Khóa luận Khảo sát sinh trưởng một chủng nấm vân chi đen Trametes versicolor L.:Fr pilát có nguồn gốc từ Trung Quốc

ân tử của PSP khoảng 100 kDa. 2.4.2.2. Dược tính [22], [28], [29] Các nghiên cứu về dược lý đã chứng minh rằng PSP ảnh hưởng mạnh mẽ đến sức khỏe và năng lượng, được xem là loại chất cảm ứng điều hoà sinh học mới. PSP không gây hại đối với các tế bào bình thường. PSP có khả năng phân biệt giữa tế bào thường và tế bào ung thư. Có thể tiêu diệt tế bào ung thư mà không gây bất cứ sự thay đổi hay tạo độc tố trên tế bào (Mei-po Yang, Hongkong university). Tỉ lệ phần trăm bệnh nhân trải qua thử nghiệm hiệu quả của PSP trong các giai đoạn II và III cho thấy tỉ lệ sống còn gia tăng đáng kể so với nhóm đối chứng: 90 – 97 % đối với ung thư dạ dày, 82 – 87 % đối với ung thư thực quản, 70 – 86 % đối với ung thư phổi. PSP là chất đầy tiềm năng và hiệu quả trong điều trị ung thư. 22 9 PSP gia tăng chức năng miễn dịch của cơ thể bình thường. Tăng sự biểu hiện của gen Interleukin-6 (IL-6) trong các tế bào lympho máu ngoại vi (PBL) ở người và do đó sản xuất ra IL-6 và cũng hoạt hoá tế bào bạch cầu để gia tăng quá trình sản xuất interferon α và γ lên gấp 2 – 4 lần. Gia tăng mạnh mẽ chỉ số thực bào, trị số HC50, kháng thể ở chuột, tăng PBL từ phase G1 đến phase S, thúc đẩy sự phát sinh PBL. Thúc đẩy sự phát sinh tế bào lympho T và tế bào tiền tế bào T ở tuyến ức và lách, tăng cường hoạt tính tế bào lympho B. 9 PSP trung hoà quá trình ức chế miễn dịch do khối u gây ra ở động vật. Làm ngưng quá trình tiêu biến của tuyến ức ở chuột mang bệnh Sarcoma. Trung hoà sự trương phồng của gan khi mắc bệnh ung thư cổ trướng Ehrlich. Chống lại quá trình ức chế kháng thể của tế bào ung thư Sarcoma ở chuột. Tăng giá trị bổ thể huyết thanh C3 trong chuột mắc bệnh Sarcoma. 9 PSP trung hoà quá trình ức chế miễn dịch do tác dụng của các hoá dược trong điều trị ung thư. Ức chế quá trình tiêu biến tế bào bạch cầu do cyclophosphamine (CPA) gây ra và rút ngắn thời gian phục hồi tế bào bạch cầu. Chống lại quá trình ức chế của CPA trên IL-2 và tế bào T tự sát thương. Phục hồi lại phản ứng mẫn cảm loại chậm bị ức chế bởi CPA. Dùng kết hợp với các phương pháp hoá trị và xạ trị sẽ làm giảm các tác dụng phụ của hoá dược và có hiệu quả cao hơn. 9 PSP ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở người và động vật thí nghiệm PSP (50 mg/kg, ip hoặc po) có thể ức chế sự phát triển của Sarcoma 180 ở chuột. PSP (100 µg/ml) có thể ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid của tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich. Ức chế sự phát triển tế bào ung thư bạch cầu P388, tế bào u tủy, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư phổi Lewis ở chuột. Nó có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư dạ dày, ung thư tuyến phổi ở người, ung thư tế bào bạch cầu đơn nhân to, ung thư mô bạch huyết ở da. Nó cũng gây ra sự tiêu biến tế bào ung thư và sự tích tụ NST mà không tạo ra bất kỳ độc tố nào trên tế bào fibroblast hay tế bào chủ (Liang-Zhong Xu, Bao-zhen Zhong, 2003). 23 Huyết thanh bạch cầu (ALS) có thể được trung hoà. Hoạt tính kháng khối u của PSP có liên quan với sự gia tăng tế bào lympho T. Tăng sự sản xuất các hợp chất nitơ trung gian, anion superoxide và yếu tố gây hoại tử ung thư. 9 Một số hiệu quả khác của PSP. Cải thiện sự thèm ăn của chuột khi dùng kết hợp với CPA. Giảm phản ứng đau của động vật khi chịu các tác nhân kích thích như điện, acid acetic, nước nóng. Ức chế hệ thần kinh trung ương và giảm hoạt tính tự phát của chuột. Tăng khả năng chịu đựng trong điều kiện thiếu oxy đối với chuột thí nghiệm. Biểu hiện khả năng ức chế sự tương tác giữa HIV-1 gp120 và làm bất động thụ thể CD4 (IC50=6,25µg/ml), ức chế enzyme glycohydralase gắn với sự glycosic virus và làm giảm độc tố tế bào. Do đó hướng sắp tới PSP sẽ được nghiên cứu để tạo thành tác nhân kháng virus in vivo. Ngoài ra, PSP còn được ứng dụng trong chữa trị các bệnh viêm nhiễm virus và bệnh gan. 2.4.3. So sánh giữa PSK và PSP [28] PSP và PSK là chuỗi proteoglycan, có trọng lượng phân tử khoảng 100 kDa, thành phần polysaccharide đều không có N-acetylamino-hexose trong khi tất cả chuỗi polysaccharide khác có. PSP và PSK đều được xem là những chất gây biến đổi các đáp ứng sinh học có khả năng trị ung thư và làm tăng miễn dịch, nhưng những nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàn cho thấy PSP và PSK có một số khác biệt. Bảng 2.2: So sánh giữa PSK và PSP Đặc điểm so sánh Giống nhau Khác nhau Chủng loại Vân chi Trametes versicolor PSP: chủng COV-1 từ Trung Quốc. PSK: CM-101 từ Nhật. Dạng dược phẩm PSP: dạng viên PSK: dạng gói Màu bột Nâu PSP: nâu PSK: nâu đậm Dạng nguyên liệu thô Hệ sợi 24 Kỹ thuật lên men Nguồn carbon chính là glucose lên men ở 25oC, 3 ngày hoặc 26oC, pH = 5 – 7. PSP: nguồn nitơ từ bột đậu nành PSK: nguồn nitơ từ pepton và cao nấm men. Thời gian lên men của PSP (64 giờ) nhanh gấp 3 lần PSK. Phương pháp chiết Chiết bằng nước nóng. PSP: tủa bằng cồn. PSK: sử dụng phương pháp muối hoá với (NH4)2SO4 để tủa. Phần đường Galactose, glucose, mannose, xylose PSP: arabinose, rhmanose PSK: fucose - Ngăn chặn sự tổng hợp acid nucleic của tế bào Ehrlich ascitic và sự phát triển của tế bào ung thư Sarcoma-180, bạch cầu P388… PSP: tỉ lệ ngăn chặn trên P388 là 90 – 96 % (1mg/kg). PSK: có tỉ lệ là 61 – 90 % (1mg/kg) PSP: tỉ lệ ức chế sự tổng hợp RNA, DNA của tế bào Ehrlich là 47%, 65%. PSK: 39%, 34%. - Phục hồi lại phản ứng mẫn cảm bị ức chế bởi các dược chất hoá học và bảo tồn lượng bạch cầu. Mức ngăn chặn của PSP, đối với bệ Sarcoma trên chuột là 43%, PSK 28%. Dược tính Gia tăng hoạt tính đại thực bào, hàm lượng globulin miễn dịch, bổ thể C3, kháng thể HC50, và IL-2 tế bào lympho-T PSP có thể làm tăng hàm lượng α- và β-ITF tạo bởi tế bào bạch cầu gấp 2 – 4 lần. Độc tính LD50>20g/kd, không đôc, không làm xuất hiện các dị hình, không ảnh hưởng đến sinh sản. PSP có thể tạo ra phản ứng độc bằng cách tập hợp nhiễm sắc thể của các tế bào ung thư phổi nhưng không độc trên chuột bình thường. Tác dụng trị liệu Làm giảm độc và phản ứng phụ của hoá trị và xạ trị, tăng chức năng miễn dịch, tăng hiệu quả chữa trị, kéo dài tuổi thọ và tăng chất lượng cuộc sống. PSP làm tăng sự thèm ăn, làm giảm đau. 25 2.5. Phương pháp chiết xuất hợp chất thô từ nấm (Phương pháp trích ly) [5] 2.5.1. Khái niệm Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất. Tùy theo cơ chế và đặc điểm, quá trình chiết được phân ra: 9 Chiết lỏng - lỏng với cơ chế chính là quá trình phân bố của chất tan trong hai chất lỏng không đồng tan với nhau theo định luật phân bố. 9 Chiết rắn - lỏng với cơ sở chính là sự hoà tan của chất tan vào dung môi. 2.5.2. Các quá trình xảy ra trong chiết xuất 2.5.2.1. Quá trình hoà tan Sự hoà tan là một quá trình vật lý trong đó chất tan được solvat hoá và kéo vào dung môi. Sự hòa tan này không có chọn lọc, tất cả những chất tan được trong dung môi đều có mặt trong dịch chiết. Quá trình hoà tan nhanh hay chậm phụ thuộc vào khả năng hòa tan của chất tan trong dung môi, diện tích bề mặt tiếp xúc của chất tan với dung môi, nhiệt độ và sự khuếch tán của chất tan trong dung môi. Nồng độ dung dịch phụ thuộc vào bản chất của dung môi và của chất tan, số lượng của dung môi và của chất tan. 2.5.2.2. Quá trình khuếch tán Quá trình khuếch tán xảy ra nhằm làm triệt tiêu sự chênh lệch nồng độ giữa dung dịch ở những nơi dung môi tiếp xúc với chất tan và dung dịch ở những nơi dung môi không hoặc ít tiếp xúc với chất tan. Sự khuếch tán thúc đẩy quá trình hoà tan và kéo chất tan từ các tế bào vỡ ra khỏi tế bào đi vào dịch chiết. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán: 9 Sự chêch lệch nồng độ 9 Nhiệt độ 9 Độ nhớt của dung môi 2.5.2.3. Quá trình thẩm tích Việc di chuyển chất tan phân tử nhỏ qua các kênh bào tương (Plasmodesmata, ống trao đổi) trong quá trình chiết xuất được thực hiện bởi sự khuếch tán thụ động theo 26 gradient nồng độ. Sự thẩm tích làm cho quá trình hòa tan chiết xuất có tính chọn lọc hơn. Các yếu tố ảnh hưởng: Cấu trúc vách tế bào, kích thước chất tan, nhiệt độ. 2.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất 2.5.3.1. Nguyên liệu Bản chất của nguyên liệu: bề dày của vách tế bào, đường kính của ống trao đổi là hai yếu tố quan trọng nhất. Mức độ chia nhỏ của nguyên liệu: Nguyên liệu càng được chia nhỏ, quá trình chiết càng nhanh. Tuy nhiên cách chia nhỏ phải phù hợp với từng loại nguyên liệu và dung môi. Chất tan: Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càng nhanh. Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng qua vách tế bào càng lớn. 2.5.3.2. Dung môi Khả năng hoà tan của dung môi: Khả năng hoà tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hoà tan càng nhanh làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. Dung môi phân cực hoà tan các chất phân cực, dung môi kém phân cực hoà tan các chất kém phân cực. Độ nhớt của dung môi: Độ nhớt càng thấp, quá trình chiết xảy ra càng nhanh. Sự thấm dung môi qua vách tế bào: Nguyên liệu còn tươi, còn nhiều nước làm chậm quá trình chiết đối với các dung môi kém phân cực. 2.5.3.3. Kỹ thuật chiết Tốc độ của quá trình chiết phụ thuộc các yếu tố: 9 Sự khuấy trộn: Làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. 9 Nhiệt độ, áp suất: Tăng nhiệt độ, tăng áp suất làm tăng tốc dộ chiết. 9 Chất trợ tan: Các chất diện hoạt có tác dụng đẩy nhanh quá trình chiết. 9 Siêu âm và vi sóng: Làm tăng chuyển động nhiệt của các phân tử chất tan và dung môi, tăng sự hoà tan và quá trình khuếch tán. 27 2.5.4. Các phương pháp chiết 2.5.4.1. Chiết các nguyên liệu tươi Nguyên liệu được cắt nhỏ, ngâm ngập trong dung môi và được xay nhỏ bằng một cánh khuấy quay với tốc độ rất cao (khoảng 10 000 vòng/phút) trong một thời gian ngắn (5 – 10 phút). Quá trình chiết này được thực hiện trong máy khuấy có tốc độ cao nên được gọi là turbo-extraction. 2.5.4.2. Phương pháp ngâm Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng nguyên liệu trong những dụng cụ thích hợp. 9 Phương pháp ngâm lạnh: Nguyên liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm thường không dưới 12 giờ để đảm bảo quá trình chiết được căn bản hoàn tất. 9 Phương pháp ngâm nóng: Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn. 9 Chiết bằng Soxhlet và Kumagawa: Là phương pháp ngâm nóng nhiều lần lần với một lượng nhỏ dung môi. Kumagawa cho phép chiết ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sôi của dung môi còn Soxhlet gần với phương pháp ngâm lạnh hơn. 9 Chiết bằng dung môi ở nhiệt độ sôi: Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ sôi của dung môi. Ưu điểm của phương pháp là quá trình chiết xảy ra nhanh; khuyến điểm là cần phải có dụng cụ, thiết bị thích hợp. 2.5.4.3. Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt Là phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua nguyên liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hoà tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối nguyên liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi /dịch chiết đi từ nơi nguyên liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao hơn. Quá trình ngấm kiệt được tiến hành dưới nhiệt độ thường hay ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Bình 28 chiết được thiết kế với bộ phận gia nhiệt và bảo ôn, dung môi được đưa vào bình ở nhiệt độ cao. 29 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian Đề tài được tiến hành từ tháng 3 năm 2005 đến tháng 8 năm 2005. 3.1.2. Địa điểm Trung tâm nghiên cứu Linh chi và Nấm dược liệu – Công ty cổ phần dược liệu TW2 thành phố Hồ Chí Minh. Phòng vi sinh - Bộ môn Công Nghệ sinh Học - Trường đại học Nông Lâm TpHCM. 3.2. Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, hoá chất 3.2.1. Nguyên liệu Nấm vân chi đen Trametes versicolor có nguồn gốc từ Trung Quốc do Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu thuộc Công ty cổ phần Dược Liệu TW2 TpHCM cung cấp. 3.2.2. Hoá chất, môi trường sử dụng 3.2.2.1.Hoá chất: Cồn 96oC, Vôi bột, Urea, DAP (diamon phosphat), SA (sulphat amon), Nitrate canxi, supe lân, NPK 20-20-15, Dynamic lifter. 