Khóa luận Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải SSR60F và coker 312 bằng vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

ổi chất của vết thƣơng của cây và có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi trƣờng. Với một nồng độ AS thích hợp VirA có thể đƣợc kích thích bởi đƣờng, các opine khối u hoặc amino axit (Ziemienowicz, 2001). Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá. Sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG đƣợc phosphoryl hoá bởi aspartic axit còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv., 1990) và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen vir có kích thƣớc khoảng 12 bp trong trình tự “vir box” (Winans và ctv., 1987). Sự phosphoryl hoá làm cho protein VirG gắn kết vào “vir boxes” và kích hoạt sự sao mã của các gen virBCDEFGH (Ziemienowicz, 2001). Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn (hình 2.3) và đƣa sợi đơn T-DNA vào trong tế bào cây. Các protein đƣợc mã hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA. Protein VirD2 là một endonuclease, protein này sẽ cắt T-DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của sợi đơn T- DNA. Protein VirD2 đƣợc tinh sạch từ oligonucleotide sợi đơn mang các trình tự bờ ở vị trí tƣơng đồng (Deng và ctv., 1998). Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn 28 DNA, nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzyme nuclease trong tế bào cây (Deng và ctv., 1998). Protein VirE2 là protein chiếm số lƣợng nhiều nhất. Protein VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp thúc đẩy đƣa phức hợp T-DNA vào nhân. Hai sản phẩm của gen vir cũng đƣợc cho là có chức năng trong việc tạo T-DNA sợi đơn là: VirC1 và VirC2. VirC1 đã đƣợc thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cƣờng sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003). Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo T-DNA sợi đơn. Nhƣng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đó đề nghị rằng chúng có chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv., 2000). Ngoài ra, protein VirD2 đƣợc cho là có chức năng trong sự kết nạp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đƣa T-DNA vào nhân tế bào và lƣu lại cùng với T-DNA trong các bƣớc kết nạp. Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự kết nạp T-DNA đã đƣợc đề nghị: VirD2 hoạt động nhƣ một enzyme integrase và VirD2 hoạt động nhƣ một ligase (Ziemienowicz, 2001). Cùng với protein VirD4, mƣời một protein VirB, VirE2 và VirF tham gia đƣa T-DNA vào nhân. Hệ thống chuyển nạp T-DNA đƣợc mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u (Lai và Kado, 1998). Các protein VirB điều khiển tạo chiên mao này (chiên mao này tƣơng tự nhƣ chiên mao tiếp hợp) và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB là VirB4 và VirB11 có hoạt tính ATPase và đƣợc cho là cung cấp năng lƣợng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA, hoặc cả hai. Hệ thống VirB đƣa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây các bƣớc cần cho chuyển T-DNA vào nhân và kết nạp với DNA của cây đƣợc thực hiện (Zhu và ctv., 2000). Cầu nối VirB có thể gắn kết với phức hợp T-DNA bởi protein VirD4, protein này nằm trong màng và rất cần cho việc chuyển nạp. Hệ thống VirB/VirD4 đƣa phức hợp T-DNA–VirD2 và protein VirE2 vào tế bào chất của tế bào cây, phức hợp T-DNA cuối cùng đƣợc tạo ra bằng cách phủ T-DNA với protein VirE2 (Ziemienowicz, 2001). 29 2.3.3.3. Cơ chế lây nhiễm Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt rễ cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dƣỡng do mô rễ tạo ra. Nhƣng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thƣơng do nhiều nguyên nhân. Yêu cầu về vết thƣơng cho việc xâm nhiễm có thể dễ dàng đƣợc chứng minh bằng các thí nghiệm. Trong điều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thƣơng nhờ các dấu hiệu hoá học. Điều này có đƣợc là do đáp ứng giải phóng đƣờng và các thành phần phổ biến khác trong rễ. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có mang pTi sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thƣơng (hợp chất phenolic) nhƣ acetosyringone. Chất này có tác dụng rất mạnh mặc dù ở nồng độ thấp (10-7 M). Bởi vậy, một trong những chức năng của pTi là mã hoá cho các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thƣơng. Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. Ở nồng độ cao (10-5 – 10-4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên pTi (Deacon và ctv., 2005). Các gen vir đƣợc kích hoạt tốt nhất ở nhiệt độ 25-270C. Tuy nhiên, hầu hết các chủng Agrobacterium hoạt động ổn định ở nhiệt độ 18-200C (Gelvin, 2003) Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA (nguồn Valentine, 2003). Sau khi đƣợc kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển quá trình tạo T-DNA sợi đơn trong tế bào vi khuẩn (hình 2.3). Quá trình tạo T-DNA sợi đơn đƣợc thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein VirD1 và VirD2 thực hiện. Sau đó protein VirD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp T-DNA. Ngoài VirD1, VirD2 ngƣời ta còn cho rằng VirC1 và VirC2 cũng tham gia vào quá trình tạo T-DNA sợi đơn. Phức hợp 30 T-DNA-VirD2 cùng với protein VirE2 đƣợc chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp đƣợc mã hoá bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đƣa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào (Ziemienowicz, 2001). Hình 2.4. Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây (nguồn Valentine, 2003) Trong nhân tế bào cây, T-DNA đƣợc kết nạp vào bộ gen của cây (hình 2.4) không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả. Mô hình cơ sở cho sự kết nạp T-DNA vào bộ gen của cây đã đƣợc đề nghị. Theo mô hình này, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tƣơng đồng với DNA của cây và gắn vào. Cả việc tách sợi DNA của cây và overhang đầu 3’ của T-DNA đều đƣợc enzyme nuclease thực hiện. Cuối cùng nucleotide gắn với VirD2 tìm các đoạn vi tƣơng đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây đƣợc hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự kết nạp của T-DNA hoàn thành. Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Ziemienowicz, 2001). Các opine đƣợc tạo ra từ các khối u do vi khuẩn Agrobacterium nhiễm vào đƣợc vi khuẩn biến dƣỡng nhờ vào các gen ở vùng phân giải opin trên pTi. Tùy theo kiểu opine mà đƣợc chuyển hóa bởi các gen khác nhau (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). 31 Khả năng chuyển nạp đoạn DNA của Agrobacterium vào trong tế bào cây cung cấp một công cụ mạnh cho công nghệ sinh học thực vật và do đó chuyển nạp gene qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium là một trong những kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến trong chuyển nạp gene cây trồng. Trong thời gian ban đầu, phƣơng pháp này bị hạn chế chỉ thực hiện trên cây hai lá mầm do tin rằng Agrobacterium chỉ có thể nhiễm vào cây hái lá mầm. Sau này, ngƣời ta tìm ra rằng mặc dù Agrobacterium chỉ tạo khối u trên cây hai lá mầm nhƣng nó có thể nhiễm vào cây một lá mầm và không tạo khối u. (Ziemienowicz, 2001). Hình 2.5. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây (nguồn Zhu và ctv., 2000). 32 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu Giống bông vải: hạt của giống bông vải Coker 312 (đối chứng), SSR60F đƣợc thu từ nhà lƣới của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Hạt của các giống bông vải này phải đảm bảo là các hạt tự thụ. Mẫu cấy: Trụ hạ diệp của cây mầm 5-7 ngày tuổi. Dụng cụ, hóa chất, nguồn vi khuẩn và hóa chất: Các dụng cụ và hóa chất chuẩn bị cho nuôi cấy mô, chuyển nạp gen và xét nghiệm sinh học của phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long (phụ lục). 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành Địa điểm: Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Cờ Đỏ, Tp. Cần Thơ. Thời gian thực hiện: Nghiên cứu đƣợc tiến hành từ ngày 21 tháng 3 năm 2005 đến ngày 31 tháng 7 năm 2005. 3.3. Phƣơng pháp 3.3.1. Quy trình chuển nạp gen 3.3.1.1. Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy Hạt của các giống bông vải đƣợc đốt lớp bông xơ bao quanh bằng axit sulfuric (H2SO4) đậm đặc (98%), rồi rửa với nƣớc máy cho đến khi sạch hết axit và bột than, sau đó sấy trong tủ sấy ở 400C cho đến khi đạt độ ẩm 14% (khoảng 48h). Hạt đƣợc khử trùng bề mặt với cồn 700 (2 phút) và rửa hai lần bằng nƣớc cất vô trùng. Sau đó, hạt đƣợc khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% (w/v) bổ sung thêm 2 hoặc 3 giọt Tween 20 và lắc ở tốc độ 80 rpm. Thao tác khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% (w/v) đƣợc lặp lại hai lần, mỗi lần 10 phút và giữa hai lần khử trùng hạt đƣợc rửa bằng nƣớc cất tiệt trùng. Sau khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% (w/v), hạt đƣợc 33 rửa nhiều lần với nƣớc cất vô trùng (5lần) và ngâm qua đêm trong nƣớc cất vô trùng. Ngày hôm sau, hạt đƣợc lấy ra rửa hai lần với nƣớc cất tiệt trùng, sau đó khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% (w/v) trong 2 lần, mỗi lần khử trùng 5 phút. Giữa hai lần khử trùng bằng thủy ngân, hạt đƣợc rửa 3 lần bằng nứơc cất vô trùng. Sau khi khử trùng, hạt đƣợc bóc bỏ vỏ và cấy vào môi trƣờng nảy mầm MSG (phụ lục 4). Mẫu đƣợc nuôi cấy trong tủ cấy (Sanyo MLR35OH, Nhật) ở nhiệt độ 290C dƣới ánh sáng huỳnh quang, độ ẩm tƣơng đối bằng 50%. Từ cây mầm 5-7 ngày tuổi (hình 3.1) đã đƣợc chuẩn bị ở bƣớc trên, trụ hạ diệp đƣợc cắt cẩn thận (khoảng 5 mm) và đƣợc dùng làm vật liệu cho các thí nghiệm chuyển nạp gen. Hình 3.1. Cây mầm trên môi trƣờng nảy mầm. A: hạt mầm sau xử khử trùng đƣợc cấy lên môi trƣờng nảy mầm, B: Cây Coker 312 5 ngày tuổi 3.3.1.2. Nguồn Plasmid Plasmid pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào thực vật biến dƣỡng đƣờng mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 (Hoekema và ctv..,1984) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này ( hình 3.2). 34 Hình 3.2. Sơ đồ vectơ pManCa mang gen pmi 3.3.1.3. Chuẩn bị vi khuẩn Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vectơ pManCa, từ ống tồn trữ trong glycerol (50% v/v) trong tủ lạnh âm 800C đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đặc ABG (Chilton và ctv., 1974) có 50 mg/l kanamycine. Từ vi khuẩn trên môi trƣờng ABG (phụ lục 3) chọn ra một khuẩn lạc tốt (single colony) cấy vào 3ml môi trƣờng YEP có bổ xung kanamycin 50 mg/l (phụ lục 2) và nuôi khoảng 24 – 28 giờ ở 280C, trên máy lắc với tốc độ 200 rpm. Sau khi nuôi cấy đƣợc khoảng 24-28 giờ, dịch huyền phù vi khuẩn đƣợc cấy chuyển sang 50 ml môi trƣờng YEP có bổ sung kanamycin 50 mg/l và nuôi cấy tiếp khoảng 16–18 giờ ở 280C, lắc 200 rpm. Sau khi nuôi cấy khoảng 16-18 giờ, lấy 1ml dịch vi khuẩn để đo OD600 nhằm xác định mật số vi khuẩn (OD600~ 0,5-1,0), dịch huyền phù vi khuẩn đƣợc ly tâm 5000 rpm trong 10 phút. Phần lắng sau khi ly tâm sẽ đƣợc pha loãng (để OD600= 0,6) với môi trƣờng lây nhiễm không có phytagel và lắc với tốc độ 220 rpm ở 280C trong 1giờ (có bổ sung 0,2 mM AS). 3.3.1.4. Đồng nuôi cấy Cơ bản dựa theo qui trình của Chen và ctv., 2000 (WO 00/77230 A1, Syngenta) nhƣng có vài thay đổi. Mẫu trụ hạ diệp đƣợc cắt thành nhiều đoạn dài khoảng 5 mm. Các khúc cắt này đƣợc ngâm trong dung dịch vi khuẩn pha loãng (OD600= 0,6) trong 20 phút (thay vì 5 phút), sau đó đem lắc chung dịch vi khuẩn và mẫu trụ hạ diệp trên máy lắc với tốc độ 35 50 rpm trong 10 phút. Sau đó, dịch vi khuẩn đƣợc loại bỏ, mẫu trụ hạ diệp đƣợc làm khô trên giấy thấm tiệt trùng. Khi các mẫu trụ hạ diệp khô sẽ đƣợc cấy chuyển sang các đĩa Petri chứa môi trƣờng lây nhiễm (thay vì đặt mẫu lên giấy lọc trong đĩa petri chƣa 50 ml môi trƣờng) MSCo (phụ lục 5). Các đĩa mẫu này đƣợc giữ trong tủ nuôi cấy mô thực vật ở 210C, với điều kiện chiếu sáng liên tục trong 3 ngày. 3.3.1.5. Thanh lọc và tái sinh mẫu lây nhiễm Sau 3 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn các mẫu trụ hạ diệp đƣợc rửa bằng nƣớc cất tiệt trùng và kháng sinh carbenicillin để ức chế vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau khi rửa các mẫu trụ hạ diệp đƣợc làm khô bằng giấy thấm tiệt trùng và chuyển sang môi trƣờng phục hồi MSRec (phụ lục 6) có bổ sung thêm 500 mg/l carbenicillin. Các mẫu này sẽ đƣợc nuôi cấy một tuần ở 280C với quang kỳ 16 giờ sáng/ 8 giờ tối. Sau đó, các mẫu đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng thanh lọc MSS (phụ lục 7) chứa glucose và mannose ở nồng độ thăm dò theo sự tăng dần nồng độ mannose (25-35 g/l) và giảm dần nồng độ glucose (10-0 g/l). Qua 3 lần thanh lọc, mỗi lần cách nhau 2 tuần hoặc đến khi nghiệm thức đối chứng cho thấy tất cả các mẫu nuôi cấy đều chết. Bảng 3.1. Nồng độ mannose và glucose qua ba lần thanh lọc Lần thanh lọc Mannose Glucose I II III 25g/l 30g/l 35g/l 10g/l 5g/l 0g/l Chọn các mô kháng phát triển tốt trên môi trƣờng thanh lọc để cấy chuyển sang môi trƣờng phát sinh phôi. Các mô kháng đƣợc tách nhỏ khoảng 3 mm theo từng khối mô sẹo riêng biệt để tạo thành các dòng chuyển nạp gen giả định và cấy chuyển lên môi trƣờng phát sinh phôi DM (phụ lục 8). 