Khóa luận Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phương pháp RAPD

–19 ngày, 7–19 ngày, 2–7 ngày và 2–8 ngày theo thứ tự. Tổng thời 17 gian giai đoạn ấu trùng là 22–53 ngày. Con đực chỉ ăn trong giai đoạn 1 và 2. Các lần lột xác xảy ra trong kén sáp trong khoảng thời gian là 12 ngày. Khi ra khỏi kén thì con đực trƣởng thành chỉ dài 1 mm với 1 đôi cánh màng và không có vòi chích hút (mouthparts). Con đực trƣởng thành sống đƣợc khoảng 3-7 ngày. Con đực có vòng đời khoảng 59–117 ngày. Rệp sáp Dysmicoccus brevipes có các đặc điểm sinh học tƣơng tự nhƣ rệp sáp Dysmicoccus neobrevipes: Giai đoạn ấu trùng của con cái trải qua 3 giai đoạn lần lƣợt là 10; 6,7 và 7,9 ngày. Giai đoạn ấu trùng của con đực gồm 4 giai đoạn 9,9; 5,8; 2,5 và 3,7 ngày. Giai đoạn từ ấu trùng đến thành trùng khoảng 24 ngày (cả đực và cái). Thành trùng cái sống trong khoảng từ 17- 49 ngày, trong khi đó thành trùng đực chỉ sống đƣợc 1-3 ngày. Thành trùng cái đẻ từ 19-137 con, trong tự nhiên tỷ lệ đực cái là 1:1. Rệp sáp D. brevipes Có 2 kiểu sinh sản: Đơn tính và lƣỡng tính. Kiểu sinh sản đơn tính tìm thấy ở Hawaii, ở đây chỉ có con cái đƣợc sinh ra và không cần con đực thụ tinh. Còn ở Brazil có cả 2 dạng sinh sản đơn tính và lƣỡng tính. Ở nƣớc ta Rệp xuất hiện nhiều vào các tháng có ẩm độ không khí 70-80%, nhiệt độ thấp 15-20oC. Rệp tập trung ở gốc dứa, phần ngầm dƣới đất và sát trên mặt đất. Vào tháng 5-9 rệp thƣờng bò trên lá, quả, chồi ở trên cao. Rệp sáp bám vào các lá non, vào gốc lá già, vào mắt quả, vào rễ cây để hút dịch cây làm cây sinh trƣởng kém, lá vàng và khô. Trong khi chích hút nhựa chúng thải ra chất đƣờng mật hấp dẫn kiến và nấm bồ hóng làm cho cây kém phát triển trầm trọng. Khi cây dứa suy kiệt (gần hết nhựa) thì kiến lại tha rệp đến cây khác. Ngoài ra Kiến còn ăn một số động vật là kẻ thù tự nhiên của rệp nên có thể xem rệp và kiến có sự cộng sinh với nhau. Rệp thực chất không chứa virus, chúng sống trên cây dứa nhiễm PMWaV và thu đƣợc virus. Rệp tiếp thu và truyền virus trong suốt quá trình dinh dƣỡng. Không có ký chủ khác của virus đƣợc tìm thấy ngoài cây dứa mặc dù nhiều loài cỏ cũng là ký chủ của 2 loại rệp này. Điều đó cho thấy cây dứa nhiễm PMWaV là nguồn chứa virus duy nhất cho rệp truyền sang cây khác. 18 2.5.3. Triệu chứng [1] Theo Sether D. M. và cộng sự (1998), biểu hiện triệu chứng bệnh rất thất thƣờng và có quan hệ với thời tiết, mật độ rệp sáp và hệ gene của dứa. Theo Nguyễn Văn Kế (2002), bệnh biểu hiện đầu tiên trên các lá già nhất, sau đó đến các lá già và các lá bên trên. Dứa bị bệnh thì lá bị đỏ đầu, các lá đỏ dần lên, vỏ lụa bung ra, lá kém trƣơng nƣớc, rìa lá cuốn về phía lƣng, đầu lá cong xuống đất, hóa nâu và khô dần. Rễ ở những cây bị nhiễm bệnh cũng bị hƣ hoại, khi nhổ lên thì thấy phần vỏ rễ tuột ra khỏi phần lõi nhƣ một cái ống. Tùy theo giống từ khi cây bị nhiễm bệnh tới khi biểu hiện triệu chứng mất từ 2 tuần đến 6 tháng. Nhiều cây con bị nhiễm trong vƣờn ƣơm không có dấu hiệu bệnh, sau một thời gian trồng mới biểu hiện. Hình 2.3 Cây dứa bệnh và không bệnh héo đỏ đầu lá a: Dứa không bệnh; b: dứa bệnh Bệnh héo đỏ đầu lá thƣờng trải qua 4 giai đoạn phát triển: Xâm nhiễm: Biểu hiện bệnh là chóp lá có màu đỏ. Lây lan: Lá chuyển từ màu đỏ sang hồng, mép phiến lá uốn cong về phía mặt dƣới. Héo lá: Các lá bị bệnh khô dần, lá ở nõn vẫn mọc bình thƣờng. Gây chết cây. 19 Hình 2.4 Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá Trong chu kì của thực vật, giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa và sau đó một chút là lúc cây dễ nhiễm bệnh nhất. Hậu quả là quả bị nhỏ, chua, khô, mắt lộ rõ, không có giá trị thƣơng phẩm (Trần Thế Tục - Vũ Mạnh Hải, 2001). 2.5.4. Cách phòng trị [1] [20] Để phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá, theo Nguyễn Văn Kế (2000), cần áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp nhƣ: Chọn giống kháng bệnh. Lấy giống từ vùng ít bệnh. Xử lý vật liệu trồng bằng thuốc trừ rệp sáp. Trƣớc khi trồng, khử đất để trừ kiến và các ổ rệp. Vệ sinh đồng ruộng để khỏi lây lan vụ sau. Trong quá trình dứa phát triển cần theo dõi phun thuốc trừ rệp, kiến. Hiện nay trên thế giới biện pháp sinh học đã đƣợc áp dụng khá phổ biến và tỏ ra hữu hiệu để phòng trị rệp sáp trên dứa. Các loài thiên địch sau đây đã đƣợc du nhập và Hawaii để phòng trị rệp sáp: Các loài kí sinh bao gồm Aenasius cariocus Compere, Aenasius colombiensis Compere, Anagyrus ananatis Gahan, Euryhopauus propinquus Kerrich, Hambletonia pseudococcina Compere và Ptomastidae abnormis (Girault). Động vật ăn thịt bao gồm Cryptolaemus montrouzieri Mulsant, Lobodiplosis pseudococci Felt, Nephus bilucernarius Mulsant, Scymnus (Pullus) unicatus Sicard và Scymnus pictus Gorham. Tuy nhiên các loài này sẽ không hiệu quả nếu có sự hiện diện của kiến công sinh. 20 Hình 2.5 Bọ rùa Cryptolaemus montrouzieri [10] a: Ấu trùng; b: Bọ rùa trƣởng thành Hình 2.6 Ong bắp cày Anagyrus ananatis [10] 2.6. Marker liên kết tính kháng bệnh trên thực vật. 2.6.1. Tính kháng bệnh trên thực vật [2] Cây thể hiện tính kháng đối với ký sinh gây bệnh là do chúng mang các đặc tính phân loại khác với nhóm ký chủ của ký sinh gây bệnh, hoặc là cây chứa các gene kháng mà ký sinh không có gene tƣơng ứng để phá vỡ. Hiện tƣợng từ kháng trở thành nhiễm của cây trồng đối với vi sinh vật gây bệnh là do số lƣợng khác nhau của gene kháng hiện diện ở mỗi giống và ảnh hƣởng của gene kháng đối với ký 21 sinh. Trƣờng hợp giống nhiễm nặng đối với vi sinh vật gây bệnh là do không có gene kháng một cách hiệu quả chống lại nòi gây bệnh đó. Nhƣ vậy, sự kháng bệnh của cây trồng là do gene điều khiển. Một số giống cây trồng có thể có tính kháng đơn gene hoặc đa gene tuỳ theo số gene đối kháng với một đối tƣợng bệnh cây mà nó có. 1.1.1.1 2.6.1.1. Kháng bệnh đơn gene (monogenic resistance) Tính kháng bệnh đơn gene thƣờng do một gene có tính trội điều khiển hoặc có thể do một vài gene điều khiển nhƣng các gene này định vị rất gần nhau và liên kết với nhau rất chặt chẽ. Các gene kháng này có tính chuyên biệt cao đối với một dòng sinh lý của mầm bệnh. Do đó các giống có tính kháng đơn gene thƣờng kháng rất mạnh đối với dòng sinh lý của