Khóa luận Khảo sát thành phần loài phụ và thành phần kiểu huyết thanh của các chủng salmonella nhiễm trong thực phẩm

tuần hoàn cũng tiết ra nội độc tố. Nội độc tố chủ yếu tác động trên hệ thần kinh vận động của huyết quản, làm giảm độ bền của thành mao quản và giảm chức năng điều tiết thân nhiệt của cơ thể. Như vậy, Salmonella gây bệnh là do độc tố ruột (enterotoxin) và có lẽ còn do cytotoxin và neurotoxin. [17] 2.1.2.3 Các kiểu bệnh chính do vi khuẩn Salmonella Các kiểu huyết thanh Salmonella thường có biểu hiện bệnh với những triệu chứng lâm sàng không giống nhau được tóm tắt ở Hình 2.3. Viêm ruột: S. enteritidis và S. typhimurium thường gây bệnh viêm dạ dày, viêm ruột, bệnh gây ra do tình trạng vệ sinh thực phẩm kém. Biểu hiện bệnh đặc trưng là buồn nôn, đau bụng và tiêu chảy. Vi khuẩn không vào máu. Bệnh thường khu trú ở ruột. [1, 2, 10, 34] 10 Nhiễm trùng máu: S. choleraesuis là nguyên nhân gây nhiễm trùng máu, vi khuẩn vào cơ thể bằng đường miệng, xâm nhập vào máu gây bệnh, khu trú ở phổi, xương, màng não. Ví dụ như xương, gây biến chứng là bệnh viêm khớp kinh niên, xảy ra vào 3 – 4 tuần sau khi bắt đầu phát bệnh mạnh mẽ. [1, 2, 6] Các bệnh gây ngộ độc bằng độc tố của S. enteritidis, S. typhimurium, S. choleraesuis không sốt, gây ói mửa. Cơ thể trở lại bình thường khi được điều trị, không gây thành dịch.[2, 34] Bệnh thương hàn: S. typhi gây ra bệnh sốt thương hàn, S. paratyphi A, S. paratyphi B (S. schottmuleri) gây bệnh phó thương hàn. Triệu chứng bệnh cũng giống như sốt thương hàn, nhưng ở mức độ nhẹ hơn. Bệnh phát triển thành dịch và người bệnh nằm viện lâu. [2, 6, 18]. Hình 2.3 Các chủng Salmonella và các biểu hiện bệnh thƣờng gặp 2.1.2.4 Nguồn lây nhiễm Thực phẩm bị nhiễm bệnh là nguồn gây bệnh dễ dàng và nhanh nhất do vi khuẩn có thể phát triển nhanh trong thực phẩm, nhất là thực phẩm chưa nấu chín, rau tươi, quả, rau salát, bánh bao, bánh rán, sữa chưa thanh trùng, nhuyễn thể, tôm, cua sống trong khu vực có nguồn nước thải ô nhiễm cao do nguồn phân người và động vật. Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy hải sản. Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. [13, 15, 16] Enterobacteriacea e Salmonella S. choleraesuis S. enteritidis S. typhimurium S. paratyphi A, B, C S. typhi Nhiễm trùng máu Viêm dạ dày Phó thương hàn Thương hàn 11 2.1.2.5 Triệu chứng gây bệnh Triệu chứng bệnh do Salmonella biểu hiện phụ thuộc vào số lượng và tỉ lệ vi khuẩn nhiễm vào thực phẩm. Thời gian ủ bệnh khoảng 12 – 24 giờ, có khi vài giờ nhưng cũng có khi vài ngày. Các dấu hiệu đầu tiên là bệnh nhân thấy nhức đầu, chán ăn, mặt tái nhạt, toát mồ hôi, nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy. Thân nhiệt tăng lên 38 – 40 oC trong vòng 2 – 4 ngày sau khi phát bệnh và tùy thuộc mức độ nặng nhẹ mà kéo dài 3 – 7 ngày. Bệnh nặng gây ra viêm dạ dày , ruột. Vi khuẩn tồn tại trong ống tiêu hóa từ 6 – 8 tháng và tiếp tục bài thải ra môi trường bên ngoài. Vi khuẩn thải giảm 50% ở tuần thứ hai và còn 15% vào tuần thứ 4. [17] 2.1.2.6 Phòng ngừa Đối với gia súc, phải nuôi dưỡng tốt, thú được kiểm tra tình trạng sức khỏe trước khi giết, và tách phủ tạng trắng cẩn thận để tránh vấy nhiễm cho các phần khác. Đối với thực phẩm, phải tránh sự vấy nhiễm Salmonella từ người và động vật bị bệnh thương hàn, nước, côn trùng, động vật mang trùng bị nhiễm bệnh. Tuân thủ triệt để quy trình vệ sinh thực phẩm và cải thiện vệ sinh môi trường trong quá trình sản xuất. Xử lý nhiệt độ hoặc các phương pháp khác để diệt vi khuẩn như nấu nướng kỹ hoặc thanh trùng pasteur. Ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn trong thực phẩm bằng cách bảo quản đông lạnh thích hợp hoặc các phương pháp khác. Đối với công nghiệp thực phẩm và thương nghiệp: áp dụng quy chế vệ sinh thực phẩm trong sản xuất, bảo quản, vận chuyển, phân phối và phục vụ người tiêu thụ. Định kỳ khám sức khỏe cho người làm công tác tiếp xúc với thức ăn, phát hiện kịp thời những người lành mang vi khuẩn. 2.2 Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm đối với Salmonella 2.2.1 Salmonella trong thực phẩm Thực phẩm có giá trị dinh dưỡng càng cao càng dễ bị nhiễm vi sinh vật phân giải. Đồng thời với sự phân giải thực phẩm do Salmonella bao giờ cũng kèm theo sự xuất hiện các sản phẩm gây ngộ độc cho người sử dụng. Thực phẩm gây ngộ độc thường là thức ăn có nguồn gốc động vật như thịt gia súc gia cầm. Thịt là nguyên nhân gây ngộ độc chiếm 68% ở Anh và 88% ở Pháp. Ngoài ra có thể ngộ độc do ăn trứng, cá, sữa nhưng tỉ lệ ít hơn nhiều. Thực phẩm bị 12 nhiễm Salmonella thường không làm thay đổi tính chất lý hóa và trạng thái cảm quan của thực phẩm, vì thế rất khó bị phát hiện. Nhìn chung, thực phẩm gây ngộ độc thường có độ ẩm cao, pH không acid, đặc biệt là thức ăn đã nấu chín dùng làm thức ăn nguội như món đông, patê, xúc xích, dồi tiết thường là nguyên nhân của những vụ ngộ độc thức ăn do Salmonella. [25, 36] Ngoài ra, hoa quả và các loại rau ăn sống mặc dù có rửa sạch trước khi ăn nhưng không thể hết nguy cơ nhiễm Salmonella do chúng có thể phát triển thành số lượng lớn hơn nhiều nếu không qua chế biến, nguyên nhân chủ yếu là do sử dụng phân bón hữu cơ cho rau quả và sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm. [16] 2.2.2 Tình hình nhiễm Salmonella trong thực phẩm Theo CDC, mỗi năm nước Mỹ có khoảng 40 000 người là nạn nhân của vi khuẩn Salmonella, tuy nhiên con số này có thể còn cao hơn 30 lần. Số người tử vong vì nhiễm Salmonella hằng năm vào khoảng 600 người. Hầu hết số người bị vi khuẩn này tấn công đều có biểu hiện tiêu chảy, sốt và chuột rút ở bụng. Bệnh kéo dài 4 – 7 ngày.[23] Ở Hà Lan, từ năm 1996 đến năm 2001, có 13 970 trường hợp bị ngộ độc do Salmonella, trong đó S. enteritidis chiếm tới 43,6%, S. typhimurium chiếm 32%, S. typhi chiếm 0,8%. Ở các loài động vật được dùng làm thực phẩm thấy tỉ lệ nhiễm S. typhimurium cũng khá cao như ở bò là 32,9%, lợn chiếm 66,4%, riêng gia cầm chỉ có 5,3% nhưng có tỉ lệ nhiễm S. enteritidis tới 20,3%. [27] Ở Việt Nam, theo thống kê năm 2001 của Bộ Y tế thì trong quý III có 1684 trường hợp mắc bệnh thương hàn làm chết người. 