lọc gel phần lớn độc lập với nồng độ mẫu nhưng thể tích mẫu tương ứng với thể tích lớp nền lại khá quan trọng. Với mục đích phân tích, mẫu không nên lớn hơn 1-5% thể tích lớp nền. Với mục đích khử muối, mẫu có thể là 30-35% so với thể tích lớp nền. Độ nhớt của mẫu có thể giới hạn nồng độ mẫu mà có thể sử dụng. Mẫu có độ nhớt cao có thể pha loãng để là giảm độ nhớt. Có thể đạt được kết quả tốt hơn bằng cách áp dụng mẫu có độ nhớt cao ở tốc độ chảy thấp. Mẫu cần sạch và hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm chạy mà không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn. Lọc mẫu sẽ làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng của cột. Nếu vì tính chất của mẫu mà không thể đem lọc được thì nên ly tâm mẫu cho đến khi nó sạch. Trình bày ảnh hưởng theo giả thuyết về các điều kiện sắc kí khác nhau. Xác định thể tích trống (void volumn) và hiệu chuẩn (calibration) Thể tích trống (Void volumn) = Vo của lớp nền bằng với thể tích phân tách (elution volumn = Ve) của các nguyên liệu đã phân tách. Nên xác đinh thể tích chân không của lớp nền và nên kiểm tra tính đồng nhất của chất phân tách của lớp nền trước khi áp dụng mẫu thí nghiệm. Các protein có màu như hemoglobin, ferritin phù hợp với phương pháp xác định thể tích chân không này. Dextran xanh không được đề nghị xác đinh thể tích chân không vì nó không đồng nhất (heterogeneous) và có thể cho ra những kết quả khác nhau. Nó cũng có thể liên kết không dặc hiệu với gel. Sử dụng các protein chuẩn cho phép kiểm tra viecj nạp cột (colum packing) và sự phân tách protein (protein elution). Nó cũng cho phép so sánh các loại cột với nhau và các nguyên liệu để nạp cột khác nhau mà không làm lãng phí mẫu. Chuẩn lọc gel của hãng Bio-Rad là một hỗn hợp 5 protein có trọng lượng phân tử đã biết: thyroglobulin (Mr 670.000), gamma globulin bò (Mr 158.000), ovalbumin của gà (Mr 44.000), myoglobin của ngựa (Mr 17.000), và vitamin B12 (Mr 1350). Vitamin B12 và myoglobin có thể nhìn thấy được khi chúng di chuyển qua cột Vệ sinh và khử trùng Gel Bio-Gel P có thể được khử trùng bên trong cột bằng cách sử dụng 3% hydrogen peroxide trong nước, dung dịch ethanol, diethyl pyrocarbonat hoặc thimerosal 1: 10.000. Gel Bio-Gel P đã hydrat hóa có thể được khử trùng bằng autoclave ở pH 5.5-6.5 ở 1200 C trong 30 phút. Khi khử trung bằng autoclave, gel có thể bị phồng lên từ 4-20 lần thể tích ban đầu. Sự phồng lên càng nhiều thì làm cho kích thước lỗ càng lớn. Bảo quản Các cột đã được nạp gel Bio-Gel P có thể bảo quản không giới hạn nếu được duy trì ở pH trung tính khi có mặt chất kháng khuẩn như 0.02% sodium azide. Nên bảo quản các cột đó ở 40 C. Xác định tốc độ dòng Lọc gel là một quá trình có kiểm soát chất khyếch tán : hiệu quả phân tách tùy thuộc vào tốc độ và độ đồng nhất của kích thước hạt gel. Độ phân tách cao nhất nhạn đươc khi tốc độ dòng được duy trì trong phạm vi 2-10 cm/hr. Đối với tốc độ dòng tuyến tính 5cm/hr (nghĩa là tốc đọ dòng theo chiều dài của cột), để xác định tốc độ dòng của cột ta lấy tốc độ dòng tuyến tính nhân với diện tích thiết diện (cross sectional area) của cột. Bảng 3.3 Xác định tốc độ dòng Tốc độ dòng tuyến tính (cm/hr) Đường kính cột (cm) Diện tích thiết diện (cm2) Tốc độ dòng qua cột ml/hr 5 0.7 0.385 1.9 5 1.0 0.785 3.9 5 1.5 1.77 8.9 5 2.5 4.91 25 5 5.0 19.6 98 Đối với cột có kích thước 1.5 x 70 cm. Tốc độ dòng sẽ giảm nếu chiều dài cột tăng. ml/hr/cm2 (diện tích thiết diện) = cm3/hr/cm2 = cm/hr.