mầm bệnh tƣơng ứng. Tuy nhiên, khi gặp dòng sinh lý khác của mầm bệnh, các giống này trở thành nhiễm bệnh và nhiễm nặng. Sử dụng thƣờng xuyên giống kháng đơn gene rất dễ dẫn đến sự chuyển đổi dòng sinh lý mới của mầm bệnh và tấn công đƣợc giống này. 1.1.1.2 2.6.1.2. Kháng bệnh đa gene (polygenic resistance) hay QTL kháng Tính kháng bệnh của nhóm này đƣợc biểu hiện bởi nhiều gene. Các gene kháng này có thể có gene trội lẫn gene lặn và định vị trên các loci có tính số lƣợng (QTL). Do có nhiều gene kháng nên các giống trong nhóm này có thể kháng với nhiều dòng sinh lý khác nhau của mầm bệnh. Nhờ đó, tính kháng của giống thƣờng bền hơn, lâu bị phá vỡ hơn nhóm giống kháng đơn gene. Tuy nhiên, tính kháng của nhóm này thƣờng không mạnh bằng nhóm kháng đơn gene. Các giống kháng đa gene thƣờng gây phiền phức cho các nhà lai tạo giống do có nhiều gene kháng và có cả gene lặn nên phân ly rất phức tạp và khó chọn lọc về sau. 1.1.2 2.6.2. Xác định marker phân tử liên kết gene kháng bệnh ở thực vật Hiện nay rất nhiều marker phân tử cho tính kháng bệnh ở thực vật đã đƣợc xác định dựa vào phƣơng pháp PCR hay lai phân tử. Có marker liên kết với các gene 22 kháng bệnh chuyên biệt và cũng có marker liên kết với QTL kháng. Mặc dù hầu hết những marker gắn với QTL còn cách biệt quá xa với nhau, chƣa đủ sức dự đoán chính xác cho một chƣơng trình chọn lọc giống hiệu quả nhƣng các marker phân tử này cũng đã đóng góp to lớn trong việc chọn lọc các giống cây trồng có khả năng kháng bệnh. 2.6.3. Một số nghiên cứu phát hiện marker phân tử cho tính kháng bệnh trên thực vật bằng kỹ thuật RAPD B. Moury và ctv (2000) đã sử dụng 250 primer RAPD phân tích 153 cá thể F2 của tổ hợp lai PI195301(mẩn cảm)xPI152225(kháng bệnh) đã xác định đƣợc 4 maker liên kết tính kháng bệnh héo đốm do virus trên tiêu (OPAC10-593bp, OPAH13-800bp, OPAF16-250bp, OPB01-750bp) [9]. Xác định maker liên kết tính kháng bệnh nấm vảy ở lúa mì (Guihong YU và ctv, 2003) [13]: Dùng 520 primer RAPD phân tích quần thể F7 của tổ hợp lai Ning894037 (kháng)xAlondra (mẩn cảm), Guihong đã xác định đƣợc 3 primer S1384, S1360, S1319 khuếch đại 4 band (640bp, 600bp, 350bp, 820bp) liên kết với tính kháng bệnh nầm vảy ở lúa mì. Marker phân tử liên kết gene Vbj kháng bệnh nấm vảy trên táo bắt nguồn từ táo dại Malus baccata jackii (M Gygax và ctv, 2004) [15]: Quần thể 173 cá thể F2 từ tổ hợp lai A722-7× cv. Golden Delicious (A×GD) (Giống A722-7 mang gene Vbj kháng bệnh mấm vảy, còn giống Golden Delicious là giống mẩn cảm) đƣợc chọn ra 10 cây kháng và 10 cây bêṇh. Dùng 506 primer RAPD (10 nucleotide) để thƣc̣ hiêṇ phản ứng PCR cho 20 cây này. M.Gygax và ctv đã xác định đƣợc 3 primer RAPD là: OPB08, OPK08, OP123 khuếch đại các band 710bp, 848bp, 869bp có hiện diện trong nhóm kháng và mẹ A722-7(có gene Vbj) nhƣng không hiện diện trong nhóm mẩn cảm và bố GD. Phân tích 173 cây con F2 của AxGD thì thấy 3 marker đã liên kết với gene Vbj có tần số liên kết là 16,2% - 22%. Các nghiên cứu trong nƣớc chỉ dừng lại ở việc sử dụng các marker phân tử có sẵn để chọn giống. Tuy nhiên trong các nghiên cứu này thƣờng không dùng marker RAPD mà dùng các marker nhƣ SSR, RFLP, STS do marker RAPD không ổn định. Marker RAPD chỉ đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu xác định các loại marker khác thông qua bảng đồ di truyền. 23 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại Tp. Hồ Chí Minh 3.1.1. Thời gian và địa điểm Tiến hành từ tháng 2/2007 tới tháng 7/2007 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực Vật (Viện Công nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh). 3.1.2. Đối tƣợng Các cây dứa Cayenne thuộc 3 giống Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng sạch bệnh virus đƣợc tạo bằng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (kết hợp xử lý nhiệt) cung cấp bởi Bộ môn CNSH (Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh). 3.1.3. Dụng cụ và thiết bị Găng tay (Malaysia). Máy ly tâm 14.000 vòng/phút (Hettich, Đức). Tủ sấy (Anh). Tủ ủ mẫu (Anh). Tủ – 20oC (Sanyo, Nhật). Nồi hấp autoclave (Nhật). Máy điện di (Biorad, Thụy Điển và Cosmo Bio Co, Nhật). Máy vortex (Đức). Tủ hút, tủ cấy vô trùng (Việt Nam / Anh). Máy chụp gel (Biorad, Thụy Điển). Giếng, lƣợc đổ gel. Máy PCR PTC Thermocycle 100. Máy quang phổ UV – VIS. Cuvette. 24 3.1.4. Hóa chất  Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số từ lá dứa Dung dịch phenol:chloroform:isoamylalcohol (PCI) (25 : 24 : 1). Dung dịch isopropanol lạnh. Ethanol 96 % và ethanol 70 %. Dịch tách chiết CTAB (2% CTAB, 1,4M NaCl, 100 mM Tris – HCl pH 8, 20mM EDTA, 0,1% Mercaptoethanol). Dung dịch TE 1X (1M Tris – HCl, 0,5M EDTA). Nƣớc cất siêu sạch khử ion. Hóa chất dùng cho kiểm tra DNA Agarose (BioRad). Ethidium bromide. Loading dye. Nƣớc cất 2 lần. Dung dịch TAE 0,5X (Tris acetat 40mM, EDTA 0,1mM, pH 8,0). Ladder 0,1 – 3 kb (Biorad). Dung dịch TE 1X (1M Tris – HCl, 0,5M EDTA).  Hóa chất dùng cho phản ứng PCR-RAPD Bộ GoTaq polymerase (Promega) gồm: Taq polymerase, MgCl2 và Taq buffer. dNTPs mix (Promega). 32 Primer (10 nucleotide) (Promega). Nƣớc (cất 2 lần rồi khử ion, hấp, chiếu tia UV). 3.1.5. Phƣơng pháp tiến hành 3.1.5.1. Ly trích DNA tổng số từ lá dứa Chọn những cây dứa khỏe. Lấy khoảng 3-4 lá non, không lấy lá già, cắt bỏ phần ngọn, lau sạch rồi cho vào túi nilon đã ghi đầy đủ thông tin về mẫu và giữ mát trong thùng đá. Sau đó mẫu đƣợc đem giữ ở tủ –20oC tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh thuộc Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 25 Thực hiện ly trích theo quy trình của Dolye có cải tiến (1990). Nghiền 0,5 g lá trong nitơ lỏng, cho bột mịn vào eppendorf 1,5 ml. Thêm 1 ml dung dic̣h CTAB đa ̃đƣơc̣ đun nóng ở 650C. Mâũ đƣơc̣ ủ trong 1 giờ ở 650C. Ly tâm, chuyển phần dịch qua eppendorf mới. Sau đó thêm vào 500 μl phenol/chloroform/isoamilalcohol (25:24:1), lắc nhẹ và đều. Ly tâm trong 15 phút ở 11.000 vòng/phút. Hút dịch nổi và tủa DNA bằng cách thêm vào isopropanol, để ở 40C trong 15 – 30 phút . Rửa lại DNA bằng ethanol 700. Ly tâm và để khô. Sau đó hòa trong dung dịch TE 1X. Bảo quản mẫu ở -200C.  