Khóa luận Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải Coker312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

nistan 0,550 9 Mali 0,516 10 Benin 0,415 TỔNG CỘNG 26,613 Diện tích trồng bông của thế giới 33,457 Nguồn: ICAC, 2002 ( 9 Bảng 2.3. Mười nước có sản lượng bông cao nhất thế giới năm 2001 – 2002. (ISAAA, 2002) STT Quốc gia Sản lượng (triệu tấn) Năng suất bông xơ (Kg/ha) 1 Trung Quốc 5,320 1103 2 Mỹ 4,420 790 3 Ấn Độ 2,508 287 4 Pakistan 1,853 593 5 Uzbekistan 1,055 726 6 Thổ Nhĩ Kỳ 0,880 1345 7 Brazil 0,750 999 8 Úc 0,670 1658 9 Syria 0,335 1303 10 Ai Cập 0,314 944 Tổng Cộng 18,105 980 Các quốc gia khác 3,132 Sản lượng toàn thế giới 21,237 635 Nguồn: ICAC, 2002 2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển nạp gen khác nhau nhưng phổ biến là chuyển nạp gen trực tiếp bằng súng bắn gen với vật liệu nuôi cấy là đỉnh chồi phân sinh hoặc từ tế bào huyền phù (McCabe và Martinell, 1993; Rajasekaran và ctv, 2000), phương pháp chuyển nạp gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens (Umbeck và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996; Satyavathi và ctv, 2002). Chuyển nạp gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải thành công đã được công bố lần đầu tiên vào những năm 1980 (Firoozabady và ctv, 1987; Umbeck và ctv, 1987) với mẫu cấy là trụ hạ diệp và tử diệp. Từ đó nhiều gen được chuyển thành công vào cây bông nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, bao gồm các gen kháng côn trùng và gen kháng thuốc diệt cỏ (Perlak và ctv, 1990; Chen và ctv, 1994). Các loại mẫu cấy như trụ hạ diệp, tử diệp, mô sẹo từ trụ hạ diệp và tử diệp cũng như phôi non đã được dùng trong việc chuyển 10 gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen (Firoozabady và ctv, 1987; Perlak và ctv, 1990). Ngoài ra còn có các mô phân sinh phân lập từ trục phôi đã được sử dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bông vải (Chlan và ctv, 1995). Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thường khá thấp, khoảng 20 - 30% khi trụ hạ diệp được dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996). Một hiệu quả chuyển gen cao hơn có ý nghĩa (đến 60%) đã được công bố khi trụ hạ diệp được dùng làm mẫu cấy và gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase) được dùng làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv, 1987). Nhưng chỉ là kết quả của sự thử nghiệm sự biểu hiện gen tạm thời của gen onc. Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp gen ở song tử diệp chỉ khoảng 20 -30% (Cousins và ctv,1991), hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí còn thấp khi sử dụng phương pháp bắn gen (Keller và ctv, 1997. Sự khác biệt giữa các loại mẫu cấy được dùng trong chuyển nạp gen có thể ảnh hưởng có ý nghĩa đến hiệu quả của chuyển nạp gen và sự tái sinh, một số nhà nghiên cứu cho rằng để giảm thiểu các thể chuyển nạp gen dương tính giả, tử diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv, 1987). Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen trên cây bông vải bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho thấy các yếu tố như chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ trong chuyển gen có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen. Thêm vào đó kích thước mẫu cấy cũng ảnh hưởng đến sự sống sót của các mẫu cấy trên môi trường chọn lọc (Sunilkumar và Rathore, 2001). Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen. Chỉ có một số giống nhất định mới có khả năng tái sinh và chuyển nạp như giống bông Luồi Coker 312 và Jin 7, còn hầu hết các giống khác thường khó có thể tái sinh và chuyển nạp được. Thiếu phương pháp tái sinh cây hiệu quả cũng được xem như là một rào cản chính cho việc áp dụng phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải (Firoobady và ctv, 1987). Để cải tiến phương pháp chuyển nạp, một quy trình chuyển gen hiệu quả cao dùng cuống lá và trụ hạ diệp cây mầm làm mẫu cấy được phát triển, cùng với môi trường nuôi cấy được cải tiến thích hợp. Hiện nay, Trung Quốc đã thành công trong việc chuyển nạp gen vào cây bông vải bằng phương pháp tiêm DNA qua ống phấn, nhưng phương pháp này gặp khó khăn trong việc xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây được tạo thành nhưng chỉ một số ít cây được chuyển nạp gen (Chen và ctv, 2000). 11 2.3. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Chuyển nạp gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào bộ gen của sinh vật đang nghiên cứu. Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới như kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ… Sự chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đã được ghi nhận bằng cách sử dụng plasmid Ti, thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng. Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn được gọi là phương pháp chuyển nạp gen gián tiếp. 2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Giống Agrobacterium được chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây bệnh và kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium như: A. radiobacter ( loài nay không gây bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ… (Jiang, 2004) Hình 2.1. Khối u do Agrobacterium tumefaciens gây ra trên thực vật. A: một khối u lớn trên thân cây hoa Hồng; B: các khối u trên cành Nho (Deacon và ctv, 2005). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium (Deacon và ctv, 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5- 11 lông roi, vi khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt 29oC trong môi trường có bổ sung mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất (Domer, 1999). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh khối u trên cây (chủ yếu là cây hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào cây. Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thước là 2,6Mb. Ngoài ra vi khuẩn 12 còn mang plasmid lớn có kích thước 200 - 800 kb (Gelvin, 2003), chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập. Plasmid này có tên gọi là Plasmid Ti, hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này (Deacon và ctv, 2005). Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm nhập vào cây qua vết thương đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó là Plasmid Ti. Plasmid Ti mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn không mang Plasmid Ti thì được xem như là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ màu trắng, ban đầu được tìm thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào ngoại biên chết đi. Các khối u có thể mền và xốp và có thể bị vỡ vụn khi chạm vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ. Các khối u có đường kính đến 30 cm nhưng phổ biến là 5 – 10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường. Khi xâm nhiễm vào cây một phần gen trên Plasmid Ti sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này như một nguồn cacbon 2.3.2. Ti-plamid Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định Plasmid Ti như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T- DNA mang các gen tổng hợp các hormon thực vật và vùng gen vir, ngoài ra còn có một số gen mã hoá cho việc tái sinh plasmid, cho việc tiêu hoá opine. Trong cấu trúc của Plasmid Ti , hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T- DNA và gen vir (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002). 2.3.2.1 Chức năng của T-DNA T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 10-30 kb, trong đó có chứa gen mã hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u (Gelvin, 2003). Trong Plasmid 13 Ti, vị trí của T-DNA được giới hạn bởi bờ phải và bờ trái. Trình tự nucleotide của bờ phải và bờ trái tương tự nhau và đều có kích thước 25bp (Gelvin, 2003). Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể được bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước và tiến dần về phía trái. Việc đảo ngược bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Gelvin, 2003; Zhu và ctv, 2000). T-DNA mã hóa một vài protein và các protein này biểu hiện trong tế bào cây được chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA có thể biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào. Theo Binns và Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen được chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây, yếu tố tăng cường sao mã, các vị trí gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào. Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng hợp các hormon sinh trưởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và làm thay đổi hình dạng bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và Costantino, 1998) và các enzyme trong cây được cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một nhóm methyl của isopentenyl. Hai gen trên T-DNA khác được cho là có chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin (Korber và ctv,1991). Trong khi đó gen tml làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chưa được giải thích (Tinland và ctv, 1992). Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác. Một nhóm gen được chuyển thứ hai đều khiển sản xuất nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn, đó là các opine. Đây là một dạng kết hợp giữa một aminoacid với một keto acid hoặc một đường (Dessaux và ctv, 1998). Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lượng lớn các opine. Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine được tổng hợp từ khối u. Dựa trên các kiểu opine đựơc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng như là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine. Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). Gen ocs mã hóa cho 14 octopine synthase, enzyme này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic acid và tất cả những opine này đều được phát hiện trong các khối u (Dessaux và ctv, 1998). Sản phẩm của gen mas2’ được cho là làm kết nối glutamine hoặc glutamic acid với glucose (mặc dù đều này chưa đựơc chứng minh bằng thực nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic acid. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành agropinic acid (Dessaux và ctv, 1998). Bởi vậy, các khối u được tạo ra bởi Plasmid Ti kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine. 2.3.2.2 Chức năng của các gen vir Vùng vir trên Plasmid Ti có khoảng 25 gen được nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002) và vùng này có kích thước khoảng 30- 40 kbp (Riva và ctv, 1998). Những gen vir này mã hoá cho các vai trò như: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, gia công đoạn T-DNA, chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ. Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua dấu hiệu hoá học tiết từ vết thương. Các tín hiệu hoá học từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo ra được nhận biết trước tiên bởi VirA protein, rồi đến VirG protein để làm kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết. Gen vir được kích hoạt tối đa ở pH acid với sự hiện diện của các hợp chất phenol như là acetosyringone (AS), chất mà được giải phóng khi tế bào cây bị tổn thương (Ziemienowicz, 2001). Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào, protein VirA đáp ứng với sự trao đổi chất của vết thương của cây. VirA có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường. Với một nồng độ AS thích hợp VirA có thể được kích thích bởi đường, các opine khối u hoặc amino acid (Zhu và ctv, 2000; Ziemienowicz, 2001). Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá, sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG được phosphoryl hoá bởi aspartic acid còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv, 1990) và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen vir có kích thước khoảng 12bp trong trình tự “vir box” (Winans và ctv, 1987). 15 Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn và đưa sợi đơn T- DNA vào trong tế bào cây. Các protein được mã hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA. Protein VirD2 là một endonuclease, protein này sẽ cắt T- DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của sợi đơn T-DNA. Protein VirD2 được tinh sạch từ oligonucleotide sợi đơn mang các trình tự bờ vai ở vị trí tương đồng (Zupan và ctv, 1996; Deng và ctv,1998). Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn DNA , nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzyme nuclease trong tế bào cây (Deng và ctv, 1998), protein VirE2 là protein chiếm số lượng nhiều nhất. Protein VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp thúc đẩy sự hấp thu phức hợp T-DNA vào nhân. Hai sản phẩm của gen vir khác cũng được cho là có chức năng trong việc tạo gia công T-DNA là: VirC1 và VirC2. VirC1 đã được thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003). Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo sợi đơn T-DNA nhưng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đó đề nghị rằng chúng có chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv, 2000). Ngoài ra, Protein VirD2 được cho là có chức năng trong sự hòa hợp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đưa T-DNA vào nhân tế bào và lưu lại cùng với T-DNA trong các bước hòa hợp. Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự hòa hợp T-DNA đã được đề nghị: VirD2 hoạt động như một integrase và VirD2 hoạt động như một ligase (Ziemienowicz, 2001). Hệ thống chuyển nạp T-DNA được mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u và tạo khối u (Lai và Kado, 1998). Các protein VirB đều khiển tạo chiên mao và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB là VirB4 và VirB11 có hoạt tính ATPase và được cho là cung cấp năng lượng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA. Hệ thống VirB đưa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây các bước cần cho chuyển T-DNA vào nhân và hòa hợp với DNA của cây được thực hiện (Zhu và ctv, 2000). 16 Hình 2.2. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây (nguồn Zhu và ctv, 2000) 2.3.2.3 Cơ chế lây nhiễm Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt rễ cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dưỡng do mô rễ tạo ra. Vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thương nhờ các dấu hiệu hoá học. Đều này có được là do đáp ứng giải phóng đường và các thành phần phổ biến khác trong rễ. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang Plasmid Ti sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thương (hợp chất phenolic) như acetosyringone. Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng độ thấp (10-7 M). Bởi vậy, một trong những chức năng của Plasmid Ti là mã hoá các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương. Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. Ở nồng độ cao (10-5 – 10-4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên Plasmid Ti (Valentine, 2003 ) Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ đều khiển quá trình tạo sợi đơn T-DNA. Quá trình tạo sợi đơn T-DNA được thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein VirD1 và 17 VirD2 thực hiện. Sau đó protein VirD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp T- DNA. Phức hợp T-DNA-VirD2 cùng với protein VirE2 được chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp được mã hoá bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đưa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào. (Valentine, 2003 ) Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA (Valentine, 2003 ) Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tương đồng với DNA của cây và gắn vào. Sau đó nucleotide gắn với VirD2 tìm các đoạn vi tương đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây được hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự hòa hợp của T-DNA hoàn thành. Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Valentine, 2003 ). Hình 2.4. Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây (Valentine, 2003 ) 18 CHƢƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, sử dụng plasmid pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi và gen gus để xây dựng quy trình chuyển nạp gen với hệ thống thanh lọc bằng mannose đối với cây bông vải. 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: khóa luận được thực hiện từ ngày 21/03/2005 đến ngày 31/07/2005. Địa điểm: khóa luận được thực hiện tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, huyện Cờ Đỏ, TP. Cần Thơ. 3.3. Vật liệu nghiên cứu Giống bông vải Coker 312 và VN36P. Hạt bông vải tự thụ được thu từ cây bông vải trồng ở nhà lưới của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Mẫu cấy: trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi. Dụng cụ, thiết bị, hoá chất ở bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long (phụ lục 7). 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1.Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy Hạt của các giống bông vải được đốt lớp xơ bao quanh bằng axit sunfurit đậm đặc (H2SO4 98%), rồi rửa dưới vòi nước máy nhiều lần cho đến khi sạch hết axit và bột than, sau đó sấy trong tủ sấy ở 400C khoảng 48 giờ để đạt độ ẩm 14%. Sau khi sấy, hạt được khử trùng bề mặt với cồn 700 trong 2 phút rồi rửa bằng nước cất vô trùng (3 lần), tiếp theo hột được khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% (w/v) có vài giọt Tween 20, lắc ở tốc độ 100 vòng/phút thực hiện 2 lần mỗi lần 10 phút (giữa 2 lần khử trùng bằng HgCl2 có rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng), sau đó hạt được rửa nhiều lần với nước cất vô trùng (6 lần) rồi được bảo hoà qua đêm trong nước cất. 19 Sau khi bảo hòa qua đêm, hạt tiếp tục được khử trùng bằng HgCl2 0,1% có vài giọt Tween 20 (thực hiện 2 lần mỗi lần 5 phút). Sau đó những hạt nứt nanh được bóc vỏ trong đều kiện vô trùng và cấy vào môi trường nảy mầm MSG (phụ lục 1) và nuôi ở nhiệt độ 28 - 29 0C, độ ẩm tương đối bằng 50%. Sau 5-7 ngày ta loại bỏ những keo bị tạp nhiễm, chọn những cây không bị tạp nhiễm làm nguồn vật liệu thí nghiệm. Từ cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi đã được nuôi cấy, các trụ hạ diệp được cắt thành những đoạn dài khoảng 0,5 cm dùng làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển nạp gen. Hình 3.1. Hạt bông vải sau khi tách vỏ và cấy vào môi trường nảy mầm Hình 3.2. Cây mần in vitro 5 ngày tuổi. 20 3.4.2. Quy trình chuyển nạp gen 3.4.2.1. Nguồn plasmid Nguồn plasmid được sử dụng để nghiên cứu là vector pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào vi khuẩn biến dưỡng đường mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (Hoekema và ctv, 1983). Hình 3.3. Sơ đồ vector pManCa mang gen pmi và gen gus 3.4.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vector pManCa từ ống tồn trữ trong glycerol (50%, v/v) ở nhiệt độ -800C được nuôi cấy trên môi trường đặc ABG (Chilton và ctv, 1974) có 50 mg/l kanamycin và ủ ở 280C trong 72 giờ. Trên môi trường đặc ABG (phụ lục 4) chọn một khuẩn lạc phát triển tốt đem nuôi cấy trong 3ml môi trường lỏng YEP (An và ctv, 1988) có bổ sung 50mg/l kanamycin và nuôi qua đêm (24-28 giờ) ở 280C trên máy lắc với tốc độ 200vòng/phút. Sau khi nuôi cấy 24-28 giờ, cấy chuyền sang 50 ml môi trường YEP (phụ lục 5) có kanamycin 50mg/l và nuôi cấy khoảng 16- 18 giờ ở 280C, lắc 200 vòng/phút đến khi OD600 đạt khoảng 0,5 - 1. 3.4.2.3. Lây nhiễm (đồng nuôi cấy) Chủ yếu dựa theo quy trình của Chen và ctv, 2000 (US Patent số: WO 00/77230 A1) với một vài thay đổi: OD600 pha loãng là 0,5, thời gian ngâm mẫu trong dịch vi khuẩn là 30 phút và lây nhiễm trên môi trường không có giấy thấm (Chen và ctv tiến hành thí nghiệm với OD600 pha loãng là 0,3, thời gian 5 phút và lây nhiễm trên môi trường có giấy thấm). 21 Vi khuẩn sau khi chuẩn bị được đem li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau khi li tâm, phần lắng được pha loãng bằng môi trường lây nhiễm không có phytagel (có bổ sung AS) và lắc với tốc độ 220 vòng/phút ở 280C trong 1giờ để chuẩn bị cho lây nhiễm. Từ cây mầm in vitro đã được chuẩn bị ta cắt lấy đoạn trụ hạ diệp, sau đó đoạn cắt trụ hạ diệp được cắt thành những mẫu dài khoảng 0,5 cm rồi ngâm trong dịch vi khuẩn pha loãng (OD600 ~ 0,5) khoảng 30 phút. Sau khi lây nhiễm các mẫu cấy được chuyển vào đĩa petri có giấy thấm tuyệt trùng cho khô mẫu sau đó cấy sang đĩa petri có môi trường đồng nuôi cấy MSCo (phụ lục 2). Các đĩa mẫu sau đó được giữ trong tủ nuôi ở 210C trong đều kiện chiếu sáng liên tục khoảng 72 giờ. 3.4.2.4. Thanh lọc Sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn, mẫu cấy được rửa vi khuẩn bằng nước cất vô trùng 2 lần để loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám trên bề mặt mẫu cấy và kháng sinh carbernicillin 500 mg/l để ức chế vi khuẩn mọc trở lại. Sau khi rửa, mẫu cấy được đặt lên đĩa petri có giấy thấm vô trùng trong vài phút cho khô mẫu. Sau đó mẫu cấy được cấy chuyền lên môi trường thanh lọc MMS1 (phụ lục 3) có tác nhân thanh lọc là đường mannose và glucose ở các nồng độ khác nhau theo sự tăng dần nồng độ mannose (2,5% w/v, 30% w/v và 35% w/v) và giảm dần nồng độ glucose (10% w/v, 5% w/v và 0% w/v) qua 3 lần thanh lọc, mỗi lần cách nhau 2 tuần. Bảng 3.1. Nồng độ đường mannose và glucose ở các lần thanh lọc Lần thanh lọc Mannose Glucose I II III 25g/l 30g/l 35g/l 10g/l 5g/l 0g/l Sau khi thanh lọc thì các mô sẹo chuyển gen giả định (biến dưỡng đường mannose) xuất hiện. Tỉ lệ mô sẹo chuyển gen giả định được theo dõi. Từ các mô sẹo sống sót sau khi thanh lọc, ta chọn ra những mô sẹo phát triển tốt, có màu xanh hơi vàng và rời rạc để tách nhỏ và cấy chuyền lên môi trường phát sinh phôi MMS2 (phụ lục 6). 22 3.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi Sự biến đổi hình thái mô sẹo trong quá trình lây nhiễm và chọn lọc: Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành theo dõi sự thay đổi hình thái mô sẹo qua các giai đoạn là sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1, thanh lọc lần 2 và thanh lọc lần 3. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo: Sau các lần thanh lọc tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo được chúng tôi theo dõi và ghi nhận. Từ tỉ lệ này chúng ta có thể so sánh được sự khác nhau giữa các giống đồng thời cũng đánh giá được hiệu quả của hệ thống thanh lọc đang thực hiện. 23 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Sự hình thành và phát triển mô sẹo Trong nghiên cứu chuyển nạp gen với mẫu cấy là trụ hạ diệp thì sự hình thành và phát triển của mô sẹo có một ý nghĩa rất quan trọng. Từ các mô sẹo được hình thành sau khi lây nhiễm và qua quá trình thanh lọc chúng ta có thể chọn ra được các mô sẹo chuyển gen có khả năng tái sinh để tiếp tục tái sinh thành cây chuyển gen. Sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1 thì mô sẹo đều bắt đầu hình thành và phát triển ở cả mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm. Mô sẹo có màu xanh lá cây tuy nhiên ở mẫu đối chứng sự phát triển của mô sẹo đồng đều hơn so với mẫu lây nhiễm có thể là do mẫu lây nhiễm bị tổn thương do ngâm trong dịch vi khuẩn và rửa lại bằng nước và kháng sinh khi tiến hành lây nhiễm (Hình 4.2). Hình 4.1. Mẫu cấy giống Coker 312 sau khi lây nhiễm trên môi trường MSCo 24 Hình 4.2. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hai tuần trên môi trường thanh lọc lần 2, mô sẹo phát triển thành một khối to gấp 3 – 4 lần so với mô sẹo trên môi trường thanh lọc lần 1 (Hình 4.3). So sánh giữa đối chứng và mẫu lây nhiễm ta thấy ở mẫu đối chứng thì khối mô sẹo cứng, có màu xanh đậm còn ở mẫu lây nhiễm thì mô sẹo có màu xanh hơi vàng và chắc, một số mô sẹo có xu hướng rời ra khi chạm kẹp vào. Theo Mishra và ctv (2003) thì các mô sẹo này đáp ứng tốt với khả năng tái sinh. Hình 4.3. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 2. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm 25 Hình 4.4. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hình 4.5. Mẫu cấy VN36P sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm. Trên môi trường thanh lọc lần 3 chúng tôi thấy các mô sẹo tiếp tục phát triển và kích thước mô sẹo lớn hơn trên môi trường thanh lọc lần 2. Ngoài ra, chúng tôi còn thấy được sự khác biệt giữa đối chứng và mẫu lây nhiễm. Các mẫu đối chứng chuyển sang màu xanh đậm hơn, khối mô sẹo cứng và dính chặt vào nhau, trong khi đó ở mẫu lây nhiễm thì khối mô sẹo chắc, các mô sẹo rời và có màu xanh vàng rõ hơn khi quan sát dưới kính hiển vi. Một số mẫu ở đối chứng bắt đầu có hiện tượng hoá nâu và chết, tuy nhiên vẫn còn một số 26 mẫu sống sót, có thể là do trong các khối mô sẹo có sự tích lũy đường glucose (Hình 4.4, Hình 4.5 và Hình 4.6). Các mô sẹo có màu xanh vàng, chắc, rời rạc từ khối mô sẹo còn sống trong giai đoạn này được tách nhỏ và tiếp tục cấy chuyền lên môi trường thanh lọc giống như ở lần 3 (Hình 4.7). Sau 2 tuần quan sát chúng tôi thấy các mô sẹo được tách nhỏ từ mẫu đối chứng điều bị chết còn ở mẫu lây nhiễm thì một số mô sẹo tiếp tục phát triển có màu xanh vàng, rời rạc, đây là các mô sẹo đáp ứng tốt với khả năng tái sinh và có khả năng sinh phôi tốt (Mishra và ctv, 2002; Sakhanokho và ctv, 2001). Tuy nhiên số mô sẹo chuyển màu nâu đen trong nghiệm thức chuyển gen cũng rất nhiều. Ở các mô sẹo chết và trên một số mô sẹo hóa nâu chúng tôi thấy có xuất hiện các mô sẹo mới. Các mô sẹo này có thể là những mô sẹo được chuyển nạp gen (Hình 4.8). Hình 4.6. Mẫu cấy giống Coker 312 chết trên môi trường thanh lọc lần 3. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hình 4.7. Khối mô sẹo giống Coker 312 sau khi thanh lọc lần 3. A: mô sẹo được tách nhỏ và chuyển tiếp lên môi trường thanh lọc lần 3, B: mô sẹo không được tách và chuyển lên môi trường thanh lọc lần 3. 27 Hình 4.8. Mô sẹo giống VN36P được tách nhỏ sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm. 4.2. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau các lần thanh lọc Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong nuôi cấy mô thông thường và chuyển gen. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành theo dõi sự hình thành mô sẹo của các mẫu cấy sau khi kết thúc mỗi lần thanh lọc (thời gian cho mỗi lần thanh lọc là 2 tuần). Bảng 4.1. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 38 150 38 146 100 97,3 2 34 146 34 143 100 97,9 3 36 147 36 144 100 97,9 4 34 143 34 139 100 97,2 Trung bình 100 97,6 28 Bảng 4.2. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 42 148 42 146 100 98,6 2 39 146 39 143 100 97,9 3 42 147 42 143 100 97,3 4 40 143 40 142 100 99,3 Trung bình 100 98,3 Bảng 4.3. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 38 150 38 143 100 95,3 2 34 146 34 141 100 96,6 3 36 147 36 143 100 97,3 4 34 143 34 138 100 96,5 Trung bình 100 96,4 29 Bảng 4.4. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 42 148 42 140 100 94,6 2 39 146 39 135 100 92,5 3 42 147 42 138 100 93,9 4 40 143 40 137 100 95,8 Trung bình 100 94,2 Kết quả ở bảng 4.1 và bảng 4.2 cho thấy sau thanh lọc lần 1 thì hầu hết các mẫu đối chứng đều sống sót và hình thành mô sẹo (100%). Ở các mẫu lây nhiễm tỉ lệ này cũng khá cao. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo của giống Coker 312 sau thanh lọc lần 1 là 97,6% còn đối với giống VN36P thì tỉ lệ này là 98,3% sau khi thanh lọc lần 1. Sau khi thanh lọc lần 2 thì mẫu đối chứng vẫn sống sót và hình thanh mô sẹo với tỉ lệ 100% còn ở mẫu lây nhiễm tỉ lệ này có giảm nhưng rất nhỏ. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 của giống Coker 312 là 96,4% và của giống VN36P là 94,2% (Bảng 4.3 và Bảng 4.4). Tỉ lệ sống sót cao trong lần thanh lọc 1 và 2 có thể do còn có một lượng đường glucose trong môi trường (1% và 0,5%). Các mẫu cấy có thể đã sử dụng lượng đường này làm nguồn dinh dưỡng. Riêng ở mẫu lây nhiễm có một số mẫu bị chết có thể là do bị tổn thương khi ngâm trong dịch vi khuẩn và rửa bằng nước cất, kháng sinh trong quá trình lây nhiễm và cũng có thể do thao tác thí nghiệm khi chuyển mẫu. 30 Bảng 4.5. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 3 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 38 150 32 34 84,2 22,7 2 34 146 30 33 88,2 22,6 3 36 147 32 35 88,9 23,8 4 34 143 28 32 82,4 22,4 Trung bình 85,9 22,9 Bảng 4.6. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 3 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 42 148 37 36 88,1 24,3 2 39 146 33 33 84,6 22,6 3 42 147 35 32 83,3 21,8 4 40 143 36 31 90,0 21,7 Trung bình 86,5 22,6 Sau khi thanh lọc lần 3, số mẫu còn sống khá cao ở các đối chứng (85,9% đối với Coker312 và 86,5% đối với VN36P), còn ở mẫu lây nhiễm số mẫu còn sống là rất ít, trên giống Coker 312 là 22,9% còn trên giống VN36P là 22,6 (Bảng 4.5 và Bảng 4.6). Trên môi trường lần 3 không có đường glucose chỉ có đường mannose mà tỉ lệ mẫu đối chứng còn sống rất cao có thể là do trong các khối mô sẹo có sự tích lũy đường glucose, trong khi đó tỉ lệ mẫu sống và hình thành mô sẹo ở mẫu lây nhiễm lại thấp. Với việc các mẫu đối chứng còn sống chúng ta không thể cho rằng các mẫu lây nhiễm còn sống là các 31 mẫu được chuyển nạp gen cũng như đánh giá được sự khác biệt giữa hai giống Coker312 và VN36P về khả năng chuyển nạp gen. Sau 3 lần thanh lọc, số mẫu đối chứng sống sót cao có thể là do các khối mô sẹo có sự tích lũy đường cũng có thể do nồng độ đường mannose dùng cho các lần thanh lọc chưa được chuẩn hóa đúng mức. Để khắc phục khó khăn này chúng tôi đã tiến hành tách nhỏ và tiếp tục thanh lọc các mô sẹo còn sống. Từ các khối mô sẹo, những mô sẹo rời rạc, màu xanh hơi vàng được tách nhỏ và chuyển lên môi trường giống như ở lần thanh lọc 3 (Hình 4.6 và Hình 4.7). Sau hai tuần thì mẫu đối chứng chết hoàn toàn và mẫu lây nhiễm còn sống với tỉ lệ thấp là 10,4% đối với giống Coker 312 (Bảng 4.7) và 13,6% đối với giống VN36P (Bảng 4.8). Bảng 4.7. Tỉ lệ mẫu sống sót sau khi tách nhỏ và tiếp tục thanh lọc trên môi trường thanh lọc lần 3 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu tách nhỏ Số mẫu sống sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 32 34 0 4 0 11,8 2 30 33 0 3 0 9,1 3 32 35 0 5 0 14,3 4 28 32 0 2 0 6,3 Trung bình 0 10,4 Bảng 4.8. Tỉ lệ mẫu sống sót sau khi tách nhỏ và tiếp tục thanh lọc trên môi trường thanh lọc lần 3 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu tách nhỏ Số mẫu sống sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 37 36 0 5 0 13,9 2 33 33 0 5 0 15,2 3 35 32 0 4 0 12,5 4 36 31 0 4 0 12,9 Trung bình 0 13,6 32 Kết quả thu được cho thấy hiệu quả thanh lọc sẽ tốt hơn khi tách nhỏ mô sẹo, do đó sau khi thanh lọc lần 2 các khối mô sẹo nên được tách nhỏ rồi mới chuyển lên môi trường thanh lọc lần 3 để tránh hiện tượng thoát mẫu (escape) và việc thanh lọc sẽ hiệu quả hơn. Ngoài ra kết quả thu được cho thấy giống bông vải Coker312 và VN36P trong thử nghiệm này đáp ứng tốt với quá trình tạo mô sẹo. Mô sẹo ở các giống bắt đầu hình thành sau 14 ngày chuyển lên môi trường thanh lọc với tỉ lệ cao (97 – 98%). Trong khi đó một kết quả với tỷ lệ hình thành mô sẹo thấp hơn (78% sau 10-15 ngày) đã được công bố (Chaudhary và ctv, 2003). Sự khác nhau giữa 2 kết quả này có thể là do Chaudhary và ctv đã sử dụng hệ thống thanh lọc bằng chất kháng sinh kanamycin với nồng độ thanh lọc giảm dần, lần lượt là 50mg/l; 50mg/l; 25mg/l và 0mg/l. Ngoài ra giống bông vải được nghiên cứu trong báo cáo cũng khác nhau (Chaudhary và ctv đã nghiên cứu trên giống Coker 310). Trong khi đó ở mẫu đối chứng không chuyển gen thì tỷ lệ hình thành mô sẹo giống nhau (100%). Chúng tôi cho rằng sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo của mẫu lây nhiễm là do hệ thống thanh lọc và giống được sử dụng khác nhau. 33 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ kết quả bước đầu thu nhận được về khả năng đáp ứng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P và việc ứng dụng hệ thống thanh lọc bằng đường mannose chúng tôi có những nhận xét sau: -Các giống bông vải Coker 312 và VN36P sau khi được chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (sử dụng vắc tơ pManCa mang gen pmi và gen gus), sau 3 vòng thanh lọc trên môi trường có chứa mannose cho tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót theo thứ tự đạt 10,4% và 13,6%, so với mẫu đối chứng (không chuyển nạp gen) có 0% tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót. Điều này cho thấy hệ thống chọn lọc mannose có hiệu quả trong thanh lọc chuyển nạp gen. Sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose có lợi điểm hơn so với các hệ thống chọn lọc bằng chất kháng sinh vì làm giảm các mối lo ngại về tính an toàn sinh học của cây trồng biến đổi gen do việc sử dụng các gen đánh dấu chọn lọc là gen kháng chất kháng sinh. -Kỹ thuật tách nhỏ mô sẹo trong giai đoạn thanh lọc đóng vai trò rất quan trọng trong việc hạn chế sự phát triển của các mô không chuyển gen, đặc biệt đối với hệ thống thanh lọc bằng đường mannose. 5.2. Đề nghị Cần tiếp tục nghiên cứu thêm về các mức liều lượng đường mannose và glucose ở mỗi vòng thanh lọc và thời gian chọn lọc để nâng cao hiệu quả chọn lọc, giảm thiểu điều kiện cho hiện tượng thoát mẫu. Cần tiến hành song song nghiên cứu chuyển nạp gen cây bông vải sử dụng hệ thống thanh lọc bằng đường mannose bên cạnh các hệ thống thanh lọc phổ biến khác như hygromycin làm đối chứng nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen như vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, vật liệu nuôi cấy khởi đầu, quy trình chọn lọc, v.v. Trên cơ sở đó tiến hành hoàn thiện với hệ thống thanh lọc bằng đường mannose để ứng dụng trong việc nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của các giống bông đang được trồng ở Việt Nam. 34 CHƢƠNG 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Trần Bình, 2001. Thực trạng chuyển nạp gen ở Việt Nam. Hội Nghị Nhận Thức Về Công Nghệ Sinh Học, Hà Nội, 6-8 tháng 7 năm 2001. 2. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2003. Mục tiêu và trương trình phát triển năm 2003 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn. Tạp chí Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, số 1/2003: 5-8. 3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000. Di truyền phân tử-Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng (tập II: Chuyển nạp gen). Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp. 4. Phạm Hoàng Hộ, 1997. Cây cỏ Việt Nam. Tái bản lần thứ ba. Nhà Xuất Bản Trẻ. Tp. Hồ Chí Minh. 5. Lê Kim Hỷ, 2003.Phát Triển Cây Bông Vải Ở Các Tỉnh Duyên Hải Nam Trung Bộ. Hội nghị về phát triển cây bông vải ở Duyên Hải Nam Trung Bộ. 6. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thuỷ Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Cao Cường, 2002. Công nghệ gen. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. 7. Lê Quang Quyến, 2004. Phát Triển Cây Bông Và Nghề Trồng Bông Ở Việt Nam. Viện Nghiên Cứu Cây bông và Cây có sợi. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 8. Binns A.N. and Costantino P, 1998. The Agrobacterium oncogens, p. 251-266. (Spaink.H.P, Kondorosi. A., Hooykaas. P. J. J. editors), In The Rhizobiaceae: molecular biology of model plant-associated bacteria. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 9. Chauhary B., Kumar S., Prasad V.S.K., Oinam G.S., Burma P.K and Pental D, 2003. Slow desication to high – frequency shoot recovery from transformed 35 somatic embryos of cotton (Gossypium hirsutumL. cv. Coker 310). Plant Cell Reports 21: 955 – 960. 10. Chaudhary B., Kumar S., Prasad V.S.K., Oinam G.S., Burma P.K and Pental D, 2003. Slow desication to high – frequency shoot recovery from transformed somatic embryos of cotton (Gossypium hirsutumL. cv. Coker 310). Plant Cell Reports 21: 955 – 960. 11. Chen Z.X., Liewellyn D.J., Fan Y.L., Li S.J. , Guo S.D., Jiao G.L. and Zhao J.X, 1994. The 2,4D Resistant transgenic cotton plants produce by Agrobacterium mediated gen transfer. Scientina Agiculture Sinica 27(2): 31 – 37. 12. Chen Z.X, Zhi X.J. and Xian S.J, 2000. High-efficiency Agrobacterium- mediated transformation of cotton using petiole explants. US Patent No.: WO 00/77230 A1. 13. Chilton M.D., Currier T.C., Farrand S.K., Bendich A.J., Gordon M.P and Nestor E.W, 1974. Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumors. Proceeding of National Academy Science. USA 71: 3672- 3676. 14. Chlan Y.L., Lin J., Cary J.W., and Cleveland T.E, 1995. A producer for biolistic transformation and regenration of transgenic cotton from meristematic tissues. Plant Molecular Bology Reporter. 13: 31-37. 15. Christou P, 1997. Rice transfomrmation: bombardment. Plant Molecular Biology. Reporter. 35: 179-203. 16. Cousin Y.L, Lyon B.R and Llewellyn D.J, 1991. Transformation of Australia cotton cultivars: Prospects for cotton improvement through genetic engineering. Australia Journal Plant Physiology., 18, 481-494. 17. Deacon J., Robertson A and Isbister A, 2005. The Microbial World: Biology and Control of Crown Gall (Agrobacterium tumefaciens). Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh. 18. Deng W., Chen L., Wood D.W., Metcalfe T., Liang X., Gordon M.P., Comai L and Nester E.W, 1998. Agrobacterium VirD2 protein interacts with plant host cyclophilins. Proceeding of the National Academy of Sciences 95: 7040-7045. 36 19. Dessaux Y., Petit A., Farrand S.K and Murphy P.J, 1998. Opines and opine-like molecules involved in plant-Rhizobiaceae interactions. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 20. Firoozabady E., DeBoer D.L., Merlo D.J., Halls E.J., Anderson I.N., Raska K.A and Muray E.E, 1987. Transformation of cotton, Gossypium hirsutum L. by Agrobacterium tumefaciens and regeration of transgenic plants. Plant Molecular Bology 10: 105-116. 21. Gasser C.S. and Fraley K., 1992. Transgenic crops. Sci. Am. 266: 62-69. 22. Gelvin S.B., 2003. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67: 16-37 23. Hoa T.T.C and Bong B.B, 2003. Effcient Agrobacterium-mediated transformation of indica rice (Oryza sativa) using mannose selection system. Viet Nam Journal of Agriculture & Rural Development 1+2: 60-63. 24. Hoekema L. 1983. A binary vector strategy base on separation of Vir- and T- region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303: 179-180. 25. ISAAA, 2002. Global Review of Commercialized Transgenic Crops: 2001 26b.pdf 26. James C. 2004. Preview: Global status of commercialized biotech/GM crops: 2004. International Service for the Acquisition of Agri – Biotech Applications (ISAAA), Excutive Summary. No. 32 – 2004: 4 – 8. 27. Jiang B.G, 2004. Optimization of Agrobacterium mediated cotton transformation using shoot apex explants and quantitative trait loci analysis of yeild and yeild component traits in Upland Cotton (Gossypium hirsutm L.). PhD. Thesis, Louisiana State University, USA. 28. Jin S., Prusti R.K., Roitsch T., Ankenbauer R.G and Nester E.W, 1990. Phosphorylation of the VirG protein of Agrobacterium tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein: Essential role in biological activity of VirG. Journal of Bacteriology 172: 4945- 4950. 29. Korber H., Strizhov N., Staiger D., Feldwish J., Olsson O., Sandberg. G., Palme K., Schell J and Koncz C, 1991. T-DNA gen 5 of Agrobacterium modulates 37 auxin response by autoregulated synthesis of a growth hormone an tagonist in plants. EMBO J. 10: 3983-3991. 30. Lai E.M. and Kado C.I., 1998. Processed VirB2 Is the Major Subunit of the Promiscuous Pilus of Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology 180: 2711-2717. 31. McCabe D.E and Martinell B.J, 1993. Transformation of lite cotton cultivars via particle bombardment of meristems. Bio/Technology 11: 596-598. 32. Mishra R., Wang H.Y., Yadav N.R and Wilkins T.A, 2003. Development of a highly regenrable elite Acala cotton (Gossypium hirsutumcv. Maxxa) – a step towards genotype-independent regenration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 73: 21–35. 33. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum 15: 476-493. 34. Nobre J., Keith J.D and Dunwell J.M, 2001. Morphogenesis and regeneration from stomatal guard cell complexes of cotton (Gossypium hirsutum L.). Plant Cell Reports 20: 8-15. 35. Perlak F.J., Deaton R.W., Armstrong T.A., Fruchs R.L, Sims S.R., Grennplate J.T and Fischhoff D.A, 1990. Insect resistant cotton plants. Bio/Technology 8: 934-943. 36. Rajasekaran K., Hudspeth R.I., Cary J.W., Anderson D.M and Cleveland D.M, 2000. High- frequency stable transformation of cotton (Gossypium hirsutumL.) by particle bombardment of embryogenic cell suspension cultures. Plant Cell Reports 19: 539- 545. 37. Rajasekaran K, 1996. Regenration of plants from cryopreserved embrygenic cell suspension and callus cultures of cotton (Gossypium hirsutumL.). Plant Cell Report 3: 859 – 864. 38. de la Riva G.A., González-Cabrera J., Vázquez-Padrón R and Ayra-Pardo C, 1998 .The agrobacterium tumefaciens gen transfer to plant cell. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458. 39. Sakhanokho H.F. , Zipf A. , Rajasekaran K. , Saha S and Shama G.C, 2001, Induction of highly embryogenic calli and plant regenration in Upland 38 (Gossypium hirsutumL.) and Pima (Gossypium barbadense L.) cottons. Crop Science 41: p 1235-1240. 40. Satyavathi V.V., Prasad V., Laskmi BG. and Sita G.L, 2002. High efficiency tranformation protocol for three Indian cotton varieties via Agrobacterium tumefaciens. Plant Science 162: 215-223. 41. Sunilkumar G and Rathore K.S, 2001. Transgenic cotton: factors influencing Agrobaterium- mediated transformation and regenration. Molecular Breed 8: 37- 52. 42. Tinland B., Fournier P., Heckel T and Otten L, 1992. Expression of a chimeric heat-shock-in-ducible Agrobacterium 6b oncogen in Nicotiana rustica. Plant Molecular Biology 18: 921- 930. 43. Umbeck P.F., Johnson G., Barton K. and Swain S, 1987. Gentically transformed cotton (Gossypium hirsutumL.). Plant Biotechnology 5: 263 – 266. 44. Valentine L., 2003. Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The David and Goliath of Modern Genetics. Plant Physiology 133: 948-955. 45. Ziemienowicz A., 2001. Odyssey of Agrobacterium T-DNA. Acta biochimica polonica 48: 623.635. 46. Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B., Hooykaas P.J.J, Farrand S.K and Winans S. C, 2000. The Bases of Crown Gall Tumorigensis. Journal of Bacteriology 182:3885- 3895. 47. Zupan J. R., Citovsky V and Zambryski P, 1996. Agrobacterium VirE2 protein mediates nuclear uptake of single-stranded DNA in plant cells. Proceeding of the National Academy of Sciences 93: 2392-2397. 48. Winans S.C., Allenza P., Stachel S.E., McBride K.E and Nester E.W, 1987. Characterization of the virE operon of the Agrobacterium tumefaciens Plasmid Ti pTiA6. Nucleic Acids Research 15: 825.837. 39 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Thành phần môi trƣờng nãy mầm hạt MSG trong 1 lít 2, 15 g Hỗn hợp khoáng MS (M 0221, Duchefa, Hà Lan) 10 g Glucose 0, 9 g MgCl2.6H2O 1, 8 g Phytagel (P 8169, Sigma, Mỹ) pH 7,0 (chuẩn bằng KOH) Phụ lục 2. Thành phần môi trƣờng lây nhiễm MSCo trong 1 lít 4, 4 g Hỗn hợp khoáng và vitamin B5 (M 0231, Duchefa, Hà Lan) 30 g Glucose 0, 05 mg 2,4-D 0, 10 mg Kinetin 0, 9 g MgCl2.6H2O 2, 0 g Phytagel (P 8169, Sigma, Mỹ) pH 6,5 (chuẩn bằng KOH) 0,2 mM AS Phụ lục 3. Thành phần môi trƣờng tạo mô sẹo và thanh lọc MMS1 trong 1 lít 4, 4 g Hỗn hợp khoáng và vitamin B5 (M 0231, Duchefa, Hà Lan) 0, 05 mg 2,4-D 0, 10 mg Kinetin 0, 9 g MgCl2.6H2O 2, 0 g Phytagel (CAT. No. P 8169, Sigma, Mỹ) glucose 10 g, 5 g, 0 g. mannose 25 g, 30 g, 35 g. pH 6,5 (chuẩn bằng KOH) 500 mg CB 40 Phụ lục 4. Thành phần môi trƣờng ABG (Chilton và ctv, 1974) trong 1 lít Thành phần nồng độ cuối Dung dịch đệm AB (hấp tiệt trùng riêng) K2HPO4.3H2O 3,0 g/l NaH2PO4 1,0 g/l Khoáng AB (hấp tiệt trùng riêng) NH4Cl 1,000 g/l MgSO4.7H2O 0,300 g/l KCl 0,150 g/l CaCl2 0,010 g/l FeSO4.7H2O 0,0025 g/l Môi trƣờng ABG Glucoz 5,0 g Agar 15,0 g Nước cất 900,0 ml Khoáng AB 20X 50,0 ml Đệm AB 20X 50,0 ml Phụ lục 5. Thành phần môi trƣờng YEP (An và ctv, 1988) trong 1 lít 5,0 g Beef extract 1,0 g Yeast extract 5,0 g Pepton 5,0 g Sucrose 2 ml MgSO4 1M pH 7,0 (chuẩn bằng NaOH) Phụ lục 6. Thành phần môi trƣờng phát sinh phôi MMS2 trong 1 lít 4,4 g Hỗn hợp khoáng và vitamin B5 (M 0231, Duchefa, Hà Lan) 1,9 g KNO3 30 g glucose 0,9 g MgCl2.6H2O 2,0 g Phytagel (CAT. No. P 8169, Sigma, Mỹ) 41 pH 6,5 (chuẩn bằng KOH) Phụ lục 7. Dụng cụ, thiết bị dùng trong thí nghiệm Keo thủy tinh Nồi hấp tiệt trùng autoclave: Microm (Model No. SA- 252M) Tủ nuôi cấy: VÖtsch VB 0714 và Sanyo chamber MLR-350H (Serial No. 21215175) Cân điện tử: Chyo (MJ- 500) và AA-200 Máy đo pH Themo orion (Model 420) Microwave: Sanyo EM-G4753 Ống đong (10, 25, 100, 250, 500, 1000 ml) Đĩa Petri Ф 60 và Ф 90 Bình tam giác (10, 100, 250, 500 ml) Máy lắc (200 vòng/phút): Orbital incubator SI50 Tủ cấy: Holten LaminAir (model 1.8) và ASTECT Microflow laminar (ABS1200). 200011310) Tủ lạnh (0, 4, -200C) Máy ly tâm: Hermle Z323 Máy đo OD600 Bio-Rad Smartspec TM 3000 Tủ sấy Kéo, kẹp, dao Pipet (6, 50, 200, 1000 µl) Máy khuấy từ: Bioblock cimarec 1