36 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi 3.3.2.1. Sự hình thành mô sẹo Tỷ lệ hình thành mô sẹo đƣợc theo dõi ở thời điểm là sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi. Từ các số liệu này cho phép so sánh tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa mẫu đối chứng và giữa các giống. Phần mềm sử dụng trong quá trình phân tích số liệu: Microsoft Excel (Microsoft Office 2003) 3.3.2.2. Kết quả thanh lọc Tỷ lệ sống sót của các mẫu lây nhiễm đƣợc theo dõi qua các lần thanh lọc. Tỷ lệ sống sót đƣợc theo dõi nhằm đánh giá hiệu quả thanh lọc của mannose cũng nhƣ cho phép có kết luận sơ bộ về khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống. Phần mềm sử dụng trong quá trình phân tích số liệu: Microsoft Excel (Microsoft Office 2003). 37 Bảng 3.2. Tóm tắt quy trình chuyển nạp gen vào cây bông vải bằng vi khuẩn Agrobactrieum tumefaciens. Bƣớc Nội dung thực hiện Hình minh họa Thời gian (ngày) 1. Tạo vật liệu Hạt đƣợc khử trùng bằng cồn 70 0 trong 2 phút và dung dịch HgCl2 0,1% (w/v) trong 20 phút (2 lần), rửa lại bằng nƣớc cất tiệt trùng 5 lần, ngâm hạt trong nƣớc cất tiệt trùng qua đêm, bóc bỏ vỏ, cấy hạt lên môi trƣờng nảy mầm MSG. 5-7 2. Lây nhiễm và đồng nuôi cấy Trụ hạ diệp cây 5-7 cắt thành khúc 5 mm, ngâm trong dung dịch vi khuẩn (OD600= 0,6) 20 phút, làm khô mẫu và cấy lên môi trƣờng lây nhiễm MsCo. 2-3 3. Phục hồi Sau 3 ngày đồng nuôi cấy mẫu trụ hạ diệp đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng phục hồi MSRec có bổ sung 500 mg/l carbenicillin. 7 4. Thanh lọc Sau 7 ngày phục hồi, mẫu trụ hạ diệp đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc (MSS) có mannose với nồng độ tăng dần (2,5-3,5%, w/v) và glucose có nồng độ giảm dần (1%- 0%, w/v). Các mẫu đƣợc thanh lọc qua ba lần. 42-56 38 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Sự hình thành mô sẹo 4.1.1. Đặc điểm hình thái mô sẹo Các khúc trụ hạ diệp (khoảng 5 mm) sau 3 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn (hình 4.1) đƣợc rửa với nƣớc và kháng sinh để ức chế vi khuẩn. Sau khi rửa, các mẫu lây nhiễm đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng phục hồi MsRec. Sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi MsRec (sau 10 ngày), các mẫu lây nhiễm và mẫu đối chứng bắt đầu hình thành mô sẹo (hình 4.2). Đặc biệt là một số mẫu lây nhiễm hình thành mô sẹo khá sớm (sau 5 ngày trên môi trƣờng MsRec). Tuy nhiên, các mô sẹo lúc này còn nhỏ và có màu xanh trong. Sau 7 ngày (sau 10 ngày) trên môi trƣờng phục hồi, các mẫu lây nhiễm đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (MSS1). Hình 4.1. Các khúc trụ hạ diệp đồng nuôi cấy với vi khuẩn (A: Giống Coker 312, B: Giống SSR60F) 39 Hình 4.2. Mô sẹo giống Coker 312 sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi (A: đối chứng, B: mẫu lây nhiễm) Trên môi trƣờng thanh lọc lần 1, các mô sẹo của các mẫu lây nhiễm phát triển nhanh làm cho kích thƣớc khối mô sẹo gia tăng nhanh chóng. So với khi trên môi trƣờng phục hồi, các mô sẹo của mẫu lây nhiễm tăng gấp đôi về kích thƣớc sau 14 ngày (sau 24 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc 1 (hình 4.3). Các khối mô sẹo lúc này có màu xanh đậm và cứng. Trong khi đó, mô sẹo của các mẫu đối chứng có kích thƣớc lớn hơn và mô sẹo của đối chứng 1 (đối chứng không thanh lọc) có màu xanh vàng. Sau 14 ngày (sau 24 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 các mô sẹo đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (MSS2). Hình 4.3. Mô sẹo mẫu lây nhiễm 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (giống Coker 312) 40 Trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, các khối mô sẹo bắt đầu chuyển từ màu xanh đậm sang màu xanh vàng và không xốp. So sánh giữa mô sẹo của đối chứng và mô sẹo mẫu lây nhiễm thì thấy rằng các mô sẹo mẫu đối chứng có màu xanh vàng tốt hơn các mô sẹo mẫu lây nhiễm (hình 4.4). Ngoài ra, trên các khối mô sẹo thấy xuất hiện các mô sẹo mới có xu hƣớng rời ra khi chạm kẹp vào. Theo Mishra và ctv. (2003) các mô sẹo này đáp ứng tốt với khả năng tái sinh. Tuy nhiên, sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, màu xanh vàng và mức độ rời của các mô sẹo chƣa rõ ràng. Sau 14 ngày (sau 38 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 các mô sẹo đƣợc tách nhỏ và cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (MSS3). Hình 4.4. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (A: đối chứng, B: mẫu lây nhiễm) Sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (sau 52 ngày), trong 2 thí nghiệm đầu tiên, các mô sẹo đƣợc cấy chuyển trực tiếp lên môi trƣờng thanh lọc lần 3. Khi đó, các mô sẹo của cả mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm có kích thƣớc lớn gấp khoảng 3-4 lần khối mô sẹo trên môi trƣờng thanh lọc lần 1. Các mô sẹo có xu hƣớng rời rạc và có màu xanh vàng rõ ràng hơn so với khi trên môi trƣờng thanh lọc lần 2. Hơn nữa, trên các mô sẹo của các mẫu lây nhiễm có xuất hiện các vùng màu xám bên cạnh các cụm mô sẹo mới màu xanh vàng (hình 4.5 A). Các mô sẹo màu xanh vàng và màu xám này xuất hiện sau 42- 56 ngày, nhƣng Chaudhary và ctv. (2003) đã báo cáo các mô sẹo này xuất hiện sau 30-40 ngày. 41 Trong 7 thí nghiệm sau này, các mô sẹo đƣợc tách nhỏ (khoảng 3 mm) trƣớc khi cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 3. Kết quả là các mô sẹo chuyển màu nâu đen rất nhiều (hình 4.5 B). Đây là các mô sẹo chết. Quan sát trên một số mô sẹo hóa nâu thấy có xuất hiện các mô sẹo mới. Các mô sẹo này có thể là những mô sẹo đƣợc chuyển nạp gen. Hình 4.5. Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 3. A: Mô sẹo không tách nhỏ, B: Mô sẹo tách nhỏ 4.1.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo Trong nuôi cấy mô, sự phát sinh hình thái của mẫu cấy có một ý nghĩa rất quan trọng. Các mẫu cấy có thể phát sinh hình thái theo các hƣớng: hình thành mô sẹo, phát sinh phôi hay tái sinh thành cây. Tỷ lệ hình thành mô sẹo là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong nuôi cấy mô thông thƣờng và chuyển gen. Tỷ lệ hình thành mô sẹo cho chúng ta biết đƣợc khả năng hình thành mô sẹo của mẫu nuôi cấy. Trong thí nghiệm, tỷ lệ hình thành mô sẹo đƣợc theo dõi ở thời điểm sau 7 ngày. 42 Bảng 4.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống Coker 312 (sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu tạo mô sẹo (sau 7 ngày) Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 160 60 158 100 98,75 2 60 130 60 128 100 98,46 3 60 155 60 154 100 99,35 4 60 120 60 120 100 100 Trung bình 100 99,14 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Bảng 4.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống SSR60F (sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu tạo mô sẹo (sau 7 ngày) Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 185 59 169 98,33 91,35 2 60 176 58 160 96,67 90,91 3 60 190 60 176 100 92,63 4 60 190 59 176 98,33 92,63 5 60 200 57 180 97,67 90,00 Trung bình 96,67 91,50 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các giống có sự khác nhau. Sau 7 ngày (sau 10 ngày) trên môi trƣờng phục hồi, mẫu lây nhiễm có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất ở giống Coker 312 đạt 99,14%, giống SSR60F đạt 91,50%. Các mẫu lây nhiễm ở giống Coker 312 hình thành mô sẹo ngay khi còn trên môi trƣờng phục hồi. Trong khi đó, các mẫu lây nhiễm của giống SSR60F hình thành mô sẹo chậm hơn (hình 4.6). 43 Hình 4.6. Mô sẹo trên môi trƣờng phục hồi. A: Mô sẹo mẫu đối chứng giống SSR60F, B: Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống SSR60F, C: Mô sẹo mẫu đối chứng giống Coker 312, D: Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống Coker 312 Tất cả các mẫu đối chứng của giống Coker 312 đều hình thành mô sẹo ngay khi còn ở trên môi trƣờng phục hồi và đạt tỷ lệ 100%. Trong khi đó mẫu đối chứng của giống SSR60F hình thành mô sẹo chậm hơn và chỉ đạt tỷ lệ 96,67%. Các mẫu đối chứng hình thành mô sẹo mạnh hơn các mẫu lây nhiễm. Điều này có thể giải thích là do mẫu lây nhiễm bị tổn thƣơng do các tác nhân nhƣ: vật lý (thao tác khi cấy, va chạm giữa các mẫu, rửa mẫu…), hóa học (nƣớc, kháng sinh, môi trƣờng…). Tuy nhiên, sau khi chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần một tất cả các mẫu đều hình thành mô sẹo. Những mẫu chƣa tạo mô sẹo trên môi trƣờng phục hồi đều đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 1 và sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 1, tất cả những mẫu này đều hình thành mô sẹo. Kết quả bảng 4.1 và bảng 4.2 cho thấy hai giống đáp ứng hình thành mô sẹo tốt. Trong khi đó Chaudhary và ctv. (2003) báo cáo một tỷ lệ hình thành mô sẹo thấp hơn (78% của mẫu lây nhiễm sau 10-15 ngày). Tỷ lệ hình thành mô sẹo khác nhau này có thể là do Chaudhary và ctv. (2003) đã chuyển các mẫu lây nhiễm lên môi trƣờng thanh lọc (tác nhân thanh lọc là kanamycin) ngay. Hơn nữa, giống bông vải sử dụng cũng khác nhau (giống Coker 310). Tuy nhiên, tỷ lệ hình thành mô sẹo ở mẫu đối 44 chứng lại giống nhau (100%). Điều này có nghĩa là sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo của mẫu lây nhiễm là do thời điểm quan sát khác nhau và việc mẫu ngay lên môi trƣờng thanh lọc có ảnh hƣởng tới tỷ lệ hình thành mô sẹo. Theo Firoozabady (1987) và Rajasekaran (1996) khả năng tái sinh của cây bông còn phụ thuộc rất lớn vào kiểu gen và mẫu nuôi cấy. Điều này cho thấy rằng sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các giống bông vải ở trên một phần cũng do ảnh hƣởng của kiểu gen. Ngoài ra không loại trừ khả năng sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các giống còn do thác tác trong thí nghiệm. Các thao tác giữa các lần thí nghiệm về mặt chi tiết có thể khác nhau. Ví dụ nhƣ trong thao tác rửa vi khuẩn chỉ cần để các mẫu lây nhiễm lâu hơn một chút trong nƣớc là cũng có thể làm cho mẫu thâm đen và do đó làm kéo dài thời gian hình thành mô sẹo. 4.2. Kết quả thanh lọc Trong chuyển nạp gen, thanh lọc mẫu là điều rất quan trọng. Thanh lọc các mẫu giúp loại bỏ bớt các mẫu không đƣợc chuyển nạp gen. Các mẫu không chuyển nạp gen đƣợc loại bỏ bằng cách đặt các mẫu trên môi trƣờng chứa tác nhân thanh lọc. Những mẫu không chuyển nạp gen sẽ không phát triển hoặc phát triển chậm trên môi trƣờng có tác nhân thanh lọc. Trong khi đó, các mẫu đƣợc chuyển nạp lại sống sót và phát triển tốt trên môi trƣờng có tác nhân thanh lọc. Kết quả thanh lọc đƣợc đánh giá dựa trên số mẫu sống sót trên môi trƣờng thanh lọc. 4.2.1. Thanh lọc lần 1 Sau bảy ngày trên môi trƣờng phục hồi, các mẫu đƣợc chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (MSS1). Môi trƣờng MSS1 có chứa 1% glucose và 2,5% mannose. 45 Bảng 4.3. Kết quả thanh lọc lần 1 giống Coker 312 (sau 14 ngày trên MSS1) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 160 60 157 100 98,13 2 60 130 60 126 100 96,92 3 60 155 60 153 100 98,71 4 60 120 60 115 100 95,83 Trung bình 100 97,40 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Bảng 4.4. Kết quả thanh lọc lần 1 giống SSR60F (sau 14 ngày trên MSS1). Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 185 60 180 100 97,29 2 60 176 60 173 100 98,29 3 60 190 60 185 100 97,36 4 60 190 60 188 100 98,94 5 60 200 60 197 100 98,50 Trung bình 100 98,08 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Nhận xét: - Sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1, các mô sẹo hình thành tốt. Giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm không có sự khác biệt (hình 4.7). Nguyên nhân chính là do trong môi trƣờng MSS1 có chứa 1% (w/v) đƣờng glucose nên các mẫu cả đối chứng và lây nhiễm đều sử dụng dạng đƣờng này trƣớc để phát triển. - Một số mẫu chết trong lần thanh lọc thứ nhất có mầu nâu đen và gần nhƣ không hình thành mô sẹo. Các mẫu này chết là do các tác nhân lý hóa học. - Sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 MSS1, mô sẹo của các mẫu lây nhiễm có kích thƣớc nhỏ hơn so với mô sẹo của các mẫu đối chứng. 46 - Tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm của mỗi giống lần lƣợt là: - Giống Coker312: 100% và 97,40%. - Giống SSR60F: 100% và 98,08%. Hình 4.7. Mô sẹo giống Coker 312 sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm. 4.2.2. Thanh lọc lần 2 Sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1, các mẫu đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (MSS2). Môi trƣờng MSS2 là môi trƣờng thanh lọc lần 2 có chứa 0,5% glucose và 3% mannose. Bảng 4.5. Kết quả thanh lọc lần 2 giống Coker 312 (sau 14 ngày trên MSS2) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 157 60 150 100 98,12 2 60 126 60 125 100 96,92 3 60 153 60 147 100 98,71 4 60 119 60 117 100 99,17 Trung bình 100 97,28 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) 47 Bảng 4.6. Kết quả thanh lọc lần 2 các mẫu lây nhiễm giống SSR60F (sau 14 ngày trên MSS2). Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 180 60 179 100 99,44 2 60 173 60 172 100 99,42 3 60 185 60 180 100 97,29 4 60 188 60 183 100 97,34 5 60 197 60 193 100 97,97 Trung bình 100 98,29 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Nhận xét: - Sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (MSS2), các mô sẹo ra tăng kích thƣớc rất nhanh và theo quan sát thì kích thƣớc khối mô sẹo ra tăng gấp đôi so với kích thƣớc khi mới đặt lên trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (hình 4.8 A, B). - Giữa mô sẹo mẫu đối chứng và mô sẹo mẫu lây nhiễm vẫn chƣa có sự khác biệt rõ ràng (hình 4.8 C, D). Các khối mô sẹo của mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm trên môi trƣờng có tác nhân thanh lọc phát triển nhƣ nhau. - Trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, các mẫu đối chứng chƣa có dấu hiệu chậm phát triển lại, điều này có thể giải thích do trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 có 0,5% (w/v) glucose nên các mẫu đối chứng vẫn phát triển đƣợc. - Tỷ lệ mô sẹo sống sót giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm của mỗi giống lần lƣợt: - Giống Coker312: 100% và 97,28%. - Giống SSR60F: 100% và 98,295. - So sánh tỷ lệ sống sót của mô sẹo mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm thì thấy rằng tỷ lệ sống sót của mô sẹo mẫu đối chứng cao hơn mô sẹo mẫu lây nhiễm. Điều này có thể do tác nhân thanh lọc chƣa có ảnh hƣởng nhiều tới mô sẹo. Hơn nữa, các mẫu lây nhiễm phải chịu các tổn thƣơng trƣớc khi cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc. 48 Hình 4.8. Các khối mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng thanh lọc. A: trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, B: trên môi trƣờng thanh lọc lần 1, C, D: mẫu lây nhiễm và mẫu đối chứng 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 2. 4.2.3. Thanh lọc lần 3 Trên môi trƣờng thanh lọc MSS3, trong 2 thí nghiệm đầu tiên, các khối mô sẹo không đƣợc tách nhỏ, sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS3 thì thấy rằng: - Ở các khối mô sẹo lây nhiễm xuất hiện hai loại mô sẹo: một có màu trắng xám và một có màu xanh vàng mọc ra ngay bên cạnh các mô sẹo màu trắng xám. Các mô sẹo màu trắng xám có thể do hai nguồn gốc: một là từ các tế bào già chết và một từ các tế bào không chuyển nạp gen chết. Các khối mô sẹo của mẫu lây nhiễm có nhiều mô sẹo màu trắng xám hơn các khối mô sẹo của mẫu đối chứng. - Không có sự khác biệt rõ ràng giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm về mặt hình thái (hình 4.9 A, B). Nguyên nhân có thể do các khối mô sẹo không đƣợc tách nhỏ trƣớc khi chuyển lên môi trƣờng MSS3 nên trong các khối mô sẹo của mẫu đối chứng có thể có sự tích tụ đƣờng glucose. Tuy nhiên, sau 28 ngày trên môi trƣờng 49 MSS3, trên mẫu lây nhiễm có một số khối mô sẹo chuyển sang màu nâu xám và sậm màu dần, mẫu đối chứng cũng chuyển màu tƣơng tự (hình 4.10 A, B). Các khối mô sẹo này đƣợc cho kết luận đã chết. Ở mẫu đối chứng cũng có các khối mô sẹo tƣơng tự. Nhƣ vậy, có thể thấy rằng thanh lọc lần 3 chỉ có hiệu quả khi các mẫu đƣợc nuôi cấy ít nhất khoảng 28 ngày trên môi trƣờng MSS3. Tuy vậy, nồng độ mannose vẫn đƣợc đề nghị tăng lên ở các lần thanh lọc. Nồng độ mannose có thể bắt đầu là 3% (w/v) và thanh lọc lần 3 sẽ là 4% (w/v). Bởi vì hiệu quả thanh lọc chƣa cao. Hơn nữa, trƣớc khi đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (MSS3) các khối mô sẹo nên đƣợc tách nhỏ để rút ngắn thời gian thanh lọc. Hình 4.9. Mô sẹo giống Coker 312 (không tách nhỏ, sau 14 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (A: mẫu lây nhiễm, B: mẫu đối chứng, C, D: khối mô sẹo có các tế bào hóa nâu và các cụm mô sẹo mới) 50 Hình 4.10. Mô sẹo giống Coker 312 sau 28 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 3. A: mẫu lây nhiễm, B: mẫu đối chứng chết. Trong 7 thí nghiệm sau , sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc MSS2, các khối mô sẹo đƣợc tách nhỏ (khoảng 3 mm) và chuyển lên môi trƣờng MSS3 có 3,5% mannose và 0% glucose. Kết quả thanh lọc lần 3 các mẫu lây nhiễm (sau 14 ngày trên MSS3) đƣợc tóm tắt ở bảng 4.7 và bảng 4.8. Kết quả cho thấy, hiệu quả chọn lọc mannose có biểu hiện rõ. Các cụm mô sẹo đều chuyển sang màu nâu đen (cả đối chứng và mẫu lây nhiễm). Các cụm mô sẹo này không phát triển gia tăng kích thƣớc và chết (hình 4.11 A và B). Tuy nhiên một số mô sẹo sau khi hoá đen lại phát triển các mô sẹo mới ở các mẫu chuyển nạp gen. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F. Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc. 51 Bảng 4.7. Kết quả thanh lọc lần 3 giống Coker 312 (sau 14 ngày trên MSS3) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 150 0 1 0 0,67 2 60 125 0 4 0 3,20 3 60 147 0 2 0 1,36 4 60 117 0 2 0 1,70 Trung bình 0 1,73 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Bảng 4.8. Kết quả thanh lọc lần 3 giống SSR60F (sau 14 ngày trên MSS3). Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 179 0 5 0 2,79 2 60 172 0 10 0 5,81 3 60 180 0 6 0 3,33 4 60 183 0 7 0 3,83 5 60 193 0 5 0 2,59 Trung bình 0 3,67 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm). Hình 4.11. Mô sẹo giống Coker 312 (tách nhỏ) sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (A: mẫu lây nhiễm, B: mẫu đối chứng) 52 Hiệu quả thanh lọc cao giúp giảm bớt khó khăn trong việc xác định mô sẹo đƣợc chuyển nạp gen. Kết quả thanh lọc ở bảng 4.7 và bảng 4.8 cho thấy tỉ lệ mẫu sống sót sau khi đƣợc chuyển nạp gen ở bông vải là thấp. Hiện nay, trong chuyển nạp gen vào cây bông vải, các tác nhân thanh lọc đƣợc sử dụng chủ yếu là các kháng sinh nhƣ: kanamycin, hygromycin…và các tác giả này cũng báo cáo là hiệu quả chuyển nạp gen thấp (Firoozabady và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996). Điều quan trọng ở đây đó là ý nghĩa của việc thiết kế các bƣớc thanh lọc và tác nhân đƣợc sử dụng. Các bƣớc thanh lọc nhƣ trên giúp cho các mẫu chuyển nạp gen thích nghi từ từ với sự thay đổi nồng độ đƣờng. Sự có mặt của đƣờng glucose sẽ giúp cho tất cả các mẫu đều phát triển, điều này giúp cho chúng ta tránh bị mất những mẫu chuyển gen. Một số tác giả dùng hệ thống thanh lọc với chất kháng sinh nhƣ: kanamycin, hygromicin…, khi thanh lọc đặt ngay mẫu lây nhiễm lên môi trƣờng có nồng độ tác nhân thanh lọc cao sau đó mới giảm dần nồng độ tác nhân thanh lọc. Ví dụ nhƣ: trong nghiên cứu của mình Chaudhary và ctv. (2003) sử dụng hệ thống thanh lọc qua 4 lần thanh lọc với nồng độ Kanmycin lần lƣợt là 50mg/l, 50mg/l, 25mg/l và 0mg/l (Chaudhary và ctv., 2003). Hay nhƣ Haq (2004) thanh lọc mẫu chuyển gen qua 4 lần thanh lọc với nồng độ kanamycin lần lƣợt là 50mg/l, 25mg/l, 25mg/l và 25mg/l (Haq, 2004). Điều này có thể làm cho chúng ta mất đi một số mẫu chuyển nạp gen vì các mẫu chuyển nạp gen chƣa kịp thích nghi, gen đƣợc chuyển chƣa hoạt động ổn định do đó chƣa giúp cho mẫu chuyển gen có thể sống sót đƣợc. Trong khi đó, nếu áp dụng các bƣớc thanh lọc nhƣ trên sẽ giúp làm giảm việc mất đi các mẫu chuyển nạp gen vì với cách thiết kế nhƣ trên tất cả các mẫu đều có điều kiện phát triển nhƣ nhau nhƣng những mẫu đƣợc chuyển gen sẽ phát triển mạnh hơn và các mẫu sẽ đƣợc thanh lọc dần qua các lần thanh lọc tiếp theo. Hơn nữa, sử dụng đƣờng mannose để thanh lọc các mẫu sẽ giúp làm giảm những lo ngại về tính an toàn của cây chuyển nạp gen khi sử dụng kháng sinh trong thanh lọc. 53 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Với kết quả thu đƣợc về khả năng đáp ứng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của hai giống bông vải Coker 312 và SSR60F, trong đó đã tập trung nghiên cứu về hệ thống thanh lọc bằng đƣờng mannose ở bông vải sau khi đƣợc biến nạp, chúng tôi có những nhận xét sau: - Sau khi lây nhiễm trụ hạ diệp bằng bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (vắc tơ pManCa mang gen pmi và gen gus), các mô sẹo của hai giống bông phát triển bình thƣờng qua hai lần thanh lọc trong môi trƣờng có chứa mannose. Ở lần thanh lọc thứ 3, hiệu quả chọn lọc bằng mannose biểu hiện rõ. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F. - Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc và việc chọn mẫu sống sót do chuyển nạp gen thành công đƣợc chính xác. - Tỷ lệ sống sót của mẫu đƣợc biến nạp gen qua thanh lọc bằng mannose ở bông vải là thấp vì vậy cần tăng số lƣợng mẫu biến nạp. 5.2. Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu để chuẩn hoá nồng độ mannose ở các lần thanh lọc, kích thƣớc mô sẹo, v.v. để nâng cao hiệu quả chọn lọc bằng mannose. - Tiếp tục thực hiện các bƣớc tiếp theo để tạo ra cây biến đổi gen. - Chú ý giống bông vải SSR60F để sử dụng trong chƣơng trình tạo giống bông biến đổi gen ở Việt Nam. 54 55 CHƢƠNG 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Trần Bình, 2001. Thực trạng chuyển nạp gen ở Việt Nam. Hội Nghị Nhận Thức Về Công Nghệ Sinh Học, Hà Nội, 6-8 tháng 7 năm 2001. 2. Bộ GD và ĐT, Trƣờng ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội, bộ môn Cây Công Nghiệp,1996. Cây Công Nghiệp. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 3. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2003. Mục tiêu và trƣơng trình phát triển năm 2003 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn. Tạp chí Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, số 1/2003: 5-8. 4. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000.Di truyền phân tử-Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng (tập II:Chuyển nạp gen ). Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp. 5. Phạm Hoàng Hộ, 1997. Cây cỏ Việt Nam. Tái bản lần thứ ba. Nhà Xuất Bản Trẻ. Tp. Hồ Chí Minh. 6. Lê Kim Hỷ, 2003. Phát Triển Cây Bông Vải Ở Các Tỉnh Duyên Hải Nam Trung Bộ. Hội nghị về phát triển cây bông vải ở Duyên Hải Nam Trung Bộ, tháng 5/2003. 7. Lê Quang Quyến, 2004. Phát Triển Cây Bông Và Nghề Trồng Bông Ở Việt Nam. Viện Nghiên Cứu Cây bông và Cây có sợi. 8. Trƣơng Thu Thủy, Nguyễn Hữu Cƣờng, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình, Trịnh Minh Hợp, Lê Quang Quyến, 2003. Nghiên cứu quy trình tái sinh cây bông (Gossypiym hirsutum L.) từ phôi Soma. Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học toàn quốc, Hà Nội. 831 – 836. 56 TIẾNG NƢỚC NGOÀI 9. Binns A.N. and Costantino P., 1998. The Agrobacterium oncogens, pp: 251-266. In: The Rhizobiaceae: molecular biology of model plant-associated bacteria, (Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P.J. J. - editors). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 10. Brubaker C.L., Brown A.H.D., Stewart J.M., Kilby M.J. and Grace J.P., 1999. Production of fertile hybrid germplasm with diploid Australian Gossypium species for cotton improvement. Euphytica 108: 199-210. 