Đánh giá kết quả bằng điện di DNA tổng số sau khi ly trích sẽ đƣợc đánh giá định tính bằng điện di trên gel agarose 1%. Sau khi điện di, gel sẽ đƣợc ngâm trong dung dịch ethidium bromide trong 10 phút sau đó đƣợc đƣợc chụp bằng máy chụp gel. Cách tiến hành: Pha dung dịch TAE 0,5X. Pha gel agarose với nồng độ 1% (15 ml cho gel 6 và 8 giếng, 30ml cho gel 12 và 17 giếng). Đun bằng lò Viba 2 phút cho agarose tan thật đều. Để nguội đến 50-550C, đổ vào khuôn, cài lƣợc vào. Chờ 30 phút để agarose đông. Gở lƣợc ra rồi đặt bảng gel vào buồn điện di. Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 1 μl loading dye và 4 μl DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA, thời gian 20 phút. Nhuộm ethidium bromide khoảng 10 phút (có mang bao tay). Gel sau khi nhuộm sẽ đƣợc chụp bằng tia tử ngoại UV. Nếu mẫu có DNA thì band DNA sẽ phát sáng dƣới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm 26 nhạt của band điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. Nếu địên di kiểm tra kết quả RAPD thì pha gel 2 % và điện di ở điều kiện 50 V, 400 A trong 60 phút.  Đánh giá kết quả bằng phƣơng pháp đo mật độ quang Ngƣời ta tính tỉ lệ OD260/OD280 để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid. Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 thì dung dịch acid nucleic đƣợc xem là sạch. Khi mẫu có lẩn protein hay phenol thì tỉ lệ này sẽ thấp hơn và mẫu DNA không đạt yêu cầu để thực hiện RAPD. Một cách tổng quát, hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức: Hàm lƣợng DNA (ng/µl) = [(62,9*OD260)-(36*OD280)] * Độ pha loãng Phƣơng pháp tính gần đúng hàm lƣợng DNA bằng OD: Xây dựng đƣờng chuẩn: dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần với dung dịch TE 1X: hút 20 µl dung dịch DNA hòa tan với 1,980 ml TE 1X). Tiến hành đo OD ở 2 bƣớc sóng OD260, OD280. Đối với một dung dịch DNA sợi đôi, sự hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm tăng lên khi phân tử DNA bị biến tính tức là khi hai sợi tách rời nhau. Ngƣời ta gọi đó là hiệu quả siêu sắc (hyperchromic effect). Sau khi đo OD các mẫu DNA tổng số đƣợc pha loãng về nồng độ 50ng/μl để thực hiện phản ứng RAPD. Đây là nồng độ đƣợc cho là tối ƣu cho phản ứng RAPD. 3.1.5.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Taq polymerase Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 27 Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ Taq polymerase Hoá chất Nồng độ Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 PCR buffer dNTPs Primer Mg 2+ Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 1X 0,2 mM 1 pm/ l 3 mM 0,5 U 50 ng Thêm vào cho đủ 25 l 1X 0,2 mM 1 pm/ l 3 mM 0,75 U 50 ng Thêm vào cho đủ 25 l 1X 0,2 mM 1 pm/ l 3 mM 1 U 50 ng Thêm vào cho đủ 25 l Phƣơng pháp tiến hành: Chọn một mẫu DNA có chất lƣợng tốt, thực hiện phản ứng RAPD với nồng độ và các thành phần nhƣ bảng 3.3. Thực hiện Phản ứng RAPD theo chu trình nhiệt ở bảng 3.2. Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng RAPD [16] Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 5 phút 45 94 30 giây 37 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút Giữ ở 40C Chỉ tiêu đánh giá kết quả thí nghiệm: Độ sáng, rõ của các band trên gel agarose 2% sau khi tiến hành điện di 50V trong 60 phút. Thí nghiệm 2 : Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Primer Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 28 Bảng 3.3 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ primer. Hoá chất Nồng độ Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 PCR buffer dNTPs 1.2 Primer Mg 2+ Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 1X 0,2 mM 0,8 pm/ l 3 mM 0,75 U 50 ng Thêm vào cho đủ 25 l 1X 0,2 mM 1 pm/ l 3 mM 0,75 U 50 ng Thêm vào cho đủ 25 l 1X 0,2 mM 1,2 pm/ l 3 mM 0,75 U 50 ng Thêm vào cho đủ 25 l Phƣơng pháp tiến hành: Chọn một mẫu DNA có chất lƣợng tốt, thực hiện phản ứng RAPD với nồng độ và các thành phần nhƣ bảng 3.4. Thực hiện phản ứng RAPD theo chu trình nhiệt ở bảng 3.2. Định tính kết quả phản ƣ́ng bằng phƣơng pháp điện di : Quan sát độ sáng và độ rõ của các band. Chọn nghiệm thức tốt nhất. Chỉ tiêu đánh giá kết quả thí nghiệm: Độ sáng, rõ của các band trên gel agarose 2% sau khi tiến hành điện di 50V trong 60 phút. 3.1.5.3. Thực hiện phản ứng RAPD Phản ứng RAPD sau khi tối ƣu các thành phần phản ứng sẽ đƣợc ứng dụng để đánh giá độ đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng tại Tp. Hồ Chí Minh với tất các primer. Sản phẩm RAPD đƣợc kiểm tra kích thƣớc bằng điện di trên gel agarose 2%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, dƣới hiệu điện thế 50V trong 60 phút. Sau đó, gel đƣợc ngâm trong dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml và các vạch DNA sẽ đƣợc quan sát dƣới tia UV. 29 3.1.5.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot Sau khi tiến hành điện di sự hiện diện hay vắng mặt của các band trên bảng gel sẽ đƣợc ghi nhận ở mỗi cá thể, đƣợc dùng để phân tích bằng phần mềm NTSYS. Số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây dựng ma trận tƣơng đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Dice (1979). 2a Sxy= 2a +b+c a: Số band chung giữa hai mẫu. b: Số band mẫu x có mà mẫu y không có. c: Số band mẫu y có mà mẫu x không có. Sxy: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu x và y. Từ Sxy ta tính đƣợc khoảng cách di truyền giữa x và y: Dxy = 1 – Sxy Trên cơ sở toán học này, các nhà toán học đã xây dựng các phần mềm WINDIST và NTSYS cho máy tính. Chƣơng trình WINDIST tạo ra ma trận tƣơng đồng từ bộ dữ liệu nhập sẵn. Chƣơng trình NTSYS version 2.1 tạo ra sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu (Kangle Zheng và ctv, 1995). Hiện nay 2 chƣơng trình WINDIST và NTSYS đƣợc gộp lại thành chƣơng trình package – NTSYS để tiện dụng hơn. Cách nhập số liệu: Dữ liệu thu đƣợc từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excel theo những quy định chung. Nếu nhƣ sản phẩm có band hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện diện band. Sau khi nhập số liệu, ở ô A3 nhập số “1” (đối với ma trận hình chữ nhật), ô B3 ghi số hàng, ô C3 ghi số cột, và D3 nhập số “0” nếu không có số liệu thiếu. Sau đó, bản số liệu trong excel sẽ đƣợc dùng để xây dựng ma trận tƣơng đồng trong phần mềm NTSYSpc version 2.1. Dùng hệ số DICE để tính mức tƣơng đồng. Sơ đồ 30 cây phát sinh loài sẽ đƣợc tạo ra khi sử dụng phƣơng pháp UPGMA trong phần mềm NTSYS. Sau khi có cây phân nhóm di truyền, tiến hành kiểm tra độ tin cậy bằng cách dựng bootstrap bằng phần mềm Winboot. Đây là phần mềm được phát triển bởi Immamnuel V. Yap và Rebecca j. Nelson (1996), có thể tải miễn phí tại trang wep Dữ liệu thu được từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excel tương tự như file excel của phần mềm NTSYS chỉ khác là dữ liệu của các mẫu được trình bày theo hàng ngang: có band hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện diện band. Ô A1 là số hàng tương đương với số mẫu, ô B1 là số cột tương đương với số band. Chọn hệ số DICE và lặp lại 10000 lần. Phần mềm sẽ cho kết quả là độ lặp lại của các phân nhóm tương đương với độ chính xác của các phân nhóm đó. 3.2. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne 3.2.1. Thời gian và địa điểm Tiến hành gây nhiễm cho dứa từ tháng 1/2007 tới tháng 8/2007 tại khu nhà lưới bảo vệ thực vật - khoa nông học- ĐH Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh và bộ nôn Công Nghệ Sinh Học- ĐH Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh 3.2.2. Đối tƣợng Rệp sáp đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật- khoa Nông Học-ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Bí đỏ mua tại các chợ ở quận Thủ Đức Tp. Hồ Chí Minh. Dứa bệnh cung cấp bởi nông trƣờng Pham Văn Hai (Tp. Hồ Chí Minh) 300 cây dứa sạch bệnh virus đƣợc tạo bằng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (kết hợp xử lý nhiệt) gồm: 100 cây giống Trung Quốc, 100 cây giống Thái Lan, 100 cây giống Lâm Đồng đƣợc cung cấp bởi Bộ môn CNSH (Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh). 31 3.2.3. Dụng cụ Hộp nhốt rệp (1x1x1m). Đèn 5W (dùng để chuyển rệp). Lƣới che (dài 18 m rộng 2 m). Cọ vẽ. Phòng máy lạnh với nhiệt độ 25-26oC. Cân điện tử. 3.2.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.2.4.1. Nuôi rệp Rệp được nuôi theo phương pháp của William Roltsch (2001) [21]: Chủng lên quả bí khoảng 200 rệp/quả (bí nặng khoảng 1,5 Kg). Đặt bí trong thùng giấy và che tối để rệp phát triển. Tiến hành khảo sát nuôi trong điều kiện nhiệt độ là 25-26oC và 33-34 oC tại bộ nôn Công Nghệ Sinh Học- ĐH Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh. Hình 3.1 Thả rệp lên bí Tốc độ phát triển của rệp trên bí đƣợc tính dựa và khối lƣợng rệp trên bí sau mỗi tuần (7ngày). Khối lƣợng rệp đƣợc tính bằng cách quét rệp trên bí xuống và cân để định lƣợng. 3.2.4.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh Dứa bệnh đƣợc lấy tại nông trƣờng Phạm Văn Hai (Tp. Hồ Chí Minh) dựa vào biểu hiện bệnh bên ngoài nhƣ các lá đỏ dần lên, vỏ lụa bung ra, lá kém trƣơng nƣớc, 32 rìa lá cuốn về phía lƣng, đầu lá cong xuống đất, vỏ rễ tuột ra khỏi phần lõi (Nguyễn Văn Kế, 2001). Rệp trên bí đƣợc chuyển sang dứa bệnh theo 2 phƣơng pháp: Dùng đèn: Bí có rệp đƣợc đặt xung quanh cây dứa bệnh. Đặt bóng đèn 5W phía trên dứa bệnh cho rệp tự di chuyển sang. Dứa bệnh đƣợc cắt bớt lá để không cản ánh sáng từ đèn tới bí. Chuyển rệp trực tiếp: Rệp đƣợc quét trực tiếp bằng cọ vẽ từ bí sang dứa bệnh. Đánh giá 2 phƣơng pháp dựa vào lƣợng rệp còn sống trên dứa bệnh sau khi chuyển 1 tuần. Hình 3.2 Dứa bệnh làm nguồn lây PMWaV 3.2.4.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh Dứa bệnh sau đó đƣợc cắt nhỏ thành nhiều mảnh. Mỗi mảnh có khoảng 50 rệp. Các mảnh này sẽ đƣợc đặt lên dứa cần chủng với số lƣợng khoảng 150 con/cây. Vị trí thả rệp là trên 1 lá ở gần gốc dứa vì rệp chủ yếu sống trên các lá dứa sát mặt đất và trên rễ cây dứa. Dùng lƣới để che nắng để tránh nhiệt độ cao vào buổi trƣa ảnh hƣởng tới sự phát triển của rệp. 33 Hình 3.3 Vị trí thả rệp lên dứa sạch bệnh 3.3. Xác Định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne 3.3.1. Thời gian và địa điểm Tiến hành từ tháng 7/2007 tới tháng 8/2007 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực Vật (Viện Công nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh). 3.3.2. Đối tƣợng Các cây dứa invitro có và không có biểu hiện triệu chứng sau khi chủng bệnh. 3.3.3. Dụng cụ và Thiết bị: Tƣơng tự mục 3.1.3.1. 3.3.4. Hóa chất  Hóa chất dùng cho tách chiết và kiểm tra DNA tƣơng tự mục 3.1.3.2.  Hóa chất dùng cho phản ứng PCR-RAPD: Bộ GoTaq polymerase (Promega) gồm: Taq polymerase, MgCl2 và Taq buffer. dNTPs mix (Promega). Primer: Các primer cho đa hình trên dứa khi đánh giá đa dạng di truyền. Nƣớc (cất 2 lần rồi khử ion, hấp, chiếu tia UV). 34 3.3.5. Phƣơng pháp Trên các luống đã chủng bệnh, chọn cây có biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá rõ nhất (các lá đỏ dần lên, vỏ lụa bung ra, lá kém trƣơng nƣớc, rìa lá cuốn về phía lƣng, đầu lá cong xuống đất, hóa nâu và khô) và tất cả các cây không biểu bệnh của mỗi giống. Tiến hành lấy mẫu, ly trích DNA. Sau đó thực hiện phản ứng RAPD đã tối ƣu cho các mẫu này với các primer cho đa hình trên dứa. Sản phẩm RAPD đƣợc kiểm tra kích thƣớc bằng điện di trên gel agarose 2%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, dƣới hiệu điện thế 50V trong 60 phút. Sau đó, gel đƣợc ngâm trong dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml và các vạch DNA sẽ đƣợc quan sát dƣới tia UV. Trên bảng gel điện di nếu có band đa hình chỉ xuất hiện ở cây không biểu hiện bệnh mà không xuất hiện ở cây có biểu hiện bệnh ở mỗi giống thì band đó có thể liên kết với gene quy định tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa. Trong thí nghiệm có sử dụng các mẫu không chủng bệnh để đối chứng, xác định mức độ tin cậy của phản ứng RAPD. 35 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại Tp. Hồ Chí Minh. 4.1.1. Ly trích DNA tổng số từ lá dứa Để thực hiện phản ứng PCR tốt cần phải có DNA mẫu tốt và ít tạp. DNA mẫu tốt đƣợc đánh giá dựa và độ sáng rõ của band DNA tổng số trên gel agarose 1%. Sau khi ly trích theo quy trình của Dolye có cải tiến (1990) và kiểm tra sản phẩm bằng phƣơng pháp điện di và đo OD, chúng tôi nhận thấy quy trình này phù hợp với mô lá dứa. DNA tổng số ly trích đƣợc sáng rõ tuy có tạp nhƣng có thể pha loãng để thực hiện phản ứng RAPD do kỹ thuật này không đòi hỏi DNA tổng số thật tinh sạch. Hình 4.1 Kết quả ly trích DNA dứa TQ: dứa Cayenne Trung Quốc ; TL: dứa Cayenne Thái Lan; LD: dứa Cayenne Lâm Đồng; Q: dứa Queen Các mẫu DNA tổng số sau đó đƣợc pha loãng tới nồng độ 50 ng/μl để thực hiện phản ứng RAPD. 1.2.1.1.1.1.1.1.1 4.1.