Khóa luận Khảo sát sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trường cám gạo, rỉ đường và một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm

công nghiệp. các chế phẩm này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi, trong chăn nuôi ezyme đƣợc dùng để sơ chế thức ăn, phân hủy các hợp chất phức tạp, làm tăng khả năng tiêu hóa cho gia súc. Gần đây, hãng dƣợc Biocodex-Montronge (Pháp) cho ra sản phẩm men tiêu hóa có tên Bioflor 250 có chứa 250mg tế bào nấm men S. boulardii dùng để phòng trị tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa. 2.9.2. Ở trong nƣớc Công tác nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi ở nƣớc ta có thể nói đƣợc bắt đầu từ 1960 trở lại đây. Bao gồm các lĩnh vực sản xuất sinh khối tế bào, lên men thức ăn bột đƣờng và sản xuất chế phẩm sinh học. Năm 1975, Trần Đức Trân và Nguyễn Công Xuân đã sử dụng sinh khối nấm men đƣợc sản xuất từ rỉ đƣờng của nhà máy đƣờng Vạn Điểm để chăn nuôi heo với tỷ lệ bổ sung 3 – 4% trong khẩu phần của heo 2 – 5 tháng tuổi đạt kết quả tốt (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Để tạo ra giống nấm men vừa có khả năng đƣờng hóa cao vừa có khả năng tạo sinh khối lớn, Viện Kỹ Thuật Sinh Học thuộc Trung Tâm Khoa Học và Công Nghệ Quốc Gia Việt Nam đã nghiên cứu cấy chuyển gen amylase đƣợc tách từ chủng Endomycopsis fibuligera và gây biến nạp cho Saccharomyces cerevisiae làm cho nó có 2 đặc tính đƣờng hóa cao và sinh tổng hợp protein cao dùng trong chế biến thức ăn (Trƣơng Nam Hải, 1994, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Hiện nay, các nhà chăn nuôi khá quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm sinh học bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho gia súc, gia cầm. Đặc trƣng của các chế phẩm sinh học này là sự kết hợp của nhiều chủng loại vi sinh vật có ích nhƣ 20 Bacillus. spp, Lactobacillus. spp, Saccharomyces. spp, các enzyme amylase, protease… 21 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03 đến tháng 08 năm 2007. 3.1.2. Địa điểm Phòng thực tập vi sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Mẫu khảo sát Chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho. 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ sấy, nồi hấp khử trùng autoclave, tủ lạnh, kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu, máy li tâm, máy sục khí, micropipette… Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đũa khuấy, bình tam giác, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm, lame, lamelle, giấy đo pH… 3.2.3. Hóa chất Hóa chất dùng trong phân lập và nuôi cấy nấm men nhƣ cồn 960, nƣớc cất, agar, KH2PO4, MgSO4, K2HPO4, (NH4)2PO4. 3.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng phân lập và giữ giống nấm men là môi trƣờng Sabouraud. 22 Môi trƣờng khảo sát nuôi cấy là môi trƣờng cám gạo, môi trƣờng rỉ đƣờng mía, môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu. 3.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho. Khảo sát sự phát triển của các chủng đƣợc phân lập từ 4 mẫu trên trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B. Khảo sát sự phát triển của nấm men trong các loại môi trƣờng nuôi cấy khác nhau. Khảo sát thời gian thu nhận sinh khối nấm men trong các loại môi trƣờng trên. Khảo sát sự phối hợp nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trƣờng cám gạo và môi trƣờng rỉ đƣờng mía. 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Phân lập nấm men 3.4.1.1. Mẫu chế phẩm sinh học và men bánh mì Pha mẫu với 1 ít nƣớc muối sinh lý 90/00 rồi đem cấy ria trên mặt thạch Sabouraud. Để ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 – 48 giờ. Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, đƣờng kính khoảng 2 – 3 mm, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái. 3.4.1.2. Mẫu đu đủ và nho Chọn những chỗ bị dập, hơi có mùi rƣợu rồi cấy ria trên mặt thạch Sabourand. Để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ. Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái. 23 Sau khi xác định đƣợc đó là chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces thì đem cấy chuyền sang môi trƣờng thạch nghiêng Sabouraud để tăng sinh. 3.4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập đƣợc trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B 3.4.2.1. Mục đích Từ các chủng của 4 nguồn mẫu trên, chọn chủng có khả năng sinh trƣởng và phát triển mạnh để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.4.2.2. Thông số cố định Môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng mật rỉ đƣờng mía 60B. Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 100ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Thời gian nuôi cấy: 36 giờ. Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí. 3.4.2.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. 3.4.2.4. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí 1 yếu tố, lặp lại 2 lần với 4 nghiệm thức. Mẫu Chế phẩm Men bánh mì Đu đủ Nho Lần 1 Lần 2 24 3.4.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces Từ kết quả thí nghiệm 1, chúng tôi chọn 2 chủng có khả năng sinh trƣởng tốt nhất làm đối tƣợng nghiên cứu cho thí nghiệm 2. 3.4.3.1. Mục đích Tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch thích hợp cho số lƣợng tế bào nấm men lớn nhất. 3.4.3.2. Thông số cố định Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 300ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí. 3.4.3.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu, đơn vị tính tb/ml. Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1g chế phẩm sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud, đơn vị tính là cfu/g. Phƣơng pháp đếm tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu chỉ cho biết tổng số tế bào trong dịch nuôi cấy (bao gồm cả số tế bào sống và tế bào chết). Với mục đích nuôi cấy nấm men dùng làm chế phẩm sinh học nên yêu cầu số lƣợng tế bào sống trong chế phẩm phải cao. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa cho phép xác định số lƣợng tế bào nấm men sống trong chế phẩm, từ đó ta có thể đánh giá các yếu tố ảnh hƣởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm. 25 3.4.3.4. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch, lặp lại 3 lần. Yếu tố môi trƣờng nuôi cấy có 2 mức độ: T1:200 ml môi trƣờng rỉ đƣờng 60B + 100 ml nƣớc chiết giá đậu. T2: 200 ml môi trƣờng cám gạo + 100 ml nƣớc chiết giá đậu. Yếu tố thời gian thu hoạch có 3 mức độ: 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ. 3.4.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm Sau khi tiến hành xong thí nghiệm 2,chúng tôi thu hoạch sinh khối tế bào nấm men và sản xuất thành chế phẩm. Thử nghiệm trộn sinh khối nấm men với chất nền là cám gạo và bột mì, trong đó chia thành 3 phần: Phần 1: không bổ sung vitamin C. Phần 2: bổ sung 50/000 vitamin C. Phần 3: bổ sung 10/00 vitamin C. Sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng, tiến hành đếm số lƣợng tế bào nấm men còn sống trong chế phẩm bằng phƣơng pháp khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud. 3.4.4.1. Mục đích Xác định đƣợc thời gian thu hoạch và điều kiện bảo quản thích hợp để nấm men có khả năng sống lâu nhất trong chế phẩm. 3.4.4.2. Thông số cố định Thời gian bảo quản: 22 ngày. Nhiệt độ bảo quản: nhiệt độ phòng. Số lƣợng tế bào nấm men ở mỗi mẫu: 109 tb/g. 26 3.4.4.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1 g chế phẩm bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa, đơn vị tính là cfu/g. 3.4.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm Các mẫu lấy từ thí nghiệm 3 và chỉ tiêu theo dõi cũng là số lƣợng tế bào sống trong 1 g chế phẩm (đơn vị tính là cfu/g), nhƣng lúc này không xét đến ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C). 3.4.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung S. cerevisiae từ ống giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng Sabouraud lỏng trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, B. subtilis từ ống giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng TSB (Tryptone Soya Broth) trong 24 giờ ở 370C rồi cấy vào các bình nuôi cấy theo tỷ lệ sau: Bình 1: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0B). Bình 2: 1 ml dịch S. cerevisiae + 1 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+1B). Bình 3: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0,1 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0,1B). Bình 4: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0,01 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0,01B). 3.4.6.1. Mục đích Tìm hiểu ảnh hƣởng của B. subtilis lên sự phát triển của S. cerevisiae. 3.4.6.2. Thông số cố định Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 200 ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Thời gian nuôi cấy: 48 giờ. 27 Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí. 3.4.6.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Đơn vị tính: tb/ml. Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1 g chế phẩm sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud. Đơn vị tính: cfu/g. 3.4.6.4. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố, lặp lại 2 lần. Yếu tố môi trƣờng nuôi cấy có 2 mức độ: Môi trƣờng rỉ đƣờng: 150 ml môi trƣờng rỉ đƣờng 60B + 50 ml nƣớc chiết giá đậu. Môi trƣờng cám gạo: 150 ml môi trƣờng cám gạo + 50 ml nƣớc chiết giá đậu. Yếu tố nồng độ B. subtilis có 4 mức độ: 0, 100, 10-1, 10-2. 3.4.7. Phƣơng pháp đếm số tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu Lấy 1ml dịch nấm men nuôi cấy pha loãng với 9ml nƣớc muối sinh lý 90/00, ta đƣợc nồng độ 10-1, rồi pha tiếp đến 10-2, 10-3… chọn nồng độ thích hợp cho việc đếm đƣợc dễ dàng và có độ chính xác cao. Sau đó nhỏ lên buồng đếm hồng cầu và đếm dƣới kính hiển vi ở vật kính 40X. Kết quả đƣợc tính theo công thức: Số tế bào nấm men/1 ml = a*4000*1000*H Trong đó: A: số tế bào trong 1 ô nhỏ H: hệ số pha loãng = 1/độ pha loãng 4000 = hệ số chuyển thành 1 mm3 = 1/thể tích ô nhỏ = 1/4000 mm 1000 = hệ số chuyển mm3 thành ml (1 ml = 1000 m3) 28 3.4.8. Phƣơng pháp đếm số tế bào sống ( số khuẩn lạc trên đĩa thạch) Tế bào vi sinh vật sống là tế bào có khả năng sinh trƣởng để tạo thành một quần thể. Trên bề mặt môi trƣờng đặc, quần thể này tạo những đám có hình dạng, màu sắc riêng biệt đƣợc gọi là khuẩn lạc. Từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch suy ra số tế bào sống có trong mẫu đã cấy trên mặt thạch. Ở đây đơn vị tính là cfu/ml, nghĩa là số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 ml đơn vị thể tích. Cách tiến hành Pha loãng mẫu: lấy 1 g chế phẩm pha loãng với 9 ml nƣớc muối sinh lý 90/00 ta đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1, tiếp tục hút 1 ml dịch thể trên pha với 9 ml nƣớc muối sinh lý 90/00 ta đƣợc nồng độ pha loãng 10 -2 và làm nhƣ thế khi có đƣợc nồng độ pha loãng thích hợp. Để tách rời các tế bào, cần pha loãng mẫu kèm theo lắc mạnh dịch đã pha loãng. Cấy trải dịch pha loãng trên đĩa thạch Sabouraud: ta sẽ cấy mỗi mẫu ở 3 nồng độ pha loãng và ứng với mỗi độ pha loãng chuẩn bị 2 đĩa thạch. Sau khi lắc lại dịch pha loãng, dùng pipette vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu nhỏ lên giữa đĩa thạch. Dùng que cấy trang vô trùng gạt giọt dịch trải đều khắp cho tới khi mặt thạch khô ráo. Sau đó đem để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ và đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa. Chú ý cần phân biệt các khuẩn lạc lạ hình thành do tạp nhiễm và không tính chúng. Tính kết quả cfu/ml(g) = a*1/K*1/V A: số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa cấy có cùng độ pha loãng. V: thể tích dịch pha loãng đƣợc cấy trên mặt đĩa thạch. K: độ pha loãng của dịch cấy. Lƣu ý: xem xét số khuẩn lạc ở 3 nồng độ pha loãng kế tiếp nhau(ví dụ 10-5, 10 -6 , 10 -7). Khi nồng độ pha loãng giảm 10 lần, số khuẩn lạc trên đĩa cũng giảm xấp xỉ 10 lần và trên 2 đĩa có cùng nồng độ pha loãng chỉ chênh lệch nhau khoảng 10%. 29 điều đó chứng tỏ việc tách rời các tế bào, pha loãng cũng nhƣ dàn đều chúng trên mặt thạch diễn ra hoàn hảo và số liệu thu đƣợc là đáng tin cậy. 30 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự sinh trƣởng của các chủng đã phân lập trong môi trƣờng rỉ đƣờng 6 0 B Chúng tôi đem 4 chủng nấm men phân lập đƣợc từ 4 nguồn mẫu khác nhau nuôi trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B với thời gian nuôi cấy là 36 giờ nhằm tìm chủng có khả năng phát triển tốt nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo đƣợc thuận lợi hơn. Số liệu thu đƣợc ban đầu có đơn vị tính là tb/ml (phụ lục Bảng 7.1) sẽ chuyển đổi về giá trị logarit để xử lý thống kê. Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) Mẫu Chế phẩm Men bánh mì Đu đủ Nho Lần 1 8,450 8,204 8,459 8,566 Lần 2 8,332 8,061 8,130 8,415 Trung bình 8,391 8,133 8,295 8,491 Qua Bảng 4.1 cho thấy số lƣợng tế bào nấm men thuộc các chủng phân lập giảm dần theo thứ tự sau: Nho: 8,491 Chế phẩm: 8,391 Đu đủ: 8,295 Men bánh mì: 8,133 Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.1). Các loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cũng đồng hóa vật chất nhƣ nhau. Có thể nói, các loài khác nhau (dù là một giống) đồng hóa các nguồn 31 dinh dƣỡng là khác nhau nên tốc độ sinh trƣởng của chúng trên cùng một điều kiện nuôi cấy là khác nhau. Do đó, tuy các chủng phân lập từ 4 nguồn mẫu trên đều thuộc giống Saccharomyces nhƣng khi nuôi cấy trong cùng điều kiện môi trƣờng rỉ đƣờng 60B thì số lƣợng tế bào của chúng khác nhau là hợp lý. Dựa theo số liệu ở Bảng 4.1, chúng tôi chọn 2 chủng đƣợc phân lập từ nho và chế phẩm làm đối tƣợng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Sau khi nhuộm xem hình thái và thử nghiệm các phản ứng lên men đƣờng, chúng tôi xác định đƣợc chủng nấm men phân lập từ dịch quả nho thuộc loài S. cerevisiae, chủng phân lập từ chế phẩm sinh học (tên thƣơng mại là Ultra Levure) thuộc loài S. boulardii. Hình 4.1: Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học Ultra Levure Hình 4.2: Phân lập nấm men từ dịch quả nho 32 Hình 4.3: Hình thái S. boulardii Hình 4.4: Hình thái S. cerevisiae 33 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces Sau khi khảo sát nuôi cấy 2 loài S. boulardii và S. cerevisiae trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B, môi trƣờng cám gạo ở 3 mức độ thời gian 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, chúng tôi thu nhận số liệu về số lƣợng tế bào nấm men trong mỗi nghiệm thức (phụ lục Bảng 7.2, 7.3, 7.4 và 7.5). Tiếp theo, chúng tôi xử lý thống kê trên số liệu logarit đƣợc chuyển đổi từ dạng số liệu nguyên ban đầu (đơn vị tính là tb/ml, cfu/g). 4.2.1. Saccharomyces boulardii Bảng 4.2a: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit). Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 8,427 8,505 8,394 8,453 8,536 8,385 Lần 2 8,443 8,491 8,533 8,362 8,398 8,293 Lần 3 8,282 8,411 8,445 8,394 8,447 8,470 Bảng 4.2b: giá trị trung bình của bảng 4.2a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Rỉ đƣờng 8,384 8,469 8,457 8,437 Cám gạo 8,403 8,460 8,383 8,415 Chung 8,394 8,465 8,420 Qua Bảng 4.2 cho thấy tổng số tế bào S. boulardii trong dịch nuôi cấy ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy, số lƣợng tế bào S. boulardii trên môi trƣờng rỉ đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo (8,437>8,415). Về thời gian thu hoạch, số lƣợng tế bào S. boulardii ở thời điểm 48 giờ cao hơn 60 giờ và 36 giờ (8,465>8,420>8,394). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. Nhìn chung, mối tƣơng quan cả hai yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch ảnh hƣởng lên số lƣợng tế bào nấm men không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.2). 34 Bảng 4.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 7,537 8,546 8,834 8,175 9,041 8,537 Lần 2 8,361 8,189 8,474 9,442 8,525 8,516 Lần 3 8,975 8,406 8,569 9,389 8,331 9,316 Bảng 4.3b: giá trị trung bình của bảng 4.3a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Rỉ đƣờng 8,291 8,380 8,626 8,432 Cám gạo 9,002 8,632 8,790 8,808 Chung 8,647 8,506 8,708 Qua Bảng 4.3b cho thấy số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy, số lƣợng tế bào S. boulardii sống trên môi trƣờng cám gạo cao hơn môi trƣờng rỉ đƣờng (8,808>8,432). Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05. Về thời gian thu hoạch, số lƣợng tế bào S. boulardii sống ở thời điểm 60 giờ cao hơn 36 giờ và 48 giờ (8,708>8,647>8,506). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. Nhìn chung, mối tƣơng quan giữa yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch ảnh hƣởng lên số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chế phẩm không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.3). Với phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa, chúng tôi không tiến hành đếm liền ngay khi thu hoạch mà chế phẩm đƣợc bảo quản sau 22 ngày mới đếm. Qua Bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm khi nuôi cấy trên môi trƣờng cám gạo cao hơn trên môi trƣờng rỉ đƣờng. Có khả năng là môi trƣờng cám gạo có thành phần dinh dƣỡng đầy đủ hơn môi trƣờng rỉ đƣờng, đặc biệt có chứa nhiều vitamin B, đáp ứng đƣợc nhu cầu hoạt động sinh lý của tế bào nấm men và làm tăng sức sống của chúng trong chế phẩm. Chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy nấm men với mục đích dùng làm chế phẩm sinh học nên yêu cầu số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm phải cao. Do đó, có 35 thể kết luận môi trƣờng cám gạo là môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy S. boulardii hơn môi trƣờng rỉ đƣờng. 