3.2.2.2. Các môi trường sử dụng a. Môi trường PSA (Potato saccharose agar) [2] Khoai tây : 200g Saccharose : 20g Agar : 20g Nước cất cho đủ : 1000ml 30 b. Môi trường bán tổng hợp - BTH (Khoai tây - muối khoáng) [2] Khoai tây : 200g Saccharose : 20g KH2PO4 : 3g MgSO4 : 1,5g Agar : 20g Nước cất vừa đủ : 1000ml c. Môi trường Crapek [2] Saccharose : 30g NaNO3 : 3g KH2PO4 : 1g MgSO4 : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4 : 0,01g Agar : 20g Nước cất vừa đủ : 1000ml d. Môi trường dinh dưỡng bổ sung Nước chiết giá: 100g giá đậu + nước  xay nhuyễn  lọc bỏ bã và bổ sung nước cho đủ để tạo 1 lít dung dịch nước chiết giá. Nước chiết bắp: 100g bắp xay + nước  nấu chín  lọc bỏ bã và bổ sung nước cho đủ để tạo 1 lít dung dịch nước chiết bắp. Nước chiết khoai tây: khoai tây (200g) gọt vỏ, rủa sạch, cắt sợi, nấu và lọc lấy nước chiết + nước cất để tạo dung dịch nước khoai tây 1 lít. e. Môi trường nhân giống cấp hai Môi trường hạt: Chọn loại lúa gạo tốt, ngâm nước 24 giờ, nấu vừa nứt vỏ trấu, vớt ra để ráo, bổ sung lớp cám bắp 5%. Phân lúa vào các chai thuỷ tinh không quá 2/3 thể tích. Hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC trong 2 giờ. Để nguội 24 giờ cấy giống gốc từ môi trường thạch, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC) để tạo giống trung gian. Môi trường bắp xay: Bắp xay nấu cho nở và bổ sung các thành phần dinh dưỡng. 31 Môi trường mùn cưa: Mùn cưa cao su khô còn tốt trộn với vôi bột 1%, bổ sung nước, ủ qua đêm và tạo độ ẩm môi trường khoảng 60%. Bảng 3.1: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong mùn cưa (%)[11] Cơ chất Nguyên tố Mùn cưa gỗ cao su Mùn cưa gỗ lim Mùn cưa gỗ tạp N 1,68 ± 0,20 1,02 ± 0,20 1,27 ± 0,20 P 0,48 ± 0,04 0,37 ± 0,03 0,43 ± 0,06 K 1,18 ± 0,05 0,73 ± 0,04 0,77 ± 0,05 Ca 0,12 ± 0,03 0,15 ± 0,05 0,23 ± 0,06 Mg 0,04 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 Bảng 3.2: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong các loại bột (%) [11] Bột Nguyên tố Cám gạo Cám bắp Bột bã đậu phộng N 3,64 ± 0,70 3,08 ± 0,46 8,86 ± 0,54 P 1,37 ± 0,31 1,92 ± 0,22 0,88 ± 0,41 K 0,65 ± 0,16 0,24 ± 0,14 0,72 ± 0,18 Bảng 3.3: Hàm lượng khoáng trong nước dừa (Vanderberlt, 1954) Nguyên tố Hàm lượng (µg/100ml) Nguyên tố Hàm lượng (µg/100ml) K 3,12 Fe 0,01 Ca 1,50 Cu 0,04 Na 2,09 S 3,40 Mg 3,00 P 3,70 3.2.3. Dụng cụ, thiết bị Các dụng cụ, thiết bị cần sử dụng: đĩa petri, bình tam giác, chai thuỷ tinh, giấy lọc, máy đo pH, tủ ủ, cân điện tử, tủ sấy, nồi hấp autoclave, tủ cấy. 32 3.3. Phương pháp tiến hành thí nghiệm 3.3.1. Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi 3.3.1.1 Hình thái cấu tạo quả thể Quan sát hình dạng quả thể, cấu tạo quả thể hoàn chỉnh, thân nấm và lớp bào tầng, cấu trúc cắt ngang quả thể, chụp hình. Quan sát hệ sợi trên quả thể dưới kính hiển vi vật kính X40 và chụp hình. 3.3.1.2. Hệ sợi tơ thứ cấp Lấy mẫu hệ sợi lan trên môi trường thạch cho lên mặt lame, không nhuộm màu mẫu, dùng lamelle đè nhẹ, quan sát dưới kính hiển vi vật kính X40, quan sát hình dạng hệ sợi, vách ngăn ngang, mấu liên kết và sau đó chụp hình. 3.3.1.3. Đảm và đảm bào tử Lấy cốc thuỷ tinh có đựng nước (không đầy đến miệng cốc), đặt quả thể nấm lên trên (quả thể nấm phải lớn hơn đường kính cốc) hướng lớp bào tầng về phía miệng cốc, để nơi kín gió. Sau 1 – 2 ngày, lấy bào tử có trong cốc, quan sát dưới kính hiển vi vật kính X40 và chụp hình. 3.3.2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch 3.3.2.1. Khảo sát tốc độ lan của hệ sợi trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau Thí nghiệm được tiến hành trên 5 môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau. 9 Môi trường 1: PGA 9 Môi trường 2: Bán tổng hợp (Khoai tây - muối khoáng) 9 Môi trường 3: Crapek 9 Môi trường 4: PGA + 10% nước dừa 9 Môi trường 5: PGA + 10% nước chiết giá Tất cả các môi trường đều được hấp khử trùng 121oC/ 30phút, để nguội 50 – 55oC và đổ vào đĩa petri vô trùng. Mỗi môi trường đổ 10 đĩa. Sau 24h, cấy vào mỗi đĩa 1 hạt lúa từ môi trường nhân giống cấp hai (môi trường hạt). Tiến hành ủ ở nhiệt độ 33 phòng (30 ± 2oC). Ba ngày sau khi cấy, bắt đầu tiến hành đo đường kính hệ sợi lan theo thời gian. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ Môi trường sử dụng là môi trường bán tổng hợp – BTH (khoai tây - muối khoáng). Khử trùng môi trường 121oC/ 30 phút sau đó đổ vào đĩa petri vô trùng (mỗi môi trường đổ 10 đĩa). Sau 24h, cấy vào mỗi đĩa một hạt lúa từ môi trường hạt. Tiến hành ủ ở hai mức nhiệt độ 27 ± 2oC và nhiệt độ phòng (30 ± 2oC). Sau 3 ngày tiến hành thu thập số liệu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH Môi trường dùng làm thí nghiệm là môi trường bán tổng hợp – BTH (khoai tây - muối khoáng), điều chỉnh về các pH khác nhau: 5; 5,5; 6; 6,5; 7. Điều chỉnh pH acid dùng dung dịch HCl 1M và pH kiềm dùng NaOH 1M. Khử trùng môi trường 121oC/ 30 phút, mỗi thí nghiệm đổ 10 đĩa, sau 24h cấy giống. Ủ nhiệt độ phòng (30 ± 2oC). Bắt đầu đo và thu thập số liệu sau 3 ngày. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.3. Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai Thí nghiệm được tiến hành trên các môi trường có bổ sung thành phần dinh dường khác nhau để tìm môi trường nhân giống cấp hai tối ưu. 9 MT 1: Lúa 90% Mùn cưa 5% Cám gạo 5% 9 MT 2: Lúa 90% Mùn cưa 5% Cám bắp 5% 9 MT 3: Lúa 80% Mùn cưa 5% Bắp xay 15% 9 MT 4: Bắp xay 50% Cám gạo 25% Mùn cưa 25% 34 9 MT 5: Bắp xay 50% Mùn cưa 25% Đậu xanh 25% 9 MT 6: Bắp xay 50% Mùn cưa 50% 9 MT 7: Mùn cưa 50% Cám gạo 50% (NH4)2SO4 0,2% 9 MT 8: Mùn cưa 50% Cám gạo 50% Urea 0,1% 9 MT 9: Mùn cưa 50% Cám bắp 50% Tất cả các môi trường đều được bổ sung nước để tạo ẩm độ (khoảng 60%) cho hệ sợi nấm phát triển. Mỗi môi trường phân vào 10 ống nghiệm, hấp khử trùng bằng hơi nước nóng 121oC/2 giờ. Sau 24 giờ cấy giống từ môi trưòng hạt, ủ ở nhiệt độ phòng (khoảng 30 ± 2oC). Tiến hành đo và thu thập số liệu sau 4, 6, 8, 10 và 12 ngày. Thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp lại. Các chỉ tiêu theo dõi, quan sát. - Tốc độ tăng trưởng của hệ sợi qua các ngày 4, 6, 8, 10, 12 ngày sau khi cấy. - Màu sắc hệ sợi trên ống nghiệm. 3.3.4. Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể Thử nghiệm khả năng cho quả thể trên các môi trường sau: 9 MT 1: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Urea 0,25% 9 MT 2: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Urea 0,25% + DAP 0,25% 9 MT 3: Mùn cưa + cám gạo 5% + SA 0,5% + DAP 0,25% 9 MT 4: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Nitrate Canxi 0,5% + DAP 0,25% 9 MT 5: Mùn cưa + Cám gạo 5% + NPK 20-20-15 0,5% 9 MT 6: Mùn cưa + Cám gạo 10% 9 MT 7: Mùn cưa + Cám bắp 10% 9 MT 8: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Supe lân 0,5% + Urea 0,25% 35 9 MT 9: Mùn cưa + Urea 0,25% + DAP 0,25% 9 MT 10: Mùn cưa + Cám 5% + Dynamic lifter 0,25% Môi trường mùn cưa sau khi trộn vôi 1%, ủ qua đêm, được bổ sung chất dinh dưỡng khác nhau và cho vào bịch polypropylen. Mỗi bịch nặng 600g và có ẩm độ 65%. Mỗi công thức cho vào 10 bịch, hấp khủ trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC/2 giờ. Sau 24 giờ, để cho các bịch môi trường thật nguội và cấy giống từ môi trường lúa. Ủ ở nhiệt độ phòng, theo dõi thời gian xuất hiện hệ sợi nấm trên các bịch môi trường và thời gian xuất hiện tai nấm ở các nghiệm thức. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng Các môi trường thí nghiệm là môi trường lỏng không có agar. TN 1: Thử nghiệm trên 3 loại môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau 9 Môi trường tự nhiên: PS (khoai tây + đường) 9 Môi trường bán tổng hợp (BTH): khoai tây + muối khoáng + đường 9 Môi trường tổng hợp: Crapek Mục đích thí nghiệm: dựa trên lượng sinh khối thu được từ các môi trường trong TN1, chọn môi trường có lượng sinh khối nhiều nhất để làm đối chứng cho TN2. TN 2: Thử nghiệm trên các môi trường được bổ sung các nguồn dinh dưỡng tự nhiên MT 1: PS + 5% Nước chiết bắp MT 2: PS + 10% Nước chiết bắp MT 3: PS + 15% Nước chiết bắp MT 4: PS + 5% Nước chiết giá MT 5: PS + 10% Nước chiết giá MT 6: PS + 15% Nước chiết giá MT 7: PS + 5% Nước dừa MT 8: PS + 10% Nước dừa MT 9: PS + 15% Nước dừa MTĐC: MT TN1 Cho 50ml môi trường vào chai thuỷ tinh (250ml hay 500ml). Mỗi môi trường thực hiện 10 chai, hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC/30phút. Để nguội một 36 ngày, cấy giống từ môi trường lúa, mỗi chai môi trường cấy một hạt lúa. Ủ ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC), tiến hành thu và cân sinh khối sau 5, 10, 15 ngày. Xử lý số liệu để chọn ra môi trường tạo sinh khối nhiều nhất. 3.3.6. Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor Sinh khối thu được từ TN1 và TN2  sấy ở 45oC đến khối lượng không đổi  xay nhuyễn  cân P(g)  ly trích  lọc trên giấy đã cân bì  sấy khô ở 45oC  định lượng. So sánh tỉ lệ hợp chất polysaccharide thô thu được giữa các nghiệm thức. So sánh tỉ lệ polysaccharide thô trích từ hệ sợi và quả thể nấm vân chi. 9 Sinh khối lấy từ môi trường BTH  sấy khô  xay nhuyễn  cân P(g)  ly trích l định lượng. 9 Quả thể nấm  sấy khô  xay nhuyễn  cân P(g)  ly trích l định lượng. 37 Bột nấm P(g) -Nguyên liệu : nước = 1:35 – 40 -Đun cách thuỷ 60 phút -Lọc Dịch chiết lần 1 Bã lần 1 -Nguyên liệu : nước = 1:10 -Cách thuỷ 60 phút -Lọc Dịch chiết lần 2 Bã lần 2 -Nguyên liệu : nước = 1:10 -Đun cách thuỷ 60 phút -Lọc Dịch chiết lần 3 Bã lần 3 Dịch chiết vân chi -Cô cách thuỷ Cao nước -Tủa bằng cồn 96o -Lọc tủa Polysaccharide thô Sơ đồ 3.2: Quy trình ly trích hợp chất thô từ nấm vân chi [16], [20] 38 3.4. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý theo phương pháp xác suất thống kê dựa trên cơ sở phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS-EXCEL Trung bình mỗi mẫu: Xtb = n Xi Xi: trị số của mẫu N: số lượng mẫu Phương sai của nghiệm thức S2 S2 = 2 1 1 )( − −∑ = n XtbXi n i Độ lệch chuẩn của nghiệm thức: độ lệch chuẩn của mẫu là S. Độ lệch chuẩn nói lên mức độ chêch lệch giữa các số liệu. Số liệu càng rời rạc thì độ lệch chuẩn càng lớn; ngược lại số liệu càng tập trung thì độ lệch chuẩn càng nhỏ. S = 2S 95% các giá trị thống kê được của các môi trường sẽ nằm trong khoảng: Xtb ± S Tốc độ lan hệ sợi trung bình của mỗi nghiệm thức (N) N = k Xtb k: số ngày tơ lan Phần mềm Statgraphics Vers 7.0 Sử dụng phần mềm này để xác định sự khác biệt giữa các giá trị thu nhận được của các nghiệm thức thí nghiệm ở mức α = 0,05 hay LSD (95%) (Least Significant Difference). 9 Hai nghiệm thức có trung bình cách nhau một khoảng nhỏ hơn LSD (95%) thì xem như không khác nhau ở mức α = 0,05. 9 Ngược lại, nếu trung bình của hai nghiệm thức cách nhau một khoảng lớn hơn LSD (95%) thì xem như hai mẫu khác nhau ở mức α = 0,05. 39 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quan sát hình thái giải phẫu 4.1.1. Hình thái cấu tạo quả thể Hình 4.1: Quả thể nấm Vân chi đen Trametes versicolor (theo chiều từ trên xuống, trái qua phải: Hình 4.1a, Hình 4.1b, Hình 4.1c, Hình 4.1d ) 9 Hình 4.1a: Mặt trên nấm vân chi với những đường đồng tâm màu xám tro, nâu đen đến đen 9 Hình 4.1b: Quả thể nấm vân chi gồm nhiều lớp đan xen nhau 9 Hình 4.1c: Quả thể nâm vân chi cắt ngang 9 Hình 4.1d: Mặt dưới tai nấm vân chi Quả thể vân chi khi non mọc thành từng u lồi tròn màu trắng, trắng kem hay hơi ngã màu nâu, càng lớn sẽ xuất hiện dạng vành gồm nhiều lớp đan xen chồng chất lên nhau như ngói lợp. Mủ nấm hình quạt, cứng mỏng. Mép mủ mỏng, sắc cạnh, nguyên hay xẻ thuỳ sâu nông không theo quy luật. Mặt trên tai nấm có lớp lông mịn, dày, ngắn khoảng 0,3 – 0,5 mm. Lớp lông mịn này tạo thành nhiều đường đồng tâm có màu sắc thay đổi từ đen, nâu đen, xám tro đến nâu đất. Càng ra phía ngoài mép tán, màu sắc của các đường đồng tâm càng nhạt, càng ngã sang nâu nhiều hơn đen, mép tán có lớp 40 lông mịn màu trắng hay hơi vàng nâu. Tuy nhiên ở những vùng tán nấm nhận ít ánh sáng thì có màu vàng nâu, màu nâu, tương tự những tán nằm phía dưới cũng xuất hiện màu nâu nhiều hơn. Mặt dưới tai nấm là lớp bào tầng màu trắng - trắng kem có nhiều lỗ nhỏ. Miệng lỗ nguyên, có dạng gần tròn hay oval. Phần thịt nấm mỏng, màu trắng, trắng kem, dày 1 – 2 mm. Hệ sợi trong phần thịt nấm rất dai, bện kết chặt với nhau, quan sát thấy có hai loại sợi: 9 Sợi cứng vách dày 1,5 – 2,7 µm, thẳng, trong suốt, không có vách ngăn ngang, đường kính 3 – 6,5 µm, rất ít khi phân nhánh. 