Khóa luận Nghiên cứu khả năng lan truyền vi rút từ rệp sáp (Ferrisia virgata) đến cây tiêu (Piper nigium L.)

p nệm đó. Toàn bộ chu kỳ sống khoảng 30 ngày. Rệp sáp thường tập trung gây hại ở đầu cành, lá và quả. Rệp hút nhựa cây làm lá và quả biến vàng, héo và rụng. Trong quá trình gây hại, loài này cũng tiết ra mật ngọt thu hút nấm bồ hóng làm giảm khả năng quang hợp của cây nên cây sinh trưởng kém. 2.3.4 Thiên địch Trong điều kiện tự nhiên, rệp sáp bị nhiều thiên địch tấn công, nhất là các loài ong kí sinh thuộc giống Anagyrus. 2.3.5 Phòng trị Tại Ấn Độ, bọ rùa Cryptolaenus montrouzieri đã được du nhập từ Úc, nuôi nhân giống trong phòng thí nghiệm và thả trên các đồn điền cà phê để phòng trị rệp sáp trên cà phê. Khi mật độ cao, có thể sử dụng các biện pháp phòng trị hoá học giống như đối với các loại rệp sáp trên nhãn. 14 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện: từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007 Địa điểm thực hiện: Trại Thực Nghiệm khoa Nông Học, Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm – Trường Đại Học Nông Lâm – TP.HCM. 3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.2.1 Trại thực nghiệm Nhà lưới, chậu trồng tiêu (nhỏ, vừa, to), bình tưới nước, bình xịt rệp, dao lam, kéo, thước đo, nhiệt kế, ẩm độ kế. 3.2.2 Trung tâm phân tích thí nghiệm Máy móc, thiết bị: máy PCR, máy li tâm, máy vortex, máy điện di, máy chụp ảnh DNA, cân điện tử, lò viba, tủ mát (4oC), tủ lạnh (-20oC và -70oC), tủ sấy, pipet, eppendorf, bồn ủ nhiệt, bồn điện di, tủ cấy. Dụng cụ: cối, chày nghiền mẫu , dao lam, eppendorf, micropipette, đầu típ, ống đong hộp đựng eppendorf, khay đổ gel điện di, bồn chứa ethium bromide. 3.3 Vật liệu thí nghiệm Đối tượng được dùng để thí nghiệm là cây tiêu Vĩnh Linh. 3.4 Phƣơng pháp thí nghiệm 3.4.1 Giâm cành tiêu Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ tưới nước đến khả năng sống sót, sinh trưởng và phát triển của cành giâm. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức (T1, T2, T3) được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. 15 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm giâm cành tiêu sạch bệnh của các nghiệm thức ở các chế độ tƣới khác nhau Cách tiến hành thí nghiệm Cắt các cành tược (cành vượt) mập, các đốt mọc đều, có chiều dài khoảng 35 – 40 cm từ các cây tiêu nuôi cấy mô sạch bệnh trồng trong vườn ươm thành các đoạn nhỏ sao cho mỗi đoạn có 2 mắt là được. Tiếp đó ngâm các đoạn cắt này vào trong dung dịch NAA 20 ppm khoảng 15 – 20 phút, sau cùng lấy cành ra giâm vào các chậu đất đã được làm sẵn. Đất giâm cành là đất sạch trộn với cát theo tỉ lệ 1:1. Sau khi chuẩn bị đất giâm cành xong thì mới cắt cành tiêu để giâm. Giâm vào lúc nắng nhẹ, lúc sáng sớm hoặc chiều mát. Đặt cành tiêu đã xử lí NAA xuống khoảng 3 cm, dùng tay ấn mạnh để đất giữ chặt hom tiêu. Sau khi giâm xong cho vào nhà có che nilông, tưới nước đủ ẩm để cây ra rễ nhanh. Chỉ tiêu theo dõi Tỉ lệ (%) cành giâm sống, số lá mới/cành (lá/cành) và chiều cao (cm) chồi mới, số rễ mới/cành (rễ/cành) và chiều dài (cm) rễ của các nghiệm thức ở các chế độ tưới khác nhau sau thời gian giâm. Điều kiện thí nghiệm Nhiệt độ: 28 – 32oC, ẩm độ: 80 – 85%, thời gian thí nghiệm: 40 ngày. Nghiệm thức Chế độ tưới Số cành giâm T1 Ướt đẫm 4 lần/ngày 60 T2 Phun sương 3 lần/ngày 60 T3 Phun sương 6 lần/ngày 60 Hình 3.1 Mô hình giâm cành tiêu sạch bệnh. 16 3.4.2 Nuôi rệp sáp 3.4.2.1 Trồng bí và nuôi rệp trên cây bí Hạt bí đỏ trái dài F1 125 của Công ty liên doanh hạt giống Đông Tây được ngâm ủ trước khi gieo theo qui trình: Hạt sau khi mở khỏi bao bì cho vào nước hơi ấm (1 sôi + 3 lạnh) ngâm 5 phút cho hạt thấm đều nước. Chuẩn bị khăn ủ: ngâm khăn vào nước cho thấm đều khăn, sau đó lấy ra, vắt ráo nước. Sau 5 phút vớt hạt ra, để ráo rồi đem ủ vào trong khăn. Khi ủ thì trãi đều hạt cho khăn tiếp xúc với hạt càng nhiều càng tốt. Sau đó gấp khăn lại cho vào hộp nhựa đậy nắp lại. Sau 24 giờ ủ hạt thì đem rửa sạch lớp nhờn bên ngoài vỏ hạt, giặt khăn ủ cho sạch rồi tiếp tục ủ lại. Khi hạt nứt nanh thì đem gieo (khoảng 36 – 48 giờ sau ủ). Song song đó, chuẩn bị đất gieo hạt: đất sạch trộn với cát theo tỉ lệ 1:1. Sau khi chuẩn bị xong, cho đất vào các chậu nhựa nhỏ (khoảng 2/3 chậu), tưới ẩm. Hạt sau khi nứt nanh gieo vào trong các chậu đã chuẩn bị đất, gieo sâu không quá 2 cm. Gieo xong rắc nhẹ một ít Furadan để phòng ngừa côn trùng ăn hạt và cây con. Sau 7 ngày gieo hạt thì cây bí có 3 – 4 lá mầm, lúc này lấy các lá tiêu có chứa rệp sáp đặt lên các lá bí non. Khoảng 3 ngày sau, rệp sáp sẽ sinh trưởng và phát triển trên cây bí. Khi rệp sáp sinh sản cho rệp thế hệ thứ 1, dùng kim nhọn giết hết các rệp mẹ, đặt các cây bí đã cắt bỏ gốc có rệp thế hệ thứ 1 vào gần chỗ các chậu bí sạch rệp khác. Các rệp con trưởng thành và sinh sản sau khoảng 3 tuần, lúc này được rệp thế hệ thứ 2. Tiếp tục các thao tác trên để được rệp thế hệ thứ 5. Lúc này rệp được coi là sạch vi rút. 3.4.2.2 Nuôi rệp trên cây tiêu bệnh Đặt các cây bí mang rệp thế hệ thứ 5 vào chỗ các lá tiêu non có triệu chứng của vi rút trong 5 ngày. 17 3.4.2.3 Nuôi rệp trên cây tiêu khỏe Thí nghiệm 2: Khảo sát sự nhiễm bệnh của cây tiêu khoẻ sau khi được chủng rệp từ cây tiêu bệnh. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi lần với 12 cây tiêu khỏe. Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm nuôi rệp trên cây tiêu khỏe của các nghiệm thức với số rệp đƣợc nuôi và thời gian nuôi khác nhau Cách tiến hành thí nghiệm Đặt các cây tiêu bệnh có chứa rệp vào chỗ các chậu tiêu khỏe. Khi đã đủ thời gian nuôi rệp (10 ngày, 20 ngày và 30 ngày) thì giết hết rệp trên cây tiêu khỏe, đặt các cây này chỗ thoáng mát trong 2 tuần rồi mới quan sát và ghi nhận triệu chứng. Chỉ tiêu theo dõi Tỉ lệ (%) cây tiêu khỏe bị nhiễm bệnh, triệu chứng bệnh biểu hiện trên cây tiêu, tỉ lệ (%) cây tiêu khỏe bị nhiễm bệnh theo triệu chứng. Nghiệm thức Số rệp được nuôi (con) Thời gian nuôi (ngày) Số cây tiêu khỏe (cây) T1 30 10 12 T2 30 20 12 T3 30 30 12 T4 50 10 12 T5 50 20 12 T6 50 30 12 T7 70 10 12 T8 70 20 12 T9 70 30 12 18 Điều kiện thí nghiệm Nhiệt độ: 28 – 32oC, ẩm độ: 80 – 85%, thời gian thí nghiệm:160 ngày. 3.4.3 Kiểm tra sự nhiễm vi rút của cây tiêu sau khi đƣợc nuôi rệp sáp bằng kỹ thuật RT – PCR Kỹ thuật RT-PCR được thực hiện gồm giai đoạn tổng hợp cDNA và giai đoạn khuếch đại cDNA. Qui trình thực hiện gồm 3 bước chính: Ly trích RNA bằng kit ly trích RNA. Tổng hợp cDNA theo kit tổng hợp cDNA. Khuếch đại cDNA bằng phản ứng PCR. 3.4.3.1 Ly trích RNA theo kit ly trích của Biorad Bƣớc 1: Cắt mẫu lá tiêu bệnh thành từng lát mỏng (<5 mm). Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý DEPC, cho vào bịt ni lông rồi đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, sấy khô trong một ngày đêm) nghiền thành bột mịn với nitơ lỏng. Thêm nitơ lỏng thường xuyên, không để cho mẫu bị nóng lên. Bƣớc 2: Lấy muỗng cho khoảng 60mg bột nghiền vào ống ly tâm 2 ml có nắp đậy (không có RNase). Hòa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) có bổ sung PVP 2% (hỗn hợp này đã được trộn trước: 14 µl PVP 2% + 700 µl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu). Bƣớc 3: Cho 700 µl dung dịch đã trộn ở bước trên vào ống chứa mẫu, trộn thật kỹ bằng pipet khoảng 10 lần hoặc bằng máy vortex khoảng 30 – 60 giây. Bƣớc 4: Ly tâm 12000 vòng trong 3 phút. Chuyển toàn bộ dịch nổi vào ống ly tâm 2 ml mới. Bƣớc 5: Thêm vào ống 700 µl ethanol 70%, hoà tan bằng pipet hoặc máy vortex trong 30 giây cho đến khi không còn sự phân lớp. Bƣớc 6: Ủ ấm dung dịch hoà tan (elution solution) trong bồn ủ nhiệt ở 70 o C (chuẩn bị cho bước 15). Đặt RNA binding column (RNAbc) vào ống 2 ml không nắp. Bƣớc 7: Cho 700 µl dung dịch ở bước 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tương tự cho đến hết phần dịch còn lại. 19 Bƣớc 8: Dịch rửa low stringency từ 5X pha loãng xuống còn 1X bằng ethanol 95 – 100%. Bƣớc 9: Cho 700 µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc. Bƣớc 10: Pha Dnase I với 250 µl Tris 10mM pH 7.5. Hoà tan bằng pipet. Bƣớc 11: Trộn 5 µl Dnase I với 75 µl dung dịch Dnase dilution trong ống 1,5 ml, cho vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây. Loại bỏ dịch lọc. Bƣớc 12: Cho 700 µl dung dịch high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc. Bƣớc 13: Thực hiện tương tự như bước 12 nhưng với dung dịch low stringency. Bƣớc 14: Ly tâm tiếp12000 vòng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa trong ống. Bƣớc 15: Chuyển RNAbc vào ống 1,5 ml có nắp đậy, cho vào 80 µl dung dịch hoà tan ở bước 6. Để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 12000 vòng trong 2 phút để thu RNA tổng số. Bảo quản mẫu ở 4oC. 3.4.3.2 Khuếch đại bằng RT – PCR Bƣớc 1: Reverse transcription Thành phần và thể tích hoá chất như sau: iScript Reaction Mix 4 µl, iscript Reverse Transcriptas 1 µl, nuclease-free water 10 µl, RNA khuôn mẫu 5 µl. Tổng thể tích phản ứng là 20 µl. Chu trình nhiệt: 1 chu kỳ 5 phút ở 25oC, 30 phút ở 42oC, 5 phút ở 85oC và giữ mẫu ở 4oC. Bƣớc 2: Khuếch đại bằng PCR Sử dụng cặp primer (BADNA 1A + BADNA 4’) có trình tự sau: BADNA 1A 5’ – CTN TAY 9AR T99 YTN 9TN AT9 CCN TTY – 3’ Tm = 550C BADNA 4’ 5’ – TCC AYT TRC ANA YNS CNC CCC ANC C – 3’ Tm = 580C 20  Thành phần hoá chất Thể tích hút Nồng độ cuối iTaq buffer 5 X 10 µl 1 X MgCl2 25 mM 3 µl 1,5 mM dNTP mix 10 mM 0,4 µl 200 µM iTaq DNA polymerase 0,2 µl 1 unit primer 1 (BADNA 1A) 2 µl 0,1 pmol primer 2 (BADNA 4’) 2 µl 0,1 pmol Nuclease-free-water 30,4 µl DNA đã qua Reverse 2 µl Tổng thể tích 50 µl Bảng 3.3 Các biến đổi về thành phần phản ứng giữa các lần PCR cDNA MgCl2 Taq H2O Khác Lần 1 Không đổi Không đổi Không đổi (B) Không đổi Không đổi Lần 2 Không đổi Không đổi Không đổi (B) Không đổi Không đổi Lần 3 Không đổi Không đổi Không đổi (B) Không đổi Không đổi Lần 4 Không đổi Không đổi Không đổi (B) Không đổi Không đổi Lần 5 Không đổi Không đổi Không đổi (B) Không đổi Không đổi Lần 6 5 µl Không đổi Không đổi (B) 27,4 µl Không đổi* Lần 7 5 µl Không đổi Không đổi (B) 27,4 µl Không đổi Lần 8 5 µl Không đổi Không đổi (P) 27,4 µl Không đổi Lần 9 5 µl Không đổi Không đổi (P) 27,4 µl Không đổi Lần 10 5 µl Không đổi Không đổi (P) 27,4 µl Không đổi* Lần 11 5 µl Không đổi 1,5 unit (P) 27,3 µl Không đổi Lần 12 5 µl 2 mM Không đổi (P) 26,4 µl Không đổi Lần 13 5 µl 2 mM Không đổi (P) 26,4 µl Không đổi Lần 14 5 µl 2 mM Không đổi (F) 26,4 µl Không đổi* (B): công ty Biorad, (P): công ty Promega, (F): công ty Fermentas, *: máy PCR khác 21  Chu trình nhiệt Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR thực hiện ở các lần khác nhau PCR Giai đoạn Nhiệt độ ( o C) Thời gian (phút, giây) Số chu kỳ Lần 1 Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn thành Giữ mẫu 95 95 56 72 72 4 3 phút 30 giây 45 giây 45 giây 7 phút 15 phút 1 35 1 1 Lần 2 Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn thành Giữ mẫu 95 95 54 72 72 4 3 phút 30 giây 45 giây 45 giây 7 phút 15 phút 1 35 1 1 Lần 3 Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn thành Giữ mẫu 95 95 53 72 72 4 3 phút 30 giây 45 giây 45 giây 7 phút 15 phút 1 35 1 1 Lần 4 Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn thành Giữ mẫu 95 95 50 72 72 4 3 phút 30 giây 45 giây 45 giây 7 phút 15 phút 1 35 1 1 22 Lần 5 Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn thành Giữ mẫu 94 94 54 72 72 4 3 phút 45 giây 1 phút 1 phút 5 phút 15 phút 1 40 1 1 Lần 6 Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn thành Giữ mẫu 94 94 53 72 72 4 3 phút 45 giây 1 phút 1 phút 5 phút 15 phút 1 40 1 1 Lần 7 Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn thành Giữ mẫu 94 94 50 72 72 4 3 phút 45 giây 1 phút 1 phút 5 phút 15 phút 1 40 1 1 Lần 8 Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn thành Giữ mẫu 95 94 54 72 72 4 5 phút 45 giây 1 phút 1 phút 5 phút 15 phút 1 40 1 1 Lần 9 Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn thành 95 94 53 72 72 5 phút 45 giây 1 phút 1 phút 5 phút 1 40 1 23 Giữ mẫu 4 15 phút 1 Lần 10, lần 11, lần 12, lần 13, lần 14 Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn thành Giữ mẫu 95 94 50 72 72 4 5 phút 45 giây 1 phút 1 phút 5 phút 15 phút 1 40 1 1 3.4.3.3 Phƣơng pháp đổ gel agarose điện di Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1%. Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã được nấu chín đến 50 – 60oC, sau đó đổ vào khuôn đã được đặt lược vào trước. Bƣớc 3: Lấy lược ra, cho gel vào TAE 0,5X. Bƣớc 4: Hút 2 µl loading dye trộn với 8 µl mẫu. Bƣớc 5: Bơm vào các giếng cẩn thận 8 µl mẫu + dung dịch đệm. Bƣớc 6: Chạy điện di ở 100V trong 20 phút. Bƣớc 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5Ug/ml) trong 20 phút. Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel với nước đã qua chưng cất. Bƣớc 9: Đọc kết quả dưới tia UV, thẩm định kết quả với marker. Bƣớc 10: Chụp bản gel để lưu lại kết quả. 3.5 Phân tích thống kê Xử lý số liệu thống kê bằng phần mềm EXCELL và phân tích ANOVA sử dụng phần mềm STATGRAPHICS 7.0 24 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm. 25 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hƣởng của chế độ tƣới nƣớc đến sự sinh trƣởng và phát triển của tiêu sạch bệnh giâm cành Cành giâm lúc mới cắt khỏi thân cây mẹ chưa có rễ nên khả năng hút nước từ trong đất rất thấp; trong khi đó các bộ phận phía trên mặt đất vẫn tiến hành quá trình thoát hơi nước, gây ra sự thiếu bão hòa nước trong cành giâm làm cành bị héo. Nếu hiện tượng này kéo dài trong 3 ngày đầu giâm cành thì cành sẽ bị mất nước, không có khả năng ra rễ và sẽ chết khoảng sau 7 ngày giâm. Vì vậy, đối với công tác giâm cành, việc tưới nước để giữ ẩm độ bề mặt lá, hạn chế sự thoát hơi nước là khâu quan trọng nhất, đảm bảo tỉ lệ cành giâm sống cao. Bảng 4.1 Tỉ lệ (%) cành giâm sống của các nghiệm thức ở các thời điểm khác nhau sau giâm Trong cùng một cột các chữ cái khác nhau theo sau các số liệu biểu thị sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Chế độ tưới nước ở dạng phun sương rất thích hợp cho cành giâm mau ra rễ và đâm chồi mới, hạn chế lượng nước ứ đọng trong các chậu chứa cành giâm nên các mầm bệnh ít tồn tại, do đó số cành giâm sống cao. Riêng chế độ tưới nước ở Nghiệm thức 10 ngày sau giâm 20 ngày sau giâm 30 ngày sau giâm 40 ngày sau giâm T1 82,22 a 80,00 a 80,00 a 80,00 a T2 84,44 a 82,22 a 81,67 a 81,67 a T3 94,44 b 93,33 b 93,33 b 93,33 b LSD P = 0,0004 P = 0,0001 P = 0,0001 P = 0,0001 26 dạng phun sương 6 lần/ngày làm cành giâm mát mẻ, không bị khô so với chế độ tưới nước ở dạng phun sương 3 lần/ngày nên số cành giâm sống nhiều hơn. Đối với chế độ tưới nước ở dạng ướt đẫm 4 lần/ngày, số cành giâm sống ít do lượng nước ứ đọng trong các chậu chứa cành giâm khá nhiều làm cành giâm bị úng nước, lâu ngày sẽ chết; đồng thời cũng tạo điều kiện tốt cho các loại nấm phát triển, làm giảm sự đâm chồi mới; trong khi đó các lá già trên cành vẫn tiến hành thoát hơi nước dẫn đến sự thiếu hụt nước trong cành làm cành giâm bị héo nhanh, suy yếu dần và nếu kéo dài cành rất dễ chết. Kết quả bảng 4.1 cho thấy chế độ tưới nước ở dạng phun sương 6 lần/ngày cho tỉ lệ cành giâm sống cao hơn rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với 2 chế độ tưới còn lại. 10 ngày sau giâm, số cành giâm sống đã biểu hiện rõ rệt và có sự khác biệt giữa các chế độ tưới. 20 ngày và 30 ngày sau giâm, số cành giâm sống có giảm nhưng không đáng kể. 40 ngày sau giâm, số cành giâm sống đã dần ổn định. Trong đó, chế độ tưới nước ở dạng phun sương 6 lần/ngày có tỉ lệ cành giâm sống cao nhất (94,44%), chế độ tưới nước ở dạng ướt đẫm 4 lần/ngày có tỉ lệ cành giâm sống thấp nhất (80%). Bảng 4.2 Số lá mới và chiều cao chồi mới của các nghiệm thức sau 40 ngày giâm cành Nghiệm thức Số lá mới (lá/cành) Chiều cao chồi mới (cm) T1 1,17 a 0,15 3,46 a 0,39 T2 1,18 a 0,15 3,67 a 0,65 T3 1,98 b 0,12 4,19 b 0,73 LSD P = 0,0000 P = 0,0002 Trong cùng một cột các chữ cái khác nhau theo sau các số liệu biểu thị sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Sau 40 ngày giâm cành, chồi mới trên các cành giâm đã vươn cao và phát triển mạnh, các lá mới cũng đã hình thành và dần to lên, biểu hiện sức sống mạnh mẽ, dễ dàng thích nghi khi đem ra vườn trồng (hình 4.1d, 4.2d, 4.3d). Dựa vào kết quả bảng 4.2, chúng tôi nhận thấy chế độ tưới nước ở dạng phun sương 6 