4.2.2. Saccharomyces cerevisiae Bảng 4.4a: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 8,359 8,617 8,486 8,543 8,539 8,606 Lần 2 8,459 8,453 8,486 8,539 8,558 8,468 Lần 3 8,287 8,509 8,517 8,380 8,519 8,350 Bảng 4.4b: giá trị trung bình của bảng 4.4a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Rỉ đƣờng 8,368 8,526 8,496 8,463 Cám gạo 8,487 8,539 8,475 8,500 Chung 8,428 8,533 8,486 Qua Bảng 4.4b cho thấy tổng số tế bào S. cerevisiae trong dịch nuôi cấy ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy, số lƣợng tế bào S. cerevisiae trên môi trƣờng cám gạo cao hơn môi trƣờng rỉ đƣờng (8,5>8,463). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. Về thời gian thu hoạch, số lƣợng tế bào S. cerevisiae ở thời điểm 48 giờ cao hơn 60 giờ và 36 giờ (8,533>8,486>8,428). Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05. Nhìn chung, sự khác biệt về mối tƣơng quan giữa môi trƣờng và thời gian thu hoạch ảnh hƣởng lên tổng số tế bào S. cerevisiae trong dịch nuôi cấy không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.4). Từ kết quả số lƣợng tế bào S. cerevisiae thu hoạch vào thời điểm 48 giờ cao hơn thời điểm 60 giờ và 36 giờ ở Bảng 4.4 cho phép ta có thể kết luận thời gian thích hợp nhất để thu hoạch sinh khối tế bào nấm men là 48 giờ sau khi nuôi cấy. 36 Điều này cũng phù hợp với kết quả thí nghiệm của nhiều tác giả trƣớc (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996 và Lƣơng Thị Phƣơng Thảo, 2005). Số lƣợng tế bào nấm men tăng giảm theo qui luật, phù hợp với các giai đoạn sinh trƣởng của chúng. Trƣớc thời điểm 36 giờ nuôi cấy, nấm men trong giai đoạn thích nghi với môi trƣờng nên số lƣợng tế bào tăng không đáng kể. Từ 36 – 48 giờ là giai đoạn logarit, thời điểm số lƣợng tế bào nấm men tăng theo cấp số nhân và đạt giá trị cực đại ở khoảng 48 giờ. Trong khoảng thời gian số tế bào phát triển ào ạt, khi đó các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng không phải là vô tận, mà ngƣợc lại ngày một giảm đi, hơn nữa trong môi trƣờng xuất hiện và tích tụ các sản phẩm trao đổi chất không cần thiết đối với tế bào. Do đó, làm mất đi điều kiện thuận lợi cho sinh trƣởng của tế bào, chúng sẽ già cỗi, thoái hóa, cuối cùng xảy ra hiện tƣợng tự phân nên số lƣợng tế bào sẽ giảm. Bảng 4.5a: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 8,686 8,567 9,475 7,808 7,665 8,929 Lần 2 8,737 8,625 8,290 9,006 8,125 8,130 Lần 3 10,012 8,829 9,620 8,581 8,438 8,818 Bảng 4.5b: giá trị trung bình của bảng 4.5a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Rỉ đƣờng 9,145 8,674 9,128 8,982 Cám gạo 8,465 8,076 8,626 8,389 Chung 8,805 8,375 8,877 Qua Bảng 4.5b cho thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trên môi trƣờng rỉ đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo (8,982>8,389). Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05. Về thời gian thu hoạch, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống ở thời điểm 60 giờ cao hơn 36 giờ và 48 giờ (8,877>8,805>8,375). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. 37 Nhìn chung, sự khác biệt về mối tƣơng quan giữa yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.5). Chủng nấm men S. cerevisiae mà chúng tôi đem khảo sát đƣợc phân lập từ dịch quả nho nên có thể nó thích nghi và sinh trƣởng trên môi trƣờng rỉ đƣờng tốt hơn trên môi trƣờng cám gạo, môi trƣờng rỉ đƣờng có hàm lƣợng đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo. Do đó, chúng tôi có thể kết luận nuôi cấy S. cerevisiae trên môi trƣờng rỉ đƣờng thích hợp hơn môi trƣờng cám gạo. 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên sức sống của nấm men trong chế phẩm Việc thu hoạch và bảo quản chế phẩm ảnh hƣởng nhiều đến sức sống của nấm men trong chế phẩm. Đến thời điểm thu hoạch sinh khối tế bào nấm men, chúng tôi tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy để lấy sinh khối và đem trộn sinh khối với 2 loại chất nền là cám gạo và bột mì. Chất nền đƣợc xử lý trƣớc bằng việc sấy khô ở 110 0C/45 phút, sau đó chia làm 3 phần: Phần 1: để nguyên, không bổ sung vitamin C. Phần 2: bổ sung vitamin C với hàm lƣợng là 50/000. Phần 3: bổ sung vitamin C với hàm lƣợng là 10/00. Sau khi trộn sinh khối nấm men với chất nền, chúng tôi làm khô chế phẩm bằng cách sấy ở 380C/10 giờ. Đóng gói và để ở nhiệt độ phòng trong 22 ngày rồi tiến hành kiểm tra số lƣợng tế bào nấm men sống theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa. Số liệu thu đƣợc ban đầu tính bằng đơn vị cfu/g (phụ lục Bảng 7.6, 7.7) sẽ đƣợc qui về giá trị logarit để xử lý thống kê. 38 4.3.1. Saccharomyces boulardii Bảng 4.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) Chất nền Cám Mì Hàm lƣợng vitamin 0 50/000 1 0 /00 0 5 0 /000 1 0 /00 Lần 1 8,081 8,212 8,311 8,885 8,338 8,716 Lần 2 8,503 8,388 8,420 9,022 8,339 8,853 Lần 3 8,535 8,610 8,350 9,245 9,141 9,812 Bảng 4.6b: giá trị trung bình của bảng 4.6a 0 5 0 /000 1 0 /00 Chung Cám gạo 8,373 8,403 8,360 8,379 Bột mì 9,051 8,606 9,127 8,928 Chung 8,712 8,505 8,744 Qua Bảng 4.6b cho thấy số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về chất nền, số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong bột mì nhiều hơn trong cám (8,928>8,379). Về hàm lƣợng vitamin C, số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chất nền bổ sung vitamin C với hàm lƣợng 10/00 nhiều hơn so với hàm lƣợng 50/000 và không bổ sung vitamin C (8,744>8,712>8,505). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.6). 4.3.2. Saccharomyces cerevisiae Bảng 4.