9 Sợi bện ngắn, ngoằn ngoèo, phân nhánh rất rõ, đường kính 2 – 4 µm, vách dày 0,7 – 1,7 µm. Hình 4.2: Hệ sợi trích từ quả thể nấm vân chi 4.1.2. Hình thái cấu tạo hệ sợi hệ sợi thứ cấp Nấm Vân chi Trametes versicolor xuất hiện 3 loại hệ sợi. Khi quan sát hiển vi không nhuộm màu, cả 3 loại sợi đều không màu, trong suốt. Sợi dinh dưỡng có vách tế bào dày 0,34 – 0,6 µm, vách ngăn ngang mỏng, đường kính 2,7 – 4,4 µm, không phân nhánh hoặc ít phân nhánh. Sợi bện có vách tế bào dày hơn sợi dinh dưỡng, không có vách ngăn ngang, phân nhánh nhiều, đường kính 2,5 – 4,5 µm. Sợi cứng ở vùng thịt nấm có vách dày chiếm gần 2/3 đường kính, không có vách ngăn ngang, không phân nhánh, có đường kính 3,4 – 6,1 µm. 41 a b c Hình 4.3: Hệ sợi vân chi lấy từ môi trường thạch a: Sợi dinh dưỡng; b: Sợi cứng; c: Sợi bện 4.1.3. Đảm và bào tử đảm Không quan sát được đảm, chỉ quan sát được bào tử đảm. Bào tử đảm trong suốt, nhẵn, thon dài hơi cong giống hình quả dưa gang, vách mỏng, có đường kính 1,7 – 2,4 µm, chiều dài 3,4 – 5,1 µm. 42 Hình 4.4: Bào tử nấm vân chi 4.2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch 4.2.1. Khảo sát đường kính tăng trưởng của hệ sợi trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau Kết quả đo đường kính hệ sợi lan trên 5 môi trường thạch dinh dưỡng khác nhau được trình bày ở Bảng 4.1 Bảng 4.1: Đường kính hệ sợi lan trên 5 môi trường theo thời gian Đường kính hệ sợi lan (mm) Thời gian (ngày) MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 3 39,82 ± 3,90 27,63 ± 1,19 37,76 ± 0,98 41,31 ± 1,54 39,57 ± 2,51 4 62,15 ± 3,24 45,42 ± 0,58 59,56 ± 3,00 65,58 ± 1,62 60,57 ± 0,33 5 79,24 ± 0,24 60,22 ± 0,67 78,11 ± 3,10 82,81 ± 1,35 78,79 ± 2,75 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 Môi trường m m 3N 4N 5N Biểu đồ 4.1: Biểu diễn đường kính hệ sợi lan trên 5 môi trường dinh dưỡng theo thời gian 43 Quan sát hệ sợi lan đến ngày thứ 5 nhận thấy: Trên MT2, hệ sợi lan chậm và lan thưa nhất, mức độ tập trung hệ sợi mỏng, đường kính tăng trưởng có sự sai khác đối với tất cả các môi trường còn lại; ở MT4 (môi trường PSA có bổ sung nước dừa), hệ sợi lan nhanh nhất do trong nước dừa có một số khoáng cần thiết và một số loại vitamin có tác dụng kích thích sự tăng trưởng hệ sợi nấm, nhưng so về mặt thống kế không có sự sai khác có ý nghĩa giữa đường kính hệ sợi lan trên MT4 với MT1, MT4 với MT5, nhưng có sự sai khác giữa MT4 với MT3 (môi trường PSA có bổ sung khoáng chất tổng hợp). Tuy nhiên ở MT3, hệ sợi mọc dày nhất, xuất hiện sắc tố sớm hơn các môi trường còn lại. Thời gian hệ sợi bắt đầu xuất hiện sắc tố (màu nâu vàng hay nâu đen) là khoảng 6 – 8 ngày sau khi cấy và càng để lâu hệ sợi càng dai. Như vậy, để nhân giống hiệu quả, MT4 (gồm khoai tây + 10% nước dừa + đường) là môi trường thích hợp nhất và thời gian nhân giống tốt nhất là khoảng 6 – 8 ngày sau khi cấy. Hình 4.5: Đường kính hệ sợi tăng trưởng trên các môi trường dinh dưỡng sau 4 ngày cấy 44 4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ Kết quả đo đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở hai mức nhiệt độ được trình bày ở Bảng 4.2. Bảng 4.2: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở hai mức nhiệt độ theo thời gian Đường kính hệ sợi lan (mm) Thời gian (ngày) 30oC 27oC 3 37,76 ± 2,98 33,46 ± 3,66 4 59,56 ± 3,00 52,18 ± 3,16 5 78,11 ± 3,10 72,26 ± 1,89 0 20 40 60 80 100 30 27 Nhiệt độ (oC) m m 3N 4N 5N Biểu đồ 4.2: Biểu diễn đường kính hệ sợi nấm vân chi lan trên môi trường BTH ở nhiệt độ 27oC và 30oC theo thời gian Đường kính hệ sợi lan ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC) lớn hơn ở nhiệt độ mát (27 ± 2oC) về mặt thống kê có sự sai khác có ý nghĩa. Vì đây là loài nấm có nguồn gốc từ Trung Quốc nên có thể nhiệt độ thích hợp cho sự hình thành quả thể là thấp, nhưng khi quan sát trên môi trường thạch thì khác, ở nhiệt độ phòng hệ sợi vẫn phát triển tốt. Do đó khi phân lập hay nhân giống chỉ cần để ở nhiệt độ phòng cũng đạt được năng suất mong muốn. 45 Hình 4.6: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở 27oC và 30oC vào ngày thứ 4 4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH Số liệu thu thập trong 5 ngày đo đường kính của hệ sợi nấm vân chi lan trên môi trường BTH ở các pH khác nhau được trình bày trong Bảng 4.3. Bảng 4.3: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở các pH khác nhau theo thời gian Đường kính hệ sợi lan (mm) Thời gian (ngày) pH7 pH6,5 pH6 pH5,5 pH5 3 24,93 ± 2,17 30,60 ± 3,03 33,06 ± 3,59 35,21 ± 3,29 36,15 ± 3,20 4 37,50 ± 2,32 46,88 ± 2,81 53,10 ± 2,64 57,38 ± 4,26 57,61 ± 3,22 5 49,15 ± 2,06 61,18 ± 2,00 70,10 ± 3,71 75,64 ± 3,22 74,38 ± 3,27 0 20 40 60 80 7 6,5 6 5,5 5 pH m m 3N 4N 5N Biểu đồ 4.3: Biểu diễn đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở các pH khác nhau theo thời gian 46 Phân tích số liệu nhận xét thấy, ở pH 5,5 hệ sợi nấm vân chi lan nhanh, dày, đều, có đường kính tăng trưởng lớn nhất; tuy nhiên tốc độ lan ở pH 5 và pH 5,5 không có sự khác biệt về mặt thống kê; ở pH 7 hệ sợi lan chậm nhất, khác biệt so với tất cả pH còn lại. pH càng cao khả năng lan của hệ sợi càng chậm, khi vượt quá pH 9 thì hệ sợi có thể chết [3]. Vậy trong nhân giống cấp một cần điều chỉnh pH môi trường nằm trong khoảng 5 – 5,5. Hình 4.7: Đường kính hê sợi lan trên môi trường BTH ở các pH vào ngày thứ 4 4.3. Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai (môi trường hạt) Kết quả đo chiều dài hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống cấp hai được thể hiện ở Bảng 4.4 Bảng 4.4: Chiều dài hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống cấp hai Chiều dài hệ sợi lan (mm) Môi trường Ngày thứ 4 Ngày thứ 6 Ngày thứ 8 Ngày thứ 10 Ngày thứ 12 1 40,33 ± 3,18 57,14 ± 3,20 73,86 ± 3,05 85,28 ± 3,75 92,94 ± 4,07 2 39,61 ± 2,37 57,56 ± 1,90 74,19 ± 2,16 88,42 ± 0,52 102,17±0,44 3 37,08 ± 1,10 52,56 ± 0,77 68,44 ± 0,38 82,33 ± 0,67 94,92 ± 1,37 4 33,61 ± 3,13 47,46 ± 3,50 63,31 ± 2,16 73,11 ± 2,50 82,06 ± 3,00 5 38,08 ± 1,72 55,97 ± 1,89 73,56 ± 1,50 88,36 ± 2,29 100,92±1,91 6 34,92 ± 2,17 50,50 ± 2,68 66,78 ± 1,58 79,42 ± 1,88 94,39 ± 1,64 7 35,11 ± 1,90 47,11 ± 3,36 60,31 ± 4,04 70,31 ± 4,89 77,89 ± 4,01 8 33,50 ± 3,66 45,39 ± 3,62 58,28 ± 2,61 67,67 ± 4,06 75,42 ± 3,64 9 37,92 ± 1,91 53,75 ± 2,27 70,58 ± 2,48 83,39 ± 2,64 92,14 ± 2,66 47 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Môi trường m m 4N 6N 8N 10N 12N Biểu đồ 4.4: Biểu diễn chiều dài hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống cấp hai Kết quả sau 12 ngày đo cho thấy: hệ sợi lan trên các môi trường lúa, bắp xay có bổ sung dinh dưỡng tốt hơn lan trên các môi trường mùn cưa. Hệ sợi ở các môi trường lúa và trên môi trường bắp xay lan nhanh, dày, màu trắng, bện kết chặt với nhau, còn trên môi trường mùn cưa, hệ sợi lan chậm hơn, mức độ tập trung hệ sợi thưa, khả năng bện kết yếu. Khi phân tích thống kê các số liệu thu thập được, MT8 là môi trường có hệ sợi lan chậm và yếu nhất, MT2 và MT5 là môi trường có hệ sợi lan nhanh, mạnh, dày, có chiều dài hệ sợi lan dài và khác biệt so với các môi trường còn lại. Vậy để đạt được năng suất cao trong nhân giống trung gian có thể chọn MT2 hoặc MT5; nhưng để nhân giống số lượng lớn phục vụ sản xuất, MT2 (Lúa, Mùn cưa, Cám bắp) tối ưu hơn MT5 (Bắp xay, Mùn cưa, Đậu xanh) vì giá thành MT2 kinh tế hơn, mức độ lan của hệ sợi đồng đều hơn và sự chêch lệch giữa các số liệu thu thập từ MT2 thấp hơn MT5. Trên các môi trường, hệ sợi bắt đầu xuất hiện sắc tố từ ngày thứ 15 sau khi cấy. Khi có sự xuất hiện sắc tố (màu vàng hay vàng nâu) thì hệ sợi bện chặt lại với nhau và rất dai. Do từ ngày thứ 15, hệ sợi bắt đầu già và dai, vậy nên tiến hành cấy chuyền hay cấy sang môi trường nuôi trồng tốt nhất là khi hệ sợi được 12 – 15 ngày tuổi. 48 Hình 4 .8: Hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống trung gian sau 7 ngày cấy 4.4. Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể Các bịch môi trường sau khi cấy giống được ủ ở nhiệt độ phòng (29 ± 2oC). Qua quá trình quan sát sự xuất hiện hệ sợi nấm trên các môi trường nuôi trồng nhận thấy kết quả được thể hiện ở Bảng 4.5: Bảng 4.5: Tỉ lệ xuất hiện hệ sợi trên các môi trường nuôi trồng Tỉ lệ xuất hiện hệ sợi (%) Môi trường Ngày thứ 6 Ngày thứ 9 Ngày thứ 12 1 64,3 85,6 100 2 57,1 78,5 100 3 92,3 100 100 4 92,9 100 100 5 85,7 100 100 6 71,4 96,4 100 7 96,8 100 100 8 14,3 53,8 84,6 9 37,0 92,3 100 10 57,1 96 100 49 Như vậy về cơ bản đến ngày thứ 12 thì ở tất cả các môi trường thí nghiệm đều có sự hình thành hệ sợi, và tuỳ thuộc vào từng loại môi trường mà tốc độ hệ sợi lan ở mỗi nghiệm thức có sự khác nhau. Tiến hành quan sát tiếp sự phát triển của hệ sợi nấm, nhận thấy sau 1 tháng, hệ sợi đã lan đầy bịch môi trường, hệ sợi lan chậm nhất ở MT8, nhanh nhất là ở MT3. Tỉ lệ hệ sợi lan kín bịch môi trường ở các công thức là: MT1 (94%), MT2 (85,4%), MT3 (98%), MT4 (69,2%), MT5 (65,1%), MT6 (80,4%), MT7 (74,1%), MT8 (36%), MT9 (47%), MT10 (57,1%). Nhưng ở MT6, MT7 có sự xuất hiện mầm quả thể đầu tiên sau 2,5 tháng nuôi trong điều kiện sản xuất tại Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu TpHCM. Ba tháng sau khi cấy, tất cả môi trường đều xuất hiện mầm quả thể, trong đó tỉ lệ nảy mầm của mỗi nghiệm thức lại có sự khác biệt nhau: MT1 (26,5%), MT2 (8,6%), MT3 (15,8%), MT4 (12,1%), MT5 (5,9%), MT6 (40,5%), MT7 (26,3%), MT8 (11,1%), MT9 (0%), MT10 (10,3%). Như vậy, MT6 (Mùn cưa + Cám gạo 10%) là môi trường có sự hình thành quả thể sớm và có tỉ lệ nảy mầm cao nhất. Do giới hạn về mặt thời gian và vì đây là giống mới, có nguồn gốc từ Trung Quốc chưa thích nghi tốt với điều kiện khí hậu ở Việt Nam, lượng nấm hình thành không nhiều và không đồng đều giữa các nghiệm thức nên không thể tiến hành thu hái tai nấm và định lượng để xác định môi trường cho quả thể nhiều nhất. Thí nghiệm chỉ dừng ở mức quan sát môi trường có sự hình thành hệ sợi và xuất hiện mầm sớm nhất. 4.5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng TN1: Khảo sát khả năng tạo sinh khối nấm vân chi trên 3 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau Sinh khối thu được từ 3 loại môi trường nuôi cấy lỏng được trình bày ở Bảng 4.6 Bảng 4.6: Sinh khối nấm vân chi trên môi 3 trường lỏng Sinh khối (gam) Thời gian (ngày) PS BTH CRAPEK 5 0,0195 ± 0,0068 0,0713 ± 0,0185 0,0059 ± 0,0010 10 0,1289 ± 0,0007 0,2350 ± 0,0290 0,0241 ± 0,0046 15 0,2101 ± 0,0042 0,4323 ± 0,0375 0,0459 ± 0,0047 50 0,2101 0,0459 0,4323 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 PS CRA BTH Môi trường Si nh k hố i ( g) 5N 10N 15N Biểu đồ 4.5: Biểu diễn sinh khối nấm vân chi được tạo ra trên 3 môi trường Ba môi trường bổ sung với các thành phần dinh dưỡng khác nhau có sự khác biệt từng đôi một về khả năng tạo sinh khối, sinh khối nấm phát triển mạnh nhất ở môi trường khoai tây có bổ sung hoá chất tổng hợp (BTH), trên môi trường Crapek (gồm toàn hoá chất tổng hợp không có nguồn dinh dưỡng tự nhiên) hệ sợi tăng trưởng chậm nhất, sinh khối tạo ra ít, không thích hợp để nuôi lấy sinh khối. Vậy để tạo lượng sinh khối lớn trong sản xuất, có thể sử dụng môi trường BTH (nước chiết khoai tây + khoáng tổng hợp). Hình 4.9: Sinh khối nấm vân chi trong 3 môi trường lỏng 51 TN2: Thử nghiệm khả năng tạo sinh khối trên các môi trường dinh dưỡng tự nhiên Lượng sinh khối thu được từ 10 môi trường trong TN2 được trình bày ở Bảng 4.7 Bảng 4.7: Sinh khối vân chi trên các môi trường bổ sung dinh dưỡng tự nhiên Sinh khối nấm vân chi (gam) Môi trường 5 ngày 10 ngày 15 ngày 1 0,0274 ± 0,0173 0,1153 ± 0,0115 0,1581 ± 0,0092 2 0,0259 ± 0,0066 0,1330 ± 0,0226 0,2276 ± 0,0188 3 0,0361 ± 0,0101 0,1419 ± 0,0161 0,2433 ± 0,0156 4 0,0359 ± 0,0046 0,1141 ± 0,0089 0,1973 ± 0,0173 5 0,0338 ± 0,0050 0,1204 ± 0,0138 0,2047 ± 0,0181 6 0,0290 ± 0,0040 0,1474 ± 0,0030 0,2074 ± 0,0133 7 0,2074 ± 0,0133 0,1234 ± 0,0029 0,3402 ± 0,0156 8 0,0142 ± 0,0049 0,1293 ± 0,0083 0,2332 ± 0,0164 9 0,0320 ± 0,0040 0,1248 ± 0,0155 0,2289 ± 0,0130 10 0,0713 ± 0,0185 0,2348 ± 0,0290 0,4323 ± 0,0375 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Môi trường ga m 5N 10N 15N Biểu đồ 4.6: Biểu diễn lượng sinh khối trong các môi trường có bổ sung thành phần dinh dưỡng tự nhiên 52 Kết quả cho thấy sự tích luỹ sinh khối có sự khác nhau trên các môi trường thí nghiệm. Trong tất cả các ngày thu hoạch (5, 10, 15 ngày), sinh khối tạo ra trên MT10 (môi trường khoai tây + muối khoáng) đều cao nhất (vào ngày thứ 15, lượng sinh khối thu được trên MT10 lớn hơn MT3 1,78 lần; cao hơn MT6 2,08 lần; hơn MT7 1,27 lần). Từ kết quả thu nhận cho thấy lượng hoá chất tổng hợp bổ sung (KH2PO4, MgSO4, Peptone) có tác dụng tích cực thúc đẩy quá trình tăng trưởng