Khảo sát sự tác động của IAA, NAA lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) in vitro
MỤC LỤC
CHưƠNG TRANG
Trang tựa .i
Lời cảm ơn .iii
Tóm tắt .iv
Summary vi
Mục lục .vii
Danh sách các bảng .xi
Danh sách các hình và sơ đồ .xiii
Danh sách các chữ viết tắt xv
CHưƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu .2
1.3. Yêu cầu .2
CHưƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây .3
2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp .3
2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp .4
2.2. Alkaloid .4
2.3. Sơ lược đặc điểm về cây Trường xuân hoa Catharanthus roseus 7
2.3.1. Nguồn gốc của cây Trường xuân hoa .7
2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trường xuân hoa .8
2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trường xuân hoa 9
2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trường xuân hoa 13
2.3.5. Tính chất dược lý của cây Trường xuân hoa . 13
2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trường xuân hoa trong điều trị bệnh 14
2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp .15
2.4.1. Các chất điều hòa sinh trưởng . 15
2.4.2. Nguồn đạm 16
2.4.3. Nguồn cacbon 16
2.4.4. Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen 16
2.4.5. Các chất khác 16
2.5. Các phương pháp chiết xuất alkaloid 17
2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất 17
2.5.2. Phương pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ 17
2.5.3. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước . 18
2.6. Các phương pháp định tính sự hiện diện của alkaloid 18
2.6.1. Phản ứng tạo tủa 19
2.6.2. Phản ứng tạo màu 19
2.7. Các phương pháp định lượng alkaloid .20
2.7.1. Phương pháp cân .20
2.7.2. Phương pháp trung hòa 20
2.7.3. Định lượng alkaloid trong môi trường khan .21
2.7.4. Phương pháp so màu .21
2.7.5. Các phương pháp định lượng alkaloid hiện đại 22
2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp .22
2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản 22
2.8. Các nghiên cứu về việc tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp .23
2.8.1. Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao 24
2.8.2. Xử lý với Elicitor 24
2.8.3. Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học 24
2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất 24
2.8.3.2. Sự biến đổi sinh học .25
CHưƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nội dung nghiên cứu 26
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26
3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA lên sự
sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .26
3.3.1. Vật liệu 26
3.3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .26
3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ .26
3.3.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy .26
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu .27
3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây
Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA .27
3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA
đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 27
3.3.4. Phương pháp tiến hành 29
3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trường
xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA 29
3.4.1. Vật liệu .29
3.4.1.1. Mẫu kiểm tra 29
3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 29
3.4.1.3. Hóa chất .30
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu .30
3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây
Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner 30
3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây
Trường xuân hoa 31
3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng alkaloid của cây
Trường xuân hoa in vitro và cây Trường xuân hoa in vivo .31
3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lượng alkaloid trong cây
Trường xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE .32
3.4.3. Phương pháp tiến hành 32
3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa 32
3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trường xuân hoa 32
3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lượng alkaloid bằng CE 34
CHưƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .35
CHưƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56
5.1. Kết luận .56
5.2. Đề nghị .57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
PHỤ LỤC
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây 13
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự
sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 27
Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh
trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự
sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28
Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35
ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .35
Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35
ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36
Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35
ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của
cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy .37
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của
cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy .38
N1
N3
N2 I2
Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa
in vitro bằng thuốc thử Wagner 41
Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa
in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 43
Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa
in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 46
Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và
mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE .50
Bảng 4.10. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây
Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE 53
Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây
Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy .54
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid 7
Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa 7
Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa .8
Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine . 10
Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline 10
Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine . 11
Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây
Trường xuân hoa từ tiền chất 12
Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung
NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy .39
Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu cây
Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày 42
Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường
xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA .42
Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân
lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA .44
Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá
của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA 45
Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây
Trường xuân hoa in vitrotrên môi trường có chứa NAA 46
Hình 4.7:Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây
Trường xuân hoa in vitrotrên môi trường có chứa IAA 47
Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l, vindoline 20 mg/l 48
Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu
Trường xuân hoa in vivo tươi 49
Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu
Trường xuân hoa in vivo khô 50
Khảo sát sự tác động của IAA, NAA lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) in vitro
92 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 2276 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Khảo sát sự tác động của auxin lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây trường xuân hoa (catharanthus roseus) in vitro, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
sung NAA 0,5
mg/l. Phản ứng dương tính: xuất hiện kết tủa (mũi tên).
43
Nhỏ vài giọt thuốc thử vào dịch chiết alkaloid từ mẫu thân lá của cây Trường
xuân hoa in vitro 28 ngày tuổi trên các môi trường có bổ sung NAA, IAA với các
nồng độ khác nhau, để chọn nồng độ phù hợp kích thích cây sản xuất nhiều alkaloid
nhất. Kết quả trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro
trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy
Chất kích
thích sinh
trƣởng
Nồng độ
(mg/l)
Phản ứng màu với thuốc thử Wagner
NAA
0 dung dịch đục, tạo tủa vừa
0,1 dung dịch đục mờ, không lắng
0,5 dung dịch tạo tủa nhiều
1 dung dịch đục, tạo tủa vừa
5 dung dịch tạo tủa ít
10 dung dịch tạo tủa ít
IAA
0,1 dung dịch tạo tủa ít
0,5 dung dịch đục mờ, không lắng
1 dung dịch đục, tạo tủa vừa
5 dung dịch đục mờ, không lắng
10 dung dịch tạo tủa ít
Khi cho phản ứng với thuốc thử,ở các mẫu trên môi trường có bổ sung NAA
cho kết tủa nhiều hơn so với các mẫu trên môi trường chứa IAA. Có nghĩa là lượng
alkaloid được tạo ra nhiều trong cây nuôi cấy trên môi trường bổ sung NAA. Điều
này có thể giải thích là do IAA là chất kích thích tăng trưởng có nguồn gốc từ thực
vật nên việc sử dụng IAA như chất cảm ứng để kích thích khả năng tổng hợp
alkaloid không có hiệu quả như khi sử dụng chất có nguồn gốc hóa học như NAA.