lần/ngày 27 có số lá mới nhiều nhất (1,98 lá) và chiều cao chồi mới cao nhất (4,19 cm), chế độ tưới nước ở dạng ướt đẫm 4 lần/ngày cho số lá mới ít nhất (1,17 lá) và chiều cao chồi mới thấp nhất (3,46 cm). Các số liệu này khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Bảng 4.3 Số rễ mới và chiều dài rễ của các nghiệm thức sau 40 ngày giâm cành Nghiệm thức Số rễ mới (rễ/cành) Chiều dài rễ (cm) T1 8,98 a 0,97 5,64 a 0,92 T2 9,28 a 0,15 5,92 a 1,03 T3 10,31 b 0,12 8,47 b 1,00 LSD P = 0,001 P = 0,0000 Trong cùng một cột các chữ cái khác nhau theo sau các số liệu biểu thị sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Cành giâm muốn duy trì sự sống và phát triển thì trước tiên phải có rễ. Rễ giúp cành đứng vững, bám chặt vào đất, đồng thời cũng giúp hút nước, chất dinh dưỡng từ đất. Tiêu là loại cây có rễ chùm nên sau thời gian giâm, cành giâm càng mọc nhiều rễ thì cây phát triển càng mạnh, có sức sống cao. Do đó, ngoài việc ngâm cành giâm trong NAA lúc đầu để kích thích ra rễ thì chế độ tưới nước cũng rất cần thiết, tạo môi trường ẩm ướt giúp cành giâm mau ra rễ và tốt nhất là tưới ở dạng phun sương (hình 4.4). Kết quả bảng 4.3 cho thấy chế độ tưới nước ở dạng phun sương 6 lần/ngày cho số rễ mới và chiều dài rễ khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với 2 chế độ tưới còn lại. Trong đó, chế độ tưới nước ở dạng phun sương 6 lần/ngày có số rễ mới nhiều nhất (10,31 rễ) và chiều dài rễ cũng dài nhất (8,47 cm), chế độ tưới nước ở dạng ướt đẫm 4 lần/ngày có số rễ mới ít nhất (8,98 rễ) và chiều dài rễ ngắn nhất (5,64 cm). 28 Hình 4.1 Cành giâm với chế độ tƣới ƣớt đẫm 4 lần/ngày ở các thời điểm khác nhau sau giâm. (a) 10 ngày sau giâm, (b) 20 ngày sau giâm, (c) 30 ngày sau giâm, (d) 40 ngày sau giâm. Hình 4.2 Cành giâm với chế độ tƣới phun sƣơng 3 lần/ngày ở các thời điểm khác nhau sau giâm. (a) 10 ngày sau giâm, (b) 20 ngày sau giâm, (c) 30 ngày sau giâm, (d) 40 ngày sau giâm. (a) (b) (d) (c) (d) (a) (b) (c) 29 Hình 4.3 Cành giâm với chế độ tƣới phun sƣơng 6 lần/ngày ở các thời điểm khác nhau sau giâm. (a) 10 ngày sau giâm, (b) 20 ngày sau giâm, (c) 30 ngày sau giâm, (d) 40 ngày sau giâm. Hình 4.4 Số rễ mới và chiều dài rễ của cành giâm ở các chế độ tƣới khác nhau sau 40 ngày giâm. (a) tưới ướt đẫm 4 lần/ngày, (b) tưới phun sương 3 lần/ngày, (c) tưới phun sương 6 lần/ngày. (a) (b) (c) (d) (a) (b) (c) 30 4.2 Sự nhiễm bệnh của cây tiêu khỏe sau khi đƣợc chủng rệp từ cây tiêu bệnh Vì là hạt giống đã được chọn lọc kĩ càng nên các cây bí sau khi gieo hạt có tỉ lệ sống đến 99%. Các cây bí sinh trưởng và phát triển rất nhanh. Chỉ sau 7 ngày gieo hạt, lá đã xanh to, thân mập mạp. Đây là môi trường thuận lợi cho rệp tồn tại nên khi thả rệp từ các lá tiêu lên các cây bí này, rệp bò sang rất nhanh. Do bề mặt lá bí nhám, rệp bám vào dễ dàng, nhanh chóng thích nghi trên cây kí chủ (hình 4.1a) và khi đã ổn định thì chúng bắt đầu sinh sản. Sau 5 thế hệ, số rệp con được sinh ra rất nhiều. Khi thả lên cây tiêu bệnh thì rệp chỉ còn lại khoảng một nửa do bề mặt lá tiêu nhẵn, rệp khó bám vào. Nếu gặp trời mưa hoặc có nhiều gió, đa số rệp bị rớt xuống, chỉ một số ít bám được vào gốc tiêu để bò lên và phải mất vài giờ, có khi vài ngày mới lên đến ngọn tiêu để chích hút. Trong trường hợp này, rệp sẽ hút ít vi rút của tiêu bệnh hoặc có thể chưa hút được vi rút. Do đó, khi lây nhiễm các rệp này sang cây tiêu khoẻ trong thời gian ngắn, cây tiêu khoẻ có thể chưa bị nhiễm bệnh. Bảng 4.4 Tỉ lệ (%) cây tiêu khỏe nhiễm bệnh của các nghiệm thức ứng với số rệp đƣợc nuôi và thời gian nuôi khác nhau Trong cùng một cột các chữ cái khác nhau theo sau các số liệu biểu thị sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Nghiệm thức Số rệp được nuôi (con) Thời gian nuôi (ngày) Tỉ lệ cây nhiễm bệnh (%) T1 30 10 38,67 a T2 30 20 47,17 ab T3 30 30 55,67 b T4 50 10 52,83 b T5 50 20 58,33 b T6 50 30 66,67 bc T7 70 10 64,00 bc T8 70 20 69,67 bc T9 70 30 80,67 c 31 Kết quả bảng 4.4 cho thấy tỉ lệ cây tiêu khỏe nhiễm bệnh của các nghiệm thức có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Nghiệm thức T9 có tỉ lệ cây tiêu khỏe nhiễm bệnh cao nhất (80,67%), kế đến là nghiệm thức T8 (69,67%), nghiệm thức T1 có tỉ lệ cây tiêu khỏe nhiễm bệnh thấp nhất (38,67%). Ở đây, chúng ta thấy nghiệm thức T3 có tỉ lệ cây tiêu khỏe nhiễm bệnh cao hơn nghiệm thức T4 trong khi số rệp được nuôi trên cây tiêu khỏe của nghiệm thức T3 ít hơn của nghiệm thức T4. Đó là do thời gian rệp được nuôi trên cây tiêu khỏe của nghiệm thức T3 dài hơn của nghiệm thức T4. Nghiệm thức T4 tuy có số rệp được nuôi trên cây tiêu khỏe cao nhưng sau khi nuôi rệp, có những cây rệp chết hết nên các cây này chưa bị bệnh và chỉ trong thời gian ngắn, rệp bệnh trên các cây khác chưa thể bò sang lây bệnh. Còn nghiệm thức T3 tuy có số rệp được nuôi trên cây tiêu khỏe thấp nhưng vì có thời gian nuôi rệp dài nên các cây lúc đầu có rệp chết, chưa bệnh thì sau đó cũng dần bị bệnh do rệp bệnh trên các cây khác bò sang. Tương tự, nghiệm thức T6 cũng có tỉ lệ cây tiêu khỏe nhiễm bệnh cao hơn nghiệm thức T7. Giữa số rệp được nuôi 30 con, 50 con và 70 con có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Số rệp được nuôi trên cây tiêu khỏe càng nhiều thì tỉ lệ cây nhiễm bệnh càng cao, hầu hết các cây đều bị bệnh. Trong đó, số rệp được nuôi trên cây tiêu khỏe là 70 con có tỉ lệ cây nhiễm bệnh cao nhất (71,44%) và số rệp được nuôi là 30 con có tỉ lệ cây