Khóa luận Nghiên cứu công nghệ khử nghiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng một số chủng vi khuẩn và vi nấm

300 Bắp cho heo vỗ béo B1+B2+G1+G2 200 2.3. Vấn đề khử nhiễm các mycotoxin Sự nhiễm aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc có thể gây nguy hiểm đến sức khỏe con người và động vật. Vì vậy các nhà khoa học đã cố gắng tìm kiếm các phương pháp để loại trừ hay phá hủy các aflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm. Phương pháp giải quyết tốt nhất là kiềm chế aflatoxin và phòng ngừa. Tuy nhiên sự nhiễm aflatoxin đôi khi là không thể tránh được, và nếu phòng ngừa thất bại thì phải xem tới các biện pháp khác. Các kỹ thuật dùng để khử aflatoxin trong các mặt hàng khác nhau bao gồm phòng trừ bằng phương pháp vật lý, hóa học và sinh học. 2.3.1. Vấn đề phòng ngừa Vấn đề phòng ngừa sự nhiễm Aspergillus sản sinh aflatoxin có thể đưa ra những biện pháp kiềm chế có lợi và hiệu quả nhất. Nó có thể làm giảm phần lớn những tổn thất lương thực do nấm mốc gây hại. Sau đây là một số biện pháp phòng chống nấm mốc cho lương thực trong quá trình bảo quản: - Làm khô bằng nhiệt: Làm khô tự nhiên ( phơi dưới ánh nắng mặt trời). Sấy khô ( hàn, điện) làm cho các cơ chất đạt lượng nước cho phép. Ví dụ ngô cần làm khô tới ≤ 13% trước khi bảo quản. Phần lớn các loại nấm mốc phát triển tốt ở hàm lượng cơ chất 18-25%. - Chiếu xạ: Chiếu xạ tia cực tím, tia λ với mục đích tiêu diệt các loại vi khuẩn, nấm mốc để làm giảm thiệt hại do chúng gây ra, các tia này làm biến đổi cấu trúc chủ yếu của các axit amin, axit nucleic, protein làm tác động chuyển hóa tế bào, tác dụng diệt nấm, diệt vi khuẩn. Phần lớn các loài nấm mốc bị diệt ở liều 4.5 kgy (1kgy = 100 Krad = 1kJ/kg). - Sử dụng các loại khí: Metylbromid ở liều 129 mg/l/Penillium hoặc 40mg/l/Penillium có thể diệt được nhiều loại nấm mốc. Khí ozon ở liều 10mg/m3 không khí được xác định liên tục trong nhiều ngày có thể ngăn cản sự phát triển của nấm mốc. Khí CO2 được ứng dụng trong bảo quản lương thực trong túi PE kín có thể chống được nấm mốc. - Hoá học : Được ứng dụng và nghiên cứu do tích chất an toàn của một số hoá chất, đặc biệt là các axit hữu cơ: axit sorbic, axit propionic, axit acetic, axit benzoic các muối Na và Ca của chúng như canxipropionat hay natripionat ở liều 1-3% các axit hoặc muối của axit trên có thể ức chế sự phát triển của nấm mốc trong thời gian dài. Một số hợp chất hữu cơ khác thiosulfit, Na 2SO3, KHSO2, NaHSO3, Na2S2O5 thiabendazon diphing, tinh dầu thực vật( tinh dầu cam ở liều 0.2%) có thể ức chế được nhiều loại nấm mốc, mentho liều 1.1% một số tinh dầu khác: tinh dầu hôi tinh dầu được chiết từ cây tỏi có tác dụng ức chế nấm mốc. - Sinh học: Dùng các loại cây có sẵn trong thiên nhiên để chống nấm mốc thực phẩm. Ví dụ dùng lá cây xoan hoặc lá hoa cúc vàng để xông vì cả hai loại lá cây này đều có tinh dầu, axit focmic. Đó là những chất sát khuẩn, kháng khuẩn. Khi xông bằng hai loại lá này thì ngô có độ ẩm 10-13% có thể kéo dài thời gian bảo quản 30 ngày. - Vô hoạt hay mất hoạt tính bằng phương pháp vật lý: ít có hiệu quả vì aflatoxin có thể chịu nhiệt được nhiệt độ >100-105oC. Nếu chiếu xạ 10kgy thì sẽ gây ảnh hưởng tới nguyên liệu. Dùng hấp ướt (autoclve) 1.5at trong 60 phút nhưng lại ít có giá trị ứng dụng trong thực tế. - Phương pháp hấp thụ: Các chất hấp thụ như silicagel, axit nhân silic, than hoạt tính… có tác dụng rất tốt để hấp thụ aflatoxin trong quá trình tiêu hóa, các aflatoxin được hấp thụ sẽ được thải ra ngòai qua phân. - Làm mất hoạt tính bằng các hợp chất oxi hóa khử Na2SO4, NaHSO3, 1% hoặc 2% có tác dụng vô hoạt aflatoxin. Hiện nay người ta sử dụng NH3 ở dạng khí nén được bơm tuần hoàn vào các thùng chứa ngô bằng thép (Metal silo) hoặc trong các túi PE có thể chứa đến 2030 tấn ngô. Ngô có hàm lượng aflatoxin 750ppb sau 13 ngày xử lý, với 1.5 % NH3 ở nhiệt độ 32oC đã làm giảm xuống còn 7 ppb. 2.3.2. Các phương pháp khử độc tố bằng hóa chất Nhiều hóa chất có thể phá hủy aflatoxin tinh khiết hayaaflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự nhiên. Những hóa chất này bao gồm: chlorine, ozon, acid hydrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin. Các hóa chất dùng cho việc khử độc tố aflatoxin phải thỏa mãn các tiêu chuẩn sau: - Phải phá hủy hay khử aflatoxin Không được tạo hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc hay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng. Phải phá hủy các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi, chúng có thể tái nhiễm lại ở sản phẩm. Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban đầu. Nhiều hóa chất khảo sát đã không thỏa mãn tất cả các tiêu chuẩn trên. Mặc dù chúng phá hủy các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn. Một số quá trình xử lý bằng hóa chất có hiệu quả trong việc phá hủy các afatoxin thỏa mãn những tiêu chuẩn trên. Trong số này hydrogen peroxit, natri hydroxit và natri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử afltaoxin từ các sản phẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn, trong khi đó dimetylamin hay amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt có dầu. 2.3.3. Giảm hàm lượng aflatoxin bằng biện pháp sinh học Nhiều loại hóa chất có thể phá hủy aflatoxin tinh khiết hoặc các aflatoxin trong các nguyên liệu tự nhiễm tự nhiên khác như: chlorin, ozon, acid hydrôchloric…Các hóa chất này mặc dầu phá hủy aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm phụ có tác dụng không mong muốn. Do vậy việc sử dụng các biện pháp sinh học không có hại cho con người và thực phẩm mà lại có khả năng làm giảm sự tạo độc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố là biện pháp lý tưởng. Một số chủng nấm mốc và vi khuẩn có khả năng giảm sự tạo độc tố thì ngoài việc đảm bảo tính an toàn không độc hại đối với con người và thực phẩm được xử lý, đôi khi cần phải thỏa mãn một số yêu cầu khác, chẳng hạn Streptorocus lactic đòi hỏi nuôi trên môi trường dinh dưỡng đặc biệt nên không thể thích hợp đối với việc xử lý trên ngũ cốc và thực phẩm. Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn cho phép sử dụng là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hoá chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản. Khử độc tố bằng biện pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzym hay chuyển hoá sinh học của các độc tố nấm. 2.3.3.1. Khử nhiễm aflatoxin bằng chủng Flavobacteroum aurantiacum Flavobacterium aurantiacum là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí tế bào hình que, dạng thuôn dài, kích thước chiều dài 2-5 µm, rộng 0.3-0.5 µm, jhông có khả năng di động. Khuẩn lạc trên thạch có màu từ vàng kem đến màu vàng cam. Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Claude Morro (1970), Cotty Pitter (1992) đã cho thấy vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum có khả năng phân huỷ aflatoxin. Nó có khả năng phân hủy aflatoxin một cách không trở lại cả từ môi trường rắn và môi trường lỏng. Khả năng loại trừ aflatoxin B1 của vi khuẩn này từ các thực phẩm đã được chứng minh ở các loại dầu thực vật lạc, ngô, bơ lạc và sữa lạc. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng yếu tố có vai trò quan trọng trong việc phân giải aflatoxin B1 bằng chất chiết của Flavobacterium aurantiacum có thể là protein với các tính chất enzym. Khả năng sử dụng chất chiết protein thô từ Flavobacterium aurantiacum được tinh chế trong công nghiệp thực phẩm đã được Cộng đồng Châu Âu và cơ quan Quản lý thực phẩm và thuốc của Mỹ đề nghị như các biện pháp loại trừ aflatoxin từ các thực phẩm bị nhiễm. 2.3.3.2. Khử nhiễm aflatoxin bằng chủng Rhizopus delemar. Theo Larone Rhizopus delemar là lòai phổ biến trong thiên nhiên như trong đất, không khí, hoa quả thối, trong xác động thực vật và trong bánh mì để lâu ngày. Rhizopus delemar thường phát triển khuẩn ty bao phủ phần bên ngoài cở chất. Khuẩn ty của Rhizopus delemar không có vách ngăn. Khi còn non sợi khuẩn ty có dạng sợi bông vải màu trắng. Khi trưởng thành sợi khuẩn ty có màu xám, khi già chuyển thành màu xám hơi vàng. Khuẩn lạc Rhizopus delemar phát triển rất nhanh trên môi trừơng PDA. Mặt trắng của khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử hình tròn hoặc hình trứng, đường kính 4-11µm, bề mặt trơn. Nhiệt độ là 25oC và pH tối ưu của Rhizopus delemar là 5.5-5.8. Zhu C.R. và cộng sự (1989) đã nghiên cứu tác dụng khử nhiễm aflatoxin của Rhizopus delemar bằng thực nghiệm trên chuột nhắt có nhiễm aflatoxin. aflatoxin B1 đã được đưa vào nước uống cho chuột nhắt cái ở liều 126 mg trong một tuần và toàn thể liều thử là 3,40 mg trong thời gian 27 tuần. Chất chiết của Rhizopus delemar đã được đưa đồng thời vào nhóm chuột này bằng việc trộn dung dịch aflatoxin B1. Chuột được giết riêng biệt vào các tuần tuổi 18. 30, 38, và 52. Các ổ bệnh thay đổi tế bào gan và các mô ung thư đã được định lượng bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử và bằng các phản ứng enzym. Ở nhóm chuột ăn thức ăn nhiễm aflatoxin B1, tai biến ung thư gan là 71%. Ở nhóm chuột ăn thức ăn có Rhizopus delemar cùng với aflatoxin B1, các ổ bệnh phát triển quá mức và các ổ bệnh có triệu chứng bệnh học enzym đã giảm ở tất cả các thời gian lấy mẫu chuột để thử và không có con chuột nào xuất hiện triệu chứng ung thư gan. Kết quả thực nghiệm này cho thấy rằng Rhizopus delemar có khả năng ức chế mạnh tác dụng độc và tính gây ung thư gan của aflatoxin B1. Nấm Rhizopus delemar có thể được sử dụng như biện pháp tiện lợi và hiệu quả để kiểm soát sự nhiễm độc do aflatoxin. 2.3.6 Biện pháp phân tách vật lý a. Các qui trình phân loại Vì biện pháp phòng ngừa rất khó thực hiện trong thực tế, cho nên người ta tìm các biện pháp khác để kiềm chế. Các phương pháp sử dụng rộng rãi nhất bao gồm loại trừ chọn lọc các phần đã nhiễm của sản phẩm. Nói rộng ra, vấn đề này là khả năng áp dụng phụ thuộc chủ yếu vào tích chất vật lý của sản phẩm. Các qui trình phân loại dựa trên các đặc tính như màu và kích thước của hạt… đã được sử dụng thành công đối với lạc ăn. Những phương pháp này dựa trên sự định vị aflatoxin ở phần tương đối nhỏ của hạt, với sự thiếu hụt rất dễ nhận ra ở kích thước và hình dạng của hạt. b. Các quy trình chiết xuất bằng dung môi Việc chiết xuất bằng dung môi có một số thuận lợi: - Aflatoxin có thể bị loại trừ hoàn toàn một cách cơ bản trong điều kiện thuận lợi . - Ít có khả năng tạo từ aflatoxin những sản phẩm khác có hoạt tính sinh lý đa dạng. - Việc chiết xuất có thể tiến hành với việc thu hồi dung môi mà không bị mất chất dinh dưỡng trong nhiều trường hợp. Những điều bất lợi: - Cần phải có chiết xuất dung môi đặc biệt - Sẽ chiết xuất luôn một số thành phần hòa tan cùng aflatoxin - Giá thành của việc chiết xuất cao - Có thể bị mất mùi của sản phẩm xử lý Để tìm được dung môi có thể thích hợp cho tất cả các sản phẩm là một nhiệm vụ khó. Các yếu tố khác như giá của dung môi và biện pháp thu hồi chúng cũng là vấn đề. Thêm nữa là độc tính của dung môi và dư lượng của chúng, cuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy, dễ nổ và điểm sôi của dung môi. Các aflatoxin có thể được chiết xuất bằng các dung môi như cloroform/nước, axeton/nước. Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin đơn độc mà không loại trừ dầu.Còn các nhóm dung môi như hidrocacbon dầu hỏa/nước loại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết xuất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan – etanol - nước, và hexan –axeton - nước.Hệ thống bao gồm 54% axeton, 44% hexan và 2% nước ( tính theo trọng lượng ) đã tìm thấy một trong những hệ thống thành công nhất có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12-15% dầu và dư lượng lipit gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 microgam/kg. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Đối tượng nghiên cứu 3.1.1. Vật liệu Các chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopus delemar do phòng vi sinh Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch cung cấp 3.1.2. Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin B1 * Na2SO4 khan ( Trung Quốc ). * NaCl nhà máy hóa chất Việt Trì. * Các dung môi cloroform, hexan, aceton, chì axetat (Trung Quốc). * Các chuẩn độc tố aflatoxin B1 (Sigma, Mỹ). * Silicagel 60 F245, Merck, Cộng hòa liên bang Đức, cho sắc ký lớp mỏng. 3.1.3. Dụng cụ thí nghiệm * Buồng sắc lý lớp mỏng (chromatography tank ), Thụy Sỹ. * Máy nghiền đồng thể polytron, Cộng hòa liên bang Đức. * Giấy lọc Whatman No1, Chemapoli, Tiệp Khắc. * Kính hiển vi Olympus có gắn máy chụp ảnh Nhật. * Phễu chiết. * Ống hút tự động 0,2ml và 0,1ml Trung Quốc. * Bơm tiêm vi lượng Hamilton. * Máy cô chân không. * Đèn cực tím 254 nm – 366nm Camag (Thụy Sỹ ). * Máy đánh sóng siêu âm. * Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh vật. * Máy cất quay chân không ( Đức). * Tủ cấy vô trùng ( Đức). * Nồi hấp tự động ( Đài Loan). * Máy lắc. 3.2. Phương pháp chiết xuất aflatoxin. Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng do Doronina và Maksimenko [17] mô tả. Dựa trên cơ sở của phương pháp CB (AOAC) [13] có cải tiến gồm những giai đoạn sau: 25 gam mẫu được nuôi A. flavus, chiết xuất aflatoxin bằng hỗn hợp aceton (100ml) và dung dịch NaCl 10% (25ml). Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron. Lọc qua giấy lọc Whatman No1. Lấy 50ml dịch lọc và kết tủa bằng Pb(CH3COO)2 10% (50ml) để loại bỏ protein, tiếp tục lọc qua giấy lọc để thu 80ml dịch lọc. 80 ml dịch lọc đó chuyển vào phễu chiết và được bổ sung 2 lần hexan (40ml ) để chiết xuất bằng hai pha lỏng-lỏng. Bỏ phần dịch nổi phía trên. Phần dịch trong ở phía dưới lại tiếp tục đưa trở lại phễu chiết và được bổ sung cloroform 40ml (3lần). Lớp nước aceton nhẹ hơn sẽ nổi lên trên, loại bỏ lớp aceton. Lớp clorofrom có aflatoxin được giữ lại. Làm bay hơi toàn bộ lượng clorofrom có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không. Phần cặn được hòa tan vào 100 µl clorofrom, giữ ở 40C cho đến khi tiến hành định lượng và định tính aflatoxin. Quy trình chiết tách Aflatoxin Mẫu ngô, lạc 25ml NaCl 10% 100ml aceton Nghiền 5 phút trên máy nghiền đồng thể Nghiền nhỏ 50 ml chì axetat 10% Lọc lấy 50 ml dịch Na2SO4 khan Lọc 80 ml dịch 40 ml n-hexan (nhắc lại 2 lần) Phiễu chiết Bỏ phần dịch nổi trên Chloroform (Nhắc lại 3 lần) Lấy phần dịch trong Lấy pha trên cho vào Bình cầu Cất quay (cô chân không) lấy 3 ml cặn Ống nhót để bay hơi lấy cặn Bọc giấy bạc bảo quản lạnh 4oC - Định tính aflatoxin: Dùng bơm tiêm vi lượng (mycrosyring) nhỏ trên sắc lý lớp mỏng 2µl, 4µl, 6µl và 2lần 10µl mẫu phân tích. Một lượng nhỏ của dung dịch được chấm vào phiến mỏng cách đường thẳng mép dưới 2cm và 1,5-2 cm từ mỗi cạnh bên.Việc chấm phải thực hiện ở những phần nhỏ sao cho đường kính của các vết nhỏ không quá 5mm trên đường bắt đầu. Nhỏ 2, 4, 6 µl chuẩn aflatoxin B1 với nồng độ 0,71 ng/µl trên cùng một phiến bản mỏng. Nhỏ 5 µl chuẩn aflatoxin B1 vào cùng một vết của mẫu phân tích (10µl) như chuẩn trong. Hệ dung môi cho sắc ký bản mỏng một chiều là: clorofrom : aceton = 1: 9. Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 1µg aflatoxin/kg sản phẩm, hệ số dao động là 0,3-5,0. Phát hiện aflatoxin bằng cách phát hiện sự phát quang của phiến lớp mỏng ở buồng tối dưới đèn cực tím sóng dài (có bước sóng 365 nm). Phát hiện bằng mắt thường trên sắc ký đồ của mẫu chiết, cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn. Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc định lượng aflatoxin. Thử xác minh aflatoxin: * Thử với acid vô cơ: phun lên bản mỏng dung dịch acid H2SO4 trong nước tỉ lệ 2: 1. Nếu như màu phát quang các vết của mẫu chiết không chuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có aflatoxin trong mẫu thử. Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử aflatoxin ứng với nồng độ di động sắc ký cũng chuyển thành màu vàng, điều đó có thể xem như có aflatoxin trong mẫu thử. * Thử với acid trifluoroaxetic: Chỉ áp dụng aflatoxin B1, G1, M1 : sau khi nhỏ các vết của các mẫu thử và chuẩn aflatoxin, nhỏ lên các vết chấm của chuẩn và mẫu thử 30 µl acid trifluoroaxetic. Để phản ứng xảy ra trong 10 phút. Tránh ánh sáng. Sau đó chạy sắc ký trên hệ dung môi thích hợp. Aflatoxin sau khi kết họp với axit trifluoroaxetic tạo thành một hợp chất phân cực hơn nên có Rf thấp hơn so với aflatoxin không có axit chỉ thị. Mẫu có aflatoxin sẽ tụt ngang với Rf của chuẩn so với chuẩn không chấm axit trifluoroaxetic. Đây là phản ứng chính thức được dùng để làm phản ứng thử xác minh aflatoxin của các phòng thí nghiệm trên thế giới. _Định lượng aflatoxin: Nếu aflatoxin được phát hiện trong mẫu thử, có thể định lượng chúng như sau: Nhỏ 10µl chất chiết với đường kính của vết không quá 5mm, ở góc dưới bên phải của bản mỏng và cách mép 1,5cm. Ở góc dưới bên trái cách mép 1, 2, 3 cm và 1,5 cm từ mép dưới của bản mỏng nhỏ 2, 4, 6 µl theo thứ tự dung dịch chuẩn aflatoxin. Thực hiện sắc kí bản mỏng ở hệ dung môi cloroform : aceton =9 : 1. So sánh cường độ phát quang của các chuẩn aflatoxin khác nhau trên phiến mỏng với vết của mẫu thử. Bằng mắt thường định lượng aflatoxin ở vết của mẫu thử (nanogram) theo công thức sau: V1 .V3 .V5 . m C = —————— V2 . V4 . V6 . M Trong đó: C là nồng độ aflatoxin B1 ở mẫu thực phẩm phân tích ng/g (ppb) V1 là thể tích hỗn hợp nước – aceton (ml) V2 là thể tích hỗn hợp nước – aceton lấy cho phân tích (ml) V3 là thể tích hỗn hợp nước – aceton và chì acetate (ml) V4 là thể tích dịch lọc sau khi làm sạch bằng chì acetate (ml) V5 là thể tích dịch chiết đã bay hơi làm sạch ở cloroform trước khi làm sắc kí bản mỏng (µl) V6 là thể tích dung dịch chiết chấm vào bản mỏng (µl) m là lượng aflatoxin ở vết chuẩn trên phiến mỏng (ng) M là trọng lượng sản phẩm lấy để phân tích (g) 3.2.7. Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng chủng Rhizopus.delemar Bổ sung 1 lượng Rhizopus delemar với mật độ bào tử là 106 / g xử lý vào 250 g ngô hạt hoặc lạc hạt có bổ sung các chất khoáng và 1 lượng aflatoxin là 200 ppb. Tiến hành nuôi các chủng Rhizopus delemar trên ngô hạt hoặc lạc hạt ở các nhiệt độ là 200C, 250C, 280C, 300C, 350C và độ ẩm là 15%, 17%, 20%, 25%, 30%. Sau các khoảng thời gian là từ 1 đến 9 ngày xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin bằng chủng Rhizopus delemar trên thông qua việc xác định hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô xử lý. Chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thuỳ Châu. 3.2.8. Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng chủng Flavobacterium aurantiacum. Bổ sung 1 lượng hỗn dịch tế bào Flavobacterium aurantiacum sao cho có nồng độ là 106 tế bào/ml môi trường bột ngô lỏng hoặc bột lạc lỏng có bổ sung một số chất khoáng và một lượng aflatoxin là 200ppb. Tiến hành nuôi cấy Flavobacterium aurantiacum trên môi trường bột ngô lỏng hoạc bột lạc lỏng ở các nhiệt độ 220C, 240C, 260C,280C, 300C. Sau các khoảng thời gian từ 1 đến 9 ngày xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin bằng Flavobacterium aurantiacum thông qua việc xác định hàm lượng aflatoxin trong mẫu xử lý. Chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thuỳ Châu. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô của chủng Rhizopus delemar Trong số 22 chủng Rhizopus delemar do phòng vi sinh viện cơ điện nông nghiệp phân lập chúng tôi đã tiến hành khảo sát 6 chủng để đánh giá hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô. Bảng 1: Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng một số chủng Rhizopus delemar sau 7 ngày xử lý. STT chủng Tên chủng Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lý (ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau khi xử lý (ppb) Hiệu quả khư aflatoxin của chủng R.delemar(%) 1 R.delemarVS1 200 70 65 2 R.delemarVS2 200 40 87 3 R.delemarVS3 200 70 65 4 R.delemarVS4 200 60 70 5 R.delemarVS5 200 54 73 6 R.delemarVS6 200 70 65 Kết quả ở bảng 1 cho thấy việc sử dụng các chủng Rhizopus delemar đã khử được aflatoxin trên ngô một cách đáng kể, hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lý là 200ppb xuống còn từ là 70ppb đến 40 ppb sau xử lý. Trong số các chủng khảo sát có chủng R.delemarVS2 có hoạt tính khử aflatoxin cao nhất nhất, hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước xử lý là 200ppb và sau xử lý là 40ppb, hiệu quả khử aflatoxin của chủng này là 87%. Các chủng còn có hoạt tính khử aflatoxin thấp hơn lại cho hiệu quả khử aflatoxin đạt từ 65 đến 73%. Đây là kết quả quan trọng trong việc ứng dụng chủng Rhizopus delemarVS2 để khử nhiễm aflatoxin ở mức độ cao trên ngô ở quy mô lớn. Nghiên cứu một số của yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả khử aflatoxin nhiễm trên ngô ở mức độ cao của chủng R.delemaVS2. Để nghiên cứu công nghệ khử nhiễm trên ngô ở mức độ cao, chúng tôi đã khảo sát một số yếu tố công nghệ như thời gian xử lý, nhiệt độ xử lý, độ ẩm của ngô trong quá trình xử lý. 4.1.1.1 Ảnh hưởng của thời gian xử lý Bảng 2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin nhiễm trên ngô của chủng Rhizopus delemarVS2. STT Thời gian xử lý(ngày) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lý(ppp) bằng chủng R.delemarVS2 Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau khi xử lý bằng chủng R.delemarVS2(ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng chủng R.delemarVS2 (%) 1 Ngày thứ nhất 200 200 0 2 Ngày thứ hai 200 190 5 3 Ngày thứ ba 200 170 15 4 Ngày thứ tư 200 145 28,5 5 Ngày thứ năm 200 110 45 6 Ngày thứ sáu 200 70 65 7 Ngày thứ bảy 200 50 75 8 Ngày thứ tám 200 35 88,5 9 Ngày thứ chín 200 20 90 Kết quả bảng 2 cho thấy trong 5 ngày đầu của quá trình xử lý, hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2 là không đáng kể, chỉ đạt từ 0 đến 45%. Từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 9, hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2 là cao nhất, hàm lượng aflatoxin trên ngô trước xử lý là 200ppb giảm xuống còn 35ppb ở ngày thứ 8 và 20ppb ở ngày thứ 9 sau xử lý, hiệu quả giảm aflatoxin lần lượt là 88,5% đến 90%. Như vậy khoảng thời gian thích hợp nhất để xử lý aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2 là 8 đến 9 ngày. Dưới đây là đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2: Động thái khử aflatoxin nhiễm trên ngô bằng chủng R.. delemarVS2 4.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng R. delemar VS2. Sau khi xác định được thời gian xử lý thích hợp bằng chủng R.. delemar VS2, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến hiệu quả khử aflatoxin của chủng R.. delemarVS2. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô của các chủng R.. delemarVS2 được thể hiện ở bảng 3. Bảng 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin nhiễm trên ngô của chủng R.delemarVS2. STT Nhiệt độ (oC) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lý bằng chủng R.delemarVS2 (ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau khi xử lý bằng chủng R.delemar VS2 (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô chủng bằng R.delemarVS2. (%) 1 20 200 180 10 2 25 200 130 35 3 28 200 20 90 4 30 200 35 70 5 35 200 120 40 Kết quả bảng 3 cho thấy, với nhiệt độ xử lý là 28oC hàm lượng aflatoxin trên mẫu ngô trước khi xử lý là 200ppb và sau xử lý bằng chủng R.delemarVS2 giảm xuống còn 20ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô đạt 90%. Với nhiệt độ xử lý là 200C hàm lượng aflatoxin trên ngô trước khi xử lý là 200 ppb và sau xử lý bằng chủng R.delemarVS2 giảm xuống còn 180 ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô đạt 10%. Với nhiệt độ xử lý là 30oC, hàm lượng aflatoxin trên mẫu ngô trước khi xử lý là 200ppb và sau khi xử lý bằng chủng R.delemarVS2 giảm xuống còn 35ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô đạt 70%. Như vậy, với các nhiệt độ xử lý 20oC, 25oC, 28oC, 30oC và 35oC, chúng tôi thấy rằng ở 28oC và 30oC hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2 là rất cao. Đặc biệt với nhiệt độ xử lý là 280C hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2 là cao nhất, đạt 90%. Còn ở các nhiệt độ cao hơn 300C và thấp hơn 250C đều không thuận lợi cho hiệu quả giảm aflatoxin của chủng R.delemarVS2. Như vậy, nhiệt độ xử lý có ảnh hưởng đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của các chủng R.delemarVS2 4.1.3. Ảnh hưởng của độ ẩm xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng R.delemar VS2 Bảng 4: Ảnh hưởng của độ ẩm xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng chủng R.delemarVS2 STT Độ ẩm(%) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước xử lý bằng chủng R.delemarVS2 (ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau xử lý bằng chủng R.delemarVS2 (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng chủng Rhizopus delemarVS2(%) 1 15 200 156 22 2 17 200 104 48 3 20 200 50 75 4 25 200 40 80 5 30 200 20 90 Kết quả bảng 4 cho thấy, với độ ẩm xử lý là 30% hàm lượng aflatoxin trên mẫu ngô trước xử lý là 200ppb và sau xử lý bằng chủng R.delemarVS2 xuống còn 20ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô đạt 90%. Với độ ẩm xử lý là 15% hàm lượng aflatoxin trên mẫu ngô trước xử lý là 200ppb và sau xử lý bằng chủng R.delemarVS2 giảm xuống còn 156ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô đạt 22%. Như vậy khi độ ẩm đạt 30% hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2 là cao nhất đạt 90%. Các kết quả trên cho thấy hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô ở mức độ cao bằng chủng R.delemarVS2 tỷ lệ thuận với độ ẩm. Nhưng trong thực tiễn bảo quản, độ ẩm 30% trong ngô là quá cao. Do đó, việc khử nhiễm aflatoxin trên ngô bằng chủng R.delemarVS2 ở độ ẩm 30% không có tính khả thi. Với độ ẩm xử lý 20% hàm lượng aflatoxin trên ngô trước khi xử lý là 200ppb sau khi xử lý giảm xuống còn 50ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô đạt 75%. Chính vì thế chúng tôi chọn độ ẩm 20% để khử nhiễm aflatoxin trên ngô bằng chủng R.delemarVS2. 