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) Chất nền Cám Mì Hàm lƣợng vitamin 0 50/000 1 0 /00 0 5 0 /000 1 0 /00 Lần 1 8,269 8,684 8,359 9,150 8,423 8,558 Lần 2 8,352 9,999 9,019 8,771 8,635 8,370 Lần 3 9,572 8,919 9,325 9,242 9,719 10,155 Bảng 4.7b: giá trị trung bình của bảng 4.7a 0 5 0 /000 1 0 /00 Chung Cám gạo 8,731 9,201 8,901 8,944 Bột mì 9,054 8,926 9,028 9,003 Chung 8,893 9,064 8,965 39 Qua Bảng 4.7b cho thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về chất nền, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong bột mì nhiều hơn trong cám (9,003>8,944). Về hàm lƣợng vitamin C, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chất nền có bổ sung vitamin C với hàm lƣợng 50/000 nhiều hơn so với hàm lƣợng 10/00 và không bổ sung vitamin C (9,064>8,965>8,893). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.7). Về cơ sở lý thuyết, việc bổ sung vitamin C vào chất nền có ảnh hƣởng lên sức sống của tế bào nấm men trong chế phẩm hay không thì vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu rõ. Có khả năng do thời gian khảo sát chƣa đủ lâu (sau 22 ngày bảo quản) nên kết quả trên cũng chƣa phản ánh rõ bản chất vấn đề. 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm 4.4.1. Saccharomyces boulardii Bảng 4.8b: giá trị trung bình của bảng 4.8a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Đƣờng-cám 8,264 8,096 8,341 8,234 Cám-cám 8,407 8,341 8,500 8,416 Đƣờng-mì 7,897 8,206 8,761 8,288 Cám-mì 9,345 8,653 9,020 9,006 Chung 8,478 8,324 8,656 Qua Bảng 4.8b cho thấy số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy và chất nền, số lƣợng tế bào S. boulardii sống giảm dần theo thứ tự sau: Môi trƣờng cám gạo và chất nền bột mì: 9,006 Môi trƣờng cám gạo và chất nền cám gạo: 8,416 Môi trƣờng rỉ đƣờng và chất nền bột mì: 8,288 Môi trƣờng rỉ đƣờng và chất nền cám gạo: 8,234 Xét về thời gian thu hoạch, số lƣợng tế bào S. boulardii sống thu hoạch ở thời điểm 60 giờ cao hơn 36 giờ và 48 giờ (8,656>8,478>8,324). 40 Xét về mặt thống kê, sự khác biệt của 2 yếu tố môi trƣờng nuôi cấy - chất nền và thời gian thu hoạch đều có ý nghĩa với P<0,05. Nhìn chung, mối tƣơng quan giữa 2 yếu tố này lên số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chế phẩm thì sự khác biệt là có ý nghĩa về mặt thống kê với P<0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.8). Về môi trƣờng nuôi cấy, thí nghiệm này cho kết quả phù hợp với thí nghiệm 2, môi trƣờng cám gạo thích hợp để nuôi cấy S. boulardii hơn môi trƣờng rỉ đƣờng. Về thời gian thu hoạch, qua Bảng 4.8 chúng tôi có thể kết luận thu hoạch S. boulardii vào thời điểm 60 giờ sau khi nuôi cấy sẽ cho kết quả là số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm nhiều hơn ở 36 giờ và 48 giờ. 41 Bảng 4.8: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) MT – CN Đƣờng – Cám Cám – Cám Đƣờng – Mì Cám – Mì Thời gian 36 Giờ 48 Giờ 60 Giờ 36 Giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 7,619 7,403 8,209 8,302 7,834 8,681 6,380 8,380 8,887 8,491 8,920 8,932 Lần 2 8,412 8,397 8,328 8,505 8,567 8,381 8,380 7,674 8,048 9,445 8,508 8,660 Lần 3 8,762 8,488 8,485 8,414 8,623 8,437 8,930 8,564 9,349 10,098 8,532 9,468 Trung bình 8,264 8,096 8,341 8,407 8,341 8,500 7,897 8,206 8,761 9,345 8,653 9,020 Bảng 4.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) MT – CN Đƣờng – Cám Cám – Cám Đƣờng – Mì Cám – Mì Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 8,902 8,097 8,868 7,732 7,487 7,689 8,606 8,628 9,302 7,626 8,242 9,014 Lần 2 9,538 8,720 8,470 10,255 7,993 7,989 8,903 8,508 8,447 8,850 7,486 8,569 Lần 3 10,014 8,909 9,120 8,605 8,393 8,408 10,340 9,729 9,929 9,785 8,428 9,362 Trung bình 9,485 8,575 8,819 8,864 7,958 8,029 9,283 8,955 9,226 8,754 8,052 8,982 42 4.4.2. Saccharomyces cerevisiae Bảng 4.9b: giá trị trung bình của bảng 4.9a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Đƣờng-cám 9,485 8,575 8,819 8,960 Cám-cám 8,864 7,958 8,029 8,284 Đƣờng-mì 9,283 8,955 9,226 9,155 Cám-mì 8,754 8,052 8,982 8,596 Chung 9,097 8,385 8,764 Qua Bảng 4.9b cho thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy và chất nền, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống giảm dần theo thứ tự sau: Môi trƣờng rỉ đƣờng và chất nền bột mì: 9,155 Môi trƣờng rỉ đƣờng và chất nền cám gạo: 8,960 Môi trƣờng cám gạo và chất nền bột mì: 8,596 Môi trƣờng cám gạo và chất nền cám gạo: 8,284 Xét về thời gian, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống thu hoạch ở thời điểm 36 giờ cao hơn 60 giờ và 48 giờ (9,097>8,764>8,385). Xét về mặt thống kê, sự khác biệt của từng yếu tố môi trƣờng nuôi cấy - chất nền và thời gian thu hoạch lên số lƣợng tế bào S. cerevisiae đều có ý nghĩa với P<0,05. Nhìn chung, sự khác biệt về mối tƣơng quan giữa môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian lên sức sống của tế bào nấm men không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.9). Ở thí nghiệm 2, theo phƣơng pháp đếm số tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu chúng tôi nhận đƣợc kết quả vào thời điểm 48 giờ sau khi nuôi cấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae cao hơn 60 giờ và 36 giờ. Nhƣng ở thí nghiệm này, chúng tôi kiểm tra số lƣợng tế bào sống trong chế phẩm (sau 22 ngày bảo quản) theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa cho thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae thu hoạch vào thời điểm 36 giờ sau khi nuôi cấy nhiều hơn 60 giờ và 48 giờ. 43 Nhƣ chúng tôi đã nói yêu cầu đặt ra khi nuôi cấy nấm men làm chế phẩm sinh học là số tế bào sống trong chế phẩm phải cao nên chúng tôi có thể kết luận thời điểm thu hoạch S. cerevisiae thích hợp nhất là 36 giờ sau khi nuôi cấy. Về môi trƣờng nuôi cấy, kết quả thí nghiệm này phù hợp với thí nghiệm 2, môi trƣờng rỉ đƣờng thích hợp nuôi cấy S. cerevisiae hơn môi trƣờng cám gạo. 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung Theo thông tin chúng tôi đƣợc biết, khi sản xuất chế phẩm sinh học ngƣời ta thƣờng nuôi cấy riêng từng loại vi sinh vật, sau đó mới phối trộn để cho ra thành phẩm. Việc đó mất khá nhiều công sức, thời gian, chi phí cũng cao nên chúng tôi quyết định khảo sát việc nuôi cấy chung vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm men Saccharomyces cerevisiae trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B và môi trƣờng cám gạo. Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố (môi trƣờng nuôi cấy và nồng độ vi khuẩn B. subtilis), thời gian nuôi cấy là 48 giờ. Số liệu ban đầu thu đƣợc tính theo đơn vị tb/ml, cfu/g (phụ lục Bảng 7.8 và 7.9) sẽ chuyển đổi theo giá trị logarit để xử lý thống kê. Bảng 4.10a: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Mẫu 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Lần 1 8,583 8,439 8,599 8,667 8,435 8,011 8,342 8,470 Lần 2 8,466 8,550 8,376 8,322 8,357 8,366 8,477 8,455 Bảng 4.10b: giá trị trung bình của bảng 4.10a 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Chung Rỉ đƣờng 8,525 8,495 8,488 8,495 8,493 Cám gạo 8,396 8,189 8,410 8,463 8,354 Chung 8,461 8,342 8,449 8,479 Qua Bảng 4.10b cho thấy tổng số tế bào S. cerevisiae trong dịch nuôi cấy ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy, số lƣợng tế bào S. cerevisiae 44 trong môi trƣờng rỉ đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo (8,493>8,354). Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05. Về nồng độ vi khuẩn B. subtilis, số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong dịch nuôi cấy có bổ sung B. subtilis giảm dần theo thứ tự sau: Nồng độ 10-2 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 8,479. Nồng độ 10-1 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 8,449. Nồng độ 100 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 8,342. Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. Nhìn chung, sự khác biệt về mối tƣơng quan giữa môi trƣờng và nồng độ B. subtilis lên tổng số tế bào S. cerevisiae trong dịch nuôi cấy không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.10). Bảng 4.11: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Mẫu 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Lần 1 8,942 9,705 9,027 9,108 8,081 8,883 8,685 8,723 Lần 2 9,224 9,820 9,151 8,932 8,633 9,219 8,552 8,874 Bảng 4.11b: giá trị trung bình của bảng 4.11a 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Chung Rỉ đƣờng 9,083 9,763 9,089 9,020 9,291 Cám gạo 8,357 9,051 8,619 8,799 8,823 Chung 8,720 9,407 8,854 8,910 Qua Bảng 4.11b cho thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong môi trƣờng rỉ đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo (9,291>8,823). Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05. Về nồng độ vi khuẩn B. subtilis, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm có bổ sung B. subtilis giảm dần theo thứ tự sau: Nồng độ 100 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 9,407 Nồng độ 10-2 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 8,910 Nồng độ 10-1 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 8,854 45 Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. Nhìn chung, sự khác biệt về mối tƣơng quan giữa môi trƣờng và nồng độ B. subtilis lên số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.11). Yếu tố môi trƣờng nuôi cấy ảnh hƣởng lên số lƣợng tế bào S. cerevisiae đã đƣợc giải thích ở thí nghiệm 2 và trong thí nghiệm này cũng cho kết quả tƣơng tự. Cụ thể là số lƣợng tế bào S. cerevisiae trên môi trƣờng rỉ đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo. Ở Bảng 4.10, sự chênh lệch số lƣợng tế bào S. cerevisiae giữa 2 trƣờng hợp 1S+0B (1ml dịch S. cerevisiae + 0 ml dịch B. subtilis) và 1S+1B (1 ml dịch S. cerevisiae + 1 ml dịch B. subtilis) trong môi trƣờng rỉ đƣờng là 0,18%, trong môi trƣờng cám gạo là 1,25%. Có thể nói, trong môi trƣờng rỉ đƣờng sự có mặt của B. subtilis ảnh hƣởng không đáng kể đến số lƣợng S. cerevisiae. Ngƣợc lại, trong môi trƣờng cám gạo (môi trƣờng thƣờng đƣợc sử dụng để nuôi cấy sinh khối B. subtilis) sự có mặt của B. subtilis ảnh hƣởng đáng kể đến số lƣợng S. cerevisiae. Chúng tôi có thể kết luận khi nuôi cấy chung B. subtilis và S. cerevisiae với tỉ lệ 1:1 trong môi trƣờng cám gạo thì số lƣợng tế bào S. cerevisiae giảm đáng kể. Một điểm đáng lƣu ý khác, tuy về mặt thống kê học thì khi nuôi cấy chung nồng độ của B. subtilis không ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào S. cerevisiae nhƣng theo chúng tôi nhận thấy thì vẫn có sự ảnh hƣởng về mặt sinh học. Dựa vào một số lý do sau: Khi thu hoạch tế bào S. cerevisiae, bằng phƣơng pháp đếm số tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu chúng tôi thu đƣợc kết quả số lƣợng tế bào S. cerevisiae nuôi cấy riêng cao hơn khi nuôi cấy chung với B. subtilis (8,461>8,423) (Bảng 4.10). Sau 22 ngày bảo quản chế phẩm, chúng tôi kiểm tra số tế bào sống trong chế phẩm bằng phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa thì nhận thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae nuôi cấy chung với B. subtilis cao hơn khi nuôi cấy riêng (9,057>8,720), (Bảng 4.11). 46 Ta nhận thấy ban đầu số lƣợng tế bào S. cerevisiae nuôi cấy riêng cao hơn khi nuôi cấy chung với B. subtilis (8,461>8,423), nhƣng sau 22 ngày bảo quản số lƣợng tế bào S. cerevisiae khi nuôi cấy riêng chết nhiều hơn khi nuôi cấy chung (8,720<9,057). Nghĩa là, khi nuôi cấy chung B. subtilis có ảnh hƣởng đến S. cerevisiae theo hƣớng có lợi làm tăng sức sống của S. cerevisiae trong chế phẩm. 47 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Chúng tôi phân lập đƣợc từ dịch quả nho chủng nấm men thuộc loài S. cerevisiae và từ chế phẩm sinh học chủng nấm men thuộc loài S. boulardii. Cả 2 chủng đều có khả năng sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B và môi trƣờng cám gạo. Môi trƣờng cám gạo thích hợp cho sự sinh trƣởng của loài S. boulardii hơn môi trƣờng rỉ đƣờng 60B. Ngƣợc lại, loài S. cerevisiae sinh trƣởng trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B mạnh hơn trên môi trƣờng cám gạo. Thời điểm thu hoạch sinh khối tế bào nấm men thích hợp nhất là sau 48 giờ nuôi cấy. Vitamin C và chất nền (cám gạo, bột mì) không ảnh hƣởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm (sau 22 ngày bảo quản). Thu hoạch S. boulardii vào thời điểm 60 giờ sau khi nuôi cấy sẽ cho kết quả số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm nhiều hơn ở 36 giờ và 48 giờ. Còn thời điểm thu hoạch S. cerevisiae thích hợp nhất là 36 giờ sau khi nuôi cấy. Trong nuôi cấy chung, nồng độ vi khuẩn B. subtilis không ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào nấm men S. cerevisiae. 