11. Chauhary B., Kumar S., Prasad V.S.K., Oinam G.S., Burma P.K. and Pental D., 2003. Slow desiccation to high-frequency shoot recovery from transformed somatic embryos of cotton (Gossypium hirsutum L. cv. Coker 310). Plant Cell Reports 21: 955 – 960. 12. Chen Z.X., Liewellyn D.J., Fan Y.L., Li S.J., Guo S.D., Jiao G.L. and Zhao J.X., 1994. The 2,4-D resistant transgenic cotton plants produce by Agrobacterium mediated gene transfer. Scientina Agriculture Sinica 27(2): 31 – 37. 13. Chen Z.X, Zhi X.J. and Xian S.J., 2000. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of cotton using petiole explants. US Patent No.: WO 00/77230 A1. 14. Chilton M.D., Currier T.C., Farrand S.K., Bendich A.J., Gordon M.P. and Nestor E.W., 1974. Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumors. Proceeding of the National Academy of Sciences. USA 71: 3672- 3676. 15. Chlan Y.L., Lin J., Cary J.W. and Cleveland T.E., 1995. A producer for biolistic transformation and regeneration of transgenic cotton from meristematic tissues. Plant Molecular Biology Reporter 13: 31-37. 16. Deacon J., Robertson A. and Isbister A., 2005. The Microbial World: Biology and Control of Crown Gall (Agrobacterium tumefaciens). Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh. 17. Deng W., Chen L., Wood D.W., Metcalfe T., Liang X., Gordon M.P., Comai L. and Nester E.W., 1998. Agrobacterium VirD2 protein interacts with plant host cyclophilins. Proceeding of the National Academy of Sciences 95: 7040-7045. 57 18. Dessaux Y., Petit A., Farrand S.K. and Murphy P.J., 1998. Opines and opine-like molecules involved in plant-Rhizobiaceae interactions. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 19. Finer J.J. and Smith R.H., 1984. Initiation of callus and somatic embryos from explants of mature cotton (Gossypium klotzschianum Anderss). Plant cell reports 3: 41- 43. 20. Finer J.J. and McMullen M.D., 1990. Transformation of cotton (Gossypium hirsutumL.) via particle bombardment. Plant cell reports 8 (10): 586-589. 21. Firoozabady E., DeBoer D.L., Merlo D.J., Halls E.J., Anderson I.N., Raska K.A. and Muray E.E., 1987. Transformation of cotton, Gossypium hirsutum L. by Agrobacterium tumefaciens and regeneration of transgenic plants. Plant Molecular Bology 10: 105-116. 22. Gelvin S.B., 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Bology 51: 223-256. 23. Gelvin S.B., 2003. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67: 16-37 24. Gould J.H. and Cedeno M.M., 1998. Adaption of shoot apex culture to Agrbacterium- mediated transformation. Plant Molecular Bology 16: 1-10. 25. Hansen G. and Chilton M.D., 1999. Lessons in gen transfer to plants by a gifted microbe. Current Topics Microbiology Immunology 240: 21-57. 26. Hoa T.T.C. and Bong B.B., 2003. Effcient Agrobacterium-mediated transformation of indica rice (Oryza sativa) using mannose selection system. Viet Nam Journal of Agriculture & Rural Development 1+2: 60-63. 27. Hoekema L. 1984. A binary vector strategy base on separation of Vir- and T- region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303: 179-180. 28. Haq I.U., 2004. Agrobacterium-Mediated transformation of cotton (Gossypium hirsutm L.) via vacuum infiltration. Plant Molecular Biology Reporter 22: 279- 288. 58 29. ISAAA, 2002. Global Review of Commercialized Transgenic Crops: 2001 Feature: Bt Cotton. 26b.pdf. 30. ISAAA, 2004. Preview: Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2004. Summary (English).pdf. 31. Jiang B.G., 2004. Optimization of Agrobacterium mediated cotton transformation using shoot apex explants and quantitative trait loci analysis of yeild and yeild component traits in Upland Cotton (Gossypium hirsutm L.). PhD. Dissertation, Louisiana State University, USA. 32. Jin S., Prusti R.K., Roitsch T., Ankenbauer R.G. and Nester E.W., 1990. Phosphorylation of the VirG protein of Agrobacterium tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein: Essential role in biological activity of VirG. Journal of Bacteriology 172: 4945- 4950. 33. Korber H., Strizhov N., Staiger D., Feldwish J., Olsson O., Sandberg. G., Palme K., Schell J. and Koncz C., 1991. T-DNA gene 5 of Agrobacterium modulates auxin response by autoregulated synthesis of a growth hormone an tagonist in plants. EMBO Journal 10: 3983-3991. 34. Kumria S., Sunnichan V.G, Das D.K., Gupta S.K., Reddy V.S., Bhatnagar R.K. and Leelavathi S., 2003. High-frequency somatic embryo production and maturation into normal plants in cotton (Gossypium hirsutum L.) through metabolic stress. Plant Cell Reports 21(7): 635-639. 35. Lai E.M. and Kado C.I., 1998. Processed VirB2 Is the Major Subunit of the Promiscuous Pilus of Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology 180: 2711-2717. 36. McCabe D.E. and Martinell B.J., 1993. Transformation of lite cotton cultivars via particle bombardment of meristems. Bio/Technology 11: 596-598. 37. Miranda A., Janssen G., Hodges L., Peralta E.G. and Ream W., 1992. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. Journal of Bacteriology 174: 2288-2297. 59 38. Mishra R., Wang H.Y., Yadav N.R. and Wilkins T.A., 2003. Development of a highly regenrable elite Acala cotton (Gossypium hirsutumcv. Maxxa)–a step towards genotype-independent regeneration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 73: 21–35. 39. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia platarum 15: 473-493 40. Nobre J., Keith J.D. and Dunwell J.M., 2001. Morphogenesis and regeneration from stomatal guard cell complexes of cotton (Gossypium hirsutum L.). Plant Cell Reports 20: 8-15. 41. Ophel K. and Kerr A., 1990. Agrobacterium vitis sp. nov. for strains of Agrobacterium biovar 3 from grapevines. International Journal of Systematic Bacteriology 40: 236-241. 42. Perlak F.J., Deaton R.W., Armstrong T.A., Fruchs R.L, Sims S.R., Grennplate J.T. and Fischhoff D.A., 1990. Insect resistant cotton plants. Bio/Technology 8: 934- 943. 43. Perlak F. J., Oppenhuizen M., Gustafson K., Voth R., Sivasupramaniam S., Heering D., Carey B., Ihrig R.A. and Roberts J.K., 2001. Development and commercial use of Bollgard ® cotton in the USA- early promises versus today’s reality. The Plant Journal 27 (6): 489-501. 