Khóa luận Khảo sát sinh trrởng nấm linh chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan - Việt Nam

; Wang Chi, 1994). Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố khoáng vết hiếm. Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng cholesterol trên thành mạch. Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô. Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm Linh chi được xem như là một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung thư.[10, 11] Hiệu quả chống ung thƣ: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm. Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn [10]. Công trình của Zhibin Lin (1994) đã chỉ ra nguyên lý hiệu dụng là tăng khôi phục hệ miễn dịch, nhờ đó các phác đồ trị liệu: xạ trị, hóa trị, giải phẩu đạt kết quả cao hơn. 19 Đối với các bệnh về hô hấp: Nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là những ca điều trị viêm phế quản dị ứng – hen phế quản tới 80%, có tác dụng làm giảm và nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn.[3, 4] Khả năng kháng HIV: Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm kháng virút HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sự nhân lên của virút được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV – 1. Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virút này (Gau J.P, 1990; Kim, 1996). Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác đồ điều trị tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt [10]. Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau:(Masao Hattori, 2001)  Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1  Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV – 1  Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma). Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (- OH) ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột.[10, 27] Khả năng antioxydant: Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponine và triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985). Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi. Chính vì vậy con người có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh chi Việt Nam nói riêng.[10] Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay sau khi bị nhiễm xạ. Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ nào cho cơ thể. Ngoài ra nấm Linh chi còn có tác dụng chữa trị chứng bí tiểu, bổ thận khí chữa trị đau nhức khớp xương, gân cốt,…[11, 14] 20 Bảng 2.7: Một số bài thuốc chữa bệnh của nấm Linh chi [3] Tác dụng điều trị Pha chế Cách dùng Suy nhược thần kinh, nhức đầu chóng mặt, ngứa ban đêm Linh Chi 1 – 3 gam Sắc uống mỗi ngày 3 lần Viêm gan mãn tính, suyễn phế quản, viêm thận Linh Chi 50 gam Nghiền bột uống mỗi lần 1 – 1,5 gam, ngày uống 3 lần Bệnh tim dài Bột Linh Chi 30 gam, bột đậu 90 gam Nghiền bột 9 – 15 gam uống với nước sôi, ngày uống 3 lần Cao huyết áp, viêm gan mãn tính Linh Chi 10 gam Sắc uống mỗi ngày 3 lần Đau dạ dày Linh Chi 30 gam, rượu vang 250 gam Ngâm rượu 14 ngày, ngày uống 2 lần, mỗi lần 15 ml 2.6. Giới thiệu sơ lƣợc về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi 2.6.1. Ganoderma polysaccharide (GLPs) [16, 17] Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi. Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng. Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị. Một trong 4 loại polysaccharide có đặc tính chống khối u mạnh nhất là beta – D glucan, trọng lượng phân tử 3,12 * 105 hoặc 1,56 * 106, có tác dụng chống ung thu và tăng tính miễn dịch cho cơ thể. Vai trò dược học của polysaccharide:  Kích thích hệ miễn dịch cơ thể  Gia tăng khả năng dung nạp oxygen 21  Giảm gốc tự do hydroxyl  Ức chế khối u phát triển  Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ  Tăng chức năng gan  Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường  Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein 2.6.2. Ganoderic Acid Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử ganodermal. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng G.acid cao thì có nhiều vị đắng. [21, 22] Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid. [5, 9] Bảng 2.8: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) (Lê Xuân Thám, 1996) Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy rằng Ganoderic acid còn có tác dụng:  Giảm đau  Bảo vệ gan Hoạt chất Hoạt tính Ganoderic acid R,S Ức chế giải phóng histamin Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp Ganodermaldiol Hạ huyết áp Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid Ức chế tổng hợp cholesterol 22  Chống khối u 2.6.3. Ganoderma Adenosine [21, 22] Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh. Chức năng của adenosine:  Giảm độ nhớt máu  Ức chế kết dính tiểu cầu  Ngăn chặn hình thành cục nghẽn  Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin  Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lưu lượng máu cung cấp cho não  Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể 2.6.4. Alcaloid [5, 9] 2.6.4.1. Định nghĩa Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Tuy nhiên cũng có một số alcaloid không có nhân dị vòng với nitơ và một số alcaloid không có phản ứng kiềm. Một số alcacoid còn có thể có phản ứng acid yếu do có nhóm chức acid trong phân tử. 2.6.4.2. Tính chất Đa số alcaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn. Một vài alcaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alcaloid ở dạng lỏng và có màu. Alcaloid là những hợp chất có tính baz yếu, do sự có mặt nguyên tử nitơ. Tính baz của các alcaloid khác nhau tùy theo nhóm thế (R-) gắn trên nguyên tử nitơ. Các alcaloid tính baz yếu thì phải cần môi trường acid mạnh để tạo thành muối, tan trong nước. Các alcaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan trong dung môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alcaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: cloroform, eter, benzen. Chính vì thế, tính hòa tan của các alcaloid đóng vai trò quan trọng trong 23 việc ly trích alcaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống. 2.6.4.3. Công dụng Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược và nhiều chất rất độc. Các alcaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alcaloid.  