nhiễm bệnh thấp nhất (47,17%) (bảng 4.5). Bảng 4.5 Tỉ lệ (%) cây tiêu khỏe nhiễm bệnh ứng với số rệp đƣợc nuôi khác nhau Trong cùng một cột các chữ cái khác nhau theo sau các số liệu biểu thị sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Số rệp được nuôi (con) Tỉ lệ cây nhiễm bệnh (%) 30 47,17 a 50 59,28 b 70 71,44 c LSD P = 0, 0000 32 Mặt khác, kết quả thí nghiệm còn cho thấy thời gian thời gian nuôi rệp trên cây tiêu khỏe là 30 ngày có tỉ lệ cây nhiễm bệnh cao hơn thời gian thả rệp 10 ngày và 20 ngày nên rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Thời gian thả rệp trên cây tiêu khỏe dài thì tỉ lệ cây nhiễm bệnh cao. Trong đó, thời gian thả rệp trên cây tiêu khỏe là 30 ngày có tỉ lệ cây nhiễm bệnh cao nhất (67,66%) và thời gian thả rệp 10 ngày có tỉ lệ cây nhiễm bệnh thấp nhất (51,83%) (bảng 4.6). Bảng 4.6 Tỉ lệ (%) cây tiêu khỏe nhiễm bệnh ở các thời gian nuôi khác nhau Trong cùng một cột các chữ cái khác nhau theo sau các số liệu biểu thị sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Khi thả rệp từ cây tiêu bệnh lên cây tiêu khỏe càng nhiều thì rệp từ cây tiêu bệnh xâm nhiễm vào cây tiêu khỏe rất nhanh, hút hết các chất dinh dưỡng của cây khỏe, lan truyền vi rút qua cây khỏe làm cây suy yếu dần, sinh trưởng kém, phát triển còi cọc, cây héo, úa vàng, dễ bị các mầm bệnh khác xâm nhập (lúc này tiêu khỏe đã trở thành tiêu bệnh) và nếu lâu ngày cây sẽ chết. Mặt khác, sau khi đã thích nghi trên cây tiêu khỏe, với thời gian càng dài; chúng sẽ sinh sản nhiều thế hệ rệp con lây lan vi rút qua các cây tiêu khỏe khác một cách nhanh chóng và khi đó các triệu chứng nhiễm vi rút của cây tiêu biểu hiện rõ ràng hơn, quan sát triệu chứng bệnh thấy rất giống với triệu chứng cây tiêu bị nhiễm bệnh trong điều kiện tự nhiên. Có 4 triệu chứng bệnh nhận thấy trên lá tiêu sau khi nuôi rệp là: đốm hoa lá, xoăn mép lá, nhăn phiến lá và khảm vàng (bảng 4.7 và hình 4.2). Trong đó, triệu chứng đốm hoa lá biểu hiện nhiều nhất trên cây bệnh (47,93%), triệu chứng khảm vàng biểu hiện ít nhất (5,20%); đồng thời nghiệm thức T9 có tỉ lệ cây nhiễm vi rút theo Thời gian nuôi rệp (ngày) Tỉ lệ cây nhiễm bệnh (%) 10 51,83 a 20 58,39 a 30 67,66 b LSD P = 0,0047 33 triệu chứng cao nhất (15,10%), nghiệm thức T1 có tỉ lệ cây nhiễm vi rút theo triệu chứng thấp nhất (7,30%) (bảng 4.8). Bảng 4.7 Các triệu chứng nhiễm vi rút nhận thấy trên lá tiêu khỏe sau khi nuôi rệp sáp Bảng 4.8 Tỉ lệ (%) cây nhiễm vi rút theo triệu chứng của các nghiệm thức Tên triệu chứng Mô tả đặc điểm Đốm hoa lá Bề mặt lá tiêu đầy các vết đốm nhỏ màu vàng, sau ngã sang màu vàng đậm, thường thấy trên các lá giữa thân tiêu. Xoăn mép lá Mép lá quăn queo, ghồ ghề biến dạng, biểu hiện ở các lá phần ngọn tiêu. Nhăn phiến lá Bề mặt phiến lá nhăn nhúm, ghồ ghề biến dạng, lồi lõm, có ở cả lá non và lá già của cây tiêu. Khảm vàng Đốm, chấm vàng nhỏ giữa các gân lá, sau lớn dần thành khảm trên toàn bộ mặt lá. Nghiệm thức Tỉ lệ cây nhiễm vi rút theo triệu chứng (%) Tổng % Đốm hoa lá Nhăn phiến lá Xoăn mép lá Khảm vàng T1 3,13 3,13 0,52 0,52 7,30 T2 4,69 3,65 0,52 0 8,86 T3 5,73 3,65 0,52 0,52 10,42 T4 4,69 3,65 1,56 0 9,90 T5 4,69 3,65 2,08 0,52 10,94 T6 6,25 3,65 2,08 0,52 12,50 T7 6,25 4,69 0,52 0,52 11,98 T8 5,73 5,21 1,04 1,04 13,02 T9 6,77 5,73 1,04 1,56 15,10 Tổng % 47,93 37,01 9,88 5,20 34 Hình 4.5 Rệp sáp sinh trƣởng và phát triển trên cây bí 7 ngày tuổi và cây tiêu khoẻ 3 tháng tuổi. (a) cây bí 7 ngày tuổi, (b) cây tiêu khoẻ 3 tháng tuổi. Hình 4.6 Cây tiêu bệnh trong điều kiện tự nhiên và cây tiêu bệnh sau khi đƣợc nuôi rệp với số rệp nuôi và thời gian nuôi khác nhau. (a) cây bệnh trong điều kiện tự nhiên, (b) cây bệnh khi nuôi 30 con rệp trong 10 ngày, (c) cây bệnh khi nuôi 50 con rệp trong 20 ngày, (d) cây bệnh khi nuôi 70 con rệp trong 30 ngày. (c) (d) (a) (b) (b) (a) (b) 35 Hình 4.7 Các triệu chứng nhiễm vi rút nhận thấy trên lá tiêu khỏe sau khi nuôi rệp. (a) đốm hoa lá, (b) nhăn phiến lá, (c) xoăn mép lá, (d) khảm vàng. Kết quả thí nghiệm giống với kết quả của nhiều nghiên cứu ngoài nước. Nghiên cứu của Lockhart và các ctv (1997) cho thấy sau 5 – 8 tuần thả rệp (Planococcus citri), lá tiêu có triệu chứng đốm vàng, chứng tỏ có sự hiện diện của vi rút PYMV và Planococcus citri chính là tác nhân lây truyền vi rút cho cây tiêu khỏe ở nhiều nước Đông Nam Á. Tương tự, nghiên cứu của Bhat và các ctv (2003) cho thấy sau 5 tuần thả rệp (Ferrisia virgata), lá tiêu có triệu chứng đốm vàng khắp bề mặt lá và điều đó chứng tỏ Ferrisia virgata là tác nhân lây truyền vi rút cho cây tiêu khoẻ mạnh ở Ấn Độ. Như vậy, với triệu chứng bệnh nhận thấy trên lá tiêu khỏe (c) (d) (a) 36 sau khi nuôi rệp có thể kết luận rệp sáp (Ferrisia virgata) chính là tác nhân lây truyền vi rút cho cây tiêu Vĩnh Linh của Việt Nam. 4.3 Kết quả kiểm tra sự nhiễm vi rút của cây tiêu khỏe sau khi đƣợc nuôi rệp bệnh bằng kỹ thuật RT – PCR Đa số các cây tiêu khỏe sau khi được nuôi rệp bệnh có triệu chứng của vi rút. Chúng tôi lấy các mẫu lá bệnh đem ly trích RNA để thực hiện phản ứng RT – PCR và đã tiến hành hai lần ly trích. Lần thứ nhất ly trích 4 mẫu tương ứng với 4 triệu chứng: đốm hoa lá, nhăn phiến lá, xoăn mép lá, khảm vàng và kí hiệu lần lượt là: H1, H2, H3, H4. Lần thứ hai ly trích 3 mẫu tương ứng với 3 triệu chứng: đốm hoa lá, nhăn phiến lá, xoăn mép lá và kí hiệu lần lượt là: L1, L2, L3. Sau nhiều lần tiến hành thí nghiệm, thay đổi chu trình nhiệt và thay đổi