hệ sợi hơn các nguồn dinh dưỡng bổ sung tự nhiên (nước chiết bắp, nước chiết giá đậu, nước dừa). Khi xét đến hiệu quả của từng nguồn dinh dưỡng bổ sung, nhận thấy có kết quả như sau: sinh khối tạo ra trong môi trường PS có bổ sung nước bắp với các nồng độ khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa, môi trường có bổ sung nước chiết bắp 15% có sinh khối cao hơn các nồng độ bổ sung khác (5% và 10%), như vậy lượng nước bắp bổ sung có ảnh hưởng đến lượng sinh khối tạo ra, nồng độ bổ sung càng cao cho lượng sinh khối tạo ra càng nhiều. Môi trường PS có bổ sung nước chiết giá đậu với các nồng độ khác nhau (5%, 10%, 15%) cho lượng sinh khối tạo ra không có sự khác biệt về mặt thống kê, do vậy nồng độ nước chiết giá bổ sung không ảnh hưởng đến lượng sinh khối tạo ra. Trong khi môi trường PS có bổ sung nước dừa có sự khác biệt rõ rệt giữa các nồng độ bổ sung. Lượng nước dừa bổ sung ở nồng độ 5% cho lượng sinh khối cao nhất, khác biết có ý nghĩa so với hai nồng độ bổ sung 10% và 15%. Sinh khối thu được từ hai môi trường có bổ sung 10% và 15% nước dừa thì tương đương nhau, không có sự sai khác. Như vậy, MT10 – môi trường BTH (khoai tây muối khoáng) là môi trường thích hợp nhất được sử dụng trong nuôi cấy để thu nhận sinh khối nấm vân chi. 4.6. Định lượng hợp chất polysaccharide thô trích từ hệ sợi nấm vân chi TN1: Định lượng hợp chất polysaccharide thô trích từ sinh khối nấm vân chi thu được trên 3 môi trường PS, BTH, CRAPEK Kết quả trích ly hợp chất polysaccharide thô từ sinh khối nấm vân chi trên 3 môi trưởng lỏng được trình bày ở Bảng 4.8. Bảng 4.8: Tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối thu được trên 3 môi trường PS(%) BTH (%) CRA (%) Lần 1 10,89 11,38 0 Lần 2 11,03 10,65 0 Lần 3 10,43 11,44 0 Tỉ lệ TB 10,76 11,16 0 53 10,78 11,16 0 0 2 4 6 8 10 12 PS BTH CRA Môi trường % p ol ys ac ch ar id e th ô Biểu đồ 4.7 : Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối thu được trên 3 môi trường lỏng Vì lượng sinh khối thu được từ môi trường Crapek rất ít nên không tiến hành trích và định lượng. Lượng polysaccharide thô trích từ sinh khối thu được trên môi trường PS và BTH cho tỉ lệ tương đương nhau, khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Về mặt kinh tế, nếu sử dụng sinh khối cho mục đích ly trích polysaccharide thô thì môi trường BTH là môi trường thích hợp nhất dùng trong nuôi cấy chìm hệ sợi. TN2: Định lượng hợp chất polysaccharide thô trích từ các môi trường PSA có bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau. Kết quả trích ly lượng polysaccharide thô từ sinh khối nấm vân chi thu được trong 10 môi trường nuôi cấy lỏng được thể hiện ở Bảng 4.9 Bảng 4.9: Tỉ lệ hợp chất polysacharide thô trích từ sinh khối nấm vân chi thu được trong 10 môi trường nuôi cấy lỏng Môi trường Tỉ lệ polysaccharide thô (%) 1 11,16 ± 0,63 2 11,65 ± 0,12 3 12,38 ± 0,43 4 11,68 ± 1,87 5 14,02 ± 1,53 6 14,55 ± 0,68 7 12,96 ± 1,86 8 21,75 ± 3,35 9 15,05 ± 2,62 10 11,16 ± 0,44 54 11,1611,65 12,3811,68 14,0214,55 12,96 21,75 15,05 11,16 0 5 10 15 20 25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Môi trường % p ol ys ac ch ar id e th ô Biểu đồ 4.8: Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối hệ sợi nấm vân chi thu được trên 10 môi trường lỏng Trên sơ đồ biểu diễn, dễ dàng nhận thấy MT8 có tỉ lệ polysaccharide thô cao nhất, cao hơn môi trường đối chứng 1,95 lần, còn các môi trường còn lại tỉ lệ polysaccharide thô chiết được không sai khác hay mức độ sai khác không đáng kể. Trên môi trường PS có bổ sung nước chiết bắp với các nồng độ khác nhau cho tỉ lệ chiết không có khác biệt nhau, nhưng lượng nước chiết bắp bổ sung càng nhiều thì tỉ lệ polysaccharide thô chiết được càng cao. Trên môi trường có bổ sung nước giá, tỉ lệ polysaccharide thô thu được cao nhất là trong môi trường PS có bổ sung 15%, tuy nhiên tỉ lệ này không có sự sai khác so với nồng độ 10% nhưng sai khác với nồng độ 5%, vậy ở mức bổ sung 15% nước chiết giá cho tỉ lệ polysaccharide thô cao nhất và tỉ lệ không tăng nữa khi bổ sung nồng độ cao hơn. Môi trường PS bổ sung nước dừa với các nồng độ khác nhau có sự sai khác từng đôi một. Lượng polysaccharide thô cao nhất thu được từ sinh khối MT8. Trong khi MT10 (môi trường đối chứng), tuy có lượng sinh khối tạo ra cao nhưng tỉ lệ polysaccharide thô ly trích lại không cao hơn những công thức khác. Nếu tính ra khối lượng polysacchride thô thu được trong 1 lít môi trường nuôi cấy theo công thức: sinh khối ngày thứ 15 x tỉ lệ trích x (1000ml/50ml), thì lượng polysaccharide thô thu nhận được thể hiện trong Bảng 4.10 55 Bảng 4.10: Khối lượng polysaccharide thô trích được từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường Môi trường Khối lượng polysaccharide thô (mg/l) 1 353 2 530 3 602 4 461 5 574 6 603 7 882 8 1014 9 689 10 965 353 530 602 461 574 603 882 1014 689 965 0 200 400 600 800 1000 1200 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Môi trường po ly sa cc ha rid e th ô (m g/ l) Biểu đồ 4.9: Biểu diễn khối lượng polysaccharide thô trích được từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường Qua bảng phân tích, ta nhận thấy MT1, MT2, MT3 có sự gia tăng khối lượng polysacharide thô tỉ lệ thuận với nồng độ nước chiết bắp bổ sung. MT4, MT5, MT6 cũng có sự gia tăng khối lượng polysaccharide tỉ lệ thuận với nồng độ nước chiết bắp 56 bổ sung nhưng sự gia tăng này không đáng kể, do vậy nồng độ bổ sung 15% nước chiết giá được coi là tối ưu đối với các môi trường có bổ sung nước chiết giá dùng trong nuôi cấy lấy sinh khối ly trích hợp chất polysaccharide thô. Ở các môi trường có bổ sung nước dừa (MT7, MT8, MT9), có sự gia tăng khối lượng polysaccharide thô từ MT7 sang MT8 nhưng ở MT9 khối lượng có sự suy giảm, vậy môi trường có nồng độ bổ sung 10% nước dừa (MT8) là môi trường tối ưu cho khối lượng polysaccharide thô cao nhất (1014mg/l), cao hơn môi trường đối chứng – MT10 (965mg/l). Tuy lượng polysaccharide thô thu nhận từ MT8 cao hơn MT10 không nhiều, nhưng so về giá thành để tạo 1lít MT8 và 1lít MT10 thì MT8 là môi trường tốt nhất, thích hợp nhất được sử dụng với mục đích lấy hợp chất polysaccharide làm chất chống ung