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 36 Kết quả xác định nồng độ Taq polymerase Từ kết quả điện di trên chúng tôi nhận thấy nồng độ Taq 0,75 U là cho band sáng rõ nhất, nghĩa là sản phẩm PCR đƣợc tạo ra nhiều nhất so với những nghiệm thức còn lại. Do vậy, nồng độ Taq 0,75 U đƣợc chọn cho các phản ứng RAPD trong các thí nghiệm sau. Kết quả xác định nồng độ primer Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ primer thấp sẽ làm band tạo ra mờ. Chỉ có nồng độ primer là 1,2 pmol/µl tạo band sáng rõ. Chúng tôi quyết định chọn nồng độ primer là 1,2 pmol để thực hiện phản ứng RAPD. 4.1.3. Thực hiện phản ứng RAPD Sau khi tiến hành tối ƣu phản ứng RAPD, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD cho các mẫu dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng; dứa Queen và lan Dendrobium. Trong số 32 primer sử dụng thì có 6 primer cho đa hình, các primer còn lại hoặc không cho sản phẩm RAPD hoặc đồng hình ở tất cả các band hoặc cho số band khác nhau qua các lần PCR. Bảng 4.1 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa và lan Hình 4.2 Kết quả khảo sát nồng độ Taq polymerase Giếng 1, 2, 3: Nồng độ Taq 0,5 U Giếng 4, 5, 6: Nồng độ Taq 0,75 U Giếng 7, 8, 9: Nồng độ Taq 1 U Hình 4.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer Giếng 1, 2, 3: Nồng độ primer 0,8 pmol/µl Giếng 4, 5, 6: Nồng độ primer 1 pmol/µl Giếng 7, 8, 9: Nồng độ primer 1,2 pmol/µl 37 Primer 2.1.2. Số band khuếch đại Số band đa hình OPAC10 8 5 OPAH13 11 11 OPB01 2 1 OPB08 9 6 S1384 5 4 V20 6 3 Bảng 4.2 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa Cayenne và dứa Queen Primer Số band khuếch đại Số band đa hình OPAC10 8 3 OPAH13 3 0 OPB01 1 0 OPB08 8 4 S1384 3 0 V20 4 1 Primer OPAC10 Trong số các primer khảo sát thì primer này cho số band trên dứa nhiều nhất. Số band đa hình trên dứa là 5 và đa hình giữa dứa và lan Dendrobium là 3. Trong đó band đa hình 1000bp chỉ xuất hiện ở dứa Queen, có thể đây là marker phân tử để phân biệt dứa Queen và dứa Cayenne. 38 Primer OPAH13 Primer này khuếch đại 3 band trên dứa và 9 band trên lan, trong đó chỉ có 1 band đơn hình giữa dứa và lan và không có band đa hình giữa các giống dứa. Primer OPB01 Primer này chỉ khuếch đại 1 band trên dứa và 2 band trên lan và không có band đa hình giữa các giống dứa. Hình 4.5 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAH13 TQ: dứa Cayenne Trung Quốc; TL: dứa Cayenne Thái Lan; LD: dứa Cayenne Lâm Đồng; Q: dứa Queen; D : lan Dendrobium; L : thang chuần Hình 4.4 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAC10 TQ: dứa Cayenne Trung Quốc; TL: dứa Cayenne Thái Lan; LD: dứa Cayenne Lâm Đồng; Q: dứa Queen; D : lan Dendrobium; L : thang chuần 39 Primer OPB08 Kết quả khảo sát trên primer OPB08 cho thấy primer này khuếch đại 7 band trên dứa trong đó có 4 band đa hình. Trong đó band đa hình 500bp có ở tất cả các giống dứa Cayenne mà không có ở giống dứa Queen nên đây có thể là marker giúp phân biệt dứa Queen và Cayenne. Primer S1384 Kết quả khảo sát primer S1384 cho thấy primer này chỉ khuếch đại 3 band trên dứa và không có band đa hình giữa các giống dứa. Hình 4.7 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB08 TQ: dứa Cayenne Trung Quốc; TL: dứa Cayenne Thái Lan; LD: dứa Cayenne Lâm Đồng; Q: dứa Queen; D : lan Dendrobium; L : thang chuần Hình 4.6 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB01 TQ: dứa Cayenne Trung Quốc; TL: dứa Cayenne Thái Lan; LD: dứa Cayenne Lâm Đồng; Q: dứa Queen; D : lan Dendrobium; L : thang chuần 40 Primer V20 Kết quả khảo sát primer V20 cho thấy chỉ khuếch đại 4 band trên dứa và có 1 band đa hình 610bp chỉ xuất hiện ở dứa Cayenne. Đây có thể là marker phân tử giúp phân biệt dứa Cayenne và dứa Queen. 4.1.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot Kết quả RAPD thu đƣợc trên gel điện di đƣợc mã hóa thành dạng nhị phân và đƣa vào phân tích bằng phần mềm NTSYS-pc. Sử dụng hệ số là DICE để tính ma trận tƣơng đồng. Cây phân nhóm di truyền đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp UPGMA dựa vào ma trận tƣơng đồng tính đƣợc ở trên. Hình 4.8 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer S1384 TQ: dứa Cayenne Trung Quốc; TL: dứa Cayenne Thái Lan; LD: dứa Cayenne Lâm Đồng; Q: dứa Queen; D : lan Dendrobium ; L : thang chuần Hình 4.9 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer V20 TQ: dứa Cayenne Trung Quốc; TL: dứa Cayenne Thái Lan; LD: dứa Cayenne Lâm Đồng; Q: dứa Queen; D : lan Dendrobium; L : thang chuần 41 Bảng 4.3 Hệ số đồng dạng di truyền của 3 giống dứa Cayenne và các đối chứng Kết quả cho thấy mức tƣơng đồng gene cao nhất giữa hai giống Cayenne Trung Quốc và Cayenne Thái Lan (0,978) chứng tỏ hai giống này có cùng nguồn gốc và đứng rất gần nhau trong cây phát sinh loài. Mức tƣơng đồng gene thấp nhất giữa hai giống Cayenne Trung Quốc và Lâm Đồng (0,913) chứng tỏ hai giống này đứng xa nhau trong cây phát sinh loài. Hình 4.10 Cây phân nhóm di truyền dựa vào kết quả RAPD Sơ đồ cây phát sinh loài cho thấy nhóm dứa và đối chứng lan cách nhau khá xa trong cây sinh loài với mức tƣơng đồng 0,46 và trong nhóm dứa thì giữa nhóm Cayenne và nhóm đối chứng Queen có hệ số tƣơng đồng là 0,9. Nhóm dứa Cayenne 42 phân thành 2 nhóm nhỏ, nhóm 1 gồm 2 giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan, nhóm 2 là giống Lâm Đồng. Mức tƣơng đồng giữa 2 nhóm khoảng 0,92. Thông qua 2 đối chứng, cây phân nhóm di truyền đã thể hiện chính xác mối quan hệ di truyền giữa nhóm dứa Cayenne với đối chứng là dứa Queen và Lan. Vì vậy sự phân nhóm di truyền và khoảng cách di truyền của các giống dứa Cayenne có độ tin cậy cao. Kết quả phân nhóm di truyền của 3 giống dứa Cayenne trên cũng phù hợp với kết quả của Lê Thị Thanh Tuyền và Nguyễn Thị Lang tại Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long (2005). Để khẳng định chính xác về kết quả cây phân nhóm di truyền, thực hiện kiểm tra độ tin cậy của các phân nhóm bằng cách dựng bootstrap bằng phần mềm Winboot với số lần lặp lại là 10000 lần, hệ số là DICE. Hình 4.11 Độ tin cậy của các phân nhóm Kết quả cho thấy độ tin cậy của phân nhóm Cayenne Trung Quốc và Thái Lan là 80%, độ tin cậy của phân nhóm dứa Cayenne và dứa Queen chỉ có 48,3%, độ tin cậy của phân nhóm dứa với lan là 100%. Các kiểu phân nhóm khác nhƣ là dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan và dứa Queen chung một nhóm thì độ tin cậy chỉ 44,61%. Kiểu phân nhóm Dứa Cayenne Thái Lan với Cayenne Lâm Đồng cùng một nhóm thì độ tin cậy chỉ 15,35% và kiểu phân nhóm dứa Cayenne Trung Quốc với Queen chung một nhóm có độ tin cậy là 11,7 %. Các kiểu phân nhóm còn lại có độ tin cậy dƣới 10%. 