Tác dụng lên hệ thần kinh  Tác dụng lên huyết áp  Tác dụng trị ung thư 2.6.5. Hợp chất Saponin [28, 29] 2.6.5.1. Khái niệm chung về Saponin Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon và phần không đường gọi là aglycon. Saponin có tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu. Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao từ 200 o C trở lên và có thể trên 300oC. Saponin bị tủa bởi chì acetat, hidroxid barium, sulfat amonium nên lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. - Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:  Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan. Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean.  Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan. - Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan. 2.6.5.2. Công dụng [11]  Trị long đờm, chữa ho  Là chất phụ gia trong một số vắc xin  Tác dụng thông tiểu  Tác dụng kháng viêm, chống khối u 24 2.6.6. Germanium hữu cơ [21, 22] Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm 1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa. Cơ thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Chức năng của Germanium:  Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư  Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ  Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ 2.7. Phƣơng pháp ổn định dƣợc liệu [5] Muốn bảo quản dược liệu được lâu, tránh hiện tượng lên meo mốc, hoạt chất trong dược liệu bị biến đổi thì dược liệu phải có độ ẩm không quá 1 giới hạn nào đó. Giới hạn này gọi là độ ẩm an toàn, độ ẩm đạt tốt nhất là 13%. Thông thường sự hoạt động của men xảy ra ngay sau khi nguyên liệu bị cắt khỏi cây. Vấn đề xử lý nguyên liệu sau khi thu hái nhằm ức chế hoạt động của men để đảm bảo cấu trúc ban đầu của hợp chất trong cây và nâng cao hiệu suất chiết là cần thiết. Bản thân men là những protein không tan trong cồn, tan trong nước, bị tủa bởi một số muối vô cơ có nồng độ cao. Men hoạt động ở nhiệt độ thích hợp từ 20 – 45oC và bị phá hủy trên 60oC. Có nhiều phương pháp ổn định dược liệu, phương pháp thông thường là sấy ở nhiệt độ thấp trong khoảng thời gian dài. 2.7.1. Chuẩn bị dịch chiết Các chất trong nguyên liệu thực vật được phân thành các nhóm theo độ phân cực của chúng: Nhóm các chất không hoặc kém phân cực Nhóm các chất có độ phân cực trung bình 25 Nhóm các chất có độ phân cực mạnh Các nhóm chất này lần lượt được chiết từ nguyên liệu với các dung môi ether ethylic, ethanol (hay methanol) và nước. Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng. Trong một số trường hợp, sự thay đổi mức độ ion hóa của phân tử (dẫn đến thay đổi tính tan) của 1 nhóm chất trong môi trường acid hay baz cũng được dùng để tách các phân nhóm. Yêu cầu chung của các phản ứng hay các thuốc thử sử dụng trong định tính 1 nhóm hợp chất là chúng phải đặc hiệu, nhạy và dễ phát hiện, chúng cũng phải không hay ít bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các nhóm hợp chất khác có trong môi trường phản ứng. 2.7.2. Phƣơng pháp ngâm [5] Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng dược liệu trong dụng cụ thích hợp. Quá trình chiết xuất xảy ra mọi điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết được rút khỏi thiết bị cùng một lúc. Quá trình ngâm này có thể được lặp lại thêm 1 hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu. Sự khuấy trộn, yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, siêu âm…, được dùng làm tăng quá trình chiết. - Phương pháp ngâm lạnh: Dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm không dưới 12 giờ với các dược liệu mỏng manh hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm bảo quá trình chiết được hoàn tất - Phương pháp ngâm nóng: Là phương pháp ngâm ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn. 26 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm Đề tài được thực hiện từ 22/03/2005 đến 1/08/2005 tại Trung tâm nghiên cứu Linh chi - Nấm dược liệu, Quận 12, Thành Phố Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm vi sinh thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Đối tƣợng thí nghiệm Nấm Hắc chi (Amauroderma subresinosum) do ThS. Phan Thị Nhiều thu hái tại vùng núi Chứa Chan thuộc Tỉnh Đồng Nai (2004) và ThS. Cổ Đức Trọng phân lập, giám định. 3.3. Vật liệu thí nghiệm 3.3.1. Thiết bị Cân phân tích Kính hiển vi Máy chụp ảnh kỹ thuật số Tủ cấy vô trùng Nồi hấp Autoclave và nồi hấp hơi nước Tủ sấy 3.3.2. Hóa chất - Các hóa chất vô cơ: AgNO3, Bi(NO3)3, Fe2(SO4)3, HCl, HgCl2, HNO3, H2SO4, KI, NaOH, NH4OH. - Các hóa chất hữu cơ: anhidrid acetic, cloroform, diethyl ether, etanol. 