nồng độ của các hoá chất trong phản ứng PCR nhưng kết quả PCR dựa vào cặp mồi (BADNA 2 + BADNA 4’) của Meyer JB (2005) không đạt được như mong đợi. Ở lần RT – PCR đầu tiên, chúng tôi thực hiện phản ứng với 4 mẫu H1, H2, H3, H4. Kết quả là không có sản phẩm nào được tạo ra. Vậy là phản ứng PCR đã không xảy ra. Điều này có thể là do nhiệt độ bắt cặp cao nên cần hạ nhiệt độ bắt cặp xuống. Khi điện di sản phẩm PCR lần 2, lần 3, lần 4: mặc dầu đã hạ nhiệt độ bắt cặp xuống lần lượt là 54oC, 53oC và 50oC nhưng kết quả vẫn không có sản phẩm nào được tạo ra. Giả thuyết về nhiệt độ bắt cặp là không hợp lý mà có thể do lần đầu tiên ly trích mẫu nên thao tác còn yếu, làm mẫu bị phân hủy bởi RNase trong không khí dẫn đến không ly trích được RNA của vi rút và cũng có thể do chu trình nhiệt đưa ra lúc đầu chưa thích hợp. Khi tiến hành phản ứng RT – PCR với 3 mẫu khác: L1, L2, L3 theo chu trình nhiệt của Meyer JB (2005) ở các nhiệt độ bắt cặp khác nhau, đồng thời cũng tăng lượng mẫu DNA đã qua reverse lên 2,5 lần thì kết quả vẫn không thu được bất kì sản phẩm nào. Như vậy, giả thuyết không ly trích được RNA của vi rút lẫn giả thuyết về chu trình nhiệt chưa thích hợp là không hợp lý. Việc tăng lượng DNA đã qua reverse đưa vào phản ứng PCR cũng có thể làm tăng nhân tố ức chế phản ứng PCR. Chúng tôi thử nghiệm tăng nhiệt độ biến tính và thời gian biến tính lên, thực hiện phản ứng PCR ở các nhiệt độ bắt cặp khác nhau nhưng vẫn 37 không đạt được kết quả. Có thể trong quá trình gia nhiệt để biến tính vi rút, thành tế bào vi rút bị phá vỡ và RNA vi rút thoát ra ngoài. Tuy đã thay đổi chu trình nhiệt, tăng lượng DNA đã qua reverse và sử dụng các mẫu ly trích khác nhưng phản ứng PCR vẫn không xảy ra, có thể do nồng độ của các hoá chất trong phản ứng PCR còn thấp nên chưa khuyếch đại được hết các đoạn DNA. Chúng tôi tăng nồng độ Taq polymerase (Taq do công ty Biorad sản xuất) lên 1,5 unit và tiến hành phản ứng với nhiệt độ bắt cặp là 50oC, kết quả là không có băng DNA đích trên gel điện di. Khi tăng nồng độ MgCl2 lên 2mM (sử dụng Taq của công ty Promega) thì thấy ở giếng số 4 chứa mẫu L3 có một băng hơi mờ, ở hai giếng chứa cDNA và các giếng khác không có sản phẩm nào. Chúng tôi tiến hành lại phản ứng PCR cho mẫu L3 và điện di cùng với một sản phẩm PCR thực vật có kích thước 450 bp. Kết quả là ở giếng số 1 chứa mẫu L3 vẫn có một băng. Dù điện di đến 10 µl mẫu nhưng băng này vẫn không rõ, có thể đó là DNA của cây tiêu (hình 4.8). Mặt khác, khi thay thế Taq polymerase do công ty Promega sản xuất bằng Taq polymerase của công ty Fermentas thì ở giếng chứa mẫu L3 không cho kết quả. Vì vậy, chúng tôi cho rằng băng ở hai lần điện di trên không phải là sản phẩm. Hình 4.8 Kết quả điện di của mẫu L3 và các mẫu khác khi thực hiện phản ứng PCR lần 12 và lần 13. (a) kết quả lần 12, (b) kết quả lần 13 L3 ĐC H1 L3 L1 H3 cDNA (a) (b) 38 Khi so sánh với kết quả nghiên cứu của Lockhart và các ctv (1997), chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt. Kết quả PCR của ông cho sản phẩm 450 bp đã khẳng định có sự hiện diện của vi rút trên cây tiêu nhưng ở đây ông sử dụng cặp mồi khác (BADNA 2 + MYS 3’). Có thể do điểm khác biệt này nên qui trình kiểm tra vi rút của chúng tôi không thể cho kết quả như mong muốn. Tóm lại, kết quả điện di sản phẩm sau các lần chạy PCR không như mong đợi có thể là do rất nhiều nguyên nhân: Có thể lượng RNA của vi rút ly trích được từ các mẫu lá có triệu chứng bệnh quá ít nên hàm lượng cDNA được tạo ra rất thấp dẫn đến xác suất hút ra để chạy PCR đôi khi là rất thấp hoặc không có. Primer có thể bị mất hoạt tính do được đông lạnh và rã đông nhiều lần để thực hiện phản ứng. Lượng cDNA đã bị giảm xuống hoặc mất theo thời gian. Máy PCR khác nhau có thể ảnh hưởng đến phản ứng PCR vì mỗi máy có nhiệt độ lên xuống theo chu kỳ nhiệt khác nhau. Taq polymerase khác nhau có thể ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Quy trình phản ứng PCR chưa ổn định. 39 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ những kết quả đạt được, chúng tôi rút ra những kết luận sau: Trong công tác giâm cành tiêu, chế độ tưới nước ở dạng phun sương 6 lần/ngày đạt hiệu quả cao nhất. Rệp sáp (Ferrisia virgata) chính là tác nhân lan truyền vi rút cho cây tiêu khỏe. Số rệp được nuôi trên cây tiêu khỏe là 70 con và thời gian nuôi là 30 ngày cho tỉ lệ cây có triệu chứng đốm hoa lá cao nhất. 5.2 Đề nghị Lắp đặt hệ thống tưới phun sương tự động có cài đặt sẵn thời gian cho tiêu giâm cành nhằm hạn chế thời gian và công sức tưới. Cần nghiên cứu nhiều hơn nữa để hoàn thiện qui trình kiểm tra vi rút trên cây tiêu bằng kỹ thuật RT – PCR. Không thực hiện phản ứng RT – PCR với PCR thường mà thực hiện Nested PCR (PCR 2 lần với 2 cặp primer) hoặc thực hiện Multiplex PCR. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn An Dương, 2001. Trồng tiêu. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP.HCM. 46 trang. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005. Sinh học phân tử, tái bản lần thứ 4. Nhà xuất bản giáo dục, trang 190 – 198, 200 – 206. 3. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử. Giới thiệu và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, trang 87 – 98. 4. Vũ Triệu Mẫn, Lê Lương Tề, 1999. Bệnh Vi khuẩn và Virus hại cây trồng. Nhà xuất bản Giáo Dục, trang 143. 5. Đinh Vũ Thắng, 2006. Bước đầu tạo cây tiêu (piper nirgum) in vitro kháng nấm Phytophthora sp. Khóa luận tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. 