44
Trong số các nồng độ NAA sử dụng thì thấy mẫu cây trên môi trường chứa
NAA 0,5 mg/l tạo kết tủa nhiều nhất khi phản ứng với thuốc thử. Ở nồng độ 1 mg/l,
5 mg/l và 10 mg/l cho phản ứng tạo tủa vừa, dung dịch đục còn ở 0,1 mg/l thì dung
dịch đục và tạo kết tủa rất ít. Như vậy, khi sử dụng NAA ở nồng độ 0,5 mg/l cây
sản xuất được nhiều alkaloid nhất (Hình 4.4).
Các mẫu cây nuôi trên môi trường chứa IAA khi cho phản ứng với thuốc thử
thì thấy dung dịch đục mờ ít lắng, điều này có thể là do lượng alkaloid toàn phần
trong cây trên môi trường này được tạo ra ít. Trong các nồng độ thí nghiệm thì khi
dùng IAA 1mg/l cho hiện tượng tạo kết tủa rõ ràng nhất, ở các nồng độ còn lại có
thể do lượng alkaloid trong mẫu ít nên không quan sát thấy kết tủa, chỉ thấy dung
dịch vẫn đục (Hình 4.5).
1 2 3 4 5 6
Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu
thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên
môi trường có chứa NAA với các nồng độ khác nhau,1) 0 mg/l, 2) 0,1
mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l.
45
.
Qua thí nghiệm này cho thấy khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy một lượng
auxin thích hợp (NAA 0,5 mg/l hay IAA 1 mg/l) thì kích thích khả năng tạo alkaloid ở
cây Trường xuân hoa. Tuy nhiên, xét về mặt kinh tế, sử dụng NAA 0,5 mg/l có hiệu
quả hơn.
Định tính alkaloid trong rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có
bổ sung IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner
Tiến hành ly trích alkaloid của rễ cây Trường xuân hoa 28 ngày tuổi trên các
môi trường khác nhau trong acid H2SO4 loãng sau đó nhận diện alkaloid bằng thuốc
thử Wagner.
1 2 3 4 5
Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu thân
lá của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi
trường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau. 1) 0,1 mg/l, 2) 0,5
mg/l, 3) 1 mg/l, 4) 5 mg/l, 5)10 mg/l.
46
Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên
môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau
Chất kích
thích sinh
trƣởng
Nồng độ
(mg/l)
Phản ứng màu với thuốc thử Wagner
NAA
0 Vòng nhẫn đỏ nâu(++)
0,1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++)
0,5 Vòng nhẫn đỏ nâu(++++)
1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++)
5 Vòng nhẫn đỏ nâu(++)
10 Vòng nhẫn đỏ nâu(++)
IAA
0,1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+)
0,5 Vòng nhẫn đỏ nâu(+)
1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++)
5 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++)
10 Vòng nhẫn đỏ nâu(++)
+: nhạt màu, ++ : đậm vừa, +++ : đậm, ++++ : đậm màu nhất
1 2 3 4 5 6
Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây Trường
xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa NAA với các nồng độ
khác nhau, 1) 0 mg/l, 2) 0,1 mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l, phản
ứng tạo vòng nhẫn (mũi tên).
47
Kết quả ở hình 4.6 và 4.7 cho thấy tất cả các mẫu thí nghiệm đều phản ứng
với thuốc thử tạo vòng nhẫn màu nâu đỏ (giống mẫu đối chứng), điều này chứng tỏ
tất cả các mẫu rễ đều có chứa alkaloid. Vì alkaloid phân bố khác nhau ở thân, lá và
rễ (2.3.3) nên khi nhận biết bằng thuốc thử ở các mẫu rễ ta không thấy sự xuất hiện
kết tủa như ở mẫu thân lá.
Khi cho cùng lượng thuốc thử vào các mẫu, quan sát thấy mẫu được nuôi
trên môi trường có bổ sung NAA tạo vòng nhẫn đậm màu hơn so với các mẫu cây
được nuôi trên môi trường có chứa IAA. Trong tất cả các nồng độ NAA đã thí
nghiệm, mẫu cây được nuôi trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l cho kết quả tạo
màu đậm nhất. Việc sử dụng NAA ở nồng độ cao (5 mg/l, 10 mg/l) tạo vòng nhẫn
mờ và dễ bị hòa tan có thể là do ở nồng độ này cây thích hợp cho việc tạo mô sẹo
chứ không kích thích lên sự phát triển của rễ.
Ngược lại các mẫu trên môi trường có bổ sung IAA vòng nhẫn đậm màu ở
mẫu 3, 4, đậm vừa ở mẫu 5 và nhạt màu ở mẫu 1 và 2, điều này có nghĩa là việc sử
1 2 3 4 5
Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây
Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa
NAA với các nồng độ khác nhau. 1) 0 mg/l, 2) 0,1 mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l,
5) 5 mg/l, 6)10 mg/l.
ường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau.
Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây Trường
xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA với các nồng độ
khác nhau, 1) 0,1 mg/l, 2) 0,5 mg/l, 3) 1 mg/l, 4) 5 mg/l, 5)10 mg/l, phản ứng tạo vòng
nhẫn (mũi tên).
48
dụng IAA ở nồng độ 1 mg/l và 5 mg/l có thể kích thích lên sự sản sinh alkaloid của
cây Trường xuân hoa in vitro.
Như vậy việc sử dụng auxin ở nồng độ thích hợp (NAA 0,5 mg/l; IAA 1
mg/l) có thể tác động đến sự tích lũy alkaloid ở rễ.
Tóm lại khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l cây Trường
xuân hoa in vitro có thể đạt được hàm lượng alkaloid cao. Trong đó lượng alkaloid
tập trung nhiều ở thân lá.
4.5. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm quy trình ly trích alkaloid Trƣờng xuân hoa
Tiến hành ly trích mẫu theo hai quy trình khác nhau:
+ Quy trình 1: ly trích alkaloid từ vật liệu tươi (trang 33)
+ Quy trình 2: ly trích alkaloid từ vật liệu khô (trang 34)
Dịch chiết alkaloid sau khi ly trích được phân tích bằng CE
Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l (A), vindoline 20 mg/l (B),
Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2 và
điện thế áp 10 kV; bơm 3 s ở 25 mbar; nhiệt độ 25oC
49
Khi phân tích dịch chiết alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa tươi và khô
bằng CE đều nhận thấy có sự hiện diện của catharanthine và vindoline trong mẫu.
Khi tiến hành ly trích từ mẫu tươi, kết quả trên hình 4.9 cho thấy nhiều hợp chất
trong cây được nhận diện (mỗi pic đại diện cho một chất) nhưng theo kết quả tính
toán các dịch alkaloid ly trích từ mẫu tươi (quy trình 1) có hàm lượng cathẩnthine
và vindoline thấp hơn so với các dịch alkaloid ly trích bằng mẫu khô (quy trình 2)
( xem bảng 4.9).
2
a
b
Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu
Trường xuân hoa in vivo, mẫu ly trích ở dạng tươi. a) Catharanthine,
b) vindoline. Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium
acetate, pH 6,2 và điện thế áp 10. kV; nhiệt độ 25oC
50
Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và mẫu khô cây
Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE
Hàm lượng Catharanthine
(mg/100mg vật liệu khô)
Hàm lượng Vindoline
(mg/100mg vật liệu khô)
Quy trình 1 0,00348 0,02704
Quy trình 2 0,02087 0,05216
b
a
Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu
Trường xuân hoa in vivo, mẫu ly trích ở dạng khô, a) Catharanthine, b)
vindoline.. Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate,
pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25oC
51
Kết quả phân tích ở hình 4.9 và 4.10 cho thấy sự phân tách alkaloid ở mẫu
khô tốt hơn so với mẫu tươi, vì khi ly trích bằng vật liệu tươi, mẫu có độ nhớt cao
hơn sẽ làm cản trở quá trình phân tách các chất dẫn đến có píc đôi. Hơn nữa, theo
quy trình ly trích 1 thì mẫu phải trải qua nhiều giai đoạn tiếp xúc với dung môi nên
lượng alkaloid bị hao hụt và thời gian để chuẩn bị mẫu lâu hơn so với quy trình 2,
có thể lượng alkaloid đã bị ảnh hưởng một phần bởi ánh sáng do mẫu để lâu ngoài
môi trường. Hàm lượng catharanthine ly trích theo quy trình 2 cao 4 lần so với
lượng catharanthine thu được sau khi ly trích theo quy trình 1, còn lượng vindoline
thì cao gấp 2 lần (Biểu đồ 4.1). Như vậy việc sử dụng quy trình ly trích từ mẫu khô
cho kết quả tốt hơn.
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
QT1 QT 2
Quy trình ly trích
in
do
l a
lk
al
oi
d
(%
ch
ất
k
hô
)
Catharanthine vindoline
Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích mẫu cây
Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2.
Qua thí nghiệm này cho thấy quy trình ly trích bằng mẫu khô cho kết quả
phân tích alkaloid tốt hơn, vì quy trình ly trích mẫu tươi khá phức tạp và tốn nhiều
thời gian, mẫu phải được ly trích ngay khi thu hoạch, không bảo quản được lâu như
52
mẫu khô nên không thuận lợi khi thực hiện nghiên cứu. Trong khi đó, mẫu vật liệu
được bảo quản dễ dàng, chỉ cần trữ mẫu nơi khô ráo, tránh hút ẩm.
4.6. Thí nghiệm 4: Định lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa in vitro và
cây Trƣờng xuân hoa in vivo
Trước khi tiến hành phân tích một mẫu, máy CE được luyện cột với dung
dịch đệm và chạy chuẩn alkaloid của Trường xuân hoa.
Ly trích mẫu cây Trường xuân hoa in vivo và cây in vitro theo quy trình 2,
sau đó đem phân tích alkaloid bằng CE, kết quả thu được như sau:
Catharanthin
e
Catharanthine
Vindolin
e
Vindolin
e
Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân
hoa in vitro 2 tuần tuổi. Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M
ammonium acetate, pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25oC
Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân
hoa in vivo 2 tuần tuổi, cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M
ammonium acetate, pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25oC.