44. Rajasekaran K., Hudspeth R.I., Cary J.W., Anderson D.M. and Cleveland D.M., 2000. High-frequency stable transformation of cotton (Gossypium hirsutumL.) by particle bombardment of embryogenic cell suspension cultures. Plant Cell Reports 19: 539- 545. 45. Rajasekaran K., 1996. Regenration of plants from cryopreserved embrygenic cell suspension and callus cultures of cotton (Gossypium hirsutumL.). Plant Cell Reports 3: 859-864. 46. Reichert N.A., Lim T.K. and Young M.M., 2002. Method for transformation of cotton and organogenic regeneration. US Patent No: US 6,479,287 B1. 47. de la Riva G.A., González-Cabrera J., Vázquez-Padrón R. and Ayra-Pardo C., 1998. The Agrobacterium tumefaciens gene transfer to plant cell. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458. 60 48. Sakhanokho H.F., Zipf A., Rajasekaran K., Saha S. and Shama G.C., 2001. Induction of highly embryogenic calli and plant regenration in Upland (Gossypium hirsutumL.) and Pima (Gossypium barbadense L.) cottons. Crop Science 41: 1235- 1240. 49. Satyavathi V.V., Prasad V., Laskmi B.G. and Sita G.L., 2002. High efficiency tranformation protocol for three Indian cotton varieties via Agrobacterium tumefaciens. Plant Science 162: 215-223. 50. Stachel S.E., Timmerman B. and Zambryski P., 1987. Activation of Agrobacterium tumefaciens vir gene expression genrates multiple single-stranded T-strand molecules from the pTiA6 T-region: requirement for 5' virD gene products. EMBO Journal 6: 857-863. 51. Sunilkumar G. and Rathore K.S., 2001. Transgenic cotton: factors influencing Agrobaterium-mediated transformation and regeneration. Molecular Breeding 8: 37- 52. 52. Tinland B., Fournier P., Heckel T. and Otten L., 1992. Expression of a chimeric heat-shock-inducible Agrobacterium 6b oncogene in Nicotiana rustica. Plant Molecular Biology 18: 921- 930. 53. Umbeck P.F., Johnson G., Barton K. and Swain S., 1987. Genetically transformed cotton (Gossypium hirsutumL.). Plant Biotechnology 5:263 – 266. 54. Valentine L., 2003. Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The David and Goliath of Modern Genetics. Plant Physiology 133: 948-955. 55. Ziemienowicz A., 2001. Odyssey of Agrobacterium T-DNA. Acta biochimica polonica 48: 623.635. 56. Zupan J. R., Citovsky V. and Zambryski P., 1996. Agrobacterium VirE2 protein mediates nuclear uptake of single-stranded DNA in plant cells. Proceeding of the National Academy of Sciences 93: 2392-2397. 57. Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B., Hooykaas P.J.J, Farrand S.K. and Winans S. C., 2000. The Bases of Crown Gall Tumorigensis. Journal of Bacteriology 182: 3885- 3895. 58. Winans S.C., Allenza P., Stachel S.E., McBride K.E. and Nester E.W., 1987. Characterization of the virE operon of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiA6. Nucleic Acids Research 15: 825.837. 61 CÁC TRANG WEB THAM KHẢO: 59. 62 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Thành phần môi trƣờng MS (Murashige và Skoog, 1962) Thành phần Nộng độ cuối Nồng độ dung dịch mẹ (mg/l) (mg/l) Khoáng đa lƣợng 20X NH4NO3 1650 33000 KNO3 1900 38000 CaCl2.2H2O 440 8800 MgSO4.7H2O 370 7400 KH2PO4 170 3400 Fe-EDTA 100X FeSO4.7H2O 27,85 2780 Na2-EDTA.2H2O 37,25 3725 Khoáng vi lƣợng 100X MnSO4.4H2O 22,300 2230,0 ZnSO4.7H2O 8,600 860,0 H3PO4 6,200 620,0 KI 0,830 83,0 Na2MoO4.2H2O 0,250 25,0 CuSO4.7H2O 0,025 2,5 CoCl2.6 H2O 0,025 2,5 Các vitamin MS 100X Glycin 2,0 100 Acit nicotinic 0,5 50 Pyridoxin. HCl 0,5 50 Thiamin. HCl 1,0 20 63 Phụ lục 2. Thành phần môi trƣờng YEP (An và ctv, 1988) Bacto pepton 10 g/l Chất trích nấm men 10 g/l NaCl 5 g/l Bacto Agar 15 g/l PH 7,0 (bằng NaOH) Phụ lục 3. Thành phần môi trƣờng AB ( Chilton và ctv, 1974 ) Thành phần nồng độ cuối (g/l ) Dung dịch đệm AB (hấp tiệt trùng riêng) K2HPO4.3H2O 3,0 NaH2PO4 1,0 Khoáng AB (hấp tiệt trùng riêng) NH4Cl 1,000 MgSO4.7H2O 0,300 KCl 0,150 CaCl2 0,010 FeSO4.7H2O 0,0025 Môi trƣờng ABG Glucoz 5,0 g Agar 15,0 g Nƣớc cất 900,0 ml Khoáng AB 20X 50,0ml Đệm AB 20X 50,0 ml Phụ lục 4. Thành phần môi trƣờng MSG (Murashige và Skoog, 1962) ½ MS salts (Duchefa, M0221) 2,15 g/l MgCl2. 6H2O 0,9 g/l Glucose 10 g/l Phytagel (Sigma, P8169) 2 g/l PH: 7,0 (Bằng KOH ) 64 Phụ lục 5. Thành phần môi trƣờng lây nhiễm MsCo MS salts và B5 vitamin (M 0231) 4,4 g/l Glucoz (Art-Nr. 6780.2, Roth, Đức) 30 g/l 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid) 0,05 mg/l Kinetin 0,1 mg/l MgCl2.6H2O 0,9 g/l Phytagel (Sigma, P8169) 2 g/l Acetosyringone 200 μM PH: 6,5 (Bằng KOH) Phụ lục 6. Thành phần môi trƣờng phục hồi MsRe Môi trƣờng Ms-Co Carbenicillin 500 mg/l PH: 6,5 (bằng KOH 0,1N) Phụ lục 7. Thành phần môi trƣờng thanh lọc lần MSS MS salts và B5 vitamin (M 0231) 4,4 g/l Glucoz (Art-Nr. 6780.2, Roth, Đức) (10; 5; 0) g/l Mannose (25; 30; 35) g/l 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid) 0,05 mg/l Kinetin 0,1 mg/l MgCl2.6H2O 0,9 g/l Phytagel (Sigma, P8169) 2 g/l Carbenicillin 200 μM pH: 6,5 (bằng KOH) Phụ lục 8. Thành phần môi trƣờng phát sinh phôi DM MS salts và B5 vitamin (M 0231) 4,4 g/l KNO3 1,9 g/l Glucose 30 g/l MgCl2.6H2O 0,9 g/l Phytagel (Sigma, P8169) 2 g/l pH: 6,5 (bằng KOH) 65 Phụ lục 10: DỤNG CỤ DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM - Keo thủy tinh - Nồi hấp tiệt trùng autoclave: Microm (Model No. SA- 252M) - Tủ nuôi cấy: VÖtsch VB 0714 và Sanyo chamber MLR-350H - Cân điện tử: chyo (MJ- 500) và AA-200 - Microwave: Sanyo EM-G4753 - Ống đong (10, 25, 100, 250, 500, 1000 ml) - Đĩa Petri Ф 60 và Ф 90 - Bình tam giác (10, 100, 250, 500 ml) - Ống đong (10, 25, 100, 250, 500, 1000 ml) - Ống ly tâm: Cell StarR (Cat.No. 227261) - Máy đo pH: Themo orion (Model 420) - Kính hiển vi: Olympus TL3 - Máy lắc (200 rpm): Orbital incubator S150 - Tủ cấy: Holten LaminAir (model 1.8) và Microflow laminar (ABS1200) - Tủ lạnh (0, 4, -200C) - Máy ly tâm: Hermle Z323 - Máy đo OD600: Bio-Rad Smartspec TM 3000 - Tủ sấy - Kéo, kẹp, dao - Pipet (6, 50, 200, 1000 µl) - Máy khuấy từ: Bioblock cimarec 1