6. Phan Đức Sơn, 2003. Nghiên cứu bệnh vi rút trên cây hồ tiêu ở một số tỉnh phía Nam bằng kỹ thuật Elisa. Khóa luận tốt nghiệp cao học Khoa Nông học, Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. 7. Lê Minh Tâm, 2004. Nghiên cứu sâu hại chính và thiên địch của chúng và khảo sát hiệu quả phòng trị sâu hại của một số biện pháp trên cây mãng cầu Xiêm tại huyện Bình Chánh TP. Hồ Chí Minh. Khóa luận tốt nghiệp cao học Khoa Nông học, Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. 8. Phạm Thị Ngân Trang, 2005. Xác định vi rút gây bệnh trên cây hồ tiêu bằng phương pháp chủng bệnh trên cây chỉ thị. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Nông học, Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Đình Trường, 2005. Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 10. Anandaraj M, 2000. Diseases of black pepper. In Ravindran, P.N. (Ed), Black pepper Piper nigrum. Harwood Academic Publisher. 41 11. Bhat AI, Devasahayam S, Sarma YR, Pant RP, 2003. Association of a badnavirus in black pepper (Piper nigrum L.) transmitted by mealybug (Ferrisia virgata) in Indian. Division of Crop Protection, Division of Plant Pathology, Indian Agricutural Research Institute, Indian. 12. Duarte MRL and Albuquerque FC, 1991. Diseases of black pepper. National Research Center for Spices, Calicut, pp 13 – 28. 13. Holliday P, 1959. Suspected virus in black pepper. Commonwealth Phytopathological News 5, 49 – 52. 14. Johri JK, Srivastava KM, Raizada RK, Deshpande AL and Singh BP, 1990. Isolation and purification of a virus infecting Piper betle. Indian Phytopathology 43: 491 – 495 15. Kueh KT and Liang SS, 1992. Occurrence and Management of wrinkled- leaf disease of black pepper. Proe The International Workshop of black pepper Disease. Bandarlampung, Indonesia: 227 – 232. 16. Lockhart BEL, Kiratiya-Angul K, Jones P, Eng L, De Silva P, Olszewski NE, Lockhart N, Deema N, Sangalang J, 1997. Identification of Piper yellow mottle virus, a mealybug-transmitted badnavirus infecting Piper spp. in Southeast Asia. European journal of plant pathology 103 : 303- 311. 17. Meyer JB, 2005. Banana streak badnavirus (BSV) in South Africa: incidence, transmission and the development of an antibody based detection system. University of Pretoria 13, 49-131. 18. Prakasam V, Subbaraja KT, Bhak thavasalu CM, 1990. Mosaic disease – a new record in black pepper in lower palneys. Indian Cocoa, Arecanut and Spice Journal 13, 104. 19. Ravindran PN, 2000. Black pepper – Piper nigrum. Harwood Academic Publishers. 553 trang. 20. Sitepu D and Kasim R, 1991. Diseases of black pepper. National Research Center for Spices, Calicut, pp 39 – 54. 21. de Sliva DPP, 1996. Studies of black pepper (Piper nigrum L.) virus disease in Sri Lanka. Reading, UK. 42 22. de Silva DPP và Dharmadasa M, 1997. Screening black pepper vines against Piper yellow mottle virus by PCR and adoption of dot – blot hybridization technique for mass scale screening of black pepper plants. Export Agriculture Research Station, Sri Lanka. 23. de Sliva DPP, Jones P, Shaw MW, 2002. Indentification and transmission of Piper yellow mottle virus and Cucumber mosaic virus infecting black pepper (Piper nigrum) in Sri Lanka. Plant Pathology Division, Export Agriculture Research Station, Sri Lanka. 24. Sarma YR, Kiranmai G, Sreenivasulu P, Anandaraj M, Hema M, Venkatramana M, Murthy AK, Reddy DVR, 2001. Partial characterization and indentification of a virus associated with stunt disease of black pepper (Piper nigrum) in South Indian. Indian Institute of Spikes Research, Indian. CÁC TRANG WEB 25. 26. 27. 28. 29. PHỤ LỤC Phục lục 1 One-Way Analysis of Variance for TILESONG.10ngay -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .1525926 2 .0762963 9.265 .0004 Within groups .4200000 51 .0082353 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .5725926 53 Multiple range analysis for TILESONG.10ngay by TILESONG.nt ----------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- T2 18 .8222222 X T1 18 .8444444 X T3 18 .9444444 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits T1 - T2 0.02222 0.06074 T1 - T3 -0.10000 0.06074 * T2 - T3 -0.12222 0.06074 * -------------------------------------------------------------------------------- One-Way Analysis of Variance for TILESONG.20ngay -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .1837037 2 .0918519 10.866 .0001 Within groups .4311111 51 .0084532 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .6148148 53 Multiple range analysis for TILESONG.20ngay kq by TILESONG.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- T2 18 .8000000 X T1 18 .8222222 X T3 18 .9333333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits T1 - T2 0.02222 0.06154 T1 - T3 -0.11111 0.06154 * T2 - T3 -0.13333 0.06154 * -------------------------------------------------------------------------------- One-Way Analysis of Variance for TILESONG.30ngay -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .1900000 2 .0950000 10.888 .0001 Within groups .4450000 51 .0087255 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .6350000 53 Multiple range analysis for TILESONG.30ngay by TILESONG.