43 Hình 4.12 Các kiểu phân nhóm khác Nhƣ vậy qua kết quả cây phân nhóm di truyền với hai đối chứng là dứa Queen và lan cùng với kết quả dựng bootstrap với phần mềm winboot, chúng tôi kết luận kiểu phân nhóm di truyền của các giống Cayenne nhƣ hình 4.10 là có độ tin cậy cao nhất. Nhóm Cayenne Trung Quốc gần với Cayenne Thái Lan nhất với độ tƣơng đồng là 0,978, kế đó là nhóm Lâm Đồng có độ tƣơng đồng với nhóm Trung Quốc và Thái Lan là 0,92. Ta có thể kết luận rằng dứa Cayenne tại nông trƣờng Phạm Văn Hai Tp. Hồ Chí Minh có độ đa dạng thấp, vì độ tƣơng đồng của 3 giống này xấp xỉ 92%. Mặt khác, kết quả này còn đƣa ra một khuyến cáo rằng việc lai tạo giống dứa Cayenne mới bằng các giống dứa hiện có tại khu vực này là không có lợi. 4.2. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne 4.2.1. Nuôi rệp Bí mua về đƣợc rửa sạch, để khô. Rệp (đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật- khoa Nông Học-ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh) đƣợc chủng lên mỗi quả bí khoảng 200 con/trái. Sau đó cất bí trong thùng giấy và che tối để rệp phát triển. Tiến hành nuôi trong điều kiện nhiệt độ là 25-26oC và 33-34oC (nhiệt độ phòng). 44 Hình 4.13 Rệp phát triển trên bí sau 1 tháng a: 25-26 o C; b: 33-34 o C Sau mỗi tuần thu rệp bằng cách quét rệp trên 1 trái bí xuống và cân để định lƣợng. Khối lƣợng rệp thu đƣợc trên bí đƣợc trình bày trong biểu đồ 4.1 0.11 0.72 6.2 18.4 30.44 0.510.12 4.16 9.54 16.4 0 0 20 30 40 1 2 3 4 5 thoi gian (tuan) kh oi luo ng (g ) 25-26 do C 33-34 do C Biểu Đồ 4.1 Sự phát triển của rệp ở 25-26o C và 33-34oC (nhiệt độ phòng) Dựa vào kết quả thu đƣợc chúng tôi kết luận: Rệp sáp có thể phát triển và gia tăng số lƣợng rất nhanh trên bí đỏ trong điều kiện ánh sáng yếu. Nếu nuôi rệp trong điều kiện nhiệt độ phòng (33 oC -34oC) thì tốc độ phát triển của rệp chậm hơn so vớí nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25-26oC. 45 4.2.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh  Chuyển rệp bằng đèn Dùng đèn 5W để hấp dẫn rệp di chuyển từ bí sang dứa bệnh bằng cách để bí có đầy rệp xung quanh cây dứa bệnh. Đặt ngọn đèn 5W phía trên dứa bệnh để rệp tự di chuyển sang dứa bệnh. Dứa bệnh đƣợc cắt bớt lá để không cản ánh sáng từ đèn tới bí. Hình 4.14 Chuyển Rệp bằng đèn Kết quả sau 1 tuần chỉ có 1 số ít rệp di chuyển lên dứa. Ngoài ra có một số rệp tập trung trên đèn. Nguyên nhân có thể do đa số rệp không còn ở giai đoạn ấu trùng 2 nên không có khả năng di chuyển xa hoặc bí vẫn còn dinh dƣỡng nên rệp không muốn di chuyển. Số rệp tập trung trên đèn có thể là con đực trƣởng thành (có cánh).  Chuyển rệp trực tiếp Rệp đƣợc thu bằng cách quét trực tiếp từ bí xuống 1 tờ giấy sau đó trút toàn bộ rệp lên dứa bệnh. Rệp tiếp tục đƣợc nuôi trên dứa khoảng 1 tuần để thích nghi với loại thức ăn mới và hấp thu virus PMWaV. 46 Chúng tôi nhận thấy rệp vẫn sống trên dứa tuy số lƣợng có giảm nhiều so với lúc ban đầu có thể do trong quá trình quét rệp bằng cọ, rệp bị tác động cơ học nên dễ bị thƣơng và chết. So với phƣơng pháp chuyển rệp bằng đèn thì phƣơng pháp quét trực tiếp tuy lƣợng rệp hao hụt trong quá trình quét có nhiều nhƣng phƣơng pháp này nhanh hơn và lƣợng rệp đƣợc chuyển qua dứa nhiều hơn. Hình 4.15 Rệp phát triển trên dứa bệnh 1 tuần sau khi chủng 4.2.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh 300 cây dứa sạch bệnh được trồng tại khu nhà lưới bảo vệ thực vật (khoa nông học- ĐH Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh ). Dứa được trồng 2 hàng cách nhau 0,3 m; trên líp dài 10 m, rộng 1 m, cao 0,2 m. Rệp được nuôi trên dứa bệnh 1 tuần để thu virus. Sau đó dứa bệnh được cắt thành từng khoanh với khoảng 50 rệp. Các khoanh này được thả lên dứa sạch bệnh khoảng 150 con/cây. 47 Hình 4.16 Rệp bám vào mặt sau lá dứa bệnh Sau khi thả rệp, định kỳ kiểm tra sự hiện diện và đếm số rệp trên dứa sau mỗi 2 tuần, chúng tôi nhận thấy số lƣợng rệp giảm đi so với lúc chủng sau 2 tuần đầu tiên nhƣng bắt đầu tăng lên từ tuần thứ 4. Có lẽ do trong 2 tuần đầu rệp còn chƣa thích nghi nên chết nhiều còn từ tuần thứ 4 rệp bắt đầu thích nghi với điều kiện ngoài đồng và bắt đầu phát triển. Hình 4.17 Rệp phát triển trên dứa sau khi chủng a: 2 tuần; b: 4 tuần;c: 6 tuần;d: 8 tuần 48 Sau khi chủng rệp 8 tháng dứa đã có biểu hiện triệu chứng rõ rệt nhƣ các lá đỏ dần lên, vỏ lụa bung ra, lá kém trƣơng nƣớc, rìa lá cuốn về phía lƣng, đầu lá cong xuống đất, hóa nâu và khô. Ngoài ra cũng tránh các nhầm lẫn với các trƣờng hợp cây biểu hiện triệu chứng tƣơng tự nhƣng không phải do bệnh. Số cây biểu hiện bệnh là 107 cây chiếm tỷ lệ là 35,66%. Nhƣ vậy sau khi tiến hành chủng virus PMWaV thông qua tác nhân là rệp sáp, quá trình chủng rệp đã thành công với 35,66% cây dứa biểu hiện bệnh. Tuy nhiên, vẫn còn 64,34% số dứa không biểu hiện bệnh. Có thể do dứa có khả năng chống chịu bệnh tốt hoặc do lƣợng rệp và virus chƣa đủ để làm biểu hiện bệnh. Hơn nữa, theo Sether (2005) thì việc biểu hiện bệnh còn phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện thời tiết, đặc biệt là mƣa. Sau đó, các cây có biểu hiện triệu chứng bệnh rõ nhất và các cây không biểu hiện triệu chứng đƣợc chọn ra để phân tích xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá. Hình 4.18 Dứa biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá. 4.3. Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ đấu lá trên dứa Cayenne Sau khi phân tích đa dạng di truyền, chúng tôi chọn các primer cho đa dạng nhiều nhất trên dứa Cayenne để phân tích các cây có và không có biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá. Chúng tội chọn 2 primer OPAC10 và OPB08 vì đây là 2 primer cho đa hình nhiều nhất trên dứa Cayenne. Bản thân hai primer này cũng là marker phân tử của gene kháng bệnh héo đốm do virus cà chua trên tiêu (OPAC10-593bp) và gene kháng bệnh nấm vảy trên táo (OPB08-710bp). Việc sử dụng các marker liên 49 kết gene kháng có sẵn hy vọng sẽ rút ngắn đƣợc thời gian phát hiện gene kháng bệnh do các gene kháng và các trình tự liên kết khác khá tƣơng đồng ở thực vật. Hình 4.19 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPAC10 TQ: Dứa Cayenne Trung Quốc; TL: Dứa Cayenne Thái Lan; LD: Dứa Cayenne Lâm Đồng “+”: Cây biểu hiện bệnh; “-”: Cây không biểu hiện bệnh; “ ”: Cây không chủng bệnh Hình 4.20 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPB08 TQ: Dứa Cayenne Trung Quốc; TL: Dứa Cayenne Thái Lan; LD: Dứa Cayenne Lâm Đồng “+”: Cây biểu hiện bệnh; “-”: Cây không biểu hiện bệnh; “ ”:Cây không chủng bệnh Sau khi đã thực hiện lại phản ứng RAPD với các primer cho đa hình nhiều nhất trên dứa Cayenne (OPAC10, OPB08), Chúng tôi nhận thấy với primer OPAC10 cũng có các băng đa hình khoảng 1500bp và 850bp giữa mẫu Lâm Đồng có và không có biểu hiện bệnh nhƣng các băng này lại xuất hiện ở mẫu có biểu hiện bệnh nên không thể là marker liên kết gen kháng bệnh. Tƣơng tự với mồi OPB08 cũng có băng đa hình 600bp hiện diện ở mẫu Lâm Đồng bệnh mà không hiện diện ở mẫu Lâm Đồng kháng 50 nên không thể là marker liên kết gen kháng bệnh. Các mẫu Thái Lan và Trung Quốc không có sự khác biệt giữa mẫu có và không có biểu hiện bệnh. Riêng các mẫu không chủng bệnh khi phân tích với mồi OPB08 có sự khác biệt với các mẫu có và không có biểu hiện bệnh, có thể do các mẫu này ly trích ở các lần khác nhau nên chất lƣợng của DNA tổng số khác nhau. Nhƣ vậy kết quả kết quả phân tích với 2 mồi OPAC10 và OPB08 không cho band đa hình liên kết với kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá. Hơn thế nữa, nếu có sự xuất hiện band đa hình đó cũng khó có thể khẳng định marker đó liên kết với tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá vì các cây kháng ban đầu chƣa đƣợc xác định là có thật sự kháng với bệnh héo đỏ đầu lá hay không. Từ đó, chúng tôi xác định đƣợc một số nguyên nhân không xác định đƣợc marker kháng nhƣ: Chƣa có 1 hệ thống xác định mức độ bệnh thông qua kiểu hình. Hơn nữa bệnh có khả năng tiềm ẩn nên việc này càng khó khăn. RAPD là phƣơng pháp xác định marker phổ biến và dễ làm nhƣng phƣơng pháp này phụ thuộc nhiều vào yếu tố ngẫu nhiên nên xác suất thành công thấp. Việc xác định marker RAPD liên kết tính kháng bệnh chỉ dễ dàng khi tính kháng do 1 gene quy định. Tuy nhiên trong tự nhiên tính kháng chủ yếu là do tổ hợp nhiều gene (QTLs) quy định. Hơn nữa dứa Cayenne là giống mẫn cảm với bệnh héo đỏ đầu lá nên việc xuất hiện 1 gene kháng bệnh là khó xảy ra (chỉ có thể xảy ra do đột biến) mà khả năng cao nhất là xuất hiện một tổ hợp gene kháng cho tính kháng mạnh hay yếu do biến dị tổ hợp. Ngoài ra, còn mối quan hệ phức tạp giữa virus PMWaV, rệp sáp và sự biểu hiện bệnh (D.M. Sether, 2004): Bệnh héo đỏ đầu lá chỉ biểu hiện bệnh ở cây có rệp sáp và virus PMWaV-2. Bệnh không biểu hiện khi không có rệp sáp hoặc cây có rệp sáp mà chỉ bị xâm nhiễm bởi virus PMWaV-1 hoặc PMWaV-3 hoặc cả hai. Điều này cũng cần đƣợc chú ý khi tiến hành chủng bệnh. Để xác định marker liên kết gene kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa có thể áp dụng các phƣơng pháp sau: Sử dụng phƣơng pháp phân tích quần thể phân ly (bulked segregant analysis, BSA): Hai giống kháng và nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá thuần chủng về kiểu hình này đƣợc phân tích bằng các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ RAPD, SSR, AFLP… để xác định band đa hình giữa 2 giống. Sau đó con lai F2 của chúng đƣợc chia thành 2 nhóm kháng và nhiễm dựa vào mức độ biểu hiện bệnh và các cá thể của 2 nhóm này 51 phân tích lại với các marker cho đa hình giữa bố và mẹ để xác định marker cho đa hình nào là marker liên kết với tính kháng bệnh. Tuy nhiên phƣơng pháp này gặp khó khăn là cần phải có vật liệu ban đầu là giống có kiểu hình kháng bệnh héo đỏ đầu lá thuần chủng trƣớc. Nghĩa là phải có giống kháng bệnh héo đỏ đầu lá để làm vật liệu ban đầu. 52 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu đƣợc, có thể đƣa ra một số kết luận sau :  Phân tích đa dạng di truyền các giống dứa Cayenne tại Tp. Hồ Chí Minh Trong các primer sử dụng thì các primer cho độ đa hình lần lƣợt là OPAC10, OPAH13, OPB01, OPB08, S1384, V20. Với mức tƣơng đồng là 0,92, nhóm dứa Cayenne phân thành 2 nhóm nhỏ, nhóm 1 gồm 2 giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan với độ tƣơng đồng là 0,98, nhóm 2 là Cayenne Lâm Đồng. Nhóm đối chứng Queen có mức tƣơng đồng với nhóm Cayenne là 0,9. Qua đó thấy đƣợc độ đa dạng di truyền của dứa Cayenne tại nông trƣờng Phạm Văn Hai Tp. Hồ Chí Minh là thấp. Nhƣ vậy, việc lai tạo giống dựa vào các giống dứa Cayenne hiện có tại khu vực này là không có lợi cho việc tăng năng suất dứa.  Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá Kết quả nuôi rệp cho thấy rệp phát triển tốt trên bí đỏ ở 25-26oC và phƣơng pháp quét trực tiếp rệp từ bí lên dứa hiệu quả hơn phƣơng pháp dùng đèn. Kết quả chủng bệnh chƣa thành công do ảnh hƣởng của nhiều yếu tố, đặc biệt điều kiện thời tiết và thiếu sự hiện diện đầy đủ các tác nhân gây bệnh nhƣ Virus PMWaV-2, rệp và kiến theo Sether và cs, 2001.  Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình biểu hiện và không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá Lần lƣợt các primer cho đa hình cao nhƣ OPAC10 và OPB08 đƣợc sử dụng để sàng lọc marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá, nhƣng kết quả không cho marker nào có liên kết với tính trạng này một cách rõ ràng. 53 5.2. Đề nghị  Tiếp tục phân tích thêm các giống cayenne ở những vùng khác để có thể đánh giá đầy đủ mức độ đa dạng di truyền của dứa Cayenne là cơ sở cho công tác chọn giống.  