Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đường ruột của cây Xuân Hoa (pseuderanthemum palatiferum)

vào môi trường tăng sinh để Salmonella phát triển nhiều và kìm hãm các vi khuẩn khác. Sau đó cấy chuyển vào môi trường có tinh ức chế chọn lọc. 20 Môi trường phân lập thích hợp nhất là SS (Salmonella – Shigella), ở nước ta các phòng xét nghiệm thường dùng môi trường Endo hoặc môi trường Istrati vì nó dễ sản xuất trong điều kiện phòng thí nghiệm và cho kết quả tốt. Chỉ riêng cấy phân, dù phân lập được vi khuẩn cũng không cho phép ta xác định chắc chắn bệnh nhân mắc bệnh vì người lành cũng có thể mang vi khuẩn thương hàn. Cấy phân ngoài mục đích chuẩn đoán cón có giá trị kiểm tra sau khi bệnh nhân đã hết các dấu hiệu lâm sàn có còn tiếp tục đào thải vi khuẩn nữa hay không. Cấy phân còn là phương pháp để phát hiện người lành mang vi khuẩn. 2.3.4.3. Chuẩn đoán gián tiếp Tiến hành phản ứng Widal để xác định kháng thể trong huyết thanh. Sau khi nhiễm Salmonella 7 – 10 ngày, trong máu sẽ xuất hiện kháng thể kháng kháng nguyên O, sau 12 – 14 ngày xuất hiện kháng thể kháng kháng nguyên H. Kháng thể tồn tại trong máu trung bình là 3 tháng đối với kháng thể O và 1 - 2 năm đối với kháng thể H. Phản ứng Widal là phản ứng ngưng kết. Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng dần thành nhiều độ đậm khác nhau, trộn riêng biệt với kháng nguyên O và kháng nguyên H để xác định hiệu giá kháng thể O. Trong giai đoạn đầu có thể chỉ thấy kháng thể O. Đến giai đoạn toàn phát sẽ thấy cả kháng thể O và H. Việc phân tích kết quả xét nghiệm ở lần thứ nhất nhiều khi rất khó và thường không cho phép ta kết luận chắc chắn. Phản ứng cần được làm hai lần để xác định động lực kháng thể: lần đầu làm ở tuần thứ nhất, lần hai làm ở tuần thứ hai của bệnh. Nếu động lực kháng thể cao thì mới cho phép chuẩn đoán chắc chắn. Nhược điểm của phương pháp chuẩn đoán gián tiếp là cho kết quả chậm. 2.3.5. Phòng bệnh 2.3.5.1. Phƣơng pháp phòng bệnh chung không đặc hiệu Những biện pháp chủ yếu là: Thực hiện vệ sinh ăn uống: Ăn chín, uống nước đã được đun sôi, rửa tay trước khi ăn, diệt ruồi. Cung cấp và sử dụng nước sạch. Quản lý, xử lý phân 21 Phát hiện người lành mang vi khuẩn, đặc biệt lưu ý những người liên quan trực tiếp với ăn uống tập thể, như những người cấp dưỡng ở các cơ quan, những người chế biến thức ăn, phục vụ ở các cửa hàng ăn uống. Chuẩn đoán sớm và cách ly bệnh nhân kịp thời, xử lý chất thải của bệnh nhân. Đối với xúc vật bị bệnh: chữa triệt để hoặc giết. 2.3.5.2. Phƣơng pháp phòng bệnh đặc hiệu Trước đây người ta xử dụng rộng rãi vacxin TAB. Đây là loại vacxin chết, 1 ml chứa khoảng 1 tỉ S. typhi, 250 triệu S. paratyphi A và 250 triệu S. paratyphi B. Vacxin TAB được đưa vào cơ thể qua đường tiêm, hiệu lực không cao và chỉ duy trì được 6 tháng. Sau đó người ta sản xuất loại vacxin chứa kháng nguyên Vi của S. typhi, đưa vào cơ thể bằng đường tiêm, có hiệu lực bảo vệ trên 70 % với liều 25 μg. Ngày nay, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đang nghiên cứu loại vacxin sống, giảm độc lực, đưa vào cơ thể bằng đường uống để kích thích miễn dịch tiết tại ruột. Loại vacxin này đã được thử nghiệm ở một số nước nhưng kết quả đã được công bố khác nhau khá nhiều. 2.3.6. Điều trị Những kháng sinh thường được dùng để điều trị Salmonella là chloramphenicol và ampicillin. Trước đây chloramphenicol là loại kháng sinh có hiệu lực gần như tuyệt đối trong điều trị các Salmonella nói chung và các Salmonella gây bệnh thương hàn nói riêng. Tuy nhiên hiện nay tỷ lệ Salmonella kháng thuốc ngày càng tăng. Ở nước ta, những năm gần đây đã xuất hiện nhiều vụ dịch thương hàn do vi khuẩn kháng thuốc gây nên. Theo kết quả của Chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh công bố năm 1999, đã có tới 40 % S. typhi (phân lập năm 1998) kháng lại ampicillin và 62 % kháng lại chloramphenicol. 2.4. Escherichia coli [3],[12],[29] Escherichia do Escherich phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Giống Escherichia được chọn là đại biểu điển hình của họ vi khuẩn đường ruột. Giống này gồm nhiều loài như E. coli, E. adecarbonxylase, E. blattae, E. fergusonii, E. hermanii và E. vulneris; 22 trong số đó, E. coli có vai trò quan trọng nhất và được chọn làm đại biểu điển hình của giống Escherichia. 2.4.1. Đặc điểm sinh học 2.4.1.1. Hình thái E. coli là trực khuẩn Gram (-), hình que thẳng. Kích thước dài, ngắn khác nhau, trung bình từ 2 – 3 x 0,5 μm; trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài (6 – 8 μm). Rất ít chủng E. coli có vỏ, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di động. Hình 2.3: Escherichia coli 2.4.1.2. Tính chất nuôi cấy E. coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi. Phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Phát triển được ở nhiệt độ từ 5 – 400C, phát triển tốt nhất ở 37 0 C, pH 7 – 7,2. Trong những điều kiện thích hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 – 30 phút. Cấy vào môi trường lỏng sau 3 – 4 giờ đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau 2 ngày trên mặt môi trường có váng mỏng. Những ngày sau dưới đáy ống có thể thấy cặn. Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 – 10 giờ, dùng kính lúp có thể quan sát được khuẩn lạc. Sau 24 giờ đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5 mm. Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng cũng có thể gặp dạng R, hoặc M. 23 2.4.1.3. Tính chất hoá sinh Lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như lactose (trừ E. coli loại EIEC), glucose, manitol, ramnose…Người ta dựa vào khả năng lên men đường lactose để phân biệt E. coli với các loài vi khuẩn đường ruột khác ONPG (+), urease (-), H2S (-), LDC (+).ff Nghiệm pháp IMVIC: I+ M+ V- I- C-, indol (+), methyl red (+), Vosges Proskauer (-), lên men đường inositol (-), citrat simmons (-). 2.4.1.4. Sức đề kháng E. coli có sức đề kháng yếu. Các chất sát khuẩn thông thường như nước Javel 1/200; phenol 1/200 giết chết vi khuẩn sau 2 – 4 phút. Nhiệt độ 550C giết chết vi khuẩn sau 1 giờ và nhiệt độ 600C giết chết vi khuẩn sau 30 phút. 2.4.1.5. Cấu tạo kháng nguyên Cấu tạo kháng nguyên của E. coli rất phức tạp. E.coli có đủ ba loại kháng nguyên O, H, K. Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân. Hiện nay người ta đã biết tới gần 160 yếu tố kháng nguyên O của E. coli. Kháng nguyên K: Là kháng nguyên bề mặt. Khoảng 100 loại yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và chia làm 3 loại dựa vào độ nhạy cảm của của kháng nguyên này với nhiệt độ: A, B và L, trong đó A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ có thể quan sát được nhờ kính hiển vi điện tử. Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lông. Hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định. 2.4.1.6. Phân loại Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E. coli được chia thành các typ huyết thanh. Với sự tổng hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều typ huyết thanh 24 khác nhau. Mỗi typ huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụ O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B). Dựa vào tính chất gây bệnh, người ta chia E. coli thành các loại: - EPEC (Enteropathogenic E. coli): E. coli gây bệnh đường ruột. - ETEC (Enterotoxigenic E. coli): E. coli sinh độc tố ruột. - EIEC (Enteroinvasive E. coli ): E. coli xâm nhập đường ruột. - EAEC (Enteroadherent E. coli): E. coli bám dính đường ruột. - EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli): E. coli gây chảy máu đường ruột. 2.4.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh Trong đường tiêu hóa E. coli chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80 %). Tuy nhiên, E. coli cũng là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong số các vi khuẩn gây ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E. coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương. Theo báo cáo của chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh thường gặp (1988 – 1994) thì E. coli đứng hàng thứ hai (sau S. aureus) về tỷ lệ phân lập được từ các loại bệnh phẩm ở nước ta. Những typ huyết thanh thường găp trên lâm sàn là: O111B4, O86B57, O126B16, O55B5, O119B4, O127B8, O26B6, O25B15, O128B12. Cơ chế gây bệnh của E.coli khác nhau tuỳ loài: ETEC: Gây bệnh do ngoại độc tố LT, là loại độc tố ruột giống độc tố ruột của V. cholerae. Độc tố này bám vào thụ thể ở ruột, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết nước và ion Cl-. EIEC: Gây bệnh do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Cơ chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ. EAEC: Gây bệnh do bám vào niêm mạc và làm tổn thương chức năng ruột. Cơ chế của hiện tượng này chưa được sáng tỏ. EHEC: Cơ chế cũng chưa hoàn toàn rõ ràng, nhưng người ta đã xác định được một loại độc tố có cấu trúc kháng nguyên và cơ chế tác động giống S. shiga. Trong quá trình gây bệnh, EHEC làm tổn thương xuất huyết ở ruột. EPEC: Cơ chế gây bệnh chưa được biết rõ. 25 2.4.3. Chuẩn đoán vi sinh vật 2.4.3.1. Chuẩn đoán trực tiếp Bệnh phẩm khác nhau tùy từng bệnh: - Phân với nhiễm khuẩn đường tiêu hoá. - Nước tiểu với nhiễm khuẩn đường tiết niệu. - Máu nếu là nhiễm khuẩn máu… Có thể làm tiêu bản soi trực tiếp với một số loại bệnh phẩm như cặn ly tâm nước tiểu hoặc nước não tủy. Phương pháp chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập. Bệnh phẩm được nhân lên trên môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo. Nước tiểu giữa dòng được tiến hành cấy đếm trên thạch thường. Máu được cấy vào canh thang. Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hóa học và định loại bằng kháng huyết thanh mẫu. Đối với viêm màng não, hiện nay người ta còn tiến hành phương pháp chuẩn đoán nhanh và đặc hiệu bằng kỹ thuật ngưng kết lactex để xác định kháng nguyên trong dịch não tủy. 2.4.3.2. Chuẩn đoán gián tiếp Trên thực tế chuẩn đoán gián tiếp không được sử dụng trong chuẩn đoán các nhiễm khuẩn do E. coli. 2.4.4. Phòng bệnh Hiện nay chưa có phương pháp phòng bệnh đặc hiệu. Để đề phòng nhiễm khuẩn đường tiêu hóa do E. coli, thực hiện các biện pháp phòng bệnh chung không đặc hiệu giống như đối với các vi khuẩn đường ruột khác. 2.4.5. Chữa bệnh E. coli thuộc vào các vi khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là chủng phân lập được từ nước tiểu, vì vậy cần làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp. Ngoài việc sử dụng kháng sinh, một số việc khác rất có giá trị như bồi phụ nước, điện giải trong trường hợp tiêu chảy (việc này nhiều khi có vai trò quyết định để cứu sống bệnh nhân), giải quyết những cản trở trên đường tiết niệu, rút ống thông sớm nếu có thể được… 26 Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu 3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1.1. Nguyên liệu Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum). Bộ phận dùng : lá. Thu hái tại vườn thực vật ĐH Cần Thơ. 3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn: Giai đoạn 1: Tiến hành thí nghiệm phân tích thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 7/2004, tại Phòng Hóa Lý- Trung Tâm Phân Tích ĐHNL và Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên. Giai đoạn 2: Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao được điều chế từ lá Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ 4/8/2005 đến 26/8/2005. Thực hiện tại phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Khoa Công Nghệ Môi Trường. 3.1.1.3. Hóa chất cần thiết  Hóa chất dùng cho phân tích thành phần hóa học - Ete dầu hỏa: chưng cất phân đọan < 900C. - Etylacetat: chưng cất phân đoạn ở 64 - 65oC, làm khan bằng Na2SO4. - Chloroform: chưng cất phân đoạn ở 60 - 61oC, làm khan bằng Na2SO4. - Ethanol : chưng cất phân đoạn ở 78oC, làm khan bằng Na2SO4. - Nước cất hai lần. - Thuốc thử hiện hình: H2SO410 % / C2H5OH, đèn UV 254nm. - Hạt silicagel dùng cho sắc ký cột: kích thước hạt 0,04 – 0,063 mm, dùng lượng silicagel gấp 30 lần lượng cao, hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút trước khi sử dụng. - Bản mỏng silicagel loại 25 DC - alufolien 20 x 20 cm, kieselgel 60 F254 , Merck. - Na2SO4, Na2CO3, FeCl3. 27 - Mg kim loại. - Natri acetat. - H2SO4 10%, H2SO4 1%, H2SO4 đđ, HCl đđ. - Thuốc thử: Liebermann, Fehling, Mayer, Bouchardat, Bertrand, Bouchardat, Dragendorff...  Hóa chất dùng cho thử nghiệm vi sinh - H2SO4 1 %, BaCl2.2H2O. - Dung môi DMSO (dimethysulfoside). - Nước cất. - Môi trường lỏng BHI. - Agar. - Cồn 960, cồn 700. 3.1.1.4. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm  Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm sử dụng cho thí nghiệm phân tích thành phần hóa học lá Xuân Hoa - Bộ soxhlet 6 chỗ (Đức). - Bộ chưng cất dung môi (Việt nam). - Máy cô quay hiệu Buchi (Đức) - Tủ sấy (Memmert). - Bếp hồng ngoại (Scott, Đức). - Bình lắng (Duran, Đức). - Ống chạy sắc ký cột kích thước 5 x 100 cm và 2,5 x 40 cm. - Điểm nóng chảy xác định trên máy BUCHI melting point - B545. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy quang phổ hồng ngoại BURKER - IFS48 - Carlo Erba - GC 6130. - Phổ 1H-NMR ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân AV - 500, tần số cộng hưởng 500 MHz tại Viện Hóa học, Hà Nội. - Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân AV - 500, tần số cộng hưởng 125 MHz tại Viện Hóa học, Hà Nội.  Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm cần cho thử nghiệm vi sinh - Tủ cấy vô khuẩn (Nuaire). 28 - Autoclave (Tomy SS – 325). - Tủ ấm (Memmert). - Cân điện tử (Sartorius). - Bếp điện (Airlux). - Pipette loại 100 – 1000 μl. - Đầu tipe loại 1000 μl. - Ống nghiệm. - Que cấy trang, que cấy vòng. - Đèn cồn... 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Xử lý nguyên liệu [19],[20] Nguyên liệu sau khi thu hái rửa sạch, để khô, sấy khô đến trọng lượng không đổi sau đó xay thành bột. 3.2.2. Xác định độ ẩm -Nguyên tắc : Mẫu được sấy ở 1050C nước sẽ bốc hơi và làm giảm khối lượng. Cân rồi suy ra độ ẩm. -Tiến hành : sấy trong chén sứ đến khối lượng không đổi. Cân chính xác 10 g mẫu sấy ở 1050C trong 2 giờ, sau đó lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 15 phút, sau đó cân thu khối lượng còn lại (a g) và tính độ ẩm mẫu theo công thức:. Độ ẩm mẫu = (10 - a ) x 100 % 3.2.3. Xác định tro toàn phần Tro toàn phần là lượng hợp chất vô cơ còn lại khi nung cháy hoàn toàn mẫu nguyên liệu, các ion còn lại ở dạng carbonat hay oxit. - Tiến hành : Nung chén sứ đến khối lượng không đổi. Cân chính xác 10 g mẫu trải đều thành một lớp mỏng. Đặt vào lò nung ở nhiệt độ 6000C trong 3 giờ, lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân khối lượng tro còn lại (b g) và tính hàm lượng tro theo công thức: Hàm lượng tro = b/10 x 100 % 29 3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật [6],[16],[20],[22] 3.3.1. Nguyên tắc Dựa vào độ hòa tan trong các dung môi khác nhau của các hợp chất trong nguyên liệu mà phân tích, dùng các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether, ethanol và nước. Sau đó xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng. 3.3.2. Cách tiến hành Chuẩn bị dịch chiết: - Dịch chiết ether: Chiết 25 g mẫu bằng diethyl ether trong bể siêu âm cho đến khi dịch ether nhạt màu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50 ml. - Dịch chiết cồn: Bã sau khi chiết bằng ether được chiết nóng bằng cồn 960 trong bể siêu âm đến khi dịch gần không màu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50 ml. - Dịch chiết nƣớc: Bã sau khi chiết bằng cồn 960, đem chiết nóng trong bể siêu âm 5 phút (3 lần) với thể tích nước vừa đủ ngập mẫu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50ml. Xác định các nhóm hợp chất: Xác định các nhóm hợp chất trong dịch ether: Chất béo Anthraglycosid Triterpenoid tự do Alkaloid Flavonoid Coumarin Tinh dầu Carotenoid Acid hữu cơ Xác định các nhóm hợp chất trong dịch cồn: Alkaloid Antraglycosid Tanin Đường khử Flavonoid Saponin 30 Xác định các nhóm hợp chất trong dịch nƣớc: Alkaloid Antraglycosid Saponin Flavonoid Tanin Polyuronic Đường khử Phương pháp định tính: Acid hữu cơ: Lấy 2 ml dịch thử cho vào ống nghiệm. Pha loãng với 1 ml nước cất, thêm một ít tinh thể NaCO3. Nếu có bọt khí sủi lên từ các tinh thể NaCO3 - Có acid hữu cơ. Alkaloid: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử trong chén sứ, hòa cắn với 4 ml HCl 1%. Chia đều trong 4 ống nghiệm, nhỏ lần lượt vào đó các thuốc thử sau cùng với kết quả nhận định là có alkaloid: Thuốc thử Valse-Mayer: Tủa trắng – vàng nhạt Bertrand : Tủa trắng Bouchardat : Tủa đỏ nâu Dragendorff : Tủa đỏ cam Antraglycosid: Phản ứng Bortrager: Cho 5 ml dịch thử vào một ống nghiệm nhỏ, thêm vào đó NaOH 10 %, lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu từ hồng tới đỏ - Có anthraglycosid. Carotenoid: Phản ứng 1: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ, nhỏ vào đó vài giọt thuốc thử Carr-Price (SbCl3 bão hòa trong CHCl3). Dung dịch có màu đỏ - Có carotenoid. Phản ứng 2: Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đậm đặc. Dung dịch có màu xanh dương - Có carotenoid. Chất béo: Nhỏ vài giọt dịch ether lên cùng một chỗ trên giấy xác định chất béo, sấy nhẹ cho hết dung môi, hết mùi tinh dầu (nếu có). Chỗ nhỏ để lại vết mờ - Có chất béo. 31 Đƣờng khử: Bốc hơi 5 ml dịch thử đến cắn. Hòa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy. Để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm - Có các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử). Coumarin: Phản ứng 1: Nhỏ vài giọt dịch thử lên một miếng giấy lọc, sấy nhẹ. Nhỏ lên đó hai giọt KOH 10 % trong cồn, tiếp tục sấy nhẹ cho khô. Che một nửa vết chấm bằng một miếng kim loại, soi UV365 nm. Sau vài phút lấy miếng kim loại ra; nhận xét sự thay đổi cường độ phát quang của nửa mặt bị che: sáng dần lên đến khi sáng tương đương với nửa không bị che – có coumarin. Phản ứng 2: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử. Hòa cắn với 2 ml cồn 700, chia đều vào hai ống nghiệm nhỏ, thêm vào ống thứ nhất 0,5 ml KOH 10 % và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương. Đun cách thuỷ cả hai ống nghiệm trong 2 phút, để nguội soi UV365 nm. Dung dịch trong ống một có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ hai - có coumarin. Flavonoid: Phản ứng Cyanidin: Lấy khoảng 10 ml dịch thử cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn khô. Hòa cắn với 2 ml cồn 250 gạn dịch cồn cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào đó một ít bột Mg kim loại và thêm từ từ 0,5 ml HCl đậm đặc. Sau phản ứng dung dịch có màu từ hồng tới đỏ - có flavonoid. Anthocyanosid: Lấy 1 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt HCl 10 %, nếu dung dịch có màu từ hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10 % - Có anthocyanosid. Proanthocyanidin: Lấy 5 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm, thêm 2 ml HCl 10 %, đun cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ - có proanthocyanidin. Polyuronic: Nhỏ từng giọt một 2 ml dịch thử vào một ống nghiệm có chứa 10 ml cồn 950. Nếu có nhiều tủa bông được tạo thành - có polyuronid. 