53
Kết quả trình bày ở hình 4.11 và 4.12 cho thấy trong mẫu Trường xuân hoa
in vitro và in vivo đều có chứa catharanthine và vindoline khi so với catharanthine
và vindolin chuẩn. Nhưng hàm lượng các chất này trong cây in vitro cao hơn so với
cây in vivo (Bảng 4.10).
Bảng 4.10. Hàm lượng Catharanthine và Vindoline trong cây Trường xuân hoa in
vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE
Biểu đồ 4.2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa
cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo
Quan sát biểu đồ 4.2 nhận thấy ở cùng một thời điểm thu hoạch nhưng các
cây Trường xuân hoa in vitro có thể sản xuất lượng catharanthine và vindoline cao
Hàm lượng Catharanthine
(mg/100mg vật liệu khô)
Hàm lượng Vindoline
(mg/100mg vật liệu khô)
Cây in vitro 0,02149 0,03642
Cây in vivo 0,01969 0,01744
54
hơn so với cây in vi vo, như vậy việc sử dụng các cây Trường xuân hoa in vitro làm
nguồn sản xuất các indol alkaloid là có thể thực hiện được. Điều này rất có ích cho
việc sản xuất các indol alkaloid trên quy mô công nghiệp vì có thể kiểm soát được
quá trình nuôi cấy và kích thích cây sản xuất các hợp chất mong muốn. Hơn nữa
ngoài việc nhân nhanh các cây Trường xuân hoa có khả năng sản xuất alkaloid với
hàm lượng cao, nuôi cấy in vitro còn có lợi điểm là giảm không gian sử dụng và
giảm chi phí so với nhân giống in vivo. Việc này có thể góp phần làm giảm giá
thành các alkaloid.
4.2.4 Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lƣợng alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa ở
từng giai đoạn phát triển bằng hệ thống điện di mao quản
Xác định hàm lượng của catharanthine và vindoline trong mẫu cây Trường
xuân hoa ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày tuổi trên môi trường có NAA 0,5 mg/l thu được
kết quả như sau:
Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in
vitro qua các giai đoạn nuôi cấy
Trong các mẫu phân tích, hàm lượng catharanthine cao nhất thu được từ cây
nuôi cấy mô ở giai đoạn 28 ngày (0,0394 %). Điều này có thể giải thích là do
catharanthine được sản xuất ở rễ và khi so sánh với kết quả nuôi cấy mô nhận thấy
cây có khả năng phát triển rễ mạnh nhất sau 28 ngày trên môi trường bổ sung NAA.
Trong khi đó, hàm lượng vindoline cao nhất là ở 7 ngày tuổi và giảm dần sau 35
Ngày
Hàm lượng catharanthine
(mg/100mg vật liệu khô)
Hàm lượng vindoline
(mg/100mg vật liệu khô)
7 0,0326 0,0371
14 0,0342 0,0112
21 0,0141 0
28 0,0394 0,0274
35 0,0291 0,0224
55
ngày tuổi. Riêng ở giai đoạn 21 ngày không phát hiện được vindoline trong cây, có
thể vì ở giai đoạn này vindoline không cần thiết cho cây nên không được tổng hợp
hoặc được tổng hợp với hàm lượng thấp và bị loại bỏ trong bớt trong quá trình ly
trích nên không phát hiện được khi phân tích bằng CE. Điều này chứng tỏ mỗi loại
alkaloid đạt được hàm lượng cao ở những giai đoạn khác nhau. Do đó việc xác định
được thời điểm cây sản xuất các hợp chất quan tâm là rất quan trọng.
Thí nghiệm này xác định được giai đoạn nuôi cấy thích hợp của cây Trường
xuân hoa, trên môi trường bổ sung NAA để thu nhận vindoline là 7 ngày tuổi và
catharanthine là 28 ngày tuổi
56
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Từ những kết quả thu được có thể đưa ra một số kết luận sau
Sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa
Việc bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy chỉ ảnh hưởng lên sự tăng
trưởng về chiều dài rễ và số rễ của cây. Nồng độ thích hợp cho sự phát triển rễ của
cây là 0,5 mg/l khi sử dụng NAA và 1mg/l đối với IAA.
Định tính alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro qua các giai đoạn
sinh trƣởng bằng thuốc thử Wagner:
Có sự hiện diện của alkaloid trong tất cả các mẫu cây Trường xuân hoa.
Lượng alkaloid khác nhau tùy theo thời gian nuôi cấy.
Giai đoạn cây in vitro tạo nhiều alkaloid nhất là sau 28 ngày nuôi cấy trên
môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l.
Lượng alkaloid được phát hiện nhiều nhất ở mẫu thân lá của cây Trường
xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l.
Thử nghiệm ly trích alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa
Quy trình ly trích alkaloid từ mẫu khô cho kết quả phân tích trên máy CE tốt
hơn so với quy trình ly trích alkaloid từ mẫu tươi, hơn nữa mẫu được bảo quản dễ
dàng với phương pháp ly trích bằng vật liệu khô và phương pháp này có thể định
danh được alkaloid nếu dựa vào píc alkaloid chuẩn.
Định lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa in vitro và cây in vivo
Hàm lượng alkaloid ở mẫu cây ngoài đồng thu được thấp hơn so với mẫu
cây nuôi cấy mô, đặc biệt là các tiền chất quan trọng như catharanthine và
vindoline.
57
Việc nuôi cấy cây in vitro trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh
trưởng bước đầu thể hiện khả năng tăng sinh tổng hợp alkaloid ở cây Trường xuân
hoa.
Kiểm tra hàm lƣợng alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa ở từng giai
đoạn phát triển bằng kĩ thuật điện di mao quản
Lượng vindoline cao nhất thu được trong cây Trường xuân hoa ở 7 ngày tuổi
và lượng catharanthine cao nhất thu được ở cây 28 ngày tuổi.
5.2. Đề nghị
Trường xuân hoa là một giống cây dược liệu có thể sản sinh các các alkaloid
quý có tác dụng trị liệu cao. Nên việc tìm hiểu các kĩ thuật nuôi cấy nhanh và tạo ra
một lượng lớn cây in vitro có khả năng tích lũy alkaloid cao rất có ý nghĩa do đó tôi
xin đề nghị một số hướng nghiên cứu tiếp theo:
Cần tiến hành phân tích hàm lượng alkaloid trong từng bộ phận của cây, từ
đó xác định bộ phận sản xuất lượng alkaloid nhiều.
Khảo sát khả năng cảm ứng hình thành alkaloid bằng cách bổ sung vào môi
trường nuôi cấy các yếu tố sinh học và hóa học có khả năng ảnh hưởng đến
sự tăng sinh tổng hợp các hoạt chất thứ cấp như chất kích thích sinh trưởng
IAA, methyle jasmonat, nấm Trichoderma…
58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Vương Văn Ánh, Nguyễn Minh Đức, Trần Hùng, Nguyễn Viết Kình, Võ
Văn Lẹo, Bùi Mỹ Linh, Ngô Thị Xuân Mai, Phạm Đông Phương, Phạm
Thanh Tâm, Hùynh Ngọc Thụy, Võ Thị Bạch Tuyết, 2006. Giáo trình thực
tập dược liệu. Bộ môn dược liệu, khoa dược, Đại học Y dược, TP. Hồ Chí
Minh, tr50 - 72.
2. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ. Bài giảng chiết xuất dược liệu, trường đại học Y
dược, TP. Hồ chí Minh, trang10.
3. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu, 1985. Phương pháp nghiên cứu hóa
học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học.
4. Nguyễn Ngọc Hồng, 2004. Bước đầu khảo sát hợp chất trao đổi bậc hai
bằng kĩ thuật nuôi cấy dịch huyền phù tế bào cây dừa cạn Catharanthus
roeus. Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí
Minh, Việt Nam.
5. Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh, 2002. Bài giảng dược
liệu, tập 2. Nhà xuất bản y học Hà Nội.
6. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất
bản Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
7. Trần Thị Lệ Minh, 2006. Giáo trình hoạt chất thứ cấp thực vật. Bộ môn
Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm. TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000. Các phương pháp nhận danh trích ly cô lập
các hợp chất hữu cơ. Học phần cao học chuyên ngành hóa hữu cơ, Trường
Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Tp.HCM, Việt Nam.
TIẾNG NƢỚC NGOÀI
9. Aniszewski Tadeusz, 2007. Alkaloids - Secrets of life. Alkaloid Chemistry,
Biological Significance. Applications and Ecological Role, 335 pages
10. Facchini J. Peter, 2001. Alkaloid biosynthesis in plants: Biochemistry, Cell
Biology, Molecular Regulation, and Metabolic Engineering Applications.
Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52: p29 – 66.
59
11. Inhou Chu, Bodnar A. Joy, White L. Earl, Bowman N. Robert, 1996.
Quantification of vincristine and vinblastine in Catharanthus roseus plants
by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A, p281- 288.
12. Jian Zhao, Wei-Hua Zhu, Qiu Hu, 2001. Enhanced cathanthine production in
Catharanthus roseus cell culture by combined elicitor treatment in shake
flasks and bioreactors. Enzyme and Microbial Technology 28: p673 – 681.
13. Jorgenson J.W. and Lukacs K.D, 1981. High resolution separation based on
Electrophoresis and Electroosmosis. J Chromatogr 218 : p209 - 216.
14. Klocke A. J., Balandrin F. M., Wurtele E. S., Bollinger W. H., 1985. Natural
Plant Chemicals: Sources of Industrial and Medicinal Materials. Science 228:
p1154-1160.
15. Kutchan Toni M., 1995. Alkaloid Biosynthesis -The Basis for Metabolic
Engineering of Medicinal Plants. The Plant Cell, Vol. 7, p1059 - 1070.
16. Luijendijk J. C. Tues, ed Van Der Meijden, and Rob Verpoorte, 1996.
Involvement of strictosidine as a defensive chemical in Catharanthus roeus.
Journal of Chemical Ecology, Vol. 22, No. 8: p1356 – 1366.
17. Milesi S., Bourgaud F., Gravot A., Gontier E., 2001. Production of plant
secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science 161: p839 –
851.
18. Marmont M. A. and Damasio E. E., 1967. The Effects of Two Alkaloids
Derived from Vinca Rosea on the Malignant Cells of Hodgkin’s Disease,
Lymphosarcoma and Acute Leukemia in Vivo. The Journal of Hematology
29: p1- 21
19. Tran Thi Le Minh, 2006. Etude de la croissance et la mise en place de la
methode de dosage des alcaloides indolique chez le. Laboratoire
d’Agronomie et Environnement. Thèse, 20 pages.
20. Tikhomiroff C., Jolicoeur M., 2002. Screening of Catharanthus roseus
secondary metabolites by high – performance liquid chromatography.
Journal of Chromatography: p87 – 93.
21. Zenk, Eds. Barz, W., Reinhard, E., M.H., 1977. Plant Tissue Culture and Its
Bio-technological Application, p. 27. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg,
New York.