3.3.3. Môi trƣờng sử dụng 3.3.3.1. Môi trƣờng dinh dƣỡng - Môi trường PGA (Potato glucose agar) Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) 27 - Môi trường PGA + 10% nước dừa già Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Nước dừa: 100 (ml) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) - Môi trường PGA + 10% dịch chiết cà rốt Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Cà rốt: 100 (ml) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) - Môi trường Mizuno Pepton: 10 (g) Glucose: 25 (g) Maltose: 50 (g) NaCl: 5 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Điều chỉnh môi trường về pH = 6 – 6,5 - Môi trường Czapek – Dox Saccharose: 30 (g) NaNO3: 3 (g) KH2PO4: 1 (g) MgSO4: 0,5 (g) KCl: 0,5 (g) FeSO4: 0,01 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Điều chỉnh môi trường về pH = 6 – 6,5 28 - Môi trường lỏng PG (Potato glucose) Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Các môi trường đều được khử trùng ở 121oC trong 25 phút. 3.3.3.2. Môi trƣờng nhân giống: Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đó phối trộn vào trong các nghiệm thức thí nghiệm. 3.3.3.3. Môi trƣờng giá thể mạt cƣa cao su: Mạt cưa mua về cần phải rây để loại bỏ dăm bào, sau đó ủ với nước vôi 0,25% qua đêm và tiến hành phối trộn dinh dưỡng theo các nghiệm thức thí nghiệm. 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm 3.4.1. Quan sát hình thái giải phẩu quả thể nấm Amauroderma subresinosum 3.4.1.1. Hình thái quả thể nấm 3.4.1.2. Phƣơng pháp quan sát hệ sợi nấm [7]  Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam kính  Cố định sợi nấm trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới lam kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn  Nhuộm bằng dung dịch fuchsin trong 5 – 10 phút  Rửa thuốc nhuộm bằng cồn 95%  Rửa ngay với nước cất để chấm dứt công đoạn tẩy màu  Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100 3.4.1.3. Phƣơng pháp quan sát bào tử nấm Linh chi đen [19, 20]  Lấy quả thể nấm Linh chi đen trong giai đoạn phóng thích bào tử, đặt lên 1 tờ giấy trắng để thu bào tử  Dùng khuyên cấy lấy ít bào tử rồi dàn đều vào 1 giọt nước trên lam kính  Cố định bào tử trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới của lam kính qua ngọn lửa đèn cồn đến khô  Quan sát bào tử nấm dưới vật kính x100 3.4.2. Khảo sát sinh trƣởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên các môi trƣờng thạch Theo T. Mizuno (1998), môi trường dùng phân lập giống từ thiên nhiên và phân giống cấp 1 thường là môi trường có chứa Maltose. Để xác định môi trường thích hợp 29 nhất cho việc bảo quản và nhân giống cấp 1 phù hợp với phòng thí nghiệm ở Việt Nam và chuẩn bị cho quá trình phát triển nuôi trồng sản xuất, chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm trên các loại môi trường: PGA, PGA bổ sung, Mizuno, Czaper – Dox. Thí nghiệm được bố trí với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 10 đĩa với 3 lần lặp lại: Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 PGA 2 PGA + 10% nước dừa 3 PGA + 10% dịch chiết cà rốt 4 Mizuno 5 Czaper - Dox Tổng số đĩa cấy: 150 đĩa Các chỉ tiêu theo dõi sau khi cấy 2 ngày:  Đo tốc độ lan tơ nấm (cm/ngày)  Quan sát màu sắc và hình thái sợi nấm Cách tiến hành thí nghiệm: Các môi trường đều hấp khử trùng ở 121oC/25 phút. Đổ môi trường vào đĩa petri vô trùng, để nguội, cấy giống vào đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng (30 2oC). Theo dõi và tiến hành đo đường kính của khuẩn lạc định kỳ 2 ngày 1 lần cho đến khi hệ sợi lan ra hết đĩa petri. 3.4.3. Nghiên cứu quá trình lên men dịch thể Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi đen trên môi trường lỏng PG Cách tiến hành: pha môi trường và đổ vào chai thuỷ tinh 0.5 lít một lượng môi trường 50 ml. Hấp khử trùng ở 121oC/25 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối ở các ngày 10, 15, 20. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô. Trong quá trình thí nghiệm, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 chai. Tổng số chai cấy là 30 chai. 30 3.4.4. Khảo sát sự sinh trƣởng của sợi nấm trên môi trƣờng nhân giống Nguyên liệu dùng là hạt lúa nấu chín và mạt cưa cao su bổ sung các thành phần: cám gạo, cám bắp theo tỷ lệ của các nghiệm thức thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 10 ống với 3 lần lặp lại: Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 Lúa 90% + mạt cưa 5% + cám gạo 5% 2 Lúa 50% + mạt cưa 25% + cám gạo 25% 3 Mạt cưa 50% + cám bắp 50% 4 Lúa 50% + cám bắp 25% + cám gạo 25% Tổng số ống nghiệm cấy: 120 ống nghiệm Các chỉ tiêu theo dõi:  Đo tốc độ lan sâu của sợi nấm 3 ngày 1 lần (cm/ngày)  Quan sát màu sắc, đặc điểm sợi nấm Cách tiến hành thí nghiệm: Tiến hành phối trộn môi trường theo các nghiệm thức thí nghiệm sao cho độ ẩm đạt khoảng 60%, cho môi trường vào khoảng 2/3 chiều dài ống nghiệm, khử trùng 121oC/60 phút, để nguội và cấy giống vào ở độ tuổi 10 – 12 ngày. Tiến hành theo dõi và đo độ lan sâu của sợi nấm theo định kỳ 3 ngày một lần. 3.4.5. Khảo sát sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh chi đen trên môi trƣờng mạt cƣa cao su Thí nghiệm được bố trí với 10 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 13 bịch với 3 lần lặp lại: Nghiệm thức Môi trường giá thể mạt cưa cao su 1 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + urê 2,5o/oo 2 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + urê 2,5o/oo + DAP 2,5 o /oo 3 Mạt cưa cao su + SA 5o/oo + DAP 2,5 o /oo 4 Mạt cưa cao su + nitrat canxi 5 o/oo + DAP 2,5 o /oo 5 Mạt cưa cao su + N-P-K202015 5o/oo 6 Mạt cưa cao su + cám gạo 10% 31 7 Mạt cưa cao su + cám bắp 10% 8 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + super lân 5o/oo + urê 2,5 o /oo 9 Mạt cưa cao su + urê 2,5o/oo + DAP 2,5 o /oo 10 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + dynamic lifter 2,5%. Tổng số bịch cấy trong 3 lần: 390 bịch Các chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi quá trình sinh trưởng và hình thành quả thể nấm Linh chi đen Cách tiến hành:  Mạt cưa cao su khô được bổ sung vôi bột với tỷ lệ 0,25% (theo trọng luợng khô của mạt cưa), bổ sung nước, trộn đều và ủ qua đêm. Độ ẩm của cơ chất mạt cưa đã ủ vôi qua đêm khoảng 45%.  