2.2.3 Các chỉ tiêu về Salmonella trong thực phẩm Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm. Vì vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu thực phẩm nhất định. Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức năng. Theo tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế 4/1998, quy định không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml đối với tất cả các loại thực phẩm. Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT 13 của Bộ Y tế đối với thực phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc phải kiểm tra đối với tất cả các loại thực phẩm như Bảng 2.3. Ủy Ban Châu Âu quy định không được phát hiện Salmonella /25 g trong bất kỳ loại thực phẩm nào. Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là thử nghiệm huyết thanh, tính chung mất khoảng 7 ngày để có kết quả. Hiện nay đã có nhiều nỗ lực để rút ngắn thời gian phát hiện Salmonella bằng những phương pháp như thử nghiệm ELISA, và thử nghiệm DNA. Việc khẳng định kết quả âm tính trong vòng 48 giờ đã là chuyện bình thường. Tuy nhiên một khi mẫu có khả năng dương tính, cần tiến hành các thao tác truyền thống để khẳng định sự có mặt của Salmonella. [1] Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella. Bảng 2.3 Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại thực phẩm theo Thông tƣ 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế Nhóm thực phẩm Phƣơng pháp kiểm tra Thịt và các cơ quan nội tạng dùng làm thực phẩm muối, sấy khô, hun khói TCVN 5153:90 Sữa và kem chưa cô đặc, chưa pha thêm đường hoặc chất ngọt khác TCVN 6402:98 Sữa nước tách bơ, sữa chua và sữa kem khác để lên men hoặc acid hóa TCVN 6402:98 Xúc xích và các sản phẩm tương tự làm từ thịt, cá làm từ bộ phận nội tạng hoặc tiết động vật; các chế phẩm thức ăn từ các sản phẩm đó TCVN 5153:90 Điều đáng lưu ý là chỉ tiêu Salmonella không phân biệt chủng có gây bệnh hay không. Trong thực tế các phòng phân tích vi sinh thực phẩm chỉ thực hiện các xét nghiệm để phát hiện Salmonella spp., không làm xét nghiệm để phân biệt loài hay định danh chủng gây bệnh. Đây là một rào cản lớn cho các nhà sản xuất và xuất nhập khẩu thực phẩm. 14 2.3 Phát hiện Salmonella bằng phƣơng pháp nuôi cấy Đây là phương pháp định tính và kết quả được báo cáo là có hay không phát hiện Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm. Do quy định không cho phép có mặt trong thực phẩm nhưng lại khó phát hiện, cho nên mẫu lấy tối thiểu phải 25 g và quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải có thêm giai đoạn tiền tăng sinh để đạt hiệu quả cao. Điều này cần thiết vì Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương nặng qua quá trình bảo quản chế biến và sự tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae, những vi khuẩn này sẽ cạnh tranh hay ức chế sự phát triển của Salmonella. [5, 9,15] Để phát hiện Salmonella cần tiến hành bốn giai đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh phù hợp. 2.3.1 Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment) Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm nghiệm không phải là mẫu bệnh phẩm. Người ta thường sử dụng môi trường tiền tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc hiệu tạo điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều vi sinh vật hiện diện trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm. Ví dụ: nước peptone đệm Buffered Peptone Water (BPW) là môi trường tiền tăng sinh được khuyến khích sử dụng trong môi trường kiểm tra nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae; riêng FDA của Mỹ thì thường sử dụng Lactose broth cho một số nhóm thực phẩm. [4, 13] Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền tăng sinh phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi. [9] 2.3.2 Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment) Giai đoạn này làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng cách ức chế hoặc ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận lợi cho việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập. 15 Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella thường được dùng là Rappaport Vassiliadis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT), Selenite Cystein Broth (SC) [15, 24]…Thông thường môi trường TT được dùng để phân tích các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc, hay các loại thực phẩm khác. Một vài nghiên cứu gần đây của AOAC (Association of Official Analytical Communities - Hiệp hội các nhà phân tích của Mỹ) cho rằng mặc dù môi trường Selenite Cystein Broth có chứa selenite ức chế mạnh các vi khuẩn khác ngoại trừ Salmonella nhưng muối sodium biselenite có thể gây ưng thư khi tiếp xúc với cơ thể người nên hạn chế sử dụng và thấy rằng môi trường RV có thể thay thế cho các loại môi trường trên để phân tích mẫu. Canh RV có tác dụng ức chế vi khuẩn khác nhờ vào MgCl2 bằng cách tác động lên thành tế bào vi khuẩn và nhờ vào màu xanh malachite ức chế các vi khuẩn Gram dương [14]. Cần lưu ý là không môi trường tăng sinh chọn lọc nào là môi trường tối ưu chung cho tất cả các dòng Salmonella. Mỗi loại môi trường tăng sinh chọn lọc được thiết lập dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau của Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng trưởng được trong môi trường khác. Ví dụ: S. typhi không phát triển được trong môi trường RV và TT; S. dublin không phát triển được trong môi trường RV. Ngoài ra, mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt nuôi cấy khác nhau như môi trường RV được ủ ở 42oC, môi trường TT và SC được ủ ở 37oC trong 22 – 24 giờ. [5, 15, 24] Ngày nay, các yêu cầu về vệ sinh thực phẩm đều khuyếch khích các phòng thí nghiệm sử dụng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc Salmonella để tăng cường khả năng phát hiện tất cả các serotype Salmonella trong mẫu. [19, 22] 2.3.3 Giai đoạn phân lập (isolation) Đây là bước tách biệt Salmonella trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng. Một số môi trường phân lập như Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth Suffite Agar (BSA), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS), Hektoen Entric Agar (HE)…Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. [8, 15, 16, 24] 16 Một số đặc điểm chính của các môi trường trên là với sự hiện diện của nấm men, đường, peptone tạo thuận lợi cho sự tăng trưởng Salmonella và Shigella yếu ớt. Sự sản sinh ra H2S cũng có thể xảy ra nhờ sự hiện diện của sắt thiosufate và sắt citrate đã thể hiện bởi những khuẩn lạc có tâm đen do sự tạo nên sulfua sắt. Trên các môi trường phân lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu khuẩn lạc đặc trưng khác nhau. Trên môi trường XLD: khuẩn lạc màu hồng tròn, trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có khả năng sinh H2S, trừ S. typhi thì khuẩn lạc trong suốt và không có tâm đen. [19, 20] Trên môi trường BSA: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay đen, có hay không có ánh kim tím trên bề mặt khuẩn lạc, môi trường xung quanh có màu nâu chuyển sang đen khi tăng thời gian ủ ấm, gây khó khăn cho việc nhận biết khuẩn lạc vi khuẩn Salmonella. Một số chủng có thể sinh khuẩn lạc màu lục với môi trường xung quanh ít nhiều có màu đen. [16, 20] Trên môi trường BPLS: khuẩn lạc Salmonella điển hình trong suốt và hơi đỏ trong môi trường, có màu đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc. Một số Salmonella xuất hiện khuẩn lạc màu lục trong suốt nếu bao quanh là vi khuẩn lên men lactose hoặc glucose gây ra vùng đó màu vàng xanh hoặc xanh; dưới 1% Salmonella không điển hình, chúng lên men đường lactose và xuất hiện khuẩn lạc vàng lục hoặc lục. [9, 37] Trên môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số loài Salmonella có thể phát triển thành khuẩn lạc có các chấm màu đen bóng, lớn hay phần lớn các khuẩn lạc hoàn toàn có màu đen. Một cách điển hình, có mộ số ít loài Salmonella sinh ra khuẩn lạc màu vàng có hoặc không có tâm đen. [9, 20] Cũng như bước tăng sinh chọn lọc, việc sử dụng hai hay nhiều môi trường phân lập sẽ cho phép gia tăng sự phát hiện số lượng các kiểu huyết thanh khác nhau trong mẫu, trong đó môi trường XLD được khuyến khích sử dụng. Hơn nữa, qua các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc và phân lập thì tế bào Salmonella bị già và suy thoái, vì vậy cần phải phục hồi chúng bằng một trong các môi trường như Tryticase Soya Agar (TSA) hay Brain Heart Infusion (BHI) để nhân sinh khối và được dùng tiếp cho các phản ứng sinh hóa và phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh về sau. 17 2.3.4 Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa Đây là bước xác nhận các dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonella trên môi trường phân lập bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng. Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella như sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase (+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), mannitol (+), sorbitol (+). Nếu các biểu hiện sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng các thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá. Vi khuẩn sau khi phục hồi được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella. Thử nghiệm trên môi trường Triple Sugar Iron agar (TSI) hay Kligler Iron Agar (KIA) để phân biệt các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Môi trường TSI hay KIA thường dùng để khảo sát sự lên men đường glucose, lactose và khả năng sinh khí H2S, khí H2 và CO2 của vi khuẩn. Trong môi trường có chất chỉ thị màu phenol red dùng để phát hiện khả năng lên men đường của vi khuẩn. Đây là môi trường rắn, được chuẩn bị trong ống nghiệm ở thể nghiêng sâu. Về cơ chế, đường glucose luôn được vi sinh vật sử dụng trong điều kiện yếm khí tương đối, vì vậy ở phần đáy ở ống nghiệm nuôi cấy luôn tạo ra nhiều acid và làm thay đổi màu của môi trường từ đỏ sang vàng, đồng thời sản sinh ra gas. Đối với Salmonella do không sử dụng đường lactose và sucrose nên sự phân hủy các acid amin rất mạnh trong điều kiện hiếu khí, sau 24 giờ ủ, làm trung hòa hay chuyển kiềm mặt thạch nghiêng làm chúng có màu đỏ. Khi có màu đen xuất hiện ở vùng nối hai phần nghiêng và sâu là do Salmonella có khả năng khử sulfate có trong môi trường, tạo thành khí H2S. Chất này phản ứng với Fe 2+ (ferrous sulfate) để tạo thành kết tủa sulfua sắt màu đen. Nếu có sinh hơi thì có những bọt khí xuất hiện sâu trong ống thạch. [5, 29] Thử nghiệm lên men đường mannitol: Salmonella có khả năng lên men đường mannitol sinh acid sẽ làm giảm pH, do môi trường có chất chỉ thị màu phenol red nên chuyển từ màu đỏ thành màu vàng. [5] Thử nghiệm Lysine Decarboxylase (LDC): với phản ứng tím LDC, các vi khuẩn Salmonella có khả năng tạo enzyme lysine decarboxylase trong môi trường có 18 lysine, ngoại trừ một vài chủng của S. gallinarum và S. choleraesuis. Vì cơ chế lên men decarboxylase có thể tác động lên nhóm carboxyl (-COOH) của acid amin sinh ra amin và khí CO2. Do trong môi trường LDC broth có chứa các thành phần như chất chỉ thị màu bromocresol purple, chất pyridoxal, lysine monohydrochloride và 1% glucose. Các sản phẩm cuối cùng của hệ enzyme này sẽ chuyển pH sang kiềm, môi trường có màu tím hoặc xanh và có sinh khối. Phản ứng âm tính được thể hiện ở màu vàng của môi trường. [20] Thử nghiệm Urea phenol red broth: Salmonella không phân giải được urea thành NH3 nên không làm thay đổi pH, môi trường sau khi nuôi cấy vẫn giữ nguyên màu tím ban đầu. Phản ứng dương tính môi trường có màu đỏ hồng. [5, 20, 29] Khi các phản ứng sinh hóa phù hợp với Salmonella thì có thể kết luận các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella spp. Bất kỳ một trong bốn phản ứng sinh hóa trên không phù hợp thì không phải là Salmonella. 2.3.5 Phản ứng huyết thanh ngƣng kết trên phiến kính để định nhóm hay loại vi khuẩn Salmonella có 3 loại kháng nguyên: kháng nguyên O bền với nhiệt, được dùng để chia thành nhóm, kháng nguyên H không bền với nhiệt dùng để định loại, kháng nguyên Vi không bền với nhiệt thường che lấp ngăn chặn phản ứng kháng nguyên O. Từ những mẫu phân lập dương tính Salmonella, tiến hành định serotype để xác định những nhóm nào thường hiện diện trong các loại nhóm thực phẩm cũng như cung cấp thêm những thông tin đánh giá về tình hình vệ sinh do những nhóm vi khuẩn Salmonella nào nhiễm nhiều nhất từ đó có ý nghĩa trong vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm. Vì có hàng ngàn serotype Salmonella, nên việc xác định Salmonella không phải là đơn giản. Người ta đi vào các nhóm hỗn hợp, rồi đến các nhóm đơn giản dần. Có những nhóm hỗn hợp O như OMA, OMB, OMC, OMD… Nhóm OMA gồm các nhóm thường gặp nhất: A, B, E, L. Nhóm OMB gồm C, F, G, H. Nhóm OMC gồm I, J, K, M, N, O, P… Kháng huyết thanh sản xuất tại Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh có kháng huyết thanh O đa giá, OMA, OMB, kháng huyết thanh O đơn giá như các nhóm A, B, D, E, và C. Muốn xác định serotype nào cần phải thử ngưng kết với kháng huyết 19 thanh H. Ví dụ: S. typhi và S. enteritidis đều có thể gây nhiễm trùng máu, nên khi ngưng kết với kháng huyết thanh O nhóm D xong chúng ta phải làm thêm kháng huyết thanh H: nếu ngưng kết với H : d kết luận là S. typhi, nếu ngưng kết với H : g, m thì kết luận là S. enteritidis. [14] Trước hết ta dùng huyết thanh ngưng kết đa giá (Polyvalent O antiserum), loại này chứa tất cả kháng thể O của Salmonella từ A đến F, ngưng kết nhanh, hoàn toàn hầu hết vi khuẩn thuộc giống Salmonella. Nếu dương tính, sau đó tiếp tục làm phản ứng gốc vi khuẩn đó với huyết thanh ngưng kết nhóm (grouping antiserum) từ A đến F, sự ngưng kết này sẽ xảy ra nhanh và hoàn toàn nếu huyết thanh ngưng kết và gốc vi khuẩn cùng nhóm. [2] Nếu làm phản ứng với huyết thanh ngưng kết đa giá vô nghiệm ta phải thực hiện phản ứng với huyết thanh ngưng kết Vi. Trường hợp kết quả phản ứng dương tính với huyết thanh ngưng kết Vi, chứng tỏ gốc vi khuẩn có kháng nguyên Vi che lấp phản ứng của kháng nguyên O với kháng thể O, do đó ta phải đun cách thủy huyền trọc vi khuẩn ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút để loại bỏ kháng nguyên Vi khỏi bề mặt tế bào. Sau khi để nguội, làm phản ứng với huyết thanh ngưng kết đa giá và huyết thanh ngưng kết nhóm C và D. Nếu kết quả âm tính với cả hai loại huyết thanh ngưng kết đa giá và Vi, gốc vi khuẩn không phải là Salmonella. [2] 2.3.6 Các phản ứng sinh hóa xác định các loài phụ Salmonella Để xác định các loài phụ Salmonella phải tiến hành các phản ứng sinh hóa được trình bày trong Bảng 2.4. 20 Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hóa các loài và loài phụ của Salmonella [35] (*) : Typhimurium, Dublin -, + : 90% hay hơn cho phản ứng dương, -: 90% hay hơn cho phản ứng âm tính; d: các kiểu huyết thanh khác nhau cho phản ứng khác nhau Có bốn thử nghiệm sinh hóa chính để xác định các loài phụ của Salmonella: Thử nghiệm lên men đường sorbitol và dulcitol: Vi sinh vật lên men hai nguồn carbonhydrate sinh ra acid hữu cơ làm pH môi trường giảm và môi trường thay đổi từ màu đỏ sang màu vàng. Các loài phụ của Salmonella có hay không có khả năng lên men hai loại đường này. Hầu hết các loài Salmonella cho phản ứng dương tính thể hiện ở sự hình thành khí bên trong ống nghiệm và pH acid (màu vàng) của môi trường. Sự hình thành acid được kết luận là test dương tính. Test âm tính thể hiện ở chỗ không Loài S. enterica S. bongori Loài phụ I II IIIa IIIb IV VI V Đặc điểm sinh hóa Dulcitol O.N.P.G (4h) Malonate Gelatinase Sorbitol Nuôi cấy với KCN Galacturonate - glutamyltransferase - glucuronidase Salicine Lactose + - - - + - - +(*) d - - + - + + + - + + d - - - + + + + - - - - - -(75%) - + + + + - + + + - +(75%) - - - + + + + + - + - d d - + - - + + d - d + + - - + + + + - - - 21 có khí tạo thành và môi trường có màu đỏ hồng. Tất cả các kiểu huyết thanh thuộc loài S. enterica I đều lên men hai loại đường này. [9] Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate: dùng để khảo sát khả năng sử dụng sodium malonate làm nguồn carbon duy nhất. Khi vi khuẩn sử dụng malonate sẽ phóng thích NH3 làm sinh ra phản ứng kiềm, biến đổi môi trường từ màu xanh lá cây sang màu xanh dương với chất chỉ thị màu là bromothymol blue. Các loài phụ của Salmonella đều có hoặc không có khả năng sử dụng malonate, riêng S. enterica I không có khả năng này. [5, 9] Thử nghiệm ONPG (o – Nitrophenyl - - D – Glucoside): xác định sự có mặt hay không có mặt enzyme - galactosidase nhờ vào sử dụng một chất hữu cơ tổng hợp o – Nitrophenyl - - D – galactopyranoside (gọi tắt ONPG) được xem như là cơ chất đối với enzyme - galactosidase. Khi vi khuẩn giải phóng enzyme - galactosidase thì chúng sẽ phân cắt cơ chất này để giải phóng orthonitrophenyl làm môi trường xuất hiện màu vàng. Mục đích của phản ứng để phân biệt các vi khuẩn có khả năng sử dụng đường lactose hay vi khuẩn không sử dụng được lactose (không có - galactosidase). S. enterica I do không có gen mã hóa enzyme - galactosidase nên phản ứng ONPG âm tính. [2, 13] 22 2.4 Một số phƣơng pháp kiểm tra nhanh Salmonella Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới vẫn đang áp dụng phương pháp nuôi cấy để phát hiện Salmonella trong thực phẩm. Đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn được chấp nhận rộng rãi. Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức lao động cho các công việc như: chuẩn bị môi trường, dụng cụ, thực hiện quy trình… Thời gian để có kết quả phân tích phải mất từ 4 – 6 ngày. Với thời gian này đã không đáp ứng được các yêu cầu cho kết quả nhanh trong việc phục vụ các chương trình giám sát chất lượng thực phẩm trên dây chuyền sản xuất như hiện nay, hoặc gây thiệt hại cho các nhà quản lí doanh nghiệp vì các chi phí lưu kho để chờ kết quả phân tích…Thay vì phải tiến hành các test sinh hóa truyền thống trong ống nghiệm, có thể sử dụng bất kỳ một trong bốn hệ thống test sinh hóa có bán sẵn trên thị trường (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II, hay MICRO-ID) để định danh các vi khuẩn Salmonella nói chung trong thực phẩm.