4.2. Xác định khả năng khử aflatoxin nhiễm trên lạc bằng chủng R.delemar Trong số 22 chủng R.delemar do phòng vi sinh Viện cơ điện Nông Nghiệp phân lập chúng tôi đã tiến hành khảo sát 6 chủng R.delemar để đánh giá hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên lạc. Bảng 5: Hiệu quả khử aflatoxin trên lạc bằng một số chủng R.delemar sau 7 ngày xử lý. STT chủng Tên chủng Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước khi xử lý (ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc sau khi xử lý (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên lạc (%) 1 R.delemarVS1 200 60 70 2 R.delemarVS2 200 34 83 3 R.delemarVS3 200 64 68 4 R.delemarVS4 200 56 72 5 R.delemarVS5 200 70 65 6 R.delemarVS6 200 64 68 Kết quả ở bảng 5 cho thấy việc sử dụng các chủng R.delemar đã khử được aflatoxin trên lạc một cách đáng kể, hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước khi xử lý là 200ppb xuống còn từ 70 đến 34ppb sau xử lý. Trong số các chủng khảo sát có chủng R.delemarVS2 có hoạt tính khử aflatoxin trên lạc cao nhất, hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước xử lý là 200 ppb và sau xử lý là 34 ppb. Hiệu quả khử aflatoxin của chủng này đạt 83%. Các chủng còn lại có hoạt tính khử aflatoxin thấp hơn đạt từ 65 đến 72 %. Đây là kết quả quan trọng trong việc ứng dụng chủng R.delemar để khử nhiễm aflatoxin ở mức độ cao trên lạc ở quy mô lớn. 4.2.1. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả khử aflatoxin nhiễm trên lạc của chủng R.delemaVS2 4.2.1.1. Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên lạc của chủng R.delemarVS2 Bảng 6: Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên lạc bằng chủng R.delemaVS2 STT Thời gian xử lý(ngày) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước khi xử lý bằng chủng R.delemaVS2 (ppp) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc sau khi xử lý bằng chủng R.delemaVS2 (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên lạc bằng chủng R.delemarVS2 (%) 1 Ngày thứ nhất 200 200 0 2 Ngày thứ hai 200 192 4 3 Ngày thứ ba 200 174 13 4 Ngày thứ tư 200 148 26 5 Ngày thứ năm 200 116 42 6 Ngày thứ sáu 200 80 60 7 Ngày thứ bảy 200 56 72 8 Ngày thứ tám 200 40 80 9 Ngày thứ chín 200 30 85 Kết quả bảng 6 cho thấy trong 5 ngày đầu của quá trình xử lý, hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc bằng chủng R.delemarVS2 là không đáng kể chỉ đạt từ 0 đến 21%. Từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 hiệu quả giảm aflatoxin tăng cao, đặc biệt trong ngày thứ 8 và ngày thứ 9, hàm lượng aflatoxin trên lạc trước xử lý là 200ppb giảm xuống còn 26ppb, 20ppb sau xử lý, hiệu quả giảm aflatoxin lần lượt là 87% đến 90%. Như vậy khoảng thời gian thích hợp nhất để xử lý aflatoxin trên lạc của chủng R.delemarVS2 là 8 đến 9 ngày. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc của chủng R.delemarVS2 Động thái khử aflatoxin nhiễm trên lạc bằng chủng R. delemarVS2 4.2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc của chủng R. delemarVS2 Bảng 7: Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc bằng chủng R. delemarVS2. STT Nhiệt độ (oC) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước khi xử lý bằng chủng R.delemarVS2. (ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc sau khi xử lý bằng chủng R.delemarVS2 (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên lạc chủng bằng R.delemarVS2 (%) 1 20 200 184 8 2 25 200 136 32 3 28 200 20 87 4 30 200 70 65 5 35 200 130 35 Kết quả bảng 7 cho thấy, với nhiệt độ xử lý là 28oC hàm lượng aflatoxin trên mẫu lạc trước khi xủ lý là 200ppb và sau khi xử lý bằng chủng R.delemarVS2 giảm xuống còn 20ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc đạt 87%. Với nhiệt độ xử lý là 200C hàm lượng aflatoxin trên lạc trước khi xử lý là 200 ppb và sau khi xử lý bằng chủng R.delemarVS2 giảm xuống còn 184ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc đạt 8%. Với nhiệt độ xử lý là 30oC, hàm lượng aflatoxin trên mẫu lạc trước khi xử lý là 200ppb và sau khi xử lý bằng chủng R.delemarVS2 giảm xuống còn 70ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc đạt 65%. Như vậy, với nhiệt độ xử lý là 20oC, 25oC, 28oC, 30oC và 35oC, chúng tôi thấy rằng ở 28oC và 30oC hiệu quả khử aflatoxin trên lạc của chủng R.delemarVS2 là rất cao. Đặc biệt là ở nhiệt độ 280C hiệu quả khử aflatoxin trên lạc của chủng R.delemarVS2 là cao nhất, đạt 87%. Còn ở các nhiệt độ cao hơn 300C và thấp hơn 250C đều không thuận lợi cho hiệu quả khử aflatoxin của chủng R.delemarVS2. Như vậy, yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng đến hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc của các chủng R.delemarVS2 4.2.1.3. Ảnh hưởng của độ ẩm xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên lạc bằng chủng R. delemarVS2 Bảng 8: Ảnh hưởng của độ ẩm đến hiệu quả khử aflatoxin trên lạc bằng chủng R.delemarVS2 STT Độ ẩm(%) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước xử lý bằng chủng R.delemarVS2 (ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc sau xử lý bằng chủng R.delemarVS2 (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên lạc bằng chủng R.delemarVS2(%) 1 15 200 160 20 2 17 200 110 45 3 20 200 56 72 4 25 200 32 79 5 30 200 26 87 Kết quả bảng 8 cho thấy, với độ ẩm xử lý 30% hàm lượng aflatoxin trên mẫu lạc trước xử lý là 200ppb và sau xử lý bằng chủng R.delemarVS2 xuống còn 26ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc đạt 87%. Độ ẩm ở 15% hàm lượng aflatoxin trên mẫu lạc trước xử lý là 200ppb và sau xử lý bằng chủng R.delemarVS2 giảm xuống còn 160ppb, hiệu quả khử aflatoxin trên lạc đạt 20%. Như vậy khi độ ẩm đạt 30% hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc của chủng R.delemarVS2 là cao nhất đạt 90%. Các kết quả trên cho thấy hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên lạc ở mức độ cao bằng chủng R.delemarVS2 tỷ lệ thuận với độ ẩm. Nhưng trong thực tiễn bảo quản, độ ẩm 30% trong lạc là quá cao. Do đó, việc khử nhiễm aflatoxin trên lạc bằng chủng R.delemarVS2 ở độ ẩm 30% không có tính khả thi. Ở độ ấm 20% hàm lượng aflatoxin trên lạc trước khi xử lý là 200ppb sau khi xử lý giảm xuống còn 56ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc đạt 72%. Chính vì thế chúng tôi đề nghị khử aflatoxin nhiễm trên lạc bằng chủng R.delemarVS2 ở độ ẩm 30%. Từ các kết quả trên cho thấy hiệu quả khử aflatoxin nhiễm trên ngô bằng chủng R.delemarVS2 cao hơn trên lạc. Ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2 trước khi xử lý, hàm lượng aflatoxin trên ngô là 200ppb và sau khi xử lý giảm xuống còn 20ppb, hiệu quả khử aflatoxin đạt 90%. Ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hiệu quả khử aflatoxin trên lạc của chủng R.delemarVS2 truớc khi xử lý, hàm lượng aflatoxin là 200ppb và sau khi xử lý giảm xuống còn 30ppb, hiệu quả khử aflatoxin đạt 85 %. Như vậy hiệu quả khử afltoxin trên ngô của chủng R.delemaVS2 cao hơn so với hiệu quả khử afltoxin trên lạc là 5%. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2, ở 280C trước khi xử lý hàm lượng aflatoxin trên ngô là 200ppb và sau khi xử lý giảm xuống còn 20ppb, hiệu quả giảm aflatoxin đạt 90%. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên lạc của chủng R.delemarVS2, ở 280C truớc khi xử lý hàm lượng aflatoxin là 200ppb và sau khi xử lý giảm xuống còn 20ppb, hiệu quả khử aflatoxin đạt 87%. Như vậy hiệu quả khử afltoxin trên ngô của chủng R.delemar VS2 cao hơn so với hiệu quả khử afltoxin trên lạc là 3%. Ảnh hưởng của độ ẩm xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2 trước khi xử lý, hàm lượng aflatoxin trên ngô là 200ppb và sau khi xử lý bằng chủng R.delemarVS2 giảm xuống còn 50ppb, hiệu quả khử aflatoxin đạt 75%. Ảnh hưởng của độ ẩm xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên lạc của chủng R.delemarVS2 truớc khi xử lý, hàm lượng aflatoxin là 200ppb và sau khi xử lý giảm xuống còn 56ppb, hiệu quả khử aflatoxin đạt 72 %. Như vậy hiệu quả khử afltoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2 cao hơn so với hiệu quả khử afltoxin trên lạc là 3%. 4.3. Xác định khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô bằng hủng Flavobacterium aurantiacum. Trong số 30 chủng F. aurantiacum do phòng vi sinh Viện cơ điện Nông Nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch cung cấp chúng tôi đã tiến hành khảo sát 8 chủng F.aurantiacum để đánh giá hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô ở mức độ cao. Bảng 9: Hiệu quả khử aflatoxin nhiễm trên ngô của một số chủng Flavobacterium aurantiacum sau 7 ngày xử lý. STT chủng Tên chủng Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lý(ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau khi xử lý(ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng Flavobacterium aurantiacum(%) 1 F.aurantiacumVS1 200 30 85 2 F.aurantiacumVS2 200 40 80 3 F.au4rantiacumVS3 200 64 68 4 F.aurantiacum VS4 200 80 60 5 F.aurantiacum VS5 200 56 72 6 F.aurantiacum VS6 200 54 73 7 F.aurantiacum VS7 200 80 60 8 F.aurantiacum VS8 200 74 63 Kết quả ở bảng 9 cho thấy việc sử dụng các chủng F.aurantiacum đã khử được aflatoxin trên ngô một cách đáng kể, hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lý là 200ppb xuống còn từ là 76ppb đến 24 ppb sau xử lý. Trong số các chủng khảo sát có chủng F.aurantiacumVS1 có hoạt tính khử aflatoxin rõ cao nhất, hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lý là 200ppb và sau xử lý là 30ppb, hiệu quả khử aflatoxin của chủng này là 85%. Các chủng còn lại có hoạt tính khử aflatoxin thấp hơn đạt từ 63% đến80%. Đây là kết quả quan trọng trong việc ứng dụng chủng F.aurantiacum để khử nhiễm aflatoxin ở mức độ cao trên ngô ở quy mô lớn. 4.3.1. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng F .aurantiacumVS1 4.3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin nhiễm trên ngô bằng chủng F .aurantiacumVS1 Để xác định thời gian tốt nhất cho quá trình khử nhiễm aflatoxin trên ngô ở mức độ cao bằng chủng F.aurantiacumVS1chúng tôi đã tiến hành làm thí nghiệm, kết quả được thể hiện ở bảng sau: Bảng 10: Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng chủng F. aurantiacumVS1. STT Thời gian xử lý(ngày) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lýbằng chủng F.aurantiacumVS1(ppp) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau khi xử lýbằng chủng F.aurantiacumVS1 (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng chủng F.aurantiacumVS1 (%) 1 Ngày thứ nhất 200 200 0 2 Ngày thứ hai 200 186 3 3 Ngày thứ ba 200 182 9 4 Ngày thứ tư 200 178 11 5 Ngày thứ năm 200 164 18 6 Ngày thứ sáu 200 70 65 7 Ngày thứ bảy 200 30 85 8 Ngày thứ tám 200 24 87 9 Ngày thứ chín 200 20 90 Kết quả bảng 10 cho thấy hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô của chủng F.aurantiacumVS1 tăng dần theo thời gian. Từ ngày thứ nhất đến ngày thứ năm hiệu quả giảm aflatoxin là không đáng kể (từ 0 – 18%). Đến ngày thứ 6, hàm lượng aflatoxin trên ngô trước khi xử lý là 200ppb và sau khi xử lý bằng chủng F. aurantiacumVS1 giảm xuống 65ppb, hiệu quả khử aflatoxin đạt 65%. Đặc biệt sau chín ngày xử lý, hiệu quả giảm aflatoxin của chủng F.aurantiacumVS1 đạt cao nhất, hàm lượng aflatoxin trên ngô trước khi xử lý là 200ppb và giảm xuống còn 20ppb sau xử lý, hiệu quả đạt là 90%. Kết quả này cho thấy thời gian xử lý có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng F.aurantiacumVS1 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng F.aurantiacumVS1 : Động thái khử aflatoxin nhiễm trên ngô bằng chủng F.aurantiacumVS1 4.3.1.2. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng F .aurantiacum VS1 Bảng 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng chủng F .aurantiacum VS1. STT Nhiệt độ (oC) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lý bằng chủng F.aurantiacum VS1 (ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau khi xử lýbằng chủng F.aurantiacum VS1 (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng F. aurantiacum VS1 (%) 1 22 200 150 25 2 24 200 40 80 3 26 200 30 85 4 28 200 50 75 5 30 200 120 40 Kết quả bảng 11 cho thấy, với nhiệt độ xử lý là 26oC hàm lượng aflatoxin trên mẫu ngô trước khi xử lý là 200ppb và sau khi xử lý bằng chủng F.aurantiacumVS1 giảm xuống còn 30ppb, hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô đạt 85%. Với nhiệt độ xử lý là 220C hàm lượng aflatoxin trên ngô trước khi xử lý là 200 ppb và sau khi xử lý bằng chủng F.aurantiacumVS1 giảm xuống còn 150ppb, hiệu quả khử aflatoxin trên ngô đạt 25%. Với nhiệt độ là 24oC, hàm lượng aflatoxin trên mẫu ngô trước khi xử lý là 200ppb và sau khi xử lý bằng chủng F.aurantiacumVS1 giảm xuống còn 40ppb, hiệu quả khử aflatoxin trên ngô đạt 80%. Như vậy, trong các nhiệt độ 20oC, 25oC, 28oC, 30oC và 35oC, chúng tôi thấy rằng ở 24oC và 26oC hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng F.aurantiacumVS1 là cao nhất. Đặc biệt là ở nhiệt độ 260C hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng F.aurantiacumVS1 là cao nhất, đạt 85%. Còn các nhiệt độ cao hơn 280C và thấp hơn 240C đều không thuận lợi cho hiệu quả khử aflatoxin của chủng F.aurantiacumVS1. Như vậy, nhiệt độ xử lý có ảnh hưởng đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của các chủng F.aurantiacumVS1. 4.3. Xác định khả năng khử aflatoxin nhiễm trên lạc bằng chủng F.aurantiacum Bảng 12: Hiệu quả khử aflatoxin trên lạc của một số chủng F.aurantiacum sau 7 ngày xử lý. STT chủng Tên chủng Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước khi xử lý(ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc sau khi xử lý(ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên mẫu lạc của chủng F.aurantiacum (%) 1 F.aurantiacumVS1 200 34 83 2 F.aurantiacumVS2 200 42 79 3 F.aurantiacumVS3 200 64 68 4 F.aurantiacumVS4 200 66 67 5 F.aurantiacumVS5 200 60 70 6 F.aurantiacumVS6 200 46 77 7 F.aurantiacumVS7 200 84 58 8 F.aurantiacumVS8 200 66 67 Kết quả ở bảng 12 cho thấy việc sử dụng các chủng F.aurantiacumVS1 đã khử được aflatoxin trên lạc một cách đáng kể, hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước khi xử lý là 200ppb xuống còn từ là 84ppb đến 34 ppb sau xử lý. Trong số các chủng khảo sát có chủng F.aurantiacumVS1 có tác hoạt tính khử aflatoxin cao nhất, hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước xử lý là 200ppb và sau xử lý là 34 ppb hiệu quả khử aflatoxin của chủng này là 83%. Các chủng còn lại có hoạt tính cho khử aflatoxin thấp hơn đạt từ 58% đến 79%. Đây là kết quả quan trọng trong việc ứng dụng chủng F.aurantiacum để khử nhiễm aflatoxin ở mức độ cao trên lạc ở quy mô lớn. 4.3.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên lạc ở mức độ cao của chủng Flavobacterium aurantiacum VS1 4.3.2.1. Ảnh hưởng của yếu tố thời gian xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên lạc của chủng F.aurantiacum VS1 Bảng 13: Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên lạc bằng chủng F. aurantiacum VS1. STT Thời gian xử lý (ngày) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước khi xử lý bằng chủng F.aurantiacum VS1(ppp) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc sau khi xử lý bằng chủng F.aurantiacum VS1(ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên lạc bằng chủng F.aurantiacum VS1 (%) 1 Ngày thứ nhất 200 200 0 2 Ngày thứ hai 200 194 3 3 Ngày thứ ba 200 184 8 4 Ngày thứ tư 200 174 13 5 Ngày thứ năm 200 168 16 6 Ngày thứ sáu 200 80 60 7 Ngày thứ bảy 200 56 72 8 Ngày thứ tám 200 40 80 9 Ngày thứ chín 200 26 87 Kết quả bảng 13 cho thấy hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc của chủng F.aurantiacumVS1 tăng dần theo thời gian. Từ ngày thứ nhất đến ngày thứ năm hàm lượng aflatoxin trên lạc trước khi xử lý là 200ppb sau khi xử lý bằng chủng F.aurantiacumVS1 giảm xuống còn 168ppb, hiệu quả khử aflatoxin là không đáng kể (từ 0 – 16%). Đến ngày thứ 6, hàm lượng aflatoxin trên lạc trước khi xử lý là 200ppb và sau khi xử lý bằng chủng F.aurantiacumVS1 giảm xuống 80ppb, hiệu quả khử aflatoxin đạt 60%. Đặc biệt sau chín ngày xử lý, hiệu quả giảm aflatoxin của chủng F.aurantiacumVS1 đạt cao nhất, hàm lượng aflatoxin trên lạc trước khi xử lý là 200ppb và sau khi xử lý bằng chủng F.aurantiacumVS1 giảm xuống còn 26ppb , hiệu quả đạt là 87%. Kết quả này cho thấy thời gian xử lý có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả khử aflatoxin trên lạc của chủng. F.aurantiacumVS1 Động thái khử aflatoxin trên lạc bằng chủng F.aurantiacumVS1 4.3.2.2. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ Bảng 14: Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc bằng chủng F.aurantiacumVS1. STT Nhiệt độ (oC) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước khi xử lý bằng chủng F.aurantiacum VS1(ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc sau khi xử lý bằng chủng F.aurantiacum VS1 (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên lạcbằng chủng F.aurantiacum VS1 (%) 1 22 200 160 20 2 24 200 44 78 3 26 200 34 83 4 28 200 60 70 5 30 200 130 35 Kết quả bảng 14 cho thấy, với nhiệt độ là 26oC hàm lượng aflatoxin trên mẫu lạc trước khi xử lý là 200ppb và sau khi xử lý bằng chủng F.aurantiacum VS1 giảm xuống còn 34ppb, hiệu quả khử aflatoxin trên lạc đạt 83%. Với nhiệt độ là 220C hàm lượng aflatoxin trên lạc trước khi xử lý là 200 ppb và sau khi xử lý bằng chủng F.aurantiacumVS1 giảm xuống còn 160ppb, hiệu quả khử aflatoxin trên lạc đạt 20%. Với nhiệt độ là 24oC, hàm lượng aflatoxin trên mẫu lạc trước khi xử lý là 200ppb và sau khi xử lý bằng chủng F.aurantiacumVS1 giảm xuống còn 44ppb, hiệu quả khử aflatoxin trên lạc đạt 78%. Như vậy, trong các nhiệt độ là 20oC, 25oC, 28oC, 30oC và 35oC, chúng tôi thấy rằng ở 24oC và 26oC hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc của chủng F.aurantiacumVS1 là rất cao. Đặc biệt là ở nhiệt độ 260C hiệu quả khử aflatoxin trên lạc của chủng F.aurantiacumVS1 là cao nhất, đạt 83%. Còn ở các nhiệt độ cao hơn 280C và thấp hơn 240C đều không thuận lợi cho hiệu quả khử aflatoxin của chủng F.aurantiacumVS1. Như vậy, yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng đến hiệu quả giảm aflatoxin trên lạc của các chủng F.aurantiacumVS1. Từ các kết quả trên cho thấy hiệu quả khử aflatoxin của chủng F.aurantiacum VS1 trên ngô cao hơn trên lạc. Ảnh hưởng của yếu tố thời gian, nhiệt độ xử đến hiệu quả khử aflatoxin của chủng F.aurantiacumVS1 trên ngô cao hơn trên lạc lần lượt là 3%, 2%. Mặt trái khuẩn lạc F.aurantiacum Mặt phải khuẩn lạc F.aurantiacum Măt trái khuẩn lạc Rhizopusdelemarr Mặt phải khuẩn lạc Rhizopusdelemar Hình thái F.aurantiacum Bọng đỉnh giá Rhizopus delemar Bào tử nấm Rhizopus delemar KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận Từ các 6 chủng Rhizopus delemar khảo sát chúng tôi đã tuyển chọn được chủng Rhizopus delemarVS2 có khả năng khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao. Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô đạt 87%, hiệu quả khử aflatoxin trên lạc đạt 83% - Từ 8 chủng Flavobacterium aurantiacum khảo sát chúng tôi đã tuyển chọn được 1 chủng Flavobabacterium aurantiacumVS1 có khả năng khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao. Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô đạt 85%, hiệu quả khử aflatoxin trên lạc đạt 83% - Các yếu tố, thời gian xử lý, nhiệt độ xử lý, độ ẩm xử lý có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng chủng Rhizopus delemar và Flavobacterium aurantiacum. Chúng tôi đề nghị: khử nhiễm aflatoxin bằng chủng R.delemarVS2 ở độ ẩm là 30%, nhiệt độ là 90% và thời gian xử lý ở ngày thứ 9, khử nhiễm aflatoxin bằng chủng F.aurantiacum ở nhiệt độ là 85% và thời gian xử lý ở ngày thứ 9 Đề nghị - Việc tuyển chọn được chủng Rhizopusdelerma và F.aurantiacum có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô, lac đạt hiệu quả cao có ý nghĩa rất quan trọng . Tác dụng khử afllatoxin nhiễm trên ngô, lạc của hai chủng Rhizopusdelerma và F.aurantiacum đạt hiệu quả như nhau. Do đó, ta nên đưa hai chủng này vào quá trình khử aflatoxin nhiễm trên ngô, lạc. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000). Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học. NXB Khoa học kỹ thuật. Đặng Hồng Miên (1982). Nấm mốc trên một số sản phẩm công nông nghiệp. Phưong pháp khử và biện pháp phòng chống. NXB khoa học và kỹ thuật. Đậu Ngọc Hào (1992) “Thức ăn nhiễm nấm mốc và độc tố Aflatoxin của chúng với gà công nghiệp”. Tạp chí nông nghiệp và công nghệ thực phẩm Số 9. Đậu Ngọc Hào (1993). Sử dụng các hợp chất Amin và NaHSO3 làm giảm hoạt tính Aflatoxin B1 trong ngô hạt và khô dầu lạc bị nhiễm nấm mốc. Kết quả nghiên cứu khoa học khoa chăn nuôi thú y. Đậu Ngọc Hào, Nguyễn Thị Thuận, Đào Tú Khánh (1991). Một số loài nấm mốc được phát hiện trong thức ăn gia cầm. Công trình nghiên cứu khoa học Viện Thú Y Quốc gia 1990 – 1991. Moreau Claude (1980). Nấm mốc độc trong thực phẩm. Đặng Miên (dịch). NXB Khoa học kỹ thuật. Nguyễn Lân Dũng (1983). Một số sản phẩm của vi nấm, độc tố của vi nấm. NXB Khoa học kỹ thuật. Nguyễn Phùng Tiến (1983). Nấm mốc trên một số sản phẩm thực phẩm. Luận án tiến sỹ sinh học. Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội. Nguyễn Thùy Châu (1996). Nghiên cứu mức độ nghiễm nấm mốc sinh độc tố (mycotoxin) trên ngô, gạo ở Việt Nam và biện pháp phòng trừ. Luận án phó tiến sĩ khoa học. Bộ giáo dục và đào tạo, Trường Đại học Khoa học tự nhiên. Nguyễn Thùy Châu và cộng sự (1995). Mức độ nhiễm Aflatoxin trên ngô ở một số tỉnh của Việt Nam. Sử dụng kỹ thuật công nghệ sinh học để bảo quản chế biến nông sản thu hoạch. NXB Nông nghiệp. Nguyễn Thùy Châu và cộng sự (1997). Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc Aflatoxin trên ngô - Biện pháp khử độc tố. Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp 1994 – 1995. NXB Nông Nghiệp, Bộ Nông Nghiệp và phát triển nông thôn. Tiêu chuẩn Việt Nam 5617 – 1991. Phương pháp xác định Aflatoxin ở ngũ cốc. Tiếng Anh AOAC (1990). Official methods of analysis Carnaghan, R.B.A., Hartlay, R.D., and Okelly. “Toxicity and fluorescence properties of the Aflatoxin”. J. Nature (London). 200, pp 1101. FAO Food and Nutrition Paper (1980). Manual of food quality control 2. Addititives contaminant techniques. Rome. Goto, T., Kawasugi S., Tsuzuta O., Okazaki H., Siriacha P., Buangsawon D., and Manabe M. (5/1986) “ Aflatoxin contamination of maize in Thailand 2. Aflatoxin contammition of maize harvested in the raining seasons of 1984 and 1985”. Proc. Jpn. Assoc. Mycotoxicol, 24, pp.53. Doronina, O. and Makshimenko, K. (1984). Analytical methods of detection, identification, quantitive determination of aflatoxin in foodstuff and fodder, FAO/UNEP/USSR International training course “ Training activities on food contamination control and monitoring with special reference to mycotoxin ”. Moscon. Kawamura, O.,et al (1989) “ A sentitive enzyme linked immunosorbent assay of ochratoxin A based on monoclonal antibodies”. Toxicol, 27, pp.887-897. Norio Kimura, Makototono. Prevention of Aflatoxin contamination in cereals and nuts by Applying Inturin A the Australian patent office, AU-A _39235/89. Krogh, P (1984). Microbial nature and biological properties of ochratoxin, FAO/UNEF/USSR International Training Course “Training activities on food contamination control and monitoring with special referene to Mycotoxin”, pp.1-14, Moscow. Liiehoj, E.B.,Fennell, D.I.,Kwoler, V.E (1996), “ A.flavus and aflatoxin in corn before harvest ”Science.193, pp.495-496. Nelson, P.E., Platter, R.D (1992), “FumonisinB1 production by Fusarium Special other than F.moniliforme in section Liseola and some related Species”, Appl Evinson Microbiol,120, pp.984-989. Widstson N.W., Wilson D.M.,Mc Millian W (1981). “Aflatoxin contamination of preharvest corn as influenced by timing and method of inoculation”, Environmental microbiology, 27, pp. 249-251. Wogan.G.N (1973). Aflatoxin carcinogenisis New York, academic pres,pp.309-304 (1997). World Health Organigation (1997). Mycotoxin, Published under the joint sponrship of United Nations Enviroment Programme and World health organigation. Tài liệu từ internet Vệ sinh an toàn thực phẩm (2006). Độc tố aflatoxin. http:// www.nutifood.com.vn Lời cảm ơn Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thuỳ Châu nguyên trưởng phòng vi sinh Viện cơ điện Nông Nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian em làm khoá luận. Em xin cảm các anh chị trong phòng vi sinh đã tạo điều kiện giúp đỡ cho em được học tập làm việc tại phòng. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa Công nghệ sinh học Viện đại học Mở Hà Nội đã dậy dỗ tôi trong 4 năm qua. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ để em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, tháng 5/2008 Sinh viên. Vũ Thị Phương Anh MỤC LỤC Nghiền nhỏ 25ml NaCl 10% 100ml aceton