Trộn đều các loại giá thể tổng hợp trên với nước sạch (có bổ sung các chất dinh dưỡng) để đạt đến độ ẩm 65 ± 2% và đóng vào các bịch PP. Hấp thanh trùng bằng hơi nước nóng 100oC trong 5 giờ.  Sau khi giá thể nguội, chúng tôi dùng giống trên môi trường hạt ngũ cốc để cấy vào các bịch giá thể mạt cưa cao su. Độ tuổi thích hợp nhất của giống là 13 – 14 ngày. Xác định hiệu suất sinh học nuôi trồng nấm Linh chi trên giá thể là tỷ lệ giữa trọng lượng thể quả tươi thu hoạch và trọng lượng cơ chất khô. Tiến hành đánh giá trọng lượng quả thể nấm được nuôi trên bịch PP chứa 180 gam cơ chất khô, trong điều kiện nuôi ở nhiệt độ 28 – 35oC. 3.5. Xác định dƣợc chất có trong nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 3.5.1. Phƣơng pháp định tính alcaloid [5] 3.5.1.1. Chuẩn bị dịch thử Để phát hiện sự hiện diện của alcaloid trong dược liệu người ta thường áp dụng nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau: - Phần 1: Bột nấm Linh Chi xay nhuyễn (10 – 20 gam) và dung dịch nước 1% H2SO4 được cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. 32 Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu không có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2. - Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn hợp gồm: chloroform:ethanol 95o:NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trường phải có tính baz). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1% đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. 3.5.1.2. Thuốc thử định tính alcaloid - Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5 gam KI trong 10 ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử. - Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25 ml HNO3 30% (D=1,18). Hòa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp 2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5oC sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần. Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu. 3.5.2. Phƣơng pháp xác định hợp chất saponin [5] Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch lọc bốc hơi đến cắn khô. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính. 3.5.2.1. Thử nghiệm tính tạo bọt Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin. Cách tiến hành: Hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 gam dược liệu vào 5 ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 33 10 ml, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả: Bọt bền trong 15 phút: + Bọt bền trong 30 phút: ++ Bọt bền trong 60 phút: +++ 3.5.2.2. Thử nghiệm Fontan – Kaudel Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 gam bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cách thủy để hòa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm. Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1N (pH =1) Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1N (pH =13) Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.  Nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau, thì sơ bộ xác định là có saponin triterpenoid.  Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác định là có saponin steroid. 3.5.3. Định tính triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann – Burchard) Chiết 10 – 20 gam bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình nón, trong 10 – 20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết ether. Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid 3.5.4. Định tính acid hữu cơ Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri Na2CO3. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận là có acid hữu cơ. 34 3.6. Định lƣợng polysaccharides (GLPs) [16, 17] Polysaccharide có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở 100 o C trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các polysaccharides có trong nấm Linh chi. Một qui trình thứ hai được ứng dụng rộng rãi để chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs. Hình 3.1: Qui trình chiết suất polysaccharides từ nấm Linh chi (Yihuai Gao và ctv, 2001) Thu nhận cả 3 dịch chiết và đem đi lọc. Lấy phần cặn (dịch lơ lửng sau khi lọc) đem đi sấy khô và cân trọng lượng. Từ đó đánh giá hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi đen. Quả thể nấm Linh Chi Thái mỏng Hổn hợp chiết rút lần 1 Bã chiết lần 1 Hỗn hợp chiết rút lần 2 Bã chiết lần 2 Dịch chiết lần 3 Dịch chiết lần 1 Dịch chiết lần 2 -Ngâm nước 70oC trong 3 giờ -Ngâm trong nước 70 o C trong 3 giờ -Ngâm trong cồn 80% ở 70oC trong 2 giờ 35 3.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excell. Tốc độ sinh trưởng trung bình của hệ sợi nấm trên các môi trường được tính như sau: Xi = (x1 + x2 + x3 + … + xi)/ni Với: - xi: Tốc độ sinh trưởng trên các môi trường (cm/ngày) - ni: Số quan sát Sử dụng phần mềm Statgraphics Ver. 7.0 để so sánh sự khác biệt về tốc độ tăng trưởng hệ sợi nấm trên các nghiệm thức thí nghiệm ở mức α = 0,05 hay LSD (95%) (Least Significant Difference). 