[1, 9, 27] Ngoài phương pháp truyền thống để phân lập và định danh Salmonella, còn có một số phương pháp kiểm tra nhanh Salmonella có thể thực hiện việc kiểm tra trên nhiều mẫu trong thời gian ngắn: 2.4.1 Phƣơng pháp dựa trên DNA 2.4.1.1 Phƣơng pháp PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật dùng để khuyếch đại một trình tự DNA xác định trong điều kiện in vitro do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phản ứng dùng men DNA polymerase chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để nhân bản một đoạn DNA lên 200 000 lần. Phương pháp PCR hiện đang được áp dụng rộng rãi trên thế giới và trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Phương pháp định tính Salmonella trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR dựa vào việc xác định đoạn DNA đích có hiện diện hay không. Kỹ thuật này bao gồm các bước như sau: tiền tăng sinh trong môi trường BPW, xử lý tế bào để thu nhận khuôn DNA, thực hiện phản ứng PCR, phân tích kết quả. Ưu điểm của PCR: (1) thời gian cho kết quả nhanh. (2) có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy. (3) hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ 23 lưu trữ hơn phương pháp huyết thanh học. Không cần dụng cụ và môi tường chuẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường. (4) Ít tốn kém công lao động. Có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. [15] 2.4.1.2 Phƣơng pháp Realtime – PCR Phương pháp Realtime PCR cũng dựa trên cơ sở PCR nhưng trong quá trình phản ứng tổng hợp sẽ gắn vào một tác nhân phát hiện, thông thường là một chất phát huỳnh quang được gắn vào một mẫu dò như chất Silber green II. Cơ chế của Realtime – PCR là mỗi một sản phẩm tạo ra sẽ gắn với một chất huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với số lượng sản phẩm tạo thành. Số lượng bản đích ban đầu càng cao thì số chu kỳ để phát hiện sản phẩm khuyếch đại càng ít. 2.4.1.3 Phƣơng pháp lai phân tử Phương pháp này được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cũng như phương pháp PCR, phương pháp này hiện nay cũng được thương mại hóa dưới dạng những bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. 2.4.2 Phƣơng pháp dựa trên kháng nguyên – kháng thể 2.4.2.1 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi trong ngành y tế, ngoài việc định tính vi sinh vật gây bệnh, ELISA còn được sử dụng trong việc chuẩn đoán bệnh AIDS, sốt xuất huyết, viêm gan… Phương pháp có ưu điểm là cho kết quả nhanh chỉ trong vài giờ sau giai đoạn tăng sinh, có độ nhạy rất cao nhưng có độ đặc hiệu thấp, số mẫu cho kết quả dương tính giả cao. Vì thế phương pháp này được dùng để sàng lọc, tất cả các mẫu cho kết quả dương tính đều cần phải được xác nhận bằng phương pháp nuôi cấy. 2.4.2.2 Phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang Dựa vào kháng thể được nhuộm huỳnh quang để phát hiện Salmonella. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang gồm: chuẩn bị kháng nguyên và cố định vết bôi kháng nguyên trên lam kính, nhuộm vết bôi bằng cách dùng chất ngưng kết có gắn chất phát huỳnh quang, kết quả được chụp qua kính hiển vi. Trên các các lam kính, Salmonella 24 phát quang vàng xanh trên nền đen, các vật khác hiện diện trên vết bôi phân biệt dễ dàng với Salmonella do chúng bắt thuốc nhuộm yếu hay không nhuộm và thiếu hình dạng phù hợp. Phương pháp này linh động, nhanh, kết quả được phát hiện sau vài giờ. Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian thực hiện Thời gian thực hiện đề tài từ 01/03/2005 đến 01/08/2005. 3.1.2 Địa điểm thực hiện Nơi lấy mẫu: Mẫu được lấy tại các chợ trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh như chợ Bà Chiểu và chợ Nguyễn Đình Chiểu quận Phú Nhuận, chợ Tân Phú quận Thủ Đức… Nơi tiến hành phân tích thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Môi trường tại Trung tâm Phân tích Hóa sinh – Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu 3.2.1 Dụng cụ và thiết bị 25 3.2.1.1 Dụng cụ Bình tam giác, cốc, ống đong hình trụ 50, 100, 500 ml, pipetman, ống nghiệm, hộp đĩa petri, que cấy vòng, que cấy thẳng, đèn cồn, bao PE vô trùng, kéo cắt, pince kim loại, khay kim loại, lame, màng lọc có kích thước lỗ lọc là 0,45 m, và bơm hút chân không. 3.2.1.2 Thiết bị Cân phân tích, máy đo pH, máy dập mẫu, kính hiển vi, nồi hấp autoclave, tủ sấy, tủ cấy an toàn sinh học, tủ ấm 37oC, bể điều nhiệt 42oC, và tủ lạnh. 3.2.2 Hóa chất và môi trƣờng 3.2.2.1 Hóa chất Các loại kháng huyết thanh O đa giá, hỗn hợp OMA, OMB và kháng huyết thanh đơn giá như nhóm A, B, C, D, E. Các loại kháng huyết thanh này do Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất. Các loại carbonhydrate như sorbitol, dulcitol. Cồn 70o, cồn 96o và nước cất. 3.2.2.2 Môi trƣờng Bao gồm những loại môi trường thông dụng để nuôi cấy, phân lập và khẳng định Salmonella trong thực phẩm. Môi trường Buffered Pepton Water (BPW): được sử dụng để tiền tăng sinh Salmonella hiện diện trong mẫu. Thành phần môi trường gồm: peptone 10 g/l, NaCl 5 g/l, Na2HPO4.12H2O 9 g/l, KH2PO4 1,5 g/l, hấp khử trùng ở 121 o C trong 15 phút, pH sau khi khử trùng là 7. Môi trường Saline Peptone Water (SPW): peptone 1 g/l, NaCl 8,5 g/l, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, pH sau khi khử trùng là 7,0 0,2. Môi trường Rapparport Vassiliadis broth (RV): được sử dụng để tăng sinh chọn lọc cho Salmonella. Thành phần môi trường như sau: peptone đậu nành 4,5 g/l, MgCl2.6H2O 29 g/l, NaCl 8 g/l, K2HPO4 0,6 g/l, malachite green oxalate 0,036 g/l, pH 5,5 0,2. Phân phối 10ml môi trường vào ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 115oC trong 15 phút. Môi trường Xylose Lysine Desoxycholate agar (XLD): được dùng để phân lập Salmonella. Thành phần XLD bao gồm: cao nấm men 3 g/l, L – Lysine HCl 5 g/l, 26 xylose 3,75 g/l, lactose 7,5 g/l, sucrose 7,5 g/l, sodium desoxycholate 1 g/l, NaCl 5 g/l, Na2S2O5 6,8 g/l, ammonium ferrous (II) citrate 0,8 g/l, phenol red 0,8 g/l, agar 18 g/l, pH cuối là 7,4 0,2. Đun sôi môi trường, không hấp. Để nguội đến 50oC. Môi trường đỗ trên đĩa petri và để khô trước khi cấy. Môi trường Tryptic Soya Agar (TSA): được sử dụng để bảo quản và phục hồi giống vi sinh vật trong quá trình thí nghiệm. Thành phần TSA gồm: tryptone 15 g/l, peptone đậu nành 5 g/l, agar 15 g/l. Đun nóng để hòa tan agar trong cốc bercher, phân phối vào các ống nghiệm khoảng 5 – 7 ml. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, pH sau khi khử trùng là 7,3. Sau đó để nguội khoảng 50 – 60oC rồi để thạch nghiêng. Môi trường Triple Sugar Iron Agar (TSI) gồm môi trường 1 có thành phần như sau: peptone 20 g/l, NaCl 5 g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, glucose 1 g/l, Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O 0,2 g/l, Na2S2O3 0,2 g/l, phenol red 0,025 g/l, agar 13 g/l và môi trường 2 gồm các thành phần như sau: cao thịt 3g/l, cao nấm men 3g/l, peptone 15g/l, proteose peptone 5 g/l, glucose 1 g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, FeSO4 0,2 g/l, NaCl 5 g/l, Na2S2O3 0,3 g/l, phenol red 0,024 g/l, agar 12 g/l. Phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống 7 ml. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, sau đó đợi nguội khoảng 50 – 60oC để nghiêng phần thạch sâu ở đáy ống cao 2,5 cm. Môi trường Mannitol phenol red broth: được sử dụng để thử nghiệm khả năng lên men đường mannitol của Salmonella. Thành phần môi trường bao gồm: peptone thịt 5 g/l, peptone đậu nành 5 g/l, mannitol 10 g/l, NaCl 5 g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau khi khử trùng là 7,4 0,2. Môi trường Lysine Decarboxylate broth (LDC): được sử dụng để thử nghiệm khả năng sinh enzyme lysine decarboxylase của Salmonella. Thành phần môi trường như sau: peptone 5 g/l, cao nấm men 3 g/l, dextrose 1 g/l, L-Lysine HCl 10 g/l, ferric (II) ammonium citrate 0,5 g/l, Na2S2O5 0,04 g/l, bromocresol purple 0,016g/l, pH 6,7. Môi trường Urea broth: được dùng để thử nghiệm khả năng thủy phân urea của Salmonella. Thành phần môi trường như sau: cao nấm men 0,1 g/l, KH2PO4 9,1 g/l, Na2HPO4 9,5 g/l, urea 20 g/l, phenol red 0,08 g/l, pH 6,8. Môi trường Sorbitol phenol red broth: được sử dụng để thử nghiệm khả năng lên men đường sorbitol của Salmonella. Thành phần môi trường gồm có: peptone thịt 27 5 g/l, peptone đậu nành 5 g/l, sorbitol 10 g/l, NaCl 5 g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau khi thanh trùng là 7,4 0,2. Môi trường Dulcitol phenol red broth: được sử dụng để thử nghiệm khả năng lên men đường dulcitol của Salmonella. Thành phần môi trường gồm có: peptone thịt 5 g/l, peptone đậu nành 5 g/l, dulcitol 10 g/l, NaCl 5 g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau khi thanh trùng là 7,4 0,2. Môi trường Malonate broth: được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng malonate của Salmonella. Thành phần môi trường bao gồm: ammonium sulphate 2 g/l, dipotassium phosphate 0,6 g/l, monopotassium phosphate 0,4g/l, sodium chloride 2 g/l, sodium malonate 3 g/l, bromthymol blue 0,025 g/l. Phân phối 3 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở 115oC trong 10 phút. pH cuối 6,7 0,2. Môi trường Lactose agar 1%: được sử dụng để cảm ứng tạo ra enzyme - galactosidase dùng trong thử nghiệm ONPG. Thành phần môi trường như sau: lactose 10 g/l, peptone 5 g/l, cao thịt 3 g/l, NaCl 10 g/l, agar 15 g/l. Đĩa giấy ONPG: được sử dụng để thử nghiệm ONPG về khả năng tổng hợp enzyme - galactosidase. Mỗi đĩa được phân phối vào mỗi ống nghiệm chứa 0,5ml nước cất đã vô trùng. Đĩa giấy ONPG. được sản xuất bởi hãng Biorad dạng thương phẩm. 3.2.3 Vật liệu thí nghiệm Mẫu thực phẩm sử dụng trong thí nghiệm bao gồm các loại thực phẩm tươi sống được thu từ các chợ trong khu vực thành phố Hồ Chí Minh. Các mẫu được thu đại diện cho 5 nhóm thực phẩm: thịt gia súc, thịt gia cầm, trứng, thủy hải sản và rau được trình bày trong Bảng 3.1. Bảng 3.1 Các nhóm thực phẩm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Nhóm mẫu thực phẩm Số lƣợng Loại mẫu Thịt gia súc 38 Thịt heo, thịt bò, nem thịt, chả chiên, chả lụa, và các sản phẩm từ thịt như huyết, lòng… Thịt gia cầm 10 Thịt gà, thịt vịt và các sản phẩm thịt như huyết, lòng… Trứng 19 Trứng và vỏ trứng gà, vịt, cút 28 Thủy hải sản 27 Các loại cá, mực, tôm, sò, nghêu, ốc… Rau 21 Các loại rau ăn sống và rau nấu canh như rau diếp cá, rau thơm, rau xà lách, rau muống, rau tồn ô… 3.3 Phƣơng pháp 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu Mẫu được thu tại chợ và được chứa trong bao nylon hoặc hộp nhựa sạch, phải bảo quản mẫu bằng nước đá cho tới khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm để phân tích. Nếu chưa phân tích, mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 - 5oC trong 24 – 36 giờ, riêng đối với mẫu rau được bảo quản ở ngăn mát. 3.3.2 Phƣơng pháp bảo quản chủng vi sinh vật Các chủng Salmonella phân lập được từ thực phẩm được bảo quản trong các ống nghiệm thạch nghiêng TSA để dùng trong các bước thử nghiệm sinh hóa và phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh. Từ các ống thạch nghiêng TSA ở giai đoạn phục hồi, lấy một ít sinh khối bằng que cấy vòng cấy chuyển sang các ống nghiệm thạch nghiêng TSA mới để nhân giống và bảo quản giống, ủ ở 37oC qua đêm. Bảo quản các ống vi khuẩn giống này trong tủ lạnh ở 3 – 4oC đến khi sử dụng tiếp vào các thí nghiệm. Thời gian bảo quản từ 1 – 2 tháng. Hết hạn bảo quản, các chủng được hoạt hóa và cấy chuyển như trên. Mỗi ống chủng phải có ghi các thông tin như: tên, ký hiệu mẫu, ký hiệu chủng, ngày, số lần cấy chuyển. 3.3.3 Phát hiện Salmonella spp. trong thực phẩm bằng phƣơng pháp nuôi cấy Quy trình được thực hiện trong nghiên cứu này được dựa trên phương pháp tiêu chuẩn NMLK 79 – 5th, 2001 của Hiệp hội phân tích thực phẩm Bắc Âu (Nordic committee on food analysis) 3.3.3.1 Tiền tăng sinh Về nguyên tắc trộn 1 phần mẫu với 9 phần môi trường nước peptone đệm (BPW). Cân 25 g mẫu trong bao PE vô trùng và hòa đều lượng mẫu đó với 225 ml nước peptone đệm, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu từ 15 – 30 giây (tùy thuộc vào loại mẫu). Ta thu được dung dịch huyền phù và ủ ở 37 1oC từ 18 – 24 giờ. [16, 19] 3.3.3.2 Tăng sinh chọn lọc Lắc đều để trộn dịch tiền tăng sinh và cấy chuyển 0,1 ml dung dịch tiền tăng sinh sang 10 ml môi trường Rappaport Vassiliadis broth (RV), ủ ống nghiệm trong bể 29 điều nhiệt ở 42 0,2oC trong 24 3 giờ. Nếu tăng sinh dương thì môi trường đục đều, có thể hơi lắng cặn và tạo váng mỏng, môi trường bị biến đổi