60
TÀI LIỆU TỪ INTERNET
22.
23.
24.
25.
26.
Masanaru Misawa, Plant tissue culture: an alternative for production of
useful metabolite. Food and Agriculture Organization of the United Nations
Rome,1994.
27. www.uic.edu/pharmacy/courses/phar331/PHAR331.00.doc
Dr. A. D. Kinghorn, PHAR331 - Fundamentals of Drug Action I- Lectures
on Natural Products
28.
Molecular structure of Vinblastine and vincristine
29.
Vinblastine, Cancerquest, Emory University
30.
31.
jY0NDAmZ3JvdXBpZD0yOSZraW5kPSZrZXl3b3JkPQ==&page=4
32.
Wang Miao
*
, LI Qiu-Rong,Transient Expression of strictosidine Synthase in
Tobaco leaves by Vacumm infiltration. Institute of Applied Ecology, the
Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China.
33.
Classification: Catharanthus roseus (L.) G. Don
PHỤ LỤC 1
Thành phần môi trƣờng MS ( Murashige và Skoog, 1962)
Agar 7,5 g/l
pH môi trƣờng ( trước khi hấp) 5,8
Nguyên tố Nồng độ (mg/l)
Nguyên tố đa
lƣợng
CaCl2 332,02
KNO3 1900,00
KH2PO4 170,00
NH4NO3 1650,00
MgSO4.7H2O 180,54
Nguyên tố vi
lƣợng
CoCl2.6H2O 0,025
CuSO4.5H2O 0,025
H3BO3 6,20
KI 0,83
MnSO4.H2O 16,90
Na2MoO4.H2O 0,25
ZnSO4.H2O 8,60
Vitamine &
aminoacid
Glycine 2,00
Myo-Inositol 100
Nicotinic acid 0,50
Pyridoxine HCl 0,50
Thiamine-HCl 0,10
FeNaEDTA 36,70
PHỤ LỤC 2
1.Kết quả thống kê chiều cao cây Trƣờng xuân hoa in vitro
7 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 16.66667 1 16.666667 .893 .3590
Within groups 970.14815 52 18.656695
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 986.81481 53
0 missing value(s) have been excluded.
Table of means for 7NGAY.DAITHAN by 7NGAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 27.407407 .8256212 .8312573 26.227656 28.587159
2 27 26.296296 .8368555 .8312573 25.116545 27.476048
--------------------------------------------------------------------------------
Total 54 26.851852 .5877877 .5877877 26.017642 27.686062
Multiple range analysis for 7NGAY.DAITHAN by 7NGAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
2 27 26.296296 X
1 27 27.407407 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 1.11111 2.35950
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
14 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 121.5000 1 121.50000 2.875 .0960
Within groups 2197.9259 52 42.26781
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 2319.4259 53
0 missing value(s) have been excluded.
Table of means for DC14NGAY.DAITHAN by DC14NGAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 40.037037 1.1391523 1.2511892 38.261303 41.812771
2 27 37.037037 1.3539869 1.2511892 35.261303 38.812771
--------------------------------------------------------------------------------
Total 54 38.537037 .8847243 .8847243 37.281403 39.792671
Multiple range analysis for DC14NGAY.DAITHAN by DC14NGAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
2 27 37.037037 X
1 27 40.037037 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 3.00000 3.55147
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
21 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 3.6296 1 3.629630 .128 .7257
Within groups 1474.0741 52 28.347578
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 1477.7037 53
0 missing value(s) have been excluded.
Table of means for DC21DAY.DAITHAN by DC21DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 45.185185 .9168213 1.0246513 43.730962 46.639409
2 27 44.666667 1.1221672 1.0246513 43.212443 46.120890
--------------------------------------------------------------------------------
Total 54 44.925926 .7245379 .7245379 43.897635 45.954217
Multiple range analysis for DC21DAY.DAITHAN by DC21DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
2 27 44.666667 X
1 27 45.185185 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 0.51852 2.90845
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
28 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups .0185 1 .018519 .000 .9841
Within groups 2332.0741 52 44.847578
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 2332.0926 53
0 missing value(s) have been excluded.
Table of means for DC28DAY.DAITHAN by DC28DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 47.111111 1.3891453 1.2888062 45.281989 48.940233
2 27 47.148148 1.1799654 1.2888062 45.319026 48.977270
--------------------------------------------------------------------------------
Total 54 47.129630 .9113236 .9113236 45.836245 48.423014
Multiple range analysis for DC28DAY.DAITHAN by DC28DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 47.111111 X
2 27 47.148148 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -0.03704 3.65824
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
35 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 29.6296 1 29.629630 .725 .4075
Within groups 2125.4074 52 40.873219
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 2155.0370 53
0 missing value(s) have been excluded.
Table of means for DC35DAY.DAITHAN by DC35DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 49.666667 1.3888034 1.2303751 47.920472 51.412861
2 27 51.148148 1.0482705 1.2303751 49.401954 52.894342
--------------------------------------------------------------------------------
Total 54 50.407407 .8700066 .8700066 49.172662 51.642153
Multiple range analysis for DC35DAY.DAITHAN by DC35DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 49.666667 X
2 27 51.148148 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -1.48148 3.49239
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
2. Kết quả thống kê số rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro
14 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 12.518519 1 12.518519 44.161 .0000
Within groups 14.740741 52 .283476
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 27.259259 53
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for SR14DAY.SORE by SR14DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 2.2222222 X
2 27 3.1851852 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -0.96296 0.29084 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
21 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 20.166667 1 20.166667 16.734 .0001
Within groups 62.666667 52 1.205128
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 82.833333 53
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for SR21DAY.SORE by SR21DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 3.0000000 X
2 27 4.2222222 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -1.22222 0.59968 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference
28 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 25.351852 1 25.351852 47.332 .0000
Within groups 27.851852 52 .535613
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 53.203704 53
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for SR28DAY.SORE by SR28DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 4.7407407 X
2 27 6.1111111 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -1.37037 0.39979 *
--------------------------------------------------------------------------------
denotes a statistically significant difference
35 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 71.185185 1 71.185185 105.873 .0000
Within groups 34.962963 52 .672365
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 106.14815 53
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for SR35DAY.sore by SR35DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
2 27 6.0370370 X
1 27 8.3333333 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 2.29630 0.44793 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
3. Kết quả thống kê chiều dài rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro
14 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 389.35185 1 389.35185 1333.293 .0000
Within groups 15.18519 52 .29202
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 404.53704 53
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for DR14DAY.DAIRE by DR14DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 2.2222222 X
2 27 7.5925926 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference +/- limits
1 - 2 -5.37037 0.29520 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
21 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 4.166667 1 4.1666667 7.927 .0069
Within groups 27.333333 52 .5256410
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 31.500000 53
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for DR21DAY.DAIRE by DR21DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 5.2222222 X
2 27 5.7777778 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 0.55556 0.39605 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
28 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 266.66667 1 266.66667 216.166 .0000
Within groups 64.14815 52 1.23362
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 330.81481 53
0 missing value(s) have been excluded
Multiple range analysis for DR28DAY.DAIRE by DR28DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 5.629630 X
2 27 10.074074 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference +/- limits
1 - 2 -4.44444 0.60673 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
35 ngày
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 317.79630 1 317.79630 157.108 .0000
Within groups 105.18519 52 2.02279
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 422.98148 53
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for DR35DAY.daire by DR35DAY.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 27 7.592593 X
2 27 12.444444 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -4.85185 0.77692 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
4. XỬ LÝ SỐ LIỆU CÂY TRUỜNG XUÂN HOA IN VITRO TRÊN MÔI TRƯỜNG CHỨA NAA
CAO CÂY TRÊN MOI TRUƠNG CÓ NAA
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 1124.938 5 224.98765 2.785 .0194
Within groups 12603.704 156 80.79297
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 13728.642 161
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for CCNAA.Caocay by CCNAA.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
6 27 49.296296 X
5 27 49.518519 X
2 27 51.814815 XX
1 27 51.851852 XX
3 27 55.666667 X
4 27 55.925926 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 0.03704 4.83333
1 - 3 -3.81481 4.83333
1 - 4 -4.07407 4.83333
1 - 5 2.33333 4.83333
1 - 6 2.55556 4.83333
2 - 3 -3.85185 4.83333
2 - 4 -4.11111 4.83333
2 - 5 2.29630 4.83333
2 - 6 2.51852 4.83333
3 - 4 -0.25926 4.83333
3 - 5 6.14815 4.83333 *
3 - 6 6.37037 4.83333 *
4 - 5 6.40741 4.83333 *
4 - 6 6.62963 4.83333 *
5 - 6 0.22222 4.83333
* denotes a statistically significant difference.
SỐ RỄ TRÊN MOI TRUƠNG CÓ NAA
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 216.27160 5 43.254321 147.401 .0000
Within groups 45.77778 156 .293447
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 262.04938 161
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for SRNÁA.SORE by SRNAA.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
6 27 .6666667 X
5 27 1.9259259 X
1 27 2.9259259 X
2 27 3.0000000 X
4 27 3.6666667 X
3 27 4.1851852 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -0.07407 0.29129
1 - 3 -1.25926 0.29129 *
1 - 4 -0.74074 0.29129 *
1 - 5 1.00000 0.29129 *
1 - 6 2.25926 0.29129 *
2 - 3 -1.18519 0.29129 *
2 - 4 -0.66667 0.29129 *
2 - 5 1.07407 0.29129 *
2 - 6 2.33333 0.29129 *
3 - 4 0.51852 0.29129 *
3 - 5 2.25926 0.29129 *
3 - 6 3.51852 0.29129 *
4 - 5 1.74074 0.29129 *
4 - 6 3.00000 0.29129 *
5 - 6 1.25926 0.29129 *
* denotes a statistically significant difference. .
DÀI RỄ TRÊN MOI TRUỜNG CÓ NAA
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 462.86420 5 92.572840 187.280 .0000
Within groups 77.11111 156 .494302
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 539.97531 161
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for DRNAA.DAIRE by DRNAA.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
6 27 1.1111111 X
5 27 2.4444444 X
1 27 4.1851852 X
2 27 5.2222222 X
3 27 5.4814815 XX
4 27 5.6296296 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference +/- limits
1 - 2 -1.03704 0.37806 *
1 - 3 -1.29630 0.37806 *
1 - 4 -1.44444 0.37806 *
1 - 5 1.74074 0.37806 *
1 - 6 3.07407 0.37806 *
2 - 3 -0.25926 0.37806
2 - 4 -0.40741 0.37806 *
2 - 5 2.77778 0.37806 *
2 - 6 4.11111 0.37806 *
3 - 4 -0.14815 0.37806
3 - 5 3.03704 0.37806 *
3 - 6 4.37037 0.37806 *
4 - 5 3.18519 0.37806 *
4 - 6 4.51852 0.37806 *
5 - 6 1.33333 0.37806 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
.
5. XỬ LÝ SỐ LIỆU CÂY TRUỜNG XUÂN HOA IN VITRO TRÊN MÔI TRƯỜNG CHỨA IAA
CAO CÂY TRÊN MOI TRUƠNG CÓ IAA
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 560.9938 5 112.19877 2.637 .0256
Within groups 6638.3704 156 42.55366
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 7199.3642 161
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for CCIAA.CAOCAY by CCIAA.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
6 27 46.333333 X
5 27 48.740741 XX
4 27 49.407407 XX
3 27 50.407407 X
2 27 51.518519 X
1 27 51.851852 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 2.44444 3.50775
1 - 3 1.44444 3.50775
1 - 4 0.33333 3.50775
1 - 5 3.11111 3.50775
1 - 6 5.51852 3.50775 *
2 - 3 -1.00000 3.50775
2 - 4 -2.11111 3.50775
2 - 5 0.66667 3.50775
2 - 6 3.07407 3.50775
3 - 4 -1.11111 3.50775
3 - 5 1.66667 3.50775
3 - 6 4.07407 3.50775 *
4 - 5 2.77778 3.50775
4 - 6 5.18519 3.50775 *
5 - 6 2.40741 3.50775
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference * denotes a
statistically significant difference.
SỐ RỄ TRÊN MOI TRUƠNG CÓ IAA
One-Way Analysis of Variance
--------------------------------------------------------------------------------
Data: SRIAA.SORE
Level codes: SRIAA.NT
Labels:
Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 191.30864 5 38.261728 104.242 .0000
Within groups 57.25926 156 .367047
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 248.56790 161
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for SRIAA.SORE by SRIAA.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
6 27 2.5925926 X
5 27 2.6666667 XX
1 27 2.9259259 X
3 27 4.0370370 X
2 27 4.2962963 X
4 27 5.6296296 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -1.37037 0.32578 *
1 - 3 -1.11111 0.32578 *
1 - 4 -2.70370 0.32578 *
1 - 5 0.25926 0.32578
1 - 6 0.33333 0.32578 *
2 - 3 0.25926 0.32578
2 - 4 -1.33333 0.32578 *
2 - 5 1.62963 0.32578 *
2 - 6 1.70370 0.32578 *
3 - 4 -1.59259 0.32578 *
3 - 5 1.37037 0.32578 *
3 - 6 1.44444 0.32578 *
4 - 5 2.96296 0.32578 *
4 - 6 3.03704 0.32578 *
5 - 6 0.07407 0.32578
* denotes a statistically significant difference.
DÀI RỄ TRÊN MOI TRUỜNG CÓ IAA
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 88.938272 5 17.787654 41.902 .0000
Within groups 66.222222 156 .424501
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 155.16049 161
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for DRIAA.DAIRE by DRIAA.NT
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
6 27 3.7777778 X
1 27 4.1851852 X
5 27 4.6666667 X
2 27 4.8148148 X
3 27 5.6666667 X
4 27 5.8518519 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference +/- limits
1 - 2 -0.62963 0.35035 *
1 - 3 -1.48148 0.35035 *
1 - 4 -1.66667 0.35035 *
1 - 5 -0.48148 0.35035 *
1 - 6 0.40741 0.35035 *
2 - 3 -0.85185 0.35035 *
2 - 4 -1.03704 0.35035 *
2 - 5 0.14815 0.35035
2 - 6 1.03704 0.35035 *
3 - 4 -0.18519 0.35035
3 - 5 1.00000 0.35035 *
3 - 6 1.88889 0.35035 *
4 - 5 1.18519 0.35035 *
4 - 6 2.07407 0.35035 *
5 - 6 0.88889 0.35035 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
PHỤ LỤC 3
Khối lƣợng của cây Trƣờng xuân hoa trƣớc và sau khi đông khô
Hàm lượng nước trong mẫu cây tươi = (0,683 - 0,088)*100/0,683 =87,1%
0,6 g vật liệu tươi = 0,6*(100 – 87,1)/100 = 0,0774 (g) =77,4 (mg) chất khô
x (mg) alkaloid/ 0,6 (g) vật liệu tươi = x*100/ 77,4(mg) alkaloid/100 mg chất khô
PHỤ LỤC 4
1. Kết quả chất chuẩn catharanthine (20mg/l) khi phân tích bằng CE
Trọng lượng tươi Trọng lượng khô
0,5287 0,0673
0,5202 0,1117
0,4794 0,0589
0,5394 0,0645
0,4653 0,0558
0,471 0,064
1,043 0,1259
0,8399 0,1006
0,7234 0,0937
0,5919 0,0797
0,8955 0,1154
1,10151 0,119
Trung bình 0,6832675 0,088041667
2. Kết quả chất chuẩn vindoline (20mg/l) khi phân tích bằng CE
3. Kết quả của mẫu Trƣờng xuân hoa khô khi phân tích bằng CE
4. Kết quả CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa tƣơi
5. Kết quả CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa in vitro
6. Kết quả CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa in vivo
7. Sắc kí đồ CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa 7 ngày tuổi
8. Sắc kí đồ CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa 14 ngày tuổi
9. Sắc kí đồ CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa 21 ngày tuổi
10. Sắc kí đồ CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa 28 ngày tuổi
11. Sắc kí đồ CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa 35 ngày tuổi
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- CAO THI THANH LOAN.pdf