32 Saponin: Lấy 5 ml dịch thử cho vào chén sứ bốc hơi tới cắn. Hòa cắn với 5 ml cồn 250 trên bếp cách thủy. Lọc, cho dịch lọc vào ống nghiệm. Thêm 5 ml nước, lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu có bọt bền - có saponin. Tanin: Bốc hơi tới cắn dịch thử trong chén sứ, hòa cắn với 4 ml nước cất trên bếp cách thủy. Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm: Ống 1: Pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1:2, thêm hai giọt thuốc thử FeCl3 5 %, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh rêu hay xanh đen - có polyphenol. Ống 2: Thêm 5 giọt dung dịch gelatin mặn, lắc đều so sánh với ống chứng. Nếu có tủa bông trắng - có tanin. Tinh dầu: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ; nếu cắn có mùi thơm nhẹ cho vào đó một ít cồn cao độ, bốc hơi tới cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng – có tinh dầu. Triterpenoid: Phản ứng Libermann-Burchard: bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử, hòa cắn với 0,5 ml anhydrid acetic và 0,5 ml CHCl3, chuyển dung dịch vào ống nghiệm, nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc theo thành ống đặt nghiêng. Nếu vòng ngăn cách có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím; lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím - có triterpennoid tự do (phytosterol). 33 Sơ đồ 3.1: Qui trình tổng quát phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật FeCl3 TT Fehling A, B Nguyên liệu Mg/HClđđ Chiết bằng ether Bã nguyên liệu Dịch Ether KOH 10% Chiết bằng cồn Lớp kiềm Lớp ether Dịch chiết cồn Bã nguyên liệu Dịch cồn Dịch ether Dịch acid Bã nguyên liệu Dịch acid H2SO4 10% vết trên giấy lọc KOH 10% Flavonoid Acid béo Anthraglycosid Cắn có mùi thơm Liebermann H2SO4đđ Tinh dầu Phytosterol Carotenoid TT Mayer, Bouchardat, Dragendoft Alkaloid KOH, HCl TT Fehling A, B TT Mayer, Bouchardat Na2CO3 Na Acetat + FeCl3 3% Mg/HClđđ KOH 10% Liebermann Anthraglycosid Sterolic Flavonoid Tanin Acid hữu cơ Alkaloid Đường khử Anthocyan Saponin Tạo bọt Cồn cao độ TT Mayer, Bouchardat H2SO4 1% H/c uronic Đường khử Tanin Alkaloid Saponin 34 3.4. Phƣơng pháp cô lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa Lấy 500 g mẫu khô, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đó lọc, dịch lọc được cô cạn dưới áp suất thấp còn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc. 3.4.1. Điều chế các loại cao 3.4.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa Cho 1500 ml dung môi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành 2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na2SO4, cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao ete dầu hỏa. 3.4.1.2 Điều chế cao CHCl3 Phần dịch nước còn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung môi CHCl3 vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm khan với Na2SO4 và cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl3. 3.4.1.3. Điều chế cao n-Butanol Phần dịch còn lại sau khi đã trích với CHCl3, được tiếp tục cho 1500 ml n- butanol vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên trên, làm khan với Na2SO4, cô cạn dung dịch dưới áp suất thấp thu được cao n-Butanol. 3.4.1.4. Điều chế cao nƣớc Phần nước cái còn lại tiến hành cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao thô H2O. 35 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ điều chế các loại cao thô từ lá Xuân Hoa Lá khô 500 g - Xay nhỏ, đun Soxhlet 72h với EtOH 70 %; 4lít, lọc Bã Dịch trích EtOH - Cô dưới áp suất thấp còn 1 lít, thêm 1 lit nước cất - Tận trích với ete dầu hỏa 1,5 lít. Pha nước Dịch trích CHCl3 Cao ete dầu hỏa Pha nước Dịch trích Ete dầu hỏa Cao CHCl3 Dịch trích n - Butanol Cao n - Butanol Pha nước Cao nước Tận trích với CHCl3; 2 lít - Làm khan với Na2SO4, Lọc - Cô cạn dưới áp suất thấp - Lọ c - Cô cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p - Làm khan với Na2SO4 - Lọc - Cô cạn dưới áp suất thấ p - Lọ c - Cô cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p Tận trích với n-Butanol - Cô cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p -Làm khan với Na2SO4, lọc - Cô cạn dưới áp suất thấp - Cô cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p Cô cạn dưới áp suất thấp - Cô cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p 36 3.4.2. Cô lập một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa Thực hiện sắc ký cột trên cao ete dầu hỏa, chất hấp phụ silicagel, dung môi giải ly là ete dầu hỏa, EtOAc và hỗn hợp của chúng với độ phân cực tăng dần. Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi giải ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là dung dịch H2SO4 10 %/EtOH. Các phân đoạn giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gộp lại. Tiến hành sắc ký cột tiếp theo các phân đoạn giống nhau, kết tinh thu được hợp chất sạch. 3.4.3. Xác định cấu trúc của hợp chất đã cô lập đƣợc Sử dụng phương pháp phổ nghiệm IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR…để xác định cấu trúc. 3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn [12],[23],[24],[25]26],[28] Làm kháng sinh đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC = Minimum Inhibitory Concentration) của các loại cao Xuân Hoa đã cô lập được có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn. Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên hai chủng vi sinh vật đường ruột: E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Nguồn: Salmonella typhimurium lấy từ viện Pasteur TP.HCM, E. coli ATCC 25922 lấy từ công ty Nam Khoa. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật sử dụng để tiến hành thử nghiệm là môi trường BHI. Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao Xuân Hoa: cao chloroform, cao ete dầu, cao n-butanol và cao nước. Dung môi sử dụng để hòa tan 4 loại cao là: dimethylsulfoside (DMSO) 3.5.1. Chuẩn bị môi trƣờng Cân 11,1 g BHI dạng tinh, cho vào 300 ml nước cất, đun và khuấy nhẹ để môi trường tan đều. Cho vào 2 bình tam giác, làm nút bông đậy lại. Sau đó tiến hành hấp vô trùng môi trường ở điều kiện 1210C trong vòng 20 phút bằng Autoclave. 