thư. TN3: Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trích Kết quả trích ly hợp chất polysaccharide thô từ quả thể và hệ sợi nấm vân chi được trình bày ở Bảng 4.10 Bảng 4.11: Tỉ lệ polysaccharide thô chiết được từ các nguồn nguyên liệu khác nhau (%) QUẢ THỂ HỆ SỢI Lần1 7,36 11,38 Lần 2 7,92 10,65 Lần 3 7,78 11,44 Tỉ lệ TB (%) 7,69 11,16 7,69 11,16 0 2 4 6 8 10 12 Qthể Hsợi Nguyên liệu % po ly sa cc ha rid e th ô Biểu đồ 4.10: Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô chiết được từ hai nguồn nguyên liệu khác nhau 57 Tỉ lệ polysaccharide thô chiết được từ quả thể nấm thấp hơn rất nhiều so với tỉ lệ từ hệ sợi. Do quả thể có vách tế bào cứng rắn và dày hơn, mức độ chia nhỏ nguyên liệu thấp hơn hệ sợi nên quá trình chiết xảy ra chậm và mức độ lôi kéo các chất chiết ra dung môi thấp do vậy tỉ lệ polysaccharide thô thu được từ quả thể thấp hơn hệ sợi. 58 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Nấm vân chi có tên khoa học là Trametes versicolor, là giống mới có nguồn gốc từ Trung Quốc. Môi trường nhân giống cấp một thích hợp: Môi trường PSA + 10% nước dừa pH thích hợp : 5,5 Nhiệt độ thích hợp cho hệ sợi tăng trưởng tốt: 30oC ± 2oC Môi trường nhân giống cấp hai thích hợp: Môi trường hạt gồm: Lúa 90%, Mùn cưa 5%, Cám bắp 5%. Môi trường tạo sinh khối tốt nhất là môi trường BTH (nước chiết khoai tây và muối khoáng). Môi trường nuôi cấy cho tỉ lệ hợp polysaccharide thô cao nhất là môi trường PSA + Nước dừa 10%. Vậy nuôi cấy với mục đích lấy polysaccharide làm dược phẩm hổ trợ trong điều trị ung thư thì môi trường PSA + Nước dừa 10% là môi trường thích hợp. Môi trường tạo quả thể thích hợp: Môi trường Mùn cưa + Vôi bột 0,25% + Cám gạo 10%. 5.2. Đề nghị Khảo sát nhiệt độ, ẩm độ thích hợp sau khi hệ sợi lan đầy bịch từ đó hoàn thiện quy trình nuôi trồng nấm vân chi đen Trametes versicolor, thuần hoá giống cho phù hợp với điều kiện tại TpHCM, ứng dụng trong sản xuất lớn. Để tiếp tục theo dõi lượng sinh khối và tỉ lệ polysaccharide chiết từu hệ sợi vân chi trên môi trường lỏng, cần thực hiện bổ sung thêm vài nồng độ nước chiết bắp cao hơn. Thực hiện giai đoạn sau ly trích hợp chất thô, thử nghiệm các phương pháp chiết xuất để tinh sạch hợp chất mong muốn. Thử nghiệm các chất có dược tính trích từ nấm trên các mẫu động vật bệnh in vitro. 59 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Vũ Văn Chuyên, 1970. Thực vật học, tập 1. Nhà xuất bản Y học và Thể dục thể thao, Hà Nội. 2. Nguyễn Lân Dũng, 2002. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1, tái bản lần thứ nhất. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Nguyễn Lân Dũng, 2002. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập2, tái bản lần thứ nhất. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 4. Phùng Võ Cẩm Hồng, 2003. Kỹ thuật phân tích, phòng phân tích hoá lý, Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh. 5. Trần Hùng và CSV, 2004. Giáo trình Phương pháp nghiên cứu dược liệu, bộ môn dược liệu, Trương đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh. 6. Nguyễn Ngọc Kiểng, 2000. Giáo trình Toán-Thống kê sinh vât, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 7. Trịnh Tam Kiệt, Võ Văn Chi, Trần Đình Nghĩa và Đặng Thị Sy, 1982. Thực tập phân loại học thực vật- thực vật bậc thấp. Nhà xuất bản Đại học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 8. Lê Văn Liễu, 1977. Một số nấm ăn được và nấm độc. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 9. Trần Thị Ngọc Mỹ, 2004. Khảo sát khả năng nuôi trồng và định tính các hoạt chất có dược tính ở nấm vân chi (Trametes ochracea). Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, TP Hồ Chí Minh. 10. Nguyễn Phước Nhuận và CSV, 2001. Giáo trình Sinh hóa học, Đại học Nông lâm, TP Hồ Chí Minh. 11. Lê Xuân Thám, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điểm hấp thụ khoáng Nấm Linh Chi Ganoderma lucidium (Leyss. exFr) Karst bằng phân tích hạt nhân, đánh dấu đồng vị và kỹ thuật liên hợp. Luận án Phó tiến sĩ khoa học Sinh học, Hà Nội. 12. Lê Xuân Thám, 1996. Nấm linh chi Ganoderma - Nguồn dược liệu quý ở Việt Nam. Nhà xuất bản Mũi Cà Mau 13. Lê Xuân Thám, 1999. Nấm trong công nghệ và chuyển hoá môi trường, Tập 1, Nấm hầu thủ Hericium erinaceum. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, TpHCM. 60 14. Lê Xuân Thám, Trần Hữu Độ, Tamikazu Kume, 1999. Bổ sung vào nhóm nấm chống ung thư ở Việt Nam: Nấm vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) Pilát. Tạp chí dược học, số 2: tr 13-15. 15. Nguyễn Xuân Thắng, 2004. Hoá sinh học. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 16. Phạm Thị Thanh Thảo, 2003. Nghiên cứu chế biến nước uống từ nấm Linh chi. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sư công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh. 17. Dương Đức Tiến , Võ Văn Chi, 1978. Phân loại học thực vật - Thực vật bậc thấp. Nhã xuất bản đại học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 18. Hồ Sĩ Tráng, 2004. Cơ sơ hoá học gỗ và cellulose, Tập 2. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 19. Cổ Đức Trọng, 2002. Nấm Vân chi một vị thuốc quý cần chú ý. Tạp chí thuốc và Sức khoẻ, số 214: tr 14-15, Nhà xuất bản Khoa học TP Hồ Chí Minh. 20. Lê Thị Tuyết Vân, 2004. Tiêu chuẩn hoá nấm Vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) Pilátt, Coriolus vesicolor (L.: Fr) Quél. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh và từ Internet 21. R.L Gilbertson, L.Ryvanden. North American polypores, vol 2. Meg asporaporia- Wrightoporia, Norway- Oslo-Fungiflora 22. 23. versicolor.html 24. Physical characteristics of Coriolus versicolor 25. 26. 27. Parris M. Kidd, Ph.D. the use of mushroom glucan and proteoglycan in cancer treatment 28. Yang QY. Yunzhin polysaccharide PSP and the general aspects of its reseach. Dept of Biol of Shanghai Teachers University 61 29. Medicinal Mushroom 30. Sinthujah Jeganathan, 2003. Potential of fungi used in Chinese remedies for cancer treament 31. Tom volk’s Fungus of the monht for august 1997 Tomvolkfungi.net 32. Beta-glucan: Adjunctive nutritional Support for health 33. Trametes versicolor extract 34. Barrie Cassileth, K.Simon Yung. Coriolus versicolor