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- T2 18 .8000000 X T1 18 .8166667 X T3 18 .9333333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits T1 - T2 0.01667 0.06252 T1 - T3 -0.11667 0.06252 * T2 - T3 -0.13333 0.06252 * -------------------------------------------------------------------------------- One-Way Analysis of Variance for TILESONG.40ngay -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .1900000 2 .0950000 10.888 .0001 Within groups .4450000 51 .0087255 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .6350000 53 Multiple range analysis for TILESONG.40ngay by TILESONG.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- T2 18 .8000000 X T1 18 .8166667 X T3 18 .9333333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits T1 - T2 0.01667 0.06252 T1 - T3 -0.11667 0.06252 * T2 - T3 -0.13333 0.06252 * -------------------------------------------------------------------------------- One-Way Analysis of Variance for TILESONG.la -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 2.0070370 2 1.0035185 25.302 .0000 Within groups 2.0227778 51 .0396623 ------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 4.0298148 53 Multiple range analysis for TILESONG.la by TILESONG.tuoi -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 18 1.5611111 X 3 18 1.8000000 X 6 18 2.0333333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 3 - 4 0.23889 0.13330 * 3 - 6 -0.23333 0.13330 * 4 - 6 -0.47222 0.13330 * ------------------------------------------------------------------------------- One-Way Analysis of Variance for TILESONG.cao -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.5120481 2 .7560241 10.223 .0002 Within groups 3.7716278 51 .0739535 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 5.2836759 53 -------------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for TILESONG.kq by TILESONG.tuoi -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 18 3.0150000 X 3 18 3.1700000 X 6 18 3.4211111 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 3 - 4 0.15500 0.18202 3 - 6 -0.25111 0.18202 * 4 - 6 -0.40611 0.18202 * -------------------------------------------------------------------------------- One-Way Analysis of Variance for TILESONG.re -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 17.455926 2 8.7279630 7.919 .0010 Within groups 56.211667 51 1.1021895 ---------------------------------------- ---------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 73.667593 53 -------------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for TILESONG.re by TILESONG.tuoi -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 18 8.977778 X 3 18 9.277778 X 6 18 10.305556 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 3 - 4 0.30000 0.70272 3 - 6 -1.02778 0.70272 * 4 - 6 -1.32778 0.70272 * -------------------------------------------------------------------------------- One-Way Analysis of Variance for TILESONG.dai -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 87.347011 2 43.673506 45.798 .0000 Within groups 48.633922 51 .9536063 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 135.98093 53 -------------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for TILESONG.kq by TILESONG.tuoi -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 18 5.6427778 X 3 18 5.9166667 X 6 18 8.4672222 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 3 - 4 0.27389 0.65364 3 - 6 -2.55056 0.65364 * 4 - 6 -2.82444 0.65364 * -------------------------------------------------------------------------------- Phục lục 2 Analysis of Variance for TN2.kq - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:TN2.sorep .5304704 2 .2652352 14.099 .0000 B:TN2.tgian .2278481 2 .1139241 6.056 .0047 INTERACTIONS AB .0032407 4 8.10185E-004 .043 .9964 RESIDUAL .8465667 45 .0188126 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1.6081259 53 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for TN2.kq -------------------------------------------------------------------------------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean -------------------------------------------------------------------------------- GRAND MEAN 54 .5929630 .0186650 .5553611 .6305648 A:TN2.sorep 30 18 .4716667 .0323287 .4065384 .5367949 50 18 .5927778 .0323287 .5276495 .6579060 70 18 .7144444 .0323287 .6493162 .7795727 B:TN2.tgian 10 18 .5183333 .0323287 .4532051 .5834616 20 18 .5838889 .0323287 .5187606 .6490171 30 18 .6766667 .0323287 .6115384 .7417949 AB 30 10 6 .3866667 .0559949 .2738612 .4994721 30 20 6 .4716667 .0559949 .3588612 .5844721 30 30 6 .5566667 .0559949 .4438612 .6694721 50 10 6 .5283333 .0559949 .4155279 .6411388 50 20 6 .5833333 .0559949 .4705279 .6961388 50 30 6 .6666667 .0559949 .5538612 .7794721 70 10 6 .6400000 .0559949 .5271945 .7528055 70 20 6 .6966667 .0559949 .5838612 .8094721 70 30 6 .8066667 .0559949 .6938612 .9194721 -------------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for TN2.kq by TN2.sorep -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 30 18 .4716667 X 50 18 .5927778 X 70 18 .7144444 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 30 - 50 -0.12111 0.09211 * 30 - 70 -0.24278 0.09211 * 50 - 70 -0.12167 0.09211 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for TN2.kq by TN2.tgian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 10 18 .5183333 X 20 18 .5838889 X 30 18 .6766667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 10 - 20 -0.06556 0.09211 10 - 30 -0.15833 0.09211 * 20 - 30 -0.09278 0.09211 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 3 Kit ly trích RNA