3.5.2. Pha loãng cao Xuân Hoa Pha loãng cao chloroform Cân 0,04 g cao chloroform bằng cân điện tử cho vào 1 ống nghiệm chứa 2ml dung môi DMSO. Đun nhẹ ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn để cao hòa tan hoàn 37 toàn vào dung môi. Lúc này nồng độ của cao chloroform trong ống nghiệm là 0,02 g/ml. Tiến hành pha loãng dung dịch cao với môi trường dinh dưỡng theo tỉ lệ 1 ml dung dịch cao : 9 ml môi trường dinh dưỡng lỏng BHI. Lúc này ta thu được dung dịch cao hòa tan trong môi trường dinh dưỡng với nồng độ 0,002 g/ml (2000 μg/ml) Lấy 12 ống nghiệm, chia làm 2 nhóm, đánh số thứ tự từ 1C đến 6C mỗi nhóm. Cho vào các ống nghiệm dung dịch cao chloroform đã pha loãng trên lần lượt: - Ống nghiệm 1C, 100 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 2C, 200 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 3C, 300 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 4C, 400 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 5C, 500 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 6C, 600 μl mỗi ống. Dùng pipette hút hút môi trường dinh dưỡng BHI đã chuẩn bị ở trên cho vào 6 ống nghiệm ở trên theo thứ tự: - Ống số 6C 400 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 1200 μg/ml. - Ống số 5C 500 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 1000 μg/ml. - Ống số 4C 600 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 800 μg/ml. - Ống số 3C 700 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 600 μg/ml. - Ống số 2C 800 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 400 μg/ml. -Ống số 1C 900 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 200 μg/ml. Pha loãng các loại cao còn lại Tiến hành tương tự như qui trình pha loãng cao chloroform. Đánh số thứ tự từ 1B đến 6B đối với cao n-butanol, 1E đến 6E đối với cao ete dầu, 1H đến 6H đối với cao nước. 38 3.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục Dung dịch chuẩn độ đục trong ống Mc Farland 0.5 là dung dịch muối BaSO4.2H2O. a. Dung dịch dự trữ A: (0,048 M) BaCl2.2H2O 11,75 g Nước cất vừa đủ 1000 ml b. Dung dịch dự trữ B: (0,36 N) H2SO4 1% c. Dung dịch chuẩn độ đục: Dung dịch A 0,5 ml Dung dịch B 99,5 ml Chia vào các tube nút vặn có cùng kích cỡ với tube nuôi cấy hay pha cấy mầm mỗi ống 4 – 6 ml, vặn chặt nút. Giữ trong tối ở nhiệt độ phòng. Trước khi dùng lắc mạnh tube chứa độ đục chuẩn trên máy rung. Hằng tháng phải thay các tube độ đục chuẩn. 3.5.4. Chuẩn bị mầm cấy Tiêu chuẩn cần đạt được là 5x105 CFU/ml. Hai chủng vi sinh vật: E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium được cấy sang ống nghiệm chứa môi trường thạch TSA, ủ ở 370C qua đêm. Sau khi vi khuẩn mọc đều trên mặt thạch, tiến hành cấy chuyền vào môi trường lỏng đã chuẩn bị ở trên. Ủ ở 370C trong vòng 16-24 giờ. Điều chỉnh độ đục của canh vi khuẩn cấy ngang với độ đục của ống chuẩn Mc Farland 0.5 (tương đương 108 CFU/ml) bằng nước muối sinh lí 0,85 %. Hình 3.1: chuẩn độ đục vi khuẩn BHI Đ/C Huyền dịch Salmonella Dung dịch Mc Farland 0,5 Huyền dịch E. coli 39 Dùng pipette hút 1ml canh vi khuẩn cho vào 9 ml môi trường lỏng BHI. Trộn đều vi khuẩn vào môi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp canh vi khuẩn và môi trường BHI. Tiếp tục dùng pipette hút 3 ml dung dịch vi khuẩn vừa pha loãng ở trên cho vào 3 ống nghiệm chứa 9 ml môi trường lỏng BHI, mỗi ống 1 ml. Trộn đều vi khuẩn vào môi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp canh vi khuẩn và môi trường lỏng BHI. Lúc này mật độ vi khuẩn trong mỗi ống nghiệm là 10 6 CFU/ml. Tiến hành pha loãng như trên đối với cả hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Sau khi pha loãng ta thu được 3 ống nghiệm chứa 30ml huyền dịch vi khuẩn E. coli 106 CFU/ml và 3 ống nghiệm chứa 30ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella 106 CFU/ml. 3.5.5. Thử nghiệm Dùng 2 ống nghiệm để tiến hành thử dung môi. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 0,06 ml dung môi DMSO và 0,94 ml môi trường BHI. Sau đó cho vào ống thứ nhất 1 ml huyền dịch vi khuẩn E. coli, cho vào ống thứ hai 1ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella. Dùng 2 ống nghiệm để làm đối chứng, mỗi ống chứa 1ml môi trường BHI. Cho vào ống thứ nhất 1ml huyền dịch vi khuẩn E. coli, ống thứ hai 1ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella. Chia các ống nghiệm đã pha loãng các loại cao trên thành 2 nhóm giống nhau, mỗi nhóm dùng để thử nghiệm một chủng vi khuẩn. Cho vào các ống nghiệm của nhóm thứ nhất, mỗi ống 1 ml huyền dịch vi khuẩn E. coli đã pha loãng 106 CFU/ml. Cho vào các ống nghiệm của nhóm thứ hai, mỗi ống 1 ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella đã pha loãng 106 CFU/ml. Như vậy trong mỗi ống nghiệm mật độ vi khuẩn là 5 x 105 CFU/ml. Nồng độ của các loại cao trong ống nghiệm lần lượt là 600 μg/ml, 500 μg/ml, 400 μg/ml, 300 μg/ml, 200 μg/ml, 100 μg/ml đối với mỗi nhóm.. 40 Cao nước Cao ete dầu hỏa Cao n-butanol Cao CHCl3 Hình 3.2: Các ống nghiệm đã cấy huyền dịch vi khuẩn vào Sau khi đã cho huyền dịch vi khuẩn vào, ủ các ống nghiệm của hai nhóm, 2 ống nghiệm đối chứng và 2 ống nghiệm thử dung môi ở nhiệt độ 370C . Sau 16-20 giờ tiến hành đọc kết quả. Quan sát sự thay đổi độ đục của môi trường, sự tạo thành cặn ở đáy của ống nghiệm và sự tạo thành váng ở bề mặt môi trường. Sau khi ủ, xác định hai nồng độ kế cận nhau mà vi khuẩn làm đục và không làm đục môi trường. Chia nhỏ hai nồng độ trên thành nhiều khoảng nồng độ và tiến hành thử nghiệm như trên. Sau quá trình thử nghiệm ta xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của các loại cao đối với vi khuẩn thử nghiệm. 41 Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nguyên liệu Nguyên liệu sau khi thu hái rửa sạch, để khô, sấy ở 500C đến trọng lượng không đổi, sau đó xay thành bột. 4.1.1. Xác định độ ẩm Nung chén sứ đến khối lượng không đổi. Cân chính xác 10 g mẫu, cho vào chén sứ, sấy ở 1050C trong 2 giờ, lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 15 phút, sau đó cân thu được 1,1 g. Như vậy độ ẩm của mẫu là: Độ ẩm mẫu = (10 - 1,1 ) x 100 % = 89 % 4.1.2. Xác định tro toàn phần Nung chén sứ đến khối lượng không đổi. Cân chính xác 10 g mẫu trải đều thành một lớp mỏng. Đặt vào lò nung ở nhiệt độ 6000C trong 3 giờ, lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân khối lượng tro còn lại được 1,2 g. Như vậy hàm lượng tro của mẫu là: Hàm lượng tro = 1,2/10 x 100 % = 12% 4.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của lá cây Xuân Hoa được thu nhận ở bảng 4.1. 42 Bảng 4.1: Tóm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học lá cây Xuân Hoa: Tên hợp chất Thuốc thử Kết quả Loại dung dịch Ete Cồn Nước Antraglycosid KOH 10% Dung dịch màu đỏ - + - Flavonoid HClđđ+Mg kim loại Màu đỏ - + - Acd béo Nhỏ dd lên giấy lọc Để vết mờ + Alkaloid Mayer Tủa - + - Dragendorf Tủa - + - Bouchardat Tủa - + - Carotenoid H2SO4 Màu xanh nhạt + Phytosterol Anhydric acetic+H2SO4 Chỗ tiếp xúc có màu nhạt ++ Tinh dầu Bốc hơi tới cắn Mùi thơm nhẹ + Coumarin Soi UV Phát huỳnh quang + Polyphenol FeCl3 2% Màu xanh đen ++ + Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt + Đường khử Thuốc thử Fehling Đỏ gạch ++ + Antracyanosid HCl, NaOH Không màu + Saponin Lắc mạnh Tạo bọt Bền Bền Liebermann Có vòng tím nâu chuyển sang đỏ ++ + Hợp chất uronic Pha loãng EtOH 90% Tủa bông nhiều ++ Chú thích: ++: rất rõ;+: rõ; -: không có Nhận xét: - Từ dịch chiết ete ethylic đã xác định sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ trong lá cây Xuân Hoa là: acid béo, carotenoid, phytosterol, tinh dầu, coumarin, acid hữu cơ. - Từ dịch cồn đã xác định được các cấu tử hữu cơ: antraglycosid, flavonoid, alkaloid, polyphenol, đường khử, antracyanosid, saponin. - Từ dịch nước đã xác định được các cấu tử hữu cơ: polyphenol, đường khử, saponin và hợp chất uronic. 43 4.3. Cô lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa Lấy 500 g mẫu khô, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đó lọc, dịch lọc được cô cạn dưới áp suất thấp còn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc. 4.3.1. Điều chế các loại cao 4.3.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa Cho 1500 ml dung môi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành 2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na2SO4, cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao ete dầu hỏa 5,6 g. 4.3.1.2. Điều chế cao CHCl3 Phần dịch nước còn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung môi CHCl3 vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm khan với Na2SO4 và cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl3 9,8 g. 4.3.1.3. Điều chế cao n-butanol Phần dịch còn lại sau khi đã trích với CHCl3, được tiếp tục cho 1500 ml n- butanol vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên trên, làm khan với Na2SO4, cô cạn dung dịch dưới áp suất thấp thu được cao n-Butanol 15,2 g. 4.3.1.4. Điều chế cao nƣớc Phần nước còn lại tiến hành cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao H2O 25,7 g. Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi được tính theo công thức: H = 500 A x 100 % Trong đó: - H : hiệu suất chiết suất. - A : Khối lượng cao thu được. - 500 : khối lượng mẫu ban đầu. Bảng 4.2: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi Loại dung môi Khối lượng cao thu được (g) Hiệu suất (%) Ete dầu hỏa 5,6 1,12 Chloroform 9,8 1,98 n-butanol 15,2 3,04 Nước 25,7 5,14 44 0 1 2 3 4 5 6 Ete dầu hỏa Chloroform n-butanol Nước % Biểu đồ 4.1: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi 4.3.2. Cô lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa Cao ete dầu hỏa sau khi thu được, lấy 3 g để tiến hành chạy sắc ký cột, chất hấp phụ là silicagel, dung môi giải ly là hỗn hợp ete dầu hỏa và EtOAc với độ phân cực tăng dần. Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa cho 15 phân đoạn Ở phân đoạn 9 với dung môi giải ly Ete dầu : EtOAc 92 : 8 và phân đoạn 10 với dung môi giải ly E : EtOAc 90 : 10 sau khi cô cạn cho cặn màu vàng nhạt (0,235 g). Sắc ký lớp mỏng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là H2SO4 10 %/EtOH cho hai vết màu nâu đen, một vết đậm Rf = 0,23 và một vệt mờ Rf= 0,17. Kết quả sắc ký cột silicagel trên 3g cao ete dầu hỏa được tóm tắt ở bảng 4.3 Hiệu suất chiết suất (%) Ete dầu hỏa Chloroform n-butanol Nước 1,12 5,14 3,04 1,98 45 Bảng 4.3 : Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g) Phân đoạn Dung ly Thể tích (ml) Trọng lượng cặn (mg) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú 1 E(100%) 100 2 E:EtOAc 99:1 200 75 Vệt dài 3 E:EtOAc 98:2 200 86 Vệt dài 4 E:EtOAc 97:3 200 98 Vệt dài 5 E:EtOAc 96:4 200 112 Nhiều vết 6 E:EtOAc 95:5 200 153 Nhiều vết 7 E:EtOAc 94:6 200 256 Nhiều vết 8 E:EtOAc 93:7 200 190 Nhiều vết 9 E:EtOAc 92:8 400 116 2vết,Rf=0,23;Rf=0,17 Khảo sát 10 E:EtOAc 90:10 400 119 2vết,Rf=0,23;Rf=0,17 Khảo sát 11 E:EtOAc 85:15 600 142 Nhiều vết 12 E:EtOAc 80:20 600 155 Nhiều vết 13 E:EtOAc 70:30 200 120 Nhiều vết 14 E:EtOAc 60:40 600 114 Nhiều vết 15 E:EtOAc 50:50 400 250 Nhiều vết Ghi chú: E = Ete dầu hỏa; EtOAc = ethylacetate; EtOH = ethyl alcol Ở phân đọan 9,10 tiếp tục quá trình sắc ký cột lần 2 với hệ dung môi giải ly E : EtOAc 90 : 10 tới 85 : 15 thu được 5 phân đọan sau khi cô cạn dung môi phân đoạn 2 và 3 và kết tinh lại trong MeOH cho tinh thể hình kim màu trắng (64mg) đặt tên S. Sắc ký lớp mỏng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là H2SO4 10 %/EtOH cho một vết màu nâu Rf = 0,23. 46 Sơ đồ 4.1: Tóm tắt quá trình sắc ký cột 3 g cao ete dầu hỏa Hình 4.1: Sắc ký bản mỏng cao ete dầu và hợp chất S Cao ete dầu hỏa Hợp chất S Sắc ký cột silicagel E : EtOAc 90 : 10 → 85 : 15 Cao ete dầu hỏa (3 g) Sắc ký cột silicagel E : EtOAc 100 % → 50 : 50 Thu đđược 15 phân đoạn Phân đoạn 9, 10 (0,235 g) Thu được 5 phân đoạn 1 – 5 Bay hơi dung môi và rữa sạch phân đoạn 2 và 3, kết tinh thu được hợp chất sạch S (64 mg) 47 4.3.