5.2. Đề nghị Tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của vitamin C lên sức sống tế bào nấm men trong chế phẩm với thời gian bảo quản dài hơn 22 ngày. Đếm đồng thời số lƣợng tế bào B. subtilis và S. cerevisiae trong thí nghiệm nuôi cấy chung 2 loài. 48 Khảo sát nuôi cấy chung vi khuẩn lactic thuộc loài Lactobacillus acidophilus với nấm men Saccharomyces cerevisiae trong môi trƣờng rỉ đƣờng. 49 Chƣơng 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ban Nông – Lâm Nghiệp, Uỷ ban Khoa Học - Kỹ Thuật Nhà Nƣớc, 1970. Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn. Nhà xuất bản Khoa Học - Kỹ Thuật Hà Nội. 2. Lao Thị Nga, 1987. Kỹ thuật sản xuất nấm men bánh mì và một số loài nấm ăn. Nhà xuất bản TP.HCM. 3. Lâm Thanh Hiền, 1996. Vi sinh vật đại cương. Tủ sách Đại học Nông Lâm TP.HCM. 4. Lƣơng Đức Phẩm, 2006. Nấm men công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa Học - Kỹ Thuật. 5. Lƣơng Thị Phƣơng Thảo, 2005. Khảo sát sự phát triển của nấm men Saccharomyces sp. trên hai loại môi trường rỉ đường và nước chiết giá đậu. Khóa luận tốt nghiệp Bác Sỹ Thú Y, Đại học Nông Lâm TP.HCM. 6. Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005. Khảo sát nuôi cấy nấm men Saccharomyces dùng làm chế phẩm bổ sung selen. Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Mở - Bán Công TP.HCM 7. Lê Thanh Lâm, 1996. Nghiên cứu di truyền học một số tính trạng có ý nghĩa kinh tế của Saccharomyces spp. Luận án Phó Tiến Sĩ Khoa Học Sinh Học, Đại học Quốc Gia Hà Nội – Khoa Học Tự Nhiên. 8. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ vi sinh tập 2. 9. Nguyễn Khắc Tuấn, 1996. Tuyển chọn một số chủng nấm men từ bánh men rượu cổ truyền để sản xuất một số chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi lợn. Luận án Phó Tiến Sĩ Khoa Học Nông Nghiệp, Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội. 10. Nguyễn Thị Hồng Phƣơng, 2006. Khảo sát sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae trên môi trường rỉ đường ở các điều kiện khác nhau. Khóa luận tốt nghiệp Bác Sĩ Thú Y, Đại học Nông Lâm TP.HCM. 50 11. Nguyễn Văn Hƣng, 1990. Nghiên cứu đặc điểm di truyền học của một số tính trạng chống chịu và lai tạo các nòi Saccharomyces có ý nghĩa kinh tế. Luận án Phó Tiến Sĩ Sinh Vật Học, Đại học Tổng Hợp Hà Nội. 12. Phạm Thị Thẳm, 2004. Phân lập và định danh một số loài nấm men thuộc giống Saccharomyces trong sản phẩm probiotic. Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Mở - Bán Công TP.HCM. 13. Vũ Thị Minh Đức. Thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. 51 Chƣơng 7 PHỤ LỤC Hình 7.1: Bình nuôi cấy nấm men Hình 7.2: Khuẩn lạc Saccharomyces sp. trên môi trƣờng thạch Sabouraud Hình 7.3: Chế phẩm sinh học chứa nấm men Saccharomyces sp. 52 7.1. Các bảng số liệu thô về số lƣợng tế bào nấm men Bảng 7.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (*108 tb/ml). Mẫu Chế phẩm Men bánh mì Đu đủ Nho Lần 1 2,816 1,600 2,880 3,680 Lần 2 2,150 1,150 1,350 2,600 Bảng 7.2: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (*108 tb/ml) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 2,675 3,200 2,475 2,838 3,438 2,425 Lần 2 2,775 3,100 3,413 2,300 2,500 1,963 Lần 3 1,913 2,575 2,788 2,475 2,800 2,950 Bảng 7.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (*108 cfu/g) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 0,344 3,517 6,820 1,496 10,999 3,443 Lần 2 2,297 1,544 2,979 27,68 3,353 3,283 Lần 3 9,447 2,544 3,704 24,463 2,144 20,722 53 Bảng 7.4: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (*108 tb/ml) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 2,288 4,138 3,063 3,488 3,463 4,038 Lần 2 2,875 2,838 3,063 3,463 3,613 2,938 Lần 3 1,938 3,225 3,288 2,400 3,300 2,238 Bảng 7.5: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (*108 cfu/g ) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 4,849 3,689 29,857 0,643 0,462 8,497 Lần 2 5,457 4,219 1,949 10,129 1,335 1,350 Lần 3 102,835 6,738 41,710 3,812 2,743 6,576 54 Bảng 7.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm (*108 cfu/g) mẫu 36 giờ 48 giờ 60 giờ lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3 đường 0 cám 0,665 4,443 4,715 0,209 2,590 2,560 2,050 3,683 2,810 đường 5 cám 0,168 0,701 6,008 0,311 4,323 3,303 0,955 0,642 2,833 đường 1 cám 0,414 2,610 6,603 0,240 0,577 3,368 1,845 2,065 3,520 cám 0 cám 2,680 4,560 2,300 0,647 3,363 2,953 0,975 0,468 5,218 cám 5 cám 2,233 2,430 3,750 0,745 4,080 6,120 5,370 2,473 2,435 cám 1 cám 1,105 2,615 1,725 0,655 3,618 3,530 8,030 4,280 0,552 đường 0 mì 0,022 0,151 14,178 6,825 0,498 2,528 11,590 2,275 4,598 đường 5 mì 0,022 6,868 4,648 0,205 0,322 2,475 4,845 0,437 57,150 đường 1 mì 0,027 0,178 6,695 0,162 0,596 5,998 6,695 0,638 5,280 cám 0 mì 0,311 50,800 46,625 21,350 3,343 1,335 5,910 6,098 36,225 cám 5 mì 1,745 0,542 10,458 3,180 2,978 1,988 3,070 1,948 6,283 cám 1 mì 7,233 32,325 318,775 0,417 3,348 6,885 16,660 5,673 45,650 Bảng 7.