sang màu xanh dương nhạt hơn ban đầu. [5, 8, 19] Hình 3.1 Biểu hiện sinh hóa đặc trƣng trên môi trƣờng chọn lọc RV a: Môi trường RV trước khi cấy b: Môi trường RV sau khi nuôi cấy 3.3.3.3 Phân lập Từ môi trường tăng sinh chọn lọc RV, dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập từ khuẩn dịch tăng sinh chọn lọc sang đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng XLD sao cho có thể tạo được những khuẩn lạc tách rời nhau. Lật ngược đĩa ủ ở 37 1oC trong 24 giờ. Lý do để lựa chọn môi trường này vì nó có tính chọn lọc tương đối yếu, cũng như chúng tôi muốn tạo thuận lợi cho việc tăng sinh tối đa các khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella, vừa ức chế việc mọc của các vi khuẩn khác và như thế sẽ hạn chế sai sót. Nhờ vào môi trường phân lập này vừa phối hợp tăng sinh sẽ làm tăng khả năng phát hiện chủng vi khuẩn mong muốn. Trên môi trường XLD khuẩn lạc Salmonella điển hình trong, hơi nhuốm đỏ do sự thay đổi của chất chỉ thị trong môi trường, phần lớn có tâm đen ở giữa, lớn, bóng. a b 30 Bao giờ cũng có thể nhận thấy một vùng môi trường đỏ lớn hoặc nhỏ, đặc biệt khi Salmonella mọc dày trong môi trường. [20] Kinh nghiệm là điều rất quan trọng trong việc nhận biết khuẩn lạc Salmonella. Hình thái của chúng ít nhiều có biến động, không chỉ theo kiểu kháng huyết thanh mà còn theo sự khác biệt giữa các lô môi trường được sử dụng. Hình 3.2 Môi trường XLD trước khi cấy Hình 3.3 Hình dạng khuẩn lạc của Salmonella trên XLD 3.3.3.4 Phục hồi 31 Chọn ít nhất 3 – 5 khuẩn lạc điển hình hay nghi ngờ ở mỗi đĩa cấy trong giai đoạn phân lập chuyển sang môi trường rắn không chọn lọc Tryptic Soy Agar (TSA) để nhân sinh khối và phục hồi chủng vi sinh vật phân lập được từ thực phẩm để tiến hành thực hiện các thí nghiệm tiếp theo, ủ ở 37 1oC trong 18 – 24 giờ. 3.3.3.5 Khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa Những khuẩn lạc nghi ngờ phải được kiểm tra khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh. Cần tiến hành kiểm tra khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa phù hợp. Theo chúng tôi để kiểm tra định tính Salmonella chỉ xác định đến giống Salmonella, không cần đến loài, thì kết quả một số thử nghiệm sinh hóa phù hợp là hoàn toàn đủ để đi đến kết luận khẳng định. Trong trường hợp này các phản ứng huyết thanh chỉ mang tính hỗ trợ. [1] Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm bốn phản ứng sinh hóa trên các môi trường TSI, Mannitol phenol red broth, Urea phenol red both và LDC broth. Thử nghiệm trên môi trường TSI: Thử nghiệm khả năng lên men lactose, glucose và sinh khí H2S. Dùng que cấy nhọn lấy sinh khối từ môi trường phục hồi TSA cấy đâm sâu vào phần thạch sâu, rồi cấy ria trên bề mặt phần thạch nghiêng. Ủ ở 37oC trong 24 giờ, Salmonella sinh trưởng làm môi trường ở phần thạch nghiêng chuyển thành màu đỏ (kiềm), phần thạch sâu chuyển thành màu vàng (acid) do chúng không lên men được lactose mà chỉ lên men glucose. Đa số các dòng Salmonella đều có khả năng tạo thành khí H2S nên trong môi trường xuất hiện những vệt đen bên trong thạch hay trên bề mặt thạch nghiêng. Vặn nút ống nghiệm hơi lỏng để duy trì điều kiện hiếu khí khi ủ các thạch nghiêng do tránh sự tạo thành quá nhiều H2S. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm. [9] Thử nghiệm khả năng lên men đường mannitol: dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối từ môi trường TSA sang môi trường Mannitol phenol red broth. Ủ ở 37oC trong 24 giờ, Salmonella lên men và sinh acid từ mannitol nên môi trường sau nuôi cấy chuyển sang màu vàng. [20] Thử nghiệm khả năng tổng hợp enzyme lysine decarboxylase: dùng que cấy vòng chuyển sinh khối từ môi trường TSA sang môi trường LDC broth. Ủ ở 37oC 32 trong 24 giờ, Salmonella cho phản ứng kiềm có biểu hiện LDC dương tính khi môi trường có sinh khối và chuyển sang màu tím hoặc màu xanh. Thử nghiệm khả năng phân giải urea: dùng que cấy vòng lấy sinh khối từ môi trường TSA cấy chuyển sang môi trường Urea phenol red broth. Ủ ở 37oC trong 24 giờ, Salmonella không thủy giải urea nên không làm chuyển màu môi trường. Những vi sinh vật có phản ứng urea dương tính làm tăng pH môi trường nên sau khi nuôi cấy môi trường chuyển sang màu đỏ hồng. Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella spp. được trình bày trong Bảng 3.2 Bảng 3.2 Biểu hiện sinh hóa của Salmonella spp. Môi trƣờng Phản ứng Biểu hiện của môi trƣờng TSI H2S Sinh khí + / - + / - Phần nghiêng đỏ/phần sâu vàng Có hay không có vệt đen Có hay không có sinh khí Lysine Decaroxylase broth + Chuyển từ xanh sang tím Mannitol phenol red broth + Chuyển từ đỏ sang vàng, đục đều Urea phenol red broth - Không đổi màu 1 a b 5 4 3 2 8 7 6 33 Hình 3.4 Môi trƣờng thử nghiệm sinh hóa Salmonella spp. trƣớc và sau khi nuôi cấy vi sinh vật a- Môi trƣờng trƣớc khi nuôi cấy: 1. Môi trường TSI, 2. Môi trường Mannitol phenol red broth, 3. Môi trường LDC, 4. Môi trường Urea phenol red broth b- Môi trƣờng sau khi nuôi cấy: 5. Môi trường TSI, 6. Môi trường Mannitol phenol red broth, 7. Môi trường LDC, 8. Môi trường Urea phenol red broth 3.3.3.6 Khẳng định Salmonella bằng kháng huyết thanh Thông thường tiến hành thử phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và đơn giá để xác định chủng phân lập là Salmonella. Chia lame kính sạch làm hai phần: một phần nhỏ một giọi nước muối sinh lý để làm đối chứng âm và nhỏ một giọt huyết thanh. Lấy một ít sinh khối vi sinh vật từ môi trường TSA khuyếch tán vào giọt huyết thanh, làm tương tự với giọt nước muối sinh lý, tán đều. Chờ 30 – 60 giây quan sát trên nền đen, phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh xảy ra khi không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối sinh lý hỗn hợp vẫn đục đều như sữa, còn ở giọt huyết thanh thì có hiện tượng ngưng kết, xuất hiện các kết tủa dạng hạt hoặc dạng sợi, dịch huyết thanh thì lại trong suốt . Sau khi quá trình thử nghiệm phản ứng sinh hóa phù hợp và có sự ngưng kết huyết thanh O đa giá và đơn giá thì kết luận Salmonella dương tính trong 25 g mẫu. Chỉ làm phản ứng với kháng huyết thanh sau khi đã xác định sinh