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất S * Sắc ký lớp mỏng: giải ly bằng hệ dung môi cloroform:ete dầu 9:1, thuốc thử hiện hình là acid sulfuric 10%/EtOH, sấy bản ở 1100C cho một vết duy nhất màu nâu có giá trị Rf = 0,23. * Nhiệt độ nóng chảy 154-156 0 C (MeOH). * Phổ khối lƣợng MS (Phụ lục số 1) m/z: 414 (M + ); 329; 255; 213; 161; 145; 105; 81; 69. * Phổ hồng ngoại IR (phụ lục số 2) ν, cm-1:3452,45 (dao động O–H); 2906,52; 2783,90 (Dao động C–H bão hòa);1662,98 (dao động C = C); 12,82,94 (dao động C – O). * Phổ 1H-NMR, CDCl3, δ, ppm (phụ lục số 3) 5,35 (d, 5Hz, – CH =); 5,14 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH =); 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH=); 3,52 (t, >CH – O –); 0,68 – 1,02 H của 6 nhóm –CH3. * Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT, CDCl3, δ, ppm (phụ lục số 4) 140,77 (>C =); 138,32 (– CH =);129,31 (– CH =); 121,73 (– CH =); 71,83 (CH – O –) Biện luận cấu trúc S: S cho phản ứng dương tính với các thuốc thử đặc trưng của triterpen và steroid như Liebermann Burchard, Salkowski và Noller. Từ các tín hiệu trên phổ IR (3452,45cm-1); 1H-NMR (3,52ppm); 13C-NMR (71,83 ppm) chứng tỏ S có nhóm – OH. Phổ 13C-NMR và 1H-NMR cho thấy S có hai nối đôi, trong đó 1 liên kết kiểu >C=CH và liên kết còn lại kiểu – CH = CH – . Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT cho biết S có 3 carbon bậc bốn (>CCH –), 9 carbon bậc hai (– CH2 –) và 6 carbon bậc 1 (– CH3), từ đó công thức phân tử của S là C29H48O, điều này được khẳng định lại dựa trên phổ khối lượng (M+= 414). Độ bất bão hoà của S là 6, như vậy cấu trúc S có 4 vòng. Kết hợp với số nguyên tử carbon giúp ta khẳng định S là một hợp chất steroid. Phổ 1H-NMR cho biết nối đôi – CH = CH – tồn tại dưới dạng trans (dựa vào các mũi cộng hưởng δ 5,13(dd, 8,5Hz; 14,5Hz) và δ 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz). Các nhận định ban đầu cho thấy S có thể là stigmasterol, khảo sát kỹ cường độ các mũi cộng hưởng tại các vị trí δ 5,35; δ 5,13 đến 5,03 và δ 3,52 cho thấy các giá trị tích phân gần bằng nhau, kết hợp với phổ 13C- NMR (xuất hiện 42 tín hiệu cộng 48 hưởng) chúng tôi dự đoán S là hỗn hợp của stigmaterol và β-sitosterol với tỉ lệ 1:1, điều này dựa vào phổ 1H NMR của các vị trí 5,35; 5,13; 5,03. Các số liệu phổ 13C-NMR và DEPT của S được so sánh với các phổ tương ứng của stigmasterol và β-sitosterol. Kết quả so sánh phổ 13C-NMR của hợp chất S với stigmasterol và β-sitosterol (phụ lục 5) cho thấy sự trùng khớp ở các vị trí của cả hai hợp chất. Như vậy S là hỗn hợp của stigmasterol và β-sitosterol. β-Sitosterol Stigmasterol Hình 4.2: Cấu trúc hóa học của β-Sitosterol và Stigmasterol 4.4. Thử nghiệm vi sinh Hai ống nghiệm thử dung môi vi khuẩn mọc làm đục môi trường, có tạo váng màu trắng trên bề mặt và có cặn trắng bên dưới ống nghiệm. Kết luận dung môi DMSO không ức chế sự phát triển của hai chủng vi khuẩn E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium ở tỉ lệ 0,06 ml/ 2 ml môi trường Đối với các loại cao ete dầu hỏa, cao n-butanol và cao nước các ống nghiệm thử nghiệm ở các nồng độ từ 100 đến 600μg/ml vi khuẩn làm đục môi trường có lắng cặn trắng ở dưới đáy. Kết luận: Cao ete dầu hỏa, cao n-butanol và cao nước không có khả năng ức chế hai chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella tới nồng độ 600 μg/ml Đối với cao chloroform, với các nồng độ 400 – 600 μg/ml quan sát thấy môi trường không bị đục. HO CH3 C2H5 H CH3 H3C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28, 29 H5C2 CH3 CH3 CH3 CH3H3C HO H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28,29 49 Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ 100-600 μg/ml Loại cao Ete dầu hỏa CHCl3 n-butanol H2O Nồng dộ (μg/ml) E.coli Sal E.coli Sal E.coli Sal E.coli Sal 100 + + + + + + + + 200 + + + + + + + + 300 + + + + + + + + 400 + + – – + + + + 500 + + – – + + + + 600 + + – – + + + + Ghi chú: +:Môi trường bị đục –: Môi trường không bị đục. Tiến hành thử nghiệm tiếp tục ở các nồng độ với khoảng cách nhỏ hơn trong khoảng từ 300 – 400 μg/ml. Hình 4.3: Các ống nghiệm nồng độ trong khoảng 300 - 400 μg/ml trước khi đem ủ. Sau khi ủ, ở nồng độ 330 μg/ml E. coli không làm đục môi trường nuôi cấy. Còn đối với Salmnella thì không làm đục môi trường ở nồng độ 340 μg/ml. 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μ g/ml). 50 Bảng 4.5: Kết quả thử nghiệm cao chloroform trong khoảng nồng độ 300-400 μg/ml Nồng độ (μg/ml) E. coli Salmonella 310 + + 320 + + 330 – + 340 – – 350 – – 360 – – 370 – – 380 – – 390 – – Ghi chú: +: Môi trường nuôi cấy bị đục –: Môi trường nuôi cấy không bị đục Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm trên E. coli. Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm trên Salmonella.. Bảng 4.6: Kết luận Vi khuẩn MIC (μg/ml) E. coli ATCC 25922 330 Salmonella typhimurium 340 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μ g/ml). 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μ g/ml) 51 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận 5.1. Khảo sát thành phần hóa học Đã sơ bộ phân tích thành phần hóa học các hợp chất có trong lá Xuân Hoa. Đã xác định được sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ: flavonoid, tanin, terpenoid, saponin... Từ 500g bột lá khô cây Xuân Hoa đã điều chế được cao ete dầu hỏa là 5,6g (hiệu suất 1,12%), cao chloroform 9,8g (hiệu suất 1,98%), cao n-butanol 15,2g (hiệu suất 3,04%) và cao nước 25,7g (hiệu suất 5,14%). Từ cao ete dầu hỏa đã tiến hành phân lập và thu được 64 mg hợp chất S (hiệu suất 2,13 % tính trên trọng lượng cao ete dầu hỏa). Cấu trúc của hợp chất được xác định dựa trên các phương pháp phổ nghiệm như khối phổ, phổ hồng ngoại, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT. Hợp chấy S được nhận danh là hỗn hợp của Stigmasterol và β-sitosterol tỉ lệ 1 : 1. 5.2. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn trên hai đối tượng vi sinh là E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium với 4 loại cao: ete dầu hỏa, chloroform, n- butanol và cao nước. Kết quả cho thấy chỉ có cao chloroform có khả năng ức chế sự phát triển của hai chủng vi sinh vật trên. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chloroform đối với hai chủng vi sinh vật lần lượt: E. coli ATCC 25922 là 330 μg/ml và Salmonella typhimurium là 340 μg/ml. II. Đề nghị Trong khoảng thời gian ngắn làm khóa luận tốt nghiệp những kết quả thu được chỉ là những kết quả bước đầu. Nếu có thời gian, xin đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để có thể tìm hiểu thêm về tác dụng sinh học và thành phần hóa học của cây Xuân Hoa. Đặt biệt là phân lập, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ trên cao chloroform và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên một số dòng vi khuẩn đường ruột khác. Từ đó làm cơ sở cho việc chuẩn hóa và tạo ra chế phẩm có khả năng thay thế kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiểm khuẩn đường tiêu hóa. 52 Phụ lục 1: Phổ MS của hợp chất S 53 Phụ lục 2: Phổ IR của hợp chất S 54 Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của hợp chất S 55 Phụ lục số 4: Phổ 13C của hợp chất S 56 Phụ lục 5: So sánh phổ 13C-NMR của S với -Sitosterol vaø Stigmasterol STT Hôïp chaát S -Sitosterol Stigmasterol 13 C-NMR DEPT Vò trí carbon 13 C-NMR Loaïi carbon Vò trí car bon 13 C-NMR Loaïi carbon 1 140,77 Bieán maát 5 140,10 >C= 5’ 140,67 >C= 2 138,32 Muõi döông - - - 22’ 138,25 -CH= 3 129,31 Muõi döông - - - 23’ 129,19 - 4 121,73 Muõi döông 6 121,60 =CH- 6’ 121,62 -CH= 5 71,83 Muõi döông 3 71,00 -CH-OH 3’ 71,72 -CH-OH 6 56,89 Muõi döông - - - 14’ 56,83 >CH- 7 56,79 Muõi döông 14 56,70 >CH- - - - 8 56,09 Muõi döông 17 55,80 >CH- - - - 9 255,99 Muõi döông - - - 17’ 55,91 >CH- 10 51,25 Muõi döông - - - 24’ 51,21 >CH- 11 50,17 Muõi döông 9 50,10 >CH- 9’ 50,12 >CH- 12 45,87 Muõi döông 24 45,60 >CH- - - - 13 42,31 Muõi aâm 4 42,10 -CH2- 12’ 42,25 -CH2- 14 42,24 Bieán maát 13 42,10 >CC< 15 40,49 Muõi döông - - - 20’ 40,45 >CH- 16 39,71 Muõi aâm 12 39,60 -CH2- 4’ 39,66 -CH2- 17 37,28 Muõi aâm 1 37,10 -CH2- 1’ 37,24 -CH2- 18 36,53 Bieán maát 10 36,40 >CC< 19 36,16 Muõi döông 20 36,00 >CH- - - - 20 33,98 Muõi aâm 22 33,80 -CH2- - - - 21 31,93 Muõi döông 8 31,80 >CH- 8’ 31,87 >CH- 22 31,89 Muõi döông - - - 25’ 31,87 >CH- 23 31,67 Muõi aâm 7 31,80 -CH2- - - - 24 31,58 Muõi aâm 2 31,50 -CH2- 7’ 31,61 -CH2- 25 29,67 Muõi döông 25 29,00 >CH- - - - 26 28,92 Muõi aâm - - - 2’ 28,92 -CH2- 27 28,25 Muõi aâm 16 28,20 -CH2- 16’ 28,20 -CH2- 28 26,13 Muõi aâm 23 26,00 -CH2- - - - 29 25,41 Muõi aâm - - - 28’ 25,40 -CH2- 30 24,38 Muõi aâm 15 24,10 -CH2- 15’ 24,35 -CH2- 31 23,10 Muõi aâm 28 23,00 -CH2- - - - 32 21,23 Muõi döông - - - 26’ 21,22 -CH3 33 21,09 Muõi aâm 11 21,10 -CH2- 11’ 21,06 -CH2- 34 21,09 Muõi döông - - - 21’ 21,09 -CH3 35 19,82 Muõi döông 26 19,70 -CH3 - - - 36 19,40 Muõi döông 19 19,30 -CH3 18’ 19,39 -CH3 37 19,00 Muõi döông 27 19,00 -CH3 27’ 18,98 -CH3 38 18,79 Muõi döông 21 18,60 -CH3 - - - 39 12,25 Muõi döông - - - 29’ 12,26 -CH3 40 12,06 Muõi döông - - - 19’ 12,04 -CH3 41 11,99 Muõi döông 29 11,90 -CH3 - - - 42 11,87 Muõi döông 18 11,80 -CH3 - - - TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tài liệu tiếng Việt: 1. Võ Hoài Bắc và Lê Thị Lan Oanh, 2003. Hàm lượng acid amin và nguyên tố khoáng trong lá cây Xuân Hoa. Tạp chí dược liệu tập 8, số 1: tr.11 - 15. 2. Võ Văn Chi,1997. Từ điển cây thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 3. Lê Huy Chính và cộng sự, 2003. Vi sinh y học. Nhà xuất bản Y Học. 4. Huỳnh Kim Diệu và Trần Văn Hòa, 2003. Efficacy of Pseuderanthemum palatiferum Powder against Diarrhea of Piglets. 5. Huỳnh Kim Diệu, 2004. Investigating the toxicity and the antibacterial activity of Pseuderanthemum palatiferum Powder. 6. Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985. Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc. Nhà xuất bản Y học. 7. Phạm Hoàng Hộ, 1993. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Montreal. 8. Trần Công Khánh,1999. Cây Xuân Hoa, từ điển bách khoa dược học. NXB Từ Điển Bách Khoa Hà Nội, tr 714. 9. Trần Công Khánh, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Thị Thanh Nhài và Lê Mai Hương, 1998. Góp phần nghiên cứu về thực vât, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xuân Hoa. Tạp chí Dược liệu, tập 3, tr 37- 41. 10. Trần Công Khánh, 1997. Sự thật về cây thuốc "kỳ diệu", cây Xuân Hoa.Tạp chí thuốc và sức khỏe, số 101, tr 10 - 11. 11. Đỗ Tất Lợi, 1995. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. 12. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Hiền và Nguyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm vi sinh vật học, tr 130 - 160. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. 13. Nguyễn Thị Thanh Nhài, 1997. Góp phần nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xuân Hoa. Luận văn tốt nghiệp dược sĩ đại học, Đại học Dược hà Nội. 14. Lê Thị Lan Oanh và cộng sự, 1998. Một số chỉ tiêu sinh hóa của cây Xuân Hoa. Tuyển tập báo cáo hội nghị hóa học toàn quốc lần 3, tập 1, 1998, tr 96-99. 15. Lê Thị Lan Oanh và cộng sự, 1999. Khảo sát một số chỉ tiêu sinh hóa và tác dụng thủy phân prôtêin của lá cây Xuân Hoa. Tạp chí dược liệu, tập 4, số 1, 1999, tr 13- 17. 16. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, 2001. Bài giảng chiết suất dược liệu. Trường Đại học Y Dược Tp.HCM. 17. Nguyễn Thị Minh Thu, 1999. Góp phần nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xuân Hoa. Luận văn thạs sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội. 18. Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh và công sự, 1999. Thử độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của cây Xuân Hoa. Tạp chí Dược học, số 9, 1999, tr 15-17. 19. Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh và Nguyễn Văn Hùng, 2000. Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa (thông báo số 5). Tạp chí Dược liệu, tập 5, số 6, tr 163-167. 20. Bộ Y Tế và Bộ GD & ĐT, 1998. Bài giảng dược liệu tập 2, Hà Nội. 21. Dược điển Việt Nam III, 2002. Nhà Xuất bản Y học Hà Nội. 22. Giáo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2004. Đại học Y Dược TP.HCM. 23. Thực tập vi sinh và miễn dịch, 2003. Trường Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh. 24. Thực hành vi sinh y học, 2002. Trường Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh. Phần tài liệu tiếng nuớc ngoài: 25. Forgo P, Kover KE, Gradient enhanced selective experiments in the 1H NMR chemical shift assignment of the skeleton and side-chain resonances of stigmasterol, a phytosterol derivative, Department of Organic Chemistry, University of Szeged, Dom ter 8, H-6720, Szeged, Hungary. pforgo@chem.u-szeged.hu, Steroids. 2004 Jan;69(1):43-50. 26. PhD Ronald Mc. Atlas, 1994. Principles of Microbiology. Univesity of Louisville, Kentucky, tr 360 - 367. Phần tài liệu từ internet: 27. 28. 29. 30.