Tiến hành chủng bệnh cho dứa nhiều lần và với mật độ rệp cao hơn để dứa biểu hiện bệnh rõ ràng.  Sử dụng nhiều primer hơn để tăng khả năng phát hiện marker liên kết tính kháng, bên cạnh đó có thể kết hợp với các phƣơng pháp xác định marker khác nhƣ AFLP, RFLP… 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: 1. Biện Thị Lan Thanh, 2005. Ứng dung kỹ thuật RT-PCR phát hịên virus PMWaV-1(Pineapple mealybug wilt associated virus-1) gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayene), luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh. 2. Bùi Chí Bửu, 2002. Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại cây trồng. Nhà xuất bản nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh. Tr 12-13, 169-208. 3. Hùynh Chấn Khôn, 2005. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây tiêu (Piper nigrum L.) tại thị xã Bà Rịa thuộc tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD, luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh. 4. Lê Thị Thanh Tuyền, 2004. Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử, luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh. 5. Lê Văn Huy, 2005. Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm Corynespora cassiicola (berk & curt) Wei gây bệnh trên cây cao su (hevea brasiliensis muell. arg.) tại trại thực nghiệm Lai Khê, viện nghiên cứu cao su Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD, luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh. 6. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh. Tr 50-53. 7. Nguyễn Thị Thu Cúc. Côn trùng và nhện gây hại cây ăn trái vùng Dồng Bằng Sông Cửu Long và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản nông nghiệp. TP Hồ Chí Minh. Tr 311-313. 8. Tôn Bảo Linh, 2004. Nghiên cứu tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá (PMWaV – Pineapple Mealybug Wilt associated Virus), luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh. 55 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI: 9. Gary C. Jahn, John W. Beardsley and Hector González-Hernández, 2003. A review of the association of ants with Mealybug Wilt Disease of Pineapple. Proc. Hawaiin Entomol. SOC 36:9–28. 10. Guihong YU, Hongxiang MA, Zhang XU, Lijian REN, Maoping ZHOU, Weizhong LU., 2004. Cloning a DNA marker associated to wheat scab resistance. J. Appl. Genet. 45(1), pp. 17-25. 11. Gygax M., Gianfranceschi L., Liebhard R., Kellerhals M., Gessler C., Patocchi A., 2004. Molecular markers linked to the apple scab resistance gene Vbj derived from Malus baccata jackii. Theor Appl Genet 109: 1702- 1709. 12. Import Risk Analysis (IRA) for the Importation of Fresh Pineapple Fruit, 2001. Agriculture, fisheries and forestry, Australia. P. 32-33. 13. Meyerdirk D. E., Warkentin R., Attavian B., Gersabeck E., A.Francis, Adams M., and Francis G., 2001. Biological Control of Pink Hibiscus Mealybug Project Manual. United States Department of Agriculture. 14. Moury B., Pflieger S., Blattes A., Lefebvre V., and Palloix A., 2000. A CAPS marker to assist selection of tomato spotted wilt virus (TSWV) resistance in pepper. Genome 43: 137–142. 15. Okubara, Inglis, Muehlbauer, Coyne, 2002. A novel RAPD marker linked to the Fusarium wilt race 5 resistance gene (Fwf) in Pisum sativum. Pisum Genetics. 16. Sether, D. M., and Hu, J. S., 2002. Closterovirus infection and mealybug exposure are necessary for the development of mealybug wilt of pineapple disease. Phytopathology, 92: 928-935. 17. Sether D. M., Melzer M. J., Busto J., Zee F., HU J. S., 2004. Diversity of Pineapple mealybug wilt associated viruses in pineapple. Phytopathology 94: 1031. Publication no. P-2004-0803-Ama. 18. Sether D. M., Melzer M. J., Busto J., 2005. Diversity and Mealybug Transmissibility of Ampeloviruses in pineapple. Plant Dis. 89:450-456. 56 TÀI LIỆU TỪ INTERNET: 19. Ronald F.L. Mau, Jayma L. Martin Kessing. Dysmicoccus brevipes (Cockerell). Updated by: J.M. Diez April 2007. 20. Ronald F.L. Mau, Jayma L. Martin Kessing. Dysmicoccus neobrevipes (Beardsley). Updated by: J.M. Diez April 2007. 21. William Roltsch, 2001. Insectary Rearing of the Pink Hibiscus Mealy Bug and Its Parasitoids in a Desert Environment. < 6SMJ:www.cdfa.ca.gov/phpps/ipc/biocontrol/insects/11pinkhibiscusmealybug/p hm_parasite- production.pdf+Insectary+Rearing+of+the+Pink+Hibiscus+Mealy+Bug+and +Its+Parasitoids+in+a&hl=vi&ct=clnk&cd=1&gl=vn> PHỤ LỤC 1.Sự phát triển của rệp trên bí sau 5 tuần Thời gian (tuần) 1 2 3 4 5 Trọng lƣợng rệp (g) (trung bình 3 lần cân) 25-26 o C 0,11 0,72 6,2 18,4 30,44 Nhiệt độ phòng (33- 34 0 C) 0,12 0,51 4,16 9,54 16,4 2. Kết quả đo OD các mẫu dùng trong phân tích đa dạng di truyền (TQ: cayenne Trung Quốc, LD: Cayene Lâm Đồng, TL: Cayenne Thái lan) Mẫu Ratio Abs Abs DNA (ng/ul) pha loãng TQ 1.81709 0.1822000 0.1002700 785.066000 16 TL 1.77507 0.2187600 0.1232400 932.336400 19 TL 1.72627 0.2125040 0.1231000 893.490160 18 Q 2.28098 0.1424700 0.0624600 671.280300 13 LAN 2.61983 0.0544400 0.0207800 267.619600 5 3. Kết quả đo OD các mẫu dùng trong xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá (“+”: biểu hiện bệnh, “-”: không biểu hiện bệnh, “”: Cây không chủng bệnh) (TQ: cayenne Trung Quốc, LD: Cayene Lâm Đồng, TL: Cayenne Thái lan) Mẫu Ratio Abs Abs DNA (ng/ul) pha loãng TQ+ 2.07660 0.2342200 0.1127900 1067.199800 21 TQ- 1.69388 0.2168500 0.1280200 903.114500 18 TQ 1.75040 0.1968500 0.1124600 833.330500 17 TL+ 1.71773 0.2250400 0.1310100 943.865600 19 TL- 1.78053 0.2933600 0.1647600 1252.098400 25 TL 1.83022 0.2113360 0.1154700 913.611440 18 LD+ 2.18030 0.1702600 0.0780900 789.811400 16 LD- 1.64556 0.2970400 0.1805100 1218.545600 24 LD 1.74126 0.1702600 0.0977800 718.927400 14 4. Kết quả mã hóa nhị phân cho kết quả điện di của các mồi TQ TL LD Q LAN OPB01 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 OPAH13 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 V20 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 S1384 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 OPAC10 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPB08 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0