36 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. Quan sát hình thái giải phẩu nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 4.1.1. Hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum Hình 4.1: Hình thái sợi nấm Linh chi đen (vật kính x100) 4.1.2. Cấu trúc bào tử nấm Amauroderma subresinosum Dựa vào khoá phân loại của các tác giả Humphrey (1938), Imazeki (1952), Steyaert (1972), Corner (1983), chúng tôi đã xác định loài nấm Linh chi đen có ở vùng núi Chứa Chan - Đồng Nai thuộc loài Amauroderma subresinosum. Quả thể nấm có cuống ngắn, đính bên hoặc có gốc đính ở bên hình nửa tròn hay hình quạt, màu đen nhẵn bóng. Đôi khi có vài mũ nhỏ phát triển chung từ một gốc chung. Mặt trên vỏ cứng màu đen bóng, có nhiều nếp nhăn đồng tâm. Mép mũ nấm thường dày, uốn lượng cong vào có các nếp gấp và các khía răng cưa. Bào tử đảm (Basidiospores) có màu nâu quế, hình trứng. Bào tử có cấu trúc lớp vỏ kép, bên trong chứa dịch trong suốt, hình dạng giống giọt dầu và kích thước bào tử dao động khá lớn 12 – 20 x 8 – 12 µm. Hình 4.2: Cấu trúc bào tử nấm Amauroderma s ubresinosum (vật kính x100) 37 4.1.3. Hình thái quả thể nấm Amauroderma subresinosum Mặt trên quả thể nấm Mặt dưới quả thể nấm Hình 4.3: Hình thái quả thể nấm Amauroderma subresinosum đƣợc nuôi trồng Quả thể nấm Amauroderma subresinosum có dạng hình quạt hay gần tròn hoặc ít nhiều dị dạng. Ở giai đoạn mầm nấm có dạng hình tròn, màu trắng. Sau khoảng 20 – 25 ngày, mầm nấm hình tròn chuyển sang hình quạt và lớp sắc tố nâu – đen bắt đầu hình thành xung quanh cuống nấm. Phía ngoài cùng rìa của quả thể nấm có màu trắng - đục, dày và sau khoảng 30 -40 ngày tiếp theo thì lớp rìa trắng chuyển sang màu đen - quế, lúc này quả thể đã già. Trên mặt mũ nấm có vân gợn đồng tâm và những rãnh nhỏ lồi lõm nhấp nhô không đồng nhất. Mũ nấm rộng 6 – 12 cm, dày 1 – 2 cm, đôi khi có vài mũ nhỏ phát triển từ 1 gốc chung. Mặt trên mũ có lớp vỏ cứng màu đen bóng, gồ lên trên, láng bóng như verni. Mép mũ thường dày, uốn lượng cong vào có các nếp gấp và các khía răng cưa. Bề mặt trên quả thể màu nâu quế, màu gỗ sẫm, nâu sẫm. Mặt dưới quả thể nấm là lớp bào tầng chứa rất nhiều lỗ nhỏ, màu trắng đục và dày cỡ 4 – 6 ống/mm. Chính những lỗ nhỏ này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành. 4.2. Sự sinh trƣởng và phát triển nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 4.2.1. Tốc độ sinh trƣởng hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên các môi trƣờng thạch Trên môi trường thạch, hệ sợi nấm Linh chi đen phát triển dưới dạng hình rễ khá sớm và tốc độ tương đối nhanh. Trong quá trình theo dõi sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi đen, chúng tôi nhận thấy trong 2 ngày đầu hệ sợi tăng trưởng rất chậm. Sau 3 ngày thì trên môi trường PGA và PGA bổ sung đều xuất hiện lớp sắc tố màu đỏ - nâu được nấm tiết ra ở gốc cấy ban đầu và lan dần đều ra xung quanh bề mặt thạch. Thời gian xuất hiện lớp sắc tố trên môi trường Mizuno là khoảng 5 ngày. Xung quanh 38 rìa khuẩn lạc là hệ sợi nấm đang tăng trưởng, màu trắng - đục và phía bên trong rìa khuẩn lạc có màu đỏ - nâu. Trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau, tốc độ tăng trưởng của sợi nấm Linh chi đen khác nhau. Tốc độ tăng trưởng sợi nấm trên môi trường Mizuno rất chậm, sau 8 ngày hệ sợi nấm phủ kín mặt thạch đĩa petri. Ngược lại trên môi trường PGA thì tốc độ lan rất nhanh và sau 4 ngày đa số sợi nấm đã phủ kín mặt thạch đĩa petri. Mặt khác mật độ hệ sợi nấm trên môi trường PGA và Mizuno rất nhiều, hệ sợi phân nhánh, nhô lên bề mặt thạch. Trên môi trường Czapek – Dox thì hệ sợi nấm rất mỏng manh, không phân nhánh, phát triển tương đối nhanh và chỉ sau 6 ngày hệ sợi nấm phủ kín mặt thạch đĩa petri. PGA Mizuno Czapek - Dox PGA+10% cà rốt Hình 4.4: Hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên các môi trƣờng thạch Bảng 4.1: Tốc độ sinh trƣởng của hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên các môi trƣờng thạch Môi trường Thời gian (ngày) Đường kính colonie (cm) PGA 2 4 2,418 ± 0,151 6,441 ± 0,18 PGA + 10% nước dừa già 2 4 2,732 ± 0,168 6,832 ± 0,19 PGA + 10% dịch chiết nước cà rốt 2 4 2,9 ± 0,227 7,823 ± 0,156 39 Mizuno 2 4 1,673 ± 0,072 3,164 ± 0,107 Czapek - Dox 2 4 2,268 ± 0,113 5,46 ± 0,174 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 cm/ngày Ngày thứ 2 Ngày thứ 4 Biểu đồ 1: Sự sinh trƣởng hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên các môi trƣờng thạch Sử dụng phần mềm Statgraphics Ver. 7.0 so sánh sự khác biệt tốc độ sinh trưởng hệ sợi giữa các môi trường trong thí nghiệm với mức ý nghĩa α = 0,05 hay LSD (95%) cho thấy tốc độ sinh trưởng sợi nấm trên các môi trường là khác nhau. Trong quá trình khảo sát nhận thấy tốc độ sinh trưởng hệ sợi ở môi trường 3 là cao nhất, môi trường 4 là chậm nhất. 4.2.2. Sự sinh trƣởng hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên môi trƣờng nhân giống Trên môi trường nhân giống, hệ sợi nấm Linh chi đen lan sâu vào khối cơ chất trong ống nghiệm với tốc độ tương đối chậm nhưng đồng đều mọi phía. Lúc còn non sợi nấm có màu trắng đục, sau 12 – 13 ngày hệ sợi lan hết khối cơ chất trong ống nghiệm. Mật độ hệ sợi tăng dần theo thời gian. Trong quá trình sinh trưởng hệ sợi nấm, thấy xuất hiện những đốm sắc tố màu đen – nâu ở bề mặt ngoài ống nghiệm. Tốc độ lan hệ sợi nấm đo được trong ống nghiệm chứa 2/3 khối cơ chất thể hiện trong bảng 4.2. 40 Bảng 4.2: Tốc độ lan sâu của hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên môi trƣờng nhân giống Thờigian (ngày) Tốc độ lan sâu xuống đáy ống nghiệm (cm) MT1 MT2 MT3 MT4 6 4,818 ± 0,199 5,372 ± 0,127 3,964 ± 0,169 4,782 ± 0,209 9 7,95 ± 0,165 8,745 ± 0,246 7,01 ± 0,191 7,827 ± 0,22 12 11,4 ± 0,167 11,782 ± 0,232 10,309 ± 0,197 10,845 ± 0,163 0 2 4 6 8 10 12 14 MT1 MT2 MT3 MT4 cm/ngày Ngày 6 Ngày 9 Ngày 12 Biểu đồ 2: Tốc độ lan sâu hệ sợi nấm Linh chi đen trên các môi trƣờng nhân giống Nhận xét: Tốc độ lan sâu hệ sợi nấm trên các môi trường nhân giống là khác nhau về mặc thống kê học với mức ý nghĩa α= 0,05. Riêng ở môi trường 1 và 4 là không có sự khác biệt về mặt thống kê học. Tốc độ lan sâu hệ sợi nấm trên môi trường 2 là nhanh nhất và ở môi trường 3 là chậm nhất. 41 Hình 4.5: Sự sinh trƣởng hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên môi trƣờng nhân giống 4.2.3. Sự sinh trƣởng sợi nấm Amauroderma subresinosum trên môi trƣờng lỏng Bảng 4.3: Khả năng tích lũy sinh khối hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên môi trƣờng lỏng Thời gian (ngày) Sinh khối (gam) 10 0,283 ± 0,02 15 0,38 ± 0,017 20 0,492 ± 0,023 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 N10 N15 N20 Ngày Trọng lượng (g/ngày) Biểu đồ 3: Khả năng tích lũy sinh khối nấm Linh chi đen trên môi trƣờng lỏng Nhận xét: Hai ngày sau khi cấy giống vào, hệ sợi nấm nổi lên bề mặt môi trường, là một khối màu trắng và lan đều xung quanh gốc cấy ban đầu. Trong quá trình tăng sinh khối, hệ sợi tiết ra sắc tố màu nâu - đỏ và sắc tố đậm dần theo thời gian nuôi 42 cấy. Những dẫn liệu ở bảng 4.3 cho thấy: Từ lúc cấy giống cho đến thời điểm 10 ngày sợi nấm tăng trưởng nhanh, từ 10 – 20 ngày kế tiếp sợi nấm tăng trưởng chậm dần. Hình 4.6: Sinh khối sợi nấm Amauroderma subresinosum trên Môi trƣờng lỏng sau 10 ngày 4.2.4. Sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh chi đen trên môi trƣờng giá thể mạt cƣa cao su Tại Việt nam có nhiều triển vọng cho việc nuôi trồng nấm Linh chi do có nguồn nhân lực dồi dào, các phế thải nông, lâm, công nghiệp đang còn tồn đọng và gây ô nhiễm môi trường. Như vậy khi phát triển nghề trồng nấm nói chung và nấm Linh chi nói riêng, không chỉ cung cấp nguồn dược liệu quí mà còn góp phần làm sạch môi trường sống, bảo vệ sức khoẻ cho chúng ta. Mạt cưa được sử dụng làm môi trường giá thể và chúng có hàm luợng cacbon rất cao. Tuy nhiên, mạt cưa là nguyên liệu nghèo chất dinh dưỡng. Do đó để nâng cao hiệu suất nuôi trồng nấm cũng như rút ngắn thời gian nuôi trồng thì cần thiết phải trộn thêm nhiều chất bổ sung. Chất bổ sung chủ yếu thường là cám gạo, cám bắp, bột khoai,… Các nguyên liệu này sẽ cung cấp vitamin hay acid amin cho hệ sợi nấm sinh trưởng nhanh. Ngoài ra, các loại phân hóa học như: Urê, DAP, NPK,… cũng được sử dụng rất nhiều trong nuôi trồng. Thực tế cho thấy khi bổ sung nguồn nitơ với hàm lượng rất thấp nhưng lại có tác dụng tốt rõ rệt đối với sự phát triển của nấm. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) trên giá thể mạt cưa cao su, sử dụng bịch PP kích thước 15 x 25 cm và chứa 180 gam cơ chất khô/bịch với qui trình như sau: 43 Hình 4.7:Qui trình nuôi trồng nấm Linh chi đen Qua quá trình khảo sát chúng tôi nhận thấy rằng pha ủ sợi kéo dài khoảng 25 – 27 ngày, khi hệ sợi bắt đầu bện kết, đưa các bịch nấm đã mọc trắng lên phòng nuôi, tiến hành tưới phun sương để duy trì độ ẩm 80 – 95%, ánh sáng nhẹ (700 – 800 lux), độ thông khí cao. Pha phát triển thể quả: ngày thứ 38 – 40 thì mầm quả thể bắt đầu Cơ chất trồng nấm Mạt cưa cao su Ống thạch giống Bịch mạt cưa đã khử trùng Chai lúa giống (meo hạt) - Rây (sàng) bỏ dăm bào - Trộn nước vôi 0,25% - Ủ đống qua đêm - Thêm dinh dưỡng - Bảo quản giống: Khi hệ sợi nấm đầy ống nghiệm, tiến hành cấy chuyền giống qua ống thạch mới. - Cấy một ít hệ sợi nấm sang môi trường lúa để tạo một lượng giống lớn cho giai đoạn trồng trên cơ chất mạt cưa. Cấy giống - Vào túi màng mỏng PP - Thanh trùng ở 100oC trong 5 giờ Bịch phôi -Nuôi ủ cho hệ sợi nấm đầy bịch Quả thể nấm - Tháo nút bông - Chuyển sang nhà tưới, duy trì độ ẩm 85 – 95% - Nhiệt độ 26 – 35oC - Ánh sáng tán xạ (700 – 800 lux) Nấm khô -Cắt gốc thu tai nấm -Sấy khô ở nhiệt độ 50oC trong 5 giờ 44 hình thành, ngày thứ 50 – 80 thì mầm nấm đang trong giai đoạn tăng trưởng và từ ngày 120 – 150 quả thể nấm bắt đầu già, có thể thu hái quả thể. Trong quá trình chăm sóc cần tưới nước dạng phun sương đều đặn, đảm bảo độ ẩm, nhiệt độ, khống chế ánh sáng và tránh gây tổn thương cơ học do ruồi, muỗi, chích hút…. Đặc biệt trong giai đoạn phát triển của thể quả nếu nhiệt độ cao, cường độ ánh sáng mạnh, phòng nuôi có độ thoáng khí kém sẽ gây ức chế sự hình thành và phát triển của quả thể. Vì vậy trong quá trình nuôi trồng nên giữ nhiệt độ thích hợp, tưới nước thường xuyên để tạo độ ẩm luôn cao, thiết kế trại nuôi trồng ở nơi mát mẻ và có độ thông khí cao, chỉ nên cho nấm tiếp xúc với nguồn sáng khuyếch tán có cường độ khoảng 700 – 800 lux, tránh sự xâm nhập của côn trùng hay các tác nhân gây tổn thương cho quả thể nấm. Sau khi thu hái cần có phương pháp bảo quản quả tốt hay chế biến ngay để bảo đảm chất lượng và độ cảm quan của nấm. Hình 4.8: Bố trí thí nghiệm 4.2.4.1. Giai đoạn sinh trƣởng sợi nấm Linh chi đen Sau khi sợi nấm mọc trắng túi, trên mặt môi trường có các khối nhỏ trắng đó là mầm quả thể, lấy nút bông ra tăng cường tưới nước giữ độ ẩm 85 – 95%, nhiệt độ 26 – 28 oC, để trong điều kiện ánh sáng tán xạ, thông thoáng gió. Khi thu hái ta có thể nhổ cả cuống lẫn tán, hong khô hoặc sấy ở nhiệt độ thấp. 45 80.77 98 69.23 90.39 59.61 92.31 73.08 30.77 25 80.13 0 20 40 60 80 100 120 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 Tỷ lệ sinh trưởng (%) Biểu đồ 4: Tỷ lệ sinh trƣởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên môi trƣờng mạt cƣa Nhận xét: Tỷ lệ sinh trưởng hệ sợi nấm ở môi trường 3, 5 và 7 nhanh hơn các môi trường còn lại. Điều này chứng tỏ nguồn đạm SA, N-P-K202015, cám bắp được sợi nấm hấp thu dễ dàng so với các nguồn dinh dưỡng khác. Trái lại tỷ lệ sinh trưởng của sợi nấm ở môi trường 9 và10 rất chậm, nguyên nhân có thể là do nguồn cám gạo và urê được nấm hấp thu chậm hơn. Như vậy ta nên lựa chọn môi trường giá thể nào giúp cho sợi nấm sinh trưởng nhanh và hạn chế sự phát sinh của các loài nấm gây bệnh. Đồng thời, thời gian xuất hiện quả thể trên môi trường phải sớm. Trong quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy hệ sợi nấm trên môi trường 3 sinh trưởng rất tốt, 98% các bịch có hệ sợi phủ kín bịch chỉ sau 20 ngày. 4.2.4.2. Giai đoạn phát triển quả thể nấm Linh chi đen Sau khi hệ sợi nấm phủ đầy bịch (giai đoạn sinh trưởng), chúng bắt đầu chuyển sang giai đoạn phát triển. Trong giai đoạn mới, hệ sợi nấm đan vào nhau và bắt đầu kết mầm nấm. Chúng tôi nhận thấy, thời gian kết mầm ở môi trường 3, 5 và 7 vào khoảng 40 – 45 ngày, riêng các môi còn lại thì thời gian kết mầm tương đối lâu 45 – 55 ngày. Nhìn chung các bịch môi trường sau khi cấy giống vào đều xuất hiện mầm quả thể và thời gian xuất hiện mầm giữa các môi trường chênh lệch nhau 10 – 15 ngày. 46 Khi hệ sợi không bện kết được ở đầu cổ bịch phôi, phải dùng dao tạo vết rạch ở đáy hoặc ở gốc bịch giúp cho mầm nấm xuất hiện. Vết rạch quá sâu và miệng rạch hở trên thành bịch dẫn đến nhiễm mốc hoặc làm vị trí rạch bị khô. Trong quá trình nuôi trồng, hầu hết các môi trường có hiện tượng sợi nấm không bện kết ở đầu cổ bịch phôi. Nguyên nhân có thể do điều kiện ngoại cảnh chưa phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển loài Linh chi này. Như vậy, sau khoảng 3 – 5 ngày tạo vết rạch thì trên các bịch phôi xuất hiện mầm nấm. Hệ sợi bện kết Mầm nấm (Sau 50 – 55 ngày) (Sau 60 – 70 ngày) Mầm nấm tăng trƣởng Quả thể nấm ( Sau 80 – 85 ngày) (Sau 95 -100 ngày) Hình 4.9: Quá trình hình thành và tăng trƣởng quả thể nấm Amauroderma subresinosum Theo dõi quá trình tạo quả thể nấm Linh chi đen, chúng tôi nhận thấy hình dạng quả thể ở các môi trường rất đồng nhất: quả thể nấm hình quạt, cuống ngắn. Riêng quả thể ở môi trường 4 và 6 không đồng nhất về kích thước, một số dị dạng. 4.2.4.3. Đánh giá hiệu suất sinh học trên các môi trƣờng giá thể mạt cƣa cao su Bảng 4.4: Hiệu suất sinh học đạt đƣợc trên các môi trƣờng giá thể mạt cƣa Môi trường giá thể Trọng lượng khô (gam) Hiệu suất sinh học (%) 1 11,31 ± 1,32 12,44 ± 1,48 2 10,5 ± 0,78 11,54 ± 0,85 3 13,04 ± 1,66 14,36 ± 1,82 4 10,21± 1,0 11,22 ± 1,13 47 5 10,6 ± 0,26 11,66 ± 0,297 6 10,36 ± 0,83 11,38 ± 0,912 7 11,98 ± 1,15 13,2 ± 1,26 8 11,58 ± 0,81 12,46 ± 1,18 9 10,34 ± 0,59 11,38 ± 0,634 10 10,94 ± 0,76 12,04 ± 0,856 0 2 4 6 8 10 12 14 16 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 Hiệu suất sinh học (%) Biểu đồ 5: Hiệu suất sinh học nuôi trồng nấm Linh chi đen Như vậy hiệu suất sinh học thu được ở môi trường 3 cao nhất (14,36%), ở môi trường 4 thấp nhất (11,22%) và hiệu suất sinh học đạt được ở các môi trường thí nghiệm đều cao hơn 11%. Hình 4.10: Quả thể nấm Amauroderma subresinosum sau 120 ngày MT- 7 MT - 8 MT - 3 48 Hình 4.11: Kết quả nuôi trồng nấm Amauroderma subresinosum 4.3. Xác định dƣợc chất có trong hệ sợi nấm và quả thể nấm Linh chi đen 4.3.1. Định tính alcaloid Cho dịch chiết bột nấm Linh chi đen tác dụng với thuốc thử Mayer thì nhận thấy xuất hiện kết tủa vô định hình màu trắng ngà. Ống 1(đối chứng): Dịch chiết với nước acid Ống 2: Dịch chiết với nước acid + thuốc thử Mayer Ống 3: Nước cất + thuốc thử Mayer 1 2 3 Hình 4.12: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer Cho dịch chiết bột nấm Linh chi đen tác dụng với thuốc Dragendorff thì nhận thấy có xuất hiện kết tủa màu cam - nâu ở dạng tủa bông và từ từ lắng xuống đáy ống nghiệm. Ống 1 (đối chứng): Dịch chiết với nước acid Ống 2: Dịch chiết với nước acid + thuốc thử Dragendorff Ống 3: Nước cất + thuốc thử Dragendorff 1 2 3 Hình 4.13: Định tính alcaloid với thuốc thử Dragendorff 49 Nhận xét: Dịch chiết nấm Linh chi đen ở phần 1 đem thử nghiệm với 2 loại thuốc thử Mayer và Dragendorff thì nhận thấy kết quả là dương tính. Đối với dịch chiết ở phần 2 đem thử nghiệm thì kết quả là âm tính: Bột dược liệu trích với nước – acid: có thể trích hết tấc cả các alcaloid ở dạng baz tự do (N sẽ biến thành NH+ tan trong nước), alcaloid dạng thứ cấp N+, dạng N – oxid (N + -> O), dạng glycosid, alcaloid loại có tính phân cực mạnh, nhưng sẽ trích luôn những hợp chất có chứa nitơ (protein, glycoprotein, nucleotide)… là những hợp chất tuy không phải là alcaloid nhưng có thể cho kết quả dương tính với thuốc thử. Bột dược liệu trích với dung môi hữu cơ – kiềm sẽ không trích được những alcaloid dạng N – oxid, dạng N tứ cấp, dạng tan tốt trong nước. Phương pháp này trích tốt các alcaloid dạng baz tự do có tính phân cực kém và tính baz yếu, cũng như các alcaloid có cấu trúc đặc thù –C=C –N – . Như vậy hoạt chất alcaloid không có trong quả thể nấm Linh đen hoặc có với hàm lượng cực thấp mà phản ứng định tính không thể quan sát được. 4.3.2. Định tính saponin 4.3.2.1. Thử nghiệm tính chất tạo bọt Kết quả ghi nhận như sau: Độ bền của bọt Kết quả Sau 15 phút + Sau 30 phút ++ Sau 60 phút +++ Như vậy dược liệu từ sinh khối và quả thể nấm Linh chi đen có chứa hoạt chất saponin Ống 1: dịch chiết dược liệu sau khi lắc Ống 2 (đối chứng): nước cất sau khi lắc 1 2 Hình 4.14: thử nghiệm tính tạo bọt từ sinh khối nấm Linh chi đen 50 4.3.2.2. Thử nghiệm Fontan – Kaudel Kết quả ghi nhận: - Bọt trong cả 2 ống nghiệm bền hơn 15 phút - Cột bọt trong ống nghiệm 3 cao hơn 3 lần cột bọt trong ống nghiệm 2. Như vậy, trong môi trường kiềm bọt bền hơn trong môi trường acid. Sơ bộ kết luận là có saponin steroid. Ống 1(đối chứng) : nước cất Ống 2 : dịch chiết bột nấm sau khi cho acid vào Ống 3 : dịch chiết bột nấm sau khi thêm baz vào 1 2 3 Hình 4.15: Thử nghiệm saponin toàn phần theo Fontan – Kaudel 4.3.3. Định tính triterpenoid Kết quả thí nghiệm nhận thấy sinh khối và quả thể nấm Linh chi có chứa hoạt chất triterpenoid (môi trường chuyển sang màu xanh lục sau khi cho acid H2SO4 đậm đặc vào từ từ). Ống 1(đối chứng): nước cất + acid Ống 2: Dịch chiết + acid đậm đặc 1 2 Hình 4.16: Định tính triterpenoid bằng phản ứng Liebermann – Burchard 4.3.4. Định tính acid hữu cơ Sau khi cho dịch chiết nước bột nấm Linh chi đen tác dụng với tinh thể Na2CO3 và hơ nóng thì nhận thấy có bọt khí xuất hiện và bay ra. Như vậy, dịch chiết nước từ quả thể nấm Linh chi đen có chứa thành phần acids hữu cơ. 51 Ống 1 : Dịch chiết nước + tinh thể Na2CO3 Ống 2 (đối chứng) : Nước cất + tinh thể Na2CO3 1 2 Hình 4.17: Định tính acid hữu cơ có trong quả thể Linh chi đen 4.3.5. Định lƣợng polysaccharide từ quả thể nấm Linh chi đen Tiến hành ly trích polysaccharides từ 15 gam nấm Linh chi đã sấy khô theo qui trình thí nghiệm. Sau quá trình lọc và sấy khô thu nhận được 0.15 gam polysaccharide thô. Như vậy hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi đen chỉ đạt khoảng 1%. Hình 4.18: Sản phẩm bột polysaccharide thô từ quả thể nấm Linh chi đen 52 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận  Môi trường nhân giống cấp 1 thích hợp : PGA + 10% dịch chiết nước cà rốt.  Trên môi trường lỏng PG hệ sợi nấm phát triển tốt.  Môi trường nhân giống cấp 2 thích hợp: Lúa 50% + 25% mạt cưa + 25% cám gạo.  Môi trường sản xuất có hiệu suất cao: Mạt cưa cao su + 5o/oo SA + 2,5 o /oo DAP.  Sinh khối hệ sợi và quả thể Linh chi đen (Amauroderma subresinosum)có chứa các thành phần hóa học: Saponine, saponin triterpenoid, acid béo và hàm lượng polysaccharide thô ly trích được trong quả thể nấm Linh chi đen khoảng 1%. 5.2. Đề nghị Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên tôi chưa thể nghiên cứu đầy đủ về nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum), đề nghị nghiên cứu thêm về: Khảo sát sâu hơn về trồng trọt và thành phần hóa học, tác dụng dược lý, lâm sàng. Nhằm hoàn thiện quy trình trồng và có thể ứng dụng trong ngành dược. 53 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Lân Dũng, 2001. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1 và 2. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội. 2. Nguyễn Hữu Đống, 2003. Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa bệnh. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội. 3. Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh, 2000. Nấm ăn nấm dược liệu - công dụng và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Hà nội. 4. Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn và Zani Federico, 2002. Cơ sở khoa học và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội. 5. Trần Hùng, 2004. Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Đại học Y Dược TP.HCM. 6. Nguyễn Đức Lượng, 2003. Vi sinh học công nghiệp, tập 2. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.HCM. 7. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nuyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TPHCM. 8. Trần Văn Mão, 2004. Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa bệnh. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội. 9. Nguyễn Phước Nhuận, 2001. Giáo trình sinh hoá học, phần 1. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TPHCM. 54 10. Lê Xuân Thám, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điển hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst. Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà nội, Việt nam. 11. Lê Xuân Thám, 1996. Nấm Linh chi - dược liệu quí ở việt nam. Nhà xuất bản mủi cà mau. 12. Lê Xuân Thám, 2005. Nấm Linh chi vàng - nấm Hoàng chi. Báo khoa học phổ thông, số 31/05 (1154). 13. Lê Duy Thắng, 2001. Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập 1. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 14. Arichi D.S. and Hagashi D.T., 2003. Linh chi nguyên chất và bệnh thời nay (Đoàn Sáng dịch). Nhà xuát bản Y học, Hà nội, Việt nam. Tiếng Anh 15. Shufeng Zhou, A clinical Study of a Ganoderma lucidum extract in patients with type II diabetes mellitus. Division of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Science, Auckland University, Auckland, New Zealand. 16. Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou, 2001. Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature. Froc Int Symposium Ganoderma Sci, Auckland. 17. Yihuai Gao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of Ganoderma polysaccharides. Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,00-00. 18. Shufeng Zhou, Yihuai Gao, Gouliang Chen, Xihu Dai and Jingxian Ye. A phase I/II study of a Ganoderma lucidum extract in patients with coronary heart disease. 19. Steyaert R.L, 1972. Species of Ganoderma and related genera mainly of the boyor and leiden herbaria. National de Beigique, Burxelle. 55 20. Zhaoji – Ding, 1980. The Ganodermataceae in chine. Berlin Shiffigart. Tài Liệu từ Internet 21. Lingzhi.htm 22. .activeCompoundsReishi.html 23. Alicechen.mht 24. Biomed~1.htm 25. Mushroom Information Center - waste G lucidum.mht 26. Reishi - Ganoderma Lucidum.mht 27. Mushroom Information Gano HIV.mht 28. 29. đnh5 56