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm (*108 cfu/g) mẫu 36 giờ 48 giờ 60 giờ lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3 đường 0 cám 6,118 3,945 198,500 0,503 5,928 6,353 3,213 0,612 8,745 đường 5 cám 14,810 47,900 12,473 2,040 6,115 7,283 10,528 4,553 21,350 đường 1 cám 3,020 51,725 98,500 1,205 3,695 10,708 8,415 3,685 9,435 cám 0 cám 0,562 0,230 3,918 0,401 2,228 2,580 0,348 0,545 3,863 cám 5 cám 0,580 538,500 4,848 0,228 0,435 2,258 0,815 0,646 1,585 cám 1 cám 0,475 1,545 3,303 0,292 0,287 2,578 0,305 1,735 2,228 đường 0 mì 3,580 6,968 7,170 6,875 2,510 7,123 56,500 3,285 74,675 đường 5 mì 4,373 9,380 9,583 3,255 4,650 1,800 3,085 2,613 125,250 đường 1 mì 4,148 7,628 640 2,613 2,503 151,750 0,489 2,503 55,025 cám 0 mì 0,724 20,028 3,705 0,522 0,441 2,905 16,645 2,155 9,288 cám 5 mì 0,192 0,621 118,225 0,426 0,192 4,398 4,550 8,423 55,025 cám 1 mì 0,353 0,604 6,030 4,290 0,286 0,730 9,783 0,537 4,723 55 Bảng 7.8: Số lƣợng tế bào trong S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (*108 tb/ml) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Mẫu 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Lần 1 8,583 8,439 8,599 8,667 8,435 8,011 8,342 8,470 Lần 2 8,466 8,550 8,376 8,322 8,357 8,366 8,477 8,455 Trung bình 8,525 8,495 8,488 8,495 8,396 8,189 8,410 8,463 Bảng 7.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (*108 cfu/g) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Mẫu 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Lần 1 8,942 9,705 9,027 9,108 8,081 8,883 8,685 8,723 Lần 2 9,224 9,820 9,151 8,932 8,633 9,219 8,552 8,874 Trung bình 9,083 9,763 9,089 9,020 8,357 9,051 8,619 8,799 7.2. Xử lý thống kê 7.2.1. Thí nghiệm 1:Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập đƣợc trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B Bảng ANOVA 7.1 Analysis of Variance for SL Source DF SS MS F P CHUNG 3 0.2745 0.0915 5.34 0.014 Error 12 0.2055 0.0171 Total 15 0.4800 7.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch đến số lƣợng tế bào nấm men 7.2.2.1. Số lƣợng tế bào S. boulardii Bảng ANOVA 7.2 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 0.00845 0.00845 0.00845 0.81 0.371 TG 2 0.05401 0.05401 0.02700 2.59 0.082 MT*TG 2 0.02871 0.02871 0.01436 1.38 0.259 Error 66 0.68721 0.68721 0.01041 Total 71 0.77838 56 Bảng ANOVA 7.3 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 2.2476 2.2476 2.2476 4.57 0.036 TG 2 0.9455 0.9455 0.4727 0.96 0.387 MT*TG 2 2.2789 2.2789 1.1394 2.32 0.106 Error 66 32.4310 32.4310 0.4914 Total 71 37.9029 7.2.2.2. Số lƣợng tế bào S. cerevisiae Bảng ANOVA 7.4 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 0.02202 0.02202 0.02202 2.12 0.150 TG 2 0.13097 0.13097 0.06549 6.30 0.003 MT*TG 2 0.05414 0.05414 0.02707 2.61 0.081 Error 66 0.68556 0.68556 0.01039 Total 71 0.89269 Bảng ANOVA 7.5 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 8.0829 8.0829 8.0829 16.79 0.000 TG 2 2.1961 2.1961 1.0981 2.28 0.110 MT*TG 2 0.1044 0.1044 0.0522 0.11 0.897 Error 66 31.7654 31.7654 0.4813 Total 71 42.1488 7.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên sức sống của nấm men trong chế phẩm 7.2.3.1. Số lƣợng tế bào S. boulardii Bảng ANOVA 7.6 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P CN 1 1.3000 1.3000 1.3000 2.49 0.116 VIT 2 0.5586 0.5586 0.2793 0.54 0.586 CN*VIT 2 0.4381 0.4381 0.2191 0.42 0.657 Error 210 109.4760 109.4760 0.5213 Total 215 111.7727 7.2.3.2. Số lƣợng tế bào S. cerevisiae Bảng ANOVA 7.7 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P CN 1 1.4787 1.4787 1.4787 2.30 0.130 VIT 2 0.7640 0.7640 0.3820 0.60 0.552 CN*VIT 2 1.5843 1.5843 0.7921 1.23 0.293 Error 210 134.7244 134.7244 0.6415 Total 215 138.5515 57 7.2.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm 7.2.4.1. Số lƣợng tế bào S. boulardii Bảng ANOVA 7.8 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT-CN 3 15.2168 15.2168 5.0723 12.26 0.000 TG 2 4.3018 4.3018 2.1509 5.20 0.006 MT-CN*TG 6 7.8697 7.8697 1.3116 3.17 0.005 Error 204 84.3844 84.3844 0.4136 Total 215 111.7727 7.2.4.2. Số lƣợng tế bào S. cerevisiae Bảng ANOVA 7.9 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT-CN 3 27.5532 27.5532 9.1844 19.64 0.000 TG 2 9.8236 9.8236 4.9118 10.50 0.000 MT-CN*TG 6 5.7882 5.7882 0.9647 2.06 0.059 Error 204 95.3864 95.3864 0.4676 Total 215 138.5515 7.2.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung 7.2.5.1. Theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu Bảng ANOVA 7.10 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 0.10600 0.10600 0.10600 4.60 0.046 BA 2 0.07939 0.07939 0.03970 1.72 0.207 MT*BA 2 0.09024 0.09024 0.04512 1.96 0.170 Error 18 0.41482 0.41482 0.02305 Total 23 0.69045 7.2.5.2. Theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa Bảng ANOVA 7.11 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 1.9471 1.9471 1.9471 10.55 0.004 BA 2 0.9100 0.9100 0.4550 2.47 0.113 MT*BA 2 0.4997 0.4997 0.2498 1.35 0.283 Error 18 3.3221 3.3221 0.1846 Total 23 6.6789 58 7.3. Thành phần các loại môi trƣờng 7.3.1. Môi trƣờng Sabouraud Glucose 40 g Pepton 20 g Agar 20 g Nƣớc cất 1000 g Ph = 5,6 7.3.2. Môi trƣờng rỉ đƣờng mía 60B KH2PO4 20 g MgSO4 5 g K2HPO4 20 g (NH4)2SO4 40 g Rỉ đƣờng mía 60B 1000 ml pH = 5 – 6. 7.3.3. Môi trƣờng cám gạo 100 g cám hoà trong 500 ml nƣớc, đun sôi, lọc qua vải màn, pha thêm nƣớc cho đủ 1000 ml, bổ sung thêm 5 g MgSO4, 3g KH2PO4. 7.3.4. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu Đun sôi hỗn hợp 200 g giá với 1000 ml nƣớc rồi ép lấy nƣớc. Tất cả các loại môi trƣờng đều đƣợc hấp khử trùng bằng autoclave ở 1210C/10 phút. 7.4. Phƣơng pháp nhuộm đơn Bƣớc 1: làm vết bôi Đặt 1 giọt nƣớc vô trùng lên phiến kính. Dùng que cấy lấy 1 ít nấm men từ khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch, hoà đều vào giọt nƣớc và trải mỏng trên mặt lame. Để khô. 59 Bƣớc 2: cố định mẫu Hơ nhẹ phía dƣới phiến kính qua ngọn lửa đèn cồn 3 – 4 lần hoặc nhỏ vài giọt cồn ngay vết trải và đốt. Mục đích: giết chết tế bào sống, gắn chặt tế bào sống vào phiến kính khi rửa không bị trôi và làm cho tế bào dễ bắt màu. Bƣớc 3: nhuộm màu Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm đơn xanh methylen 0,1%. Rửa nƣớc và làm khô. Bƣớc 4: quan sát Quan sát hình thái nấm men bằng kính hiển vi dƣới vật kính dầu 100X.