hóa. Thực hiện phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá của vi khuẩn Salmonella trước, sau đó mới làm kháng huyết thanh đơn giá sau. Hình 3.5 Phản ứng không ngƣng kết xảy ra ở giọt nƣớc muối sinh lý 33 Hình 3.6 Phản ứng ngƣng kết xảy ra ở giọt huyết thanh 34 Quy trình phân tích định tính Salmonella spp. trong thực phẩm bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống được tóm tắt trong Hình 3.7 Hình 3.7 Sơ đồ tóm tắt quy trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm 25g mẫu thực phẩm 225 ml môi trường tiền tăng sinh BPW 1- Bước đồng nhất mẫu 2- Tiền tăng sinh Ủ 37oC/18 - 24h 3- Tăng sinh chọn lọc Ủ 42oC/24h Hút 0,1ml canh khuẩn tiền tăng sinh 10ml môi trường RV Ủ ở bể điều nhiệt 42 0,2oC/18 – 24h đục 4- Phân lập Ủ 37oC/24h Môi trường XLD, khuẩn lạc tâm đen, trong suốt 5- Phục hồi Ủ 37oC/18-24h Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ 6- Thử nghiệm sinh hóa Huyết thanh học Ủ 37oC qua đêm Môi trường TSA Urea TSI Mannitol LDC Giọt huyết thanh Nước muối Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh O đa giá và đơn giá ở giọt huyết thanh, và mẫu đối chứng âm là giọt nước muối sinh lý. một ít sinh khối vi sinh vật từ môi trường TSA khuyếch tán vào và tán đều 35 3.3.4 Xác định S. enterica I Sau khi đã xác định được Salmonella spp., tiến hành nhân giống và phục hồi giống vi sinh vật bằng cách sử dụng que cấy vòng lấy một ít sinh khối từ ống nghiệm chứa chủng Salmonella đã được bảo quản ở 3 – 4oC cấy chuyển sang các ống nghiệm môi trường thạch nghiêng TSA mới, ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ. Để xác định S.enterica I, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên bốn phản ứng sinh hóa đặc trưng như sau: Thử nghiệm khả năng sử dụng malonate: dùng que cấy vòng chuyển sinh khối từ môi trường TSA sang môi trường Malonate broth, phải sử dụng thêm ống môi trường malonate không chứa vi khuẩn làm đối chứng, bởi vì loại môi trường này đôi khi không được cấy vẫn chuyển qua màu xanh dương (màu biểu hiện kết quả dương tính). Đem ủ ở 37oC qua đêm. S. enterica I không sử dụng malonate nên môi trường vẫn giữ nguyên màu xanh lục ban đầu. Thử nghiệm ONPG: sử dụng que cấy vòng lấy một ít sinh khối từ môi trường TSA cấy chuyển sang môi trường Lactose agar và ủ 37oC qua đêm, sau đó cấy vi khuẩn bằng que cấy vòng từ môi trường Lactose agar sang ống nghiệm chứa 0,5 ml nước cất có chứa đĩa ONPG. Đem ủ ở 37oC trong 4 giờ và đọc kết quả. Loài phụ S. enterica I không có hệ enzyme - galactosidase nên cho phản ứng âm tính, vì vậy không làm đổi màu dung dịch, dung dịch có màu trắng đục. Các loài phụ khác của S. enterica có thể làm nước cất chuyển sang màu vàng. Phản ứng dương tính trong ống nghiệm dung dịch có màu vàng thường sau một giờ, một số vi khuẩn cho phản ứng nhanh hơn chỉ sau 5 – 10 phút. Thử nghiệm khả năng lên men đường sorbitol: lấy ít sinh khối từ môi trường TSA, dùng que cấy vòng cấy chuyển sang môi trường Sorbitol phenol red broth. Biểu hiện dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và môi trường đục. Thử nghiệm khả năng lên men đường dulcitol: chuyển vi khuẩn bằng que cấy vòng từ môi trường TSA sang môi trường Dulcitol phenol red broth. Đậy nút không quá chặt và ủ ở 37oC qua đêm. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và xuất hiện sinh khối, đôi khi có bọt khí trên bề mặt môi trường. 36 Bốn phản ứng sinh hóa đặc trƣng của S. enterica I đƣợc thể hiện trong Bảng 3.3 và Hình 3.8. Bảng 3.3 Biểu hiện sinh hóa của S. enterica I Môi trƣờng Phản ứng Biểu hiện của môi trƣờng Malonate broth - Không đổi màu, giữ màu xanh lục ban đầu O.N.P.G. - Không đổi màu, môi trường trắng đục Dulcitol phenol red broth + Chuyển từ màu đỏ sang màu vàng Sorbitol phenol red broth + Chuyển từ màu đỏ sang màu vàng Hình 3.8 Môi trƣờng xác định S. enterica I trƣớc và sau khi nuôi cấy vi sinh vật a- Môi trƣờng trƣớc khi nuôi cấy: 1. Môi trường Malonate broth, 2. Thử nghiệm O.N.P.G., 3. Môi trường Sorbitol phenol red broth, 4. Môi trường Dulcitol phenol red broth b- Môi trƣờng sau khi nuôi cấy: 5. Môi trường Malonate broth, 6. Thử nghiệm O.N.P.G., 7. Môi trường Sorbitol phenol red broth, 8. Môi trường Dulcitol phenol red broth 1 b 5 4 3 2 8 7 6 a 37 3.3.5 Nhận định kết quả Quy trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính Salmonella giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25 g mẫu, không cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu. Nếu phản ứng sinh hóa phù hợp với đặc tính Salmonella spp. và trên phiến kính có ngưng kết, có thể kết luận là Salmonella. Nếu phản ứng sinh hóa phù hợp nhưng phản ứng huyết thanh lại âm tính, thì kết luận là vi khuẩn không ngưng kết thuộc Salmonella. Một số điểm cần lưu ý khi xác định Salmonella có trong thực phẩm bằng phương pháp truyền thống: Cần tiến hành phân tích một số lượng cần thiết các đơn vị mẫu trên cơ sở tính chính xác mang tính chất thống kê. Các môi trường thạch đĩa vừa được chuẩn bị có thể ức chế một vài chủng Salmonella, do đó nên chuẩn bị các thạch đĩa này một ngày trước khi đem sử dụng. Cần bảo quản các đĩa này trong bóng tối ở nhiệt độ phòng cho đến lúc sử dụng. Sau khi quan sát thấy có khuẩn lạc Salmonella nghi vấn trên môi trường thạch chọn lọc, phải tiến hành các test sinh hóa và huyết thanh trên tất cả các khuẩn lạc này và cần phải lấy một số lượng lớn để duy trì độ nhạy của phương pháp. Đôi khi các vi khuẩn Salmonella cho các thử nghiệm sinh hóa không điển hình như H2S âm tính, dulcitol âm tính, hay malonate dương tính, có thể được phân lập. Cần lưu ý rằng việc xếp loại các khuẩn lạc Salmonella phân lập được phụ thuộc hoàn toàn vào cấu trúc kháng nguyên chứ không chỉ riêng vào các đặc điểm sinh hóa. Đôi khi ống nghiệm chứa môi trường dịch thể malonate không được cấy vi khuẩn cũng chuyển qua màu xanh khi để lâu, do đó cần sử dụng ống chỉ chứa môi trường dịch thể malonate mới để làm đối chứng. Vì Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm. Do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Salmonella dùng làm đối chứng dương cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa.