Khóa luận Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan vanda và bước đầu khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan

ginate Rửa hạt trong nƣớc cất 5 phút để sạch CaCl2.2H2O Ngâm trong dung dịch CaCl2.7H2O 100 mM trong 15 phút 23 2.4.2 Các dạng mycorrhiza 2.4.2.1 Ectomycorrhiza Đƣợc hình thành chủ yếu trên cây rừng do nhiều loài nấm đảm và một vài loài nấm túi. Hầu hết bào tử của Ectomycorrhiza đƣợc sinh ra trên mặt đất và đƣợc phát tán nhờ gió. Sợi nấm của Ectomycorrhiza thƣờng sinh ra một lớp nấm phủ chung quanh phía ngoài của các rễ dinh dƣỡng. Các nấm này cũng đi vào bên trong rễ nhƣng chỉ phát triển xung quanh các tế bào vỏ rễ thay thế một phần phiến mỏng và hình thành cái gọi là mạng lƣới Hartig (Hartig net). Tuỳ thuộc vào màu sắc của nấm phát triển trên rễ mà Ectomycorrhiza có màu vàng, nâu, trắng, đen. 2.4.2.2 Endomycorrhiza Đƣợc hình thành trên hầu nhƣ tất cả cây trồng và trên một số cây rừng bởi các nấm tiếp hợp, chủ yếu là giống Glomus và một số nấm khác nhƣ Acaulospora. Endomycorrhiza cũng đƣợc hình thành bởi một vài nấm đảm, rễ cây có Endomycorrhiza bên ngoài giống với rễ không có mycorrhiza về hình dạng và màu sắc (Agrios, 1997) a)Vesicular –arrbuscular mycorrhiza (=arrgbusular mycorrhiza, VAM hoặc AM) Đây là nhóm phổ biến, hiện diện trên cả cây thân gỗ, là nhóm mycorrhiza quan trọng nhất trong Endomycorrhiza. Các sợi nấm mọc bên trong tế bào vỏ của rễ dinh dƣỡng hình thành vòi hút gọi là bụi (arbuscules) hoặc hình thành các u sƣng lớn dự trữ thức ăn gọi là túi nang (vesicules). Bào tử đƣợc hình thành trong đất. b)Erioid mycorrhiza Sợi nấm xoắn cuộn bên trong tế bào lông rễ của cây thuộc bộ Ericales. Sợi nấm mọc thƣa không lan rộng vào môi trƣờng đất, chúng có thể mọc từ bào tử nhƣng ít có khả năng tái sinh. c)Orchid mycorrhiza Sợi nấm xoắn cuộn bên trong rễ hoặc thân của các cây thuộc họ lan. Những cây lan nhỏ và một số cây trƣởng thành không có diệp lục tố (chlorophyll) đều cần cho sự sinh tồn của chúng. 24 2.4.3 Tác động có ích của mycorrhiza Mối quan hệ giữa lan và nấm là mối quan hệ mật thiết, trên 80% loài lan đều có mối quan hệ với nấm. Theo Currah et al (1997), nhóm nấm chính ở rễ lan là Basidiomycetes mặc dù cũng có Ascomycetes, tuy nhiên Ba sidiomycetes cũng là tác nhân gây bệnh trên những cây khác nhƣ nấm Rhizoctonia solani (theo Harley, 1982). Thậm chí, nấm cộng sinh trên loài lan này là tác nhân gây bệnh cho loài lan khác, và lan có khả năng điều tiết sự xâm nhiễm và phát triển của nấm cộng sinh. 2.4.3.1 Mở rộng diện tích hấp thu của rễ cây Sợi nấm cộng sinh là cơ quan hấp thu chủ yếu của rễ nấm, sợi nấm có thể kéo dài ra xung quanh rễ làm tăng tốc độ hút P lên gấp 6 lần. Tuổi thọ của thể sợi nấm cũng vƣợt xa lông hút. 2.4.3.2 Sự trao đổi dinh dƣỡng Do hạt lan không dự trữ chất dinh dƣỡng nên sự nẩy mầm của hạt phụ thuộc vào mycorrhiza. Mycorrhiza ở lan khác với loại mycorrhiza khác về bản chất trao đổi dinh dƣỡng. Sau khi hình thành mycorrhiza, cacbon hữu cơ và những chất dinh dƣỡng đi vào hạt. Bởi vì sự nẩy mầm của hạt lan khi không có sự cộng sinh với nấm đòi hỏi phải có các chất đƣờng, acid amin và vitamin nên ngƣời ta giả định rằng hạt lan nhận đƣợc các chất này từ nấm để nẩy mầm. Sau đó, nấm tiếp tục cung cấp nguồn năng lƣợng cho cây lan. Còn đối với các cây trong đất, do lƣợng P cố định, thƣờng các gốc phosphat kết hợp với Fe, Na, Al khó di động. Do đó, nấm rễ ngoại cộng sinh làm nhiệm vụ sản sinh enzyme phosphorase chuyển P không tan thành P hòa tan, tăng khả năng hấp thụ của rễ, cung cấp cho cây trồng. 2.4.3.3 Sự hình thành chất kích thích sinh trƣởng mycorrhiza Trong quá trình cộng sinh với rễ cây, nấm hình thành nhiều chất kích thích sinh trƣởng nhƣ auxin, cytokinin, gibberellin, vitamin B1, indole-3acetic acid (IAA). 25 2.4.3.4 Nâng cao sức chống chịu của cây Nhiều nghiên cứu đều chứng minh, sau khi nhiễm nấm cho cây, cây chủ có khả năng chống khô hạn, chống chịu mặn, nhiệt độ, độ ẩm và pH cực đoan, kim loại nặng. 2.4.3.5 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng Năm 1942, Davis phát hiện nấm rễ cộng sinh có thể làm giảm bớt bệnh hại rễ. Năm 1968, 1982, 1994 nhiều tác giả đều đề cập đến nấm cộng sinh có thể giảm bệnh thối rễ thông xuống 25%, còn làm giảm bệnh do tuyến trùng, bệnh mốc sƣơng, bệnh bƣớu rễ (Trần Văn Mão, 1999) 2.4.4 Sự xâm nhập của mycorrhiza Nấm có thể xâm nhập qua hạt, rễ, hoặc thân. Đối với hạt, nấm mọc xuyên qua hạt vào bên trong lông biểu bì. Còn ở rễ, nấm thƣờng mọc xuyên qua vỏ rễ nơi gần đầu rễ lối vào là một tế bào “cửa” của ngoại bì. Nấm nhanh chóng lan rộng khắp vỏ. Trong mỗi tế bào vỏ rễ, sợi nấm xoắn cuộn dày đặc, đƣợc gọi là “ peleton” (Harley, 1982) 26 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tƣợng thí nghiệm Cả hai nội dung đều làm thí nghiệm trên cây lan 3.2 Thời gian thực hiện Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại phòng nuôi cấy mô_ Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và phòng thực tập bệnh cây _ khoa Nông Học_ trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 3.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo Phôi soma đem bọc vỏ hạt ở các nồng độ alginate khác nhau xác định ảnh hƣởng lên tính chất vỏ hạt nhân tạo. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo Sử dụng môi trƣờng MS có nồng độ khoáng đa lƣợng khác nhau  xác định tỷ lệ sống của hạt nhân tạo. Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo sau khi tạo xong đem lƣu trữ ở các môi trƣờng khác nhau  Xác định điều kiện môi trƣờng bảo quản tối ƣu. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Hạt nhân tạo cho nẩy mầm trên các giá thể khác nhau  xác định tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo. 27 Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan Lấy mẫu rễ lan Dendrobium lai, Dendrobium rừng, Catleya, Ngọc Điểm đem nhuộm quan sát hình dạng và sự có mặt của mycorrhiza trên các giống lan. 3.4 Vật liệu nghiên cứu 3.4.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu Thiết bị: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autolave), máy đo pH, cân điện tử, đèn neon.... Dụng cụ: Pince, kéo, dao cấy, chai nƣớc biển, đĩa petri, đèn cồn, ống đong, pipet... 3.4.2 Mẫu sử dụng và điều kiện nuôi cấy Mẫu: Dùng phôi vô tính hay chồi cây lan. Điều kiện phòng nuôi cấy: Cƣờng độ ánh sáng 2000 lux Nhiệt độ 26 ± 20C Ẩm độ 60-80% Thời gian chiếu sáng:16 giờ/ngày 3.4.3 Môi trƣờng sử dụng Môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm: Môi trƣờng MS (Murashige và Skoog 1962) Thành phần Dang sử dụng nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng (Macro MS) NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 Khoáng vi lƣợng H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 28 (Micro MS) CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 ZnSO4.4H2O 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 KI 0,83 Fe_EDTA FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA.2H2O 37,3 Vitamine Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Thiamine-HCl (B1) 0,1 Glycine 2 Pyridoxine-HCl (B6) 0,5 Các chất khác: Nƣớc cất Đƣờng: 30 g/l Agar: 8 g/l pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8 Ngoài ra còn sử dụng thêm môi trƣờng MS có bổ sung thêm sodium alginate và CaCl2.2H2O 7mM để bọc vỏ nhân tạo Nhuộm rễ: Nƣớc cất, Alkaline H2O2, HCl 1%, Acid Glycerol, Trypan blue. 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.5.1 Chuẩn bị môi trƣờng Tất cả môi trƣờng đều phải đƣợc khử trùng bằng nồi hấp autoclave ở 1210C trong 25 phút, kể cả CaCl2.2H2O 29 3.5.2 Bố trí thí nghiệm Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, lập lại 3 lần. Hạt nhân tạo sau khi bọc vỏ xong cho nẩy mầm trên môi trƣờng MS không có chất kích thích sinh trƣởng. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ alginate 1 MS 10 g/l 2 MS 20 g/l 3 MS 30 g/l 4 MS 40 g/l 5 MS 50 g/l Ghi chú: Số nghiệm thức: 5 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 15 Tổng số hạt: 150 hạt Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tính chất vỏ hạt, tỷ lệ sống của phôi sau khi bọc vỏ hạt Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ alginate 1 MS 30 g/l 2 ½ MS 30 g/l 3 ¼ MS 30 g/l 4 1/8MS 30 g/l 30 Ghi chú Số nghiệm thức: 4 Số bình mỗi nghiệm thức:1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 12 Tổng số hạt: 120 Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tỷ lệ sống của hạt nhân tạo trên môi trƣờng MS Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo Nghiệm thức Môi trƣờng tao hạt Nồng độ alginate Môi trƣờng bảo quản 1 ½ MS 30 g/l Không có dinh dƣỡng 2 ½ MS 30 g/l Nƣớc cất 3 ½ MS 30 g/l Nƣớc đƣờng 4 ½ MS 30 g/l Agar 5 ½ MS 30 g/l Agar có đƣờng 6 ½ MS 30 g/l MS Ghi chú: Số nghiệm thức:6 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 18 Tổng số hạt: 180 Các dạng môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo: Môi trƣờng không dinh dƣỡng: Bình nƣớc biển không, đem hấp khử trùng sau đó cho hạt nhân tạo vào. Môi trƣờng nƣớc cất: Nƣớc cất cho vào mỗi bình 150 ml đem hấp khử trùng Môi trƣờng nƣớc đƣờng: Nƣớc cất bổ sung 30 g/l đƣờng sucrose, cho vào mỗi bình 150 ml đem hấp khử trùng cho hạt nhân tạo vào. Môi trƣờng agar: Nƣớc cất cho vào 8,6 g/l agar, cho vào mỗi bình 70- 80ml đem hấp khử trùng. 31 Môi trƣờng agar đƣờng: Nƣớc cất có 8,6 g/l agar và bổ sung thêm 30 g/l đƣờng cho vào mỗi bình 70-80 ml đem hấp khử trùng. Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi màu sắc của phôi khi bảo quản, tỷ lệ sống của hạt nhân tạo khi bảo quản và khi cho nảy mầm trên môi trƣờng MS Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Nghiệm thức Môi trƣờng tạo hạt Nồng độ alginate Điều kiện nẩy mầm 1 ½ MS 30 g/l MS 2 ½ MS 30 g/l Cầu giấy 3 ½ MS 30 g/l Bông gòn Ghi chú: Số nghiệm thức: 3 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình:10 Tổng số bình: 9 Tổng số hạt: 90 Phƣơng pháp tạo giá thể cầu giấy, bông gòn Cầu giấy: Giấy thấm xếp thành 4 lớp cho vào bình đem hấp khử trùng, sau đó cho vào thêm 40 ml nƣớc cất đã hấp tiệt trùng, cho hạt nhân tạo nằm trên bề mặt giấy. Bông gòn: Bông gòn cắt lớp dày 2 cm cho vào bình đem hấp khử trùng, sau đó cho 40 ml nƣớc cất đã tiệt trùng , cho bông gòn thấm ƣớt rồi bỏ hạt nhân tạo lên bề mặt bông gòn Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của Mycorrhiza trên một số giống lan Lấy mẫu rễ lan Dendrobium lai, Dendrobium rừng, Cattleya, Ngọc Điểm bảo quản trong túi nylon. Mỗi giống lan thu 15 mẫu rễ. Rễ sau khi lấy xong phải cắt mỏng rồi đem nhuộm theo quy trình sau: Rửa sạch rễ thấm khô hấp trong nồi autoclave ở 1210 C-3’ Rửa rễ làm nhiều lần trong nƣớc cất 32 Ngâm rễ trong dung dịch Alkaline H2O2 từ 10’ – 30’ (tuỳ theo màu nâu của rễ ) Rửa rễ nhiều lần Ngâm rễ trong dung dịch HCl 1% trong 1-2 giờ. Khi ngâm trong hoá chất cần phải làm ngập mẫu rễ và lƣợng hoá chất gấp 20 thể tích rễ. Nhuộm rễ trong Acid Glycerol/Trypan Blue 30’ tại 900C trong tủ sấy. Tồn trữ mẫu trong Acidic Glycerol Quan sát hình thái và đánh giá tỷ lệ hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan. 3.6 Xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm STATGRAPHIS 7.0 và phần mềm Excel 33 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan A: Phôi hình tim B: Phôi hình cầu C: Phôi hình lá D: Phôi hình thuỷ lôi Hình 4-2: Các dạng phôi vô tính Phôi soma là cấu trúc lƣỡng cực với cả đỉnh ngọn và vùng mô phân sinh cơ bản, mà khả năng tái sinh hình thành cành non và rễ. Tế bào có khả năng sinh phôi là những tế bào đẳng kính, nhân to, tế bào chất đậm đặc và nhiều hạt tinh bột (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Những tế bào này có hàm lƣợng protein và RNA cao và trải qua các bƣớc: -Sự biệt hoá các tế bào có khả năng sinh phôi thành tế bào phôi. -Sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành thông qua các giai đoạn sau Phôi hình cầu Phôi hình thuỷ lôi Phôi hình tim Phôi hình lá Sau 4 tuần nuôi cấy, bắt đầu xuất hiện những tế bào có cấu trúc giống phôi, phôi hình cầu có cấu tạo non hơn, có màu xanh lá ít hơn so với những dạng phôi khác. 34 A: Phôi hình cầu B: Phôi hình tim C: Phôi hình thuỷ lôi D: Phôi hình lá Hình 4.2: Cấu trúc của phôi vô tính A: Nƣớc cất B: CaCl2.2H2O C: Sodium alginate Hình 4.3: Môi trƣờng tạo hạt nhân tạo A B C 35 A: Hút sodium alginate B: Lấy phôi C: Đƣa phôi vào giọt alginate D: Nhỏ giọt phôi xuống CaCl2 Hình 4.4: Các bƣớc tạo hạt nhân tạo A: Hạt nhân tạo ngâm trong CaCl2.H2O 100 mM trong 20 phút B: Hạt nhân tạo rửa trong nƣớc cất 5 phút Hình 4.5: Sự hình thành hạt nhân tạo 36 Hình 4.6: Cấu tạo vi thể của hạt nhân tạo 4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo * Ảnh hƣởng lên hình thái vỏ hạt nhân tạo Hạt nhân tạo sau khi tạo ở các nồng độ sodium alginate 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l cho ra các hạt nhân tạo có hình thái vỏ khác nhau. Hạt nhân tạo ở nồng độ 10 g/l không định hình đƣợc rõ ràng, vỏ alginate không bọc đƣợc phôi. Bảng 4.1: Nồng độ alginate ảnh hƣởng lên hình thái vỏ hạt nhân tạo NT Môi trƣờng Sodium alginate Hình thái vỏ hạt 1 ½ MS 10 g/l Rất mềm, rất dễ vỡ 2 ½ MS 20 g/l Mềm, không bọc toàn phôi 3 ½ MS 30 g/l Vừa, bọc hạt tròn đẹp 4 ½ MS 40 g/l Dày, hạt tròn đều 5 ½ MS 50 g/l Rất dày, hạt tròn không đều Lớp alginate Phôi vô tính 37 A: Nồng độ alginate 10 g/l B: Nồng độ alginate 20 g/l C: Nồng độ alginate 30 g/l D: Nồng độ alginate 40 g/l E: Nồng độ alginate 50 g/l Hình 4-7: Hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau *Ảnh hƣởng lên khả năng bảo quản Hạt nhân tạo ở nồng độ sodium alginate 20 g/l,30 g/l, 40 g/l, 50g/l tạo hình dạng hạt rõ ràng, đƣa những hạt nhân tạo này lên môi trƣờng MS không có chất kích thích sinh trƣởng, theo dõi tỷ lệ sống của hạt nhân tạo trong khoảng thời gian dãn cách 1 tuần. 38 Bảng 4.2: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate NT Nồng độ alginate Tỷ lệ sống (%) 1tuần 1tuần 3tuần 1 10 g/l - - - 2 20 g/l 80,43 B 78,02 B 71,63B 3 30 g/l 75,41 AB 70,25 AB 69,82 B 4 40 g/l 62,68 A 58,02 A 55,28 A 5 50 g/l 60,66 A 58,98 A 55,59 A CV 18,82 23,25 17,87 Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học Biểu đồ 4-1: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau *Ảnh hƣởng lên tỷ lệ nẩy mầm Ngoài theo dõi tỷ lệ sống của hạt nhân tạo, tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo trên môi trƣờng MS cũng quan trọng 1 2 3 Tuần 39 Bảng 4.3: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau NT Nồng độ alginate Tỷ lệ nẩy mầm sau 3 tuần Tỷ lệ nẩy mầm sau 4 tuần 1 10 g/l - 2 20 g/l 61% B 66,41 B 3 30 g/l 56 % B 71,60 B 4 40 g/l 31% A 39,68 A 5 50 g/l 26% A 42,62 A CV 14,66% 20,8% Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học Kết luận sơ bộ: Ở nồng độ alginate 10 g/l, 20 g/l vỏ hạt nhân tạo rất dễ vỡ, không hình thành vỏ hạt rõ ràng. Với nồng độ alginate 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l vỏ hạt nhân tạo cứng và bọc toàn bộ phôi/chồi. Trong đó, nồng độ 30 g/l làm cho hạt nhân tạo tròn đẹp, có độ cứng vừa phải. Ở nồng độ 20 g/l và 30 g/l, tỷ lệ hạt nhân tạo sống sót và nẩy mầm cao hơn so với 40 g/l và 50 g/l có sự khác biệt về mặt thống kê. Do đó, có thể sử dụng nồng độ alginate 30 g/l để tạo hạt nhân tạo, vừa có hình thái đẹp và tỷ lệ nẩy mầm cao. Hình 4-8: Hạt nhân tạo nẩy mầm 4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo * Khảo sát khả năng bảo quản hạt trên môi trƣờng MS Vỏ hạt nhân tạo bên cạnh bị ảnh hƣởng bởi nồng độ sodium alginate còn bị ảnh hƣởng bởi môi trƣờng dinh dƣỡng bổ sung trong vỏ hạt. Vì nhờ môi trƣờng này mà cung cấp dinh dƣỡng cho phôi sống và nẩy mầm khi gặp điều kiện thuận lợi 40 Môi trƣờng sử dụng bổ sung cho vỏ hạt nhân tạo là môi trƣờng MS và môi trƣờng MS giảm dần khoáng đa lƣợng nhƣ môi trƣờng ½ MS, ¼ MS, 1/8 MS. Hạt nhân tạo sau đó đƣợc đem gieo trên môi trƣờng MS, theo dõi tỷ lệ sống của phôi hạt nhân tạo sau khoảng thời gian 1 tuần. Bảng 4.4: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau NT Môi trƣờng Tỷ lệ sống (%) 1 tuần 2 tuần 3 tuần 1 MS 91,00 NS 73,33 NS 49,67 B 2 ½ MS 86,00NS 70,67NS 55,67B 3 ¼ MS 87,33NS 81,00NS 34,67A 4 1/8 MS 77,33 NS 70,00 NS 36,67 A CV 9,42% Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học Biểu đồ 4-2: Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo ở môi trƣờng khác nhau 41 *Khảo sát tỷ lệ hạt nẩy mầm Khoáng đa lƣợng có trong vỏ hạt nhân tạo cũng ảnh hƣởng đến tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo trên môi trƣờng MS Bảng 4.5: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau NT Môi trƣờng Tỷ lệ nẩy mầm sau 3 tuần (%) Tỷ lệ nẩy mầm sau 4 tuần (%) 1 MS 52,33 B 53,80 A 2 ½ MS 71,67A 71,42B 3 ¼ MS 40,00B 50,40A 4 1/8 MS 39,00 B 47,78 A CV 18,05 14,65 Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học Kết luận sơ bộ: Ở thí nghiệm 2, chúng tôi nhận thấy hạt nhân tạo của phôi cây lan có vỏ bọc môi trƣờng nhân tạo MS,1/2MS có tỷ lệ sống sót cao hơn các môi trƣờng tạo hạt khác (1/4 MS, 1/8MS) có sự khác biệt về mặt thống kê. Còn ở môi trƣờng ½ MS tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo cao nhất (72%), thích hợp cho việc tạo hạt nhân tạo phôi cây lan Vanda. 4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo * Ảnh hƣởng đến vỏ hạt Hạt nhân tạo có vỏ bọc tối ƣu (1/2 MS, 30 g/l alginate) đƣợc thí nghiệm bảo quản ở các môi trƣờng khác nhau. 42 Bảng 4.6:Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo NT Môi trƣờng Nồng độ alginate Môi trƣờng bảo quản Hình thái vỏ hạt 1 ½ MS 30 g/l Không dinh dƣỡng Vỏ hạt khô cứng, màu xanh 2 ½ MS 30 g/l Nƣớc cất Vỏ hạt mềm vỡ ra, màu xanh 3 ½ MS 30 g/l Nƣớc đƣờng Vỏ hạt mềm nở ra, màu xanh 4 ½ MS 30 g/l Agar Hạt màu vàng, nâu đen 5 ½ MS 30 g/l Agar có đƣờng Hạt xanh vàng, 6 ½ MS 30 g/l MS Hạt vẫn giữ đƣợc hình dạng cũ A: Nƣớc cất B: Nƣớc đƣờng C: Không có chất dự trữ D: Agar E: Agar đƣờng F: Môi trƣờng MS Hình 4-9: Hạt nhân tạo trên các môi trƣờng bảo quản Kết luận sơ bộ:Trong môi trƣờng lỏng (nƣớc cất và nƣớc đƣờng), vỏ hạt bị nƣớc thẩm thấu mềm và vỡ ra, không bao đƣợc phôi, hạt nhân tạo vẫn giữ đƣợc màu xanh đậm. Trong môi trƣờng không có chất dinh dƣỡng, vỏ hạt nhân tạo khô bám chặt vào phôi. Còn môi trƣờng agar và agar có đƣờng, hạt bị vàng hoặc nâu đen. Môi trƣờng MS, hạt nhân tạo vẫn giữ đƣợc nguyên hình thái ban đầu, màu sắc và hình thái đều không thay đổi. 43 *Khảo sát tỷ lệ nẩy mầm sau khi bảo quản Hạt nhân tạo sau khi bảo quản trong 3 tuần, đem tất cả hạt nhân tạo ở mỗi loại cho nẩy mầm trên môi trƣờng MS, theo dõi tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo. Bảng 4.7: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo sau khi bảo quản NT Môi trƣờng Nồng độ alginate Môi trƣờng bảo quản Tỷ lệ nẩy mầm (%) 1 ½ MS 30 g/l Không dinh dƣỡng 18,67A 2 ½ MS 30 g/l Nƣớc cất 15,33A 3 ½ MS 30 g/l Nƣớc đƣờng 20,00A 4 ½ MS 30 g/l Agar 10,00A 5 ½ MS 30 g/l Agar có đƣờng 24,67A 6 ½ MS 30 g/l MS 71,67B CV 2,6 Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học Kết luận sơ bộ: Qua bảng trên, chúng tôi nhận thấy hạt nhân tạo từ phôi cây lan bảo quản trên môi trƣờng MS có tỷ lệ nẩy mầm cao hơn trên các môi trƣờng bảo quản khác về mặt thống kê học. 4.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Hạt sau khi tạo xong cho nẩy mầm ở 3 môi trƣờng khác nhau cầu giấy, bông gòn, MS 44 Bảng 4.8: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể NT Môi trƣờng tạo hạt Nồng độ alginate Điều kiện nẩy mầm Tỷ lệ nẩy mầm (%) 1 ½ MS 30 g/l MS 65,00A 2 ½ MS 30 g/l Cầu giấy 86,33AB 3 ½ MS 30 g/l Bông gòn 94,33B CV 17,08 % Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học A: Bông gòn B: Cầu giấy C: Môi trƣờng MS Hình 4-10: Hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể Kết luận sơ bộ: Qua thí nghiệm 4, chúng tôi nhận thấy giá thể bông gòn có hạt nhân tạo nẩy mầm với tỷ lệ cao (88,63) so với cầu giấy (68,64) và môi trƣờng MS đặc (53,65), có sự khác biệt về mặt thống kê. 45 4.2 Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza ở các giống lan Sau khi thu thập, nhuộm rễ quan sát dƣới kính hiển vi, chúng tôi quan sát mycorrhiza bắt màu xanh đậm, có các dạng sau: -Sợi nấm ăn màu xanh, phân nhiều nhánh ăn xuyên qua nhiều lớp tế bào -Sợi nấm cuộn tròn trong 1 tế bào -Sợi nấm là các cuộn tròn nằm ở các tế bào, nối với nhau bằng sợi nấm Bảng 4.9: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan Giống Số cây lấy mẫu Số cây có mycorrhiza % cây có mycorrhiza DENDROBIUM RỪNG 15 13 87 DENDROBIUM LAI 15 10 67 CATTLEYA 1 LÁ 15 12 80 CATTLEYA 2 LÁ 15 12 80 NGỌC ĐIỂM 15 7 47 ONCIDIUM 50 32 64 VANDA 50 6 12 MOKARA 50 15 30 (Riêng giống Oncidium, Vanda, Mokara tham khảo số liệu của Ngô Huỳnh Thanh Vân, 2005.) 46 Biểu đồ 4.3: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan Qua bảng số liệu và biểu đồ, chúng tôi nhận thấy hầu hết các giống lan đều có mycorrhiza cộng sinh, giúp cây lan phát triển tốt hơn. Tuy nhiên sự hiện diện ở các giống lan có sự khác biệt rõ rệt. Mycorrhiza hiện diện nhiều nhất ở Dendrobium (77%), ít nhất ở Vanda (12%). Ở những giống lan độc trụ nhƣ Mokara, Ngọc Điểm, Vanda thì sự có mặt của mycorrhiza kém hơn so với cây lan đa thân. Cây Dendrobium rừng (87%) có tỷ lệ mycorrhiza nhiều hơn so với cây Dendrobium lai (67%). Còn giữa loài Cattleya 1 lá và Cattleya 2 lá thì tỷ lệ hiện diện của mycorrhiza là ngang bằng nhau, không có sự khác biệt. Nguyên nhân: Do hình thức phát triển của rễ Do nguồn gốc cây lan trồng Do cách chăm sóc nhƣ phun thuốc trừ sâu làm giảm lƣợng nấm. 47 Hình 4-11: Vùng mô có mycorrhiza A, B: Sợi nấm đa bào, xuyên qua các tế bào C: Nấm có những u to tròn ở cuối sợi nấm D: Nấm cuộn tròn trong tế bào. Hình 4-12: Các dạng mycorrhiza C D Có mycorrhiza Không có mycorrhiza 48 A: Sợi nấm cuộn lại có 2 đầu đƣa ra bên ngoài B: Các cuộn nấm nối với nhau bằng các sợi nấm, sợi nấm có vách ngăn Hình 4-13: Dạng mycorrhiza cuộn tròn 49 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận * Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda có hình dạng đẹp, tỷ lệ nẩy mầm cao khi nồng độ sodium alginate (30 g/l) và môi trƣờng dinh dƣỡng (1/2 MS) bổ sung vào vỏ hạt nhân tạo thích hợp cho phôi cây lan Vanda. Môi trƣờng bảo quản (MS) thích hợp cho việc lƣu trữ hạt nhân tạo, bảo đảm chất lƣợng và tỷ lệ nẩy mầm cao cho hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo nẩy mầm cho tỷ lệ cao (bông gòn thấm 40 ml nƣớc cất), vì sợi gòn xốp tạo môi trƣờng thông thoáng, khô ráo, giữ độ ẩm lâu nên thích hợp cho hạt nhân tạo nẩy mầm * Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan Mycorrhiza xuất hiện ở giống lan đa thân cao hơn ( 64-87%) còn ở lan đơn thân thì tỷ lệ này thấp hơn ( 12-47%) vì vậy cây đa thân hút dinh dƣỡng tốt hơn, ít bị hiện tƣợng thiếu hụt khoáng hơn so với cây đơn thân. Mycorrhiza ở cây cấy mô (Dendrobium lai 67%) có tỷ lệ thấp hơn so với cây lan có nguồn gốc tự nhiên (Dendrobium rừng 87%) 5.2 Đề nghị * Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Tiếp tục khảo sát các điều kiện và môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo lâu hơn vẫn cho tỷ lệ nẩy mầm cao hơn khi gieo hạt nhân tạo ở điều kiện thích hợp. Tìm giá thể khác gieo hạt nhân tạo có giá rẻ nhƣng có tỷ lệ nẩy mầm cao. * Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan Tiếp tục nghiên cứu phân lập và định danh tên các dạng mycorrhiza trên cây lan. 50 Tiếp tục thu thập nhiều mẫu rễ lan và thực hiện trên nhiều loài lan để đƣa ra kết luận chính xác, chi tiết hơn. Nghiên cứu ảnh hƣởng của mycorrhiza trên sự sinh trƣởng của cây lan trong nuôi cấy in vitro. 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Bá Bổng, 1995. Nhân giống c ây bằng nuôi cấy mô. Nhà Xuất Bản Sở Khoa Học Công Nghệ Và Môi Trƣờng An Giang. 2. Lee S. Cooke, 1995. Sâu bệnh hại cây hoa lan. (Nguyễn Minh Trực dịch). Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp. 3. Dƣơng Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật (tập 1). Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh 4. Nguyễn Đức Lƣợng, Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà Xuất Bản 5. Trần Văn Mão, 1999. Sử dụng vi sinh vật có ích (tập 2). Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp 6. Nguyễn Công Nghiệp, 1999. Trồng hoa lan. Nhà Xuất Bản Trẻ 7. Liêu Hồng Phú, 2005. Khoá luận tốt nghiệp (Đại Học Nông Lâm) 8. Trịnh Pari, 2004. Luận văn thạc sĩ (Đại Học Nông Lâm 9. Nguyễn Thiện Tịch, Đoàn Thị Hoa, Trần Sĩ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Nhân, 1996. Kỹ thuật nuôi trồng hoa lan. Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp. 10. Trần Ngọc Thuỷ Tiên, 2004. Khoá luận tốt nghiệp (Đại Học Khoa Học Tự Nhiên) 11. Ngô Huỳnh Thanh Vân, 2005. Khoá luận tốt nghiệp (Đại Học Nông Lâm) 12. Câu lạc bộ học viên hoa lan, 1999. Tìm hiểu hoa lan. Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp *Tài liệu nƣớc ngoài: 1. Supriyanto, Jahja T. K., 1995. Biology and biotechnology of mycorrhiza. Southeast Asian Regional Centre for Tropical Biology Bogor, Indonesia 2. Mukerji K.G., Manoharachary C., Chamola B.P., 2001. Techniques in mycorrhiza studies. Kluwer Academic Publishers. 52 3. Sharp W.R., Sondah M.R., Caldas L.S and Maraffo S.B.,1980. The phisiology of in vitro asexual embryogenesis. Hortie 4. Fujimura T. and Komamine A., 1979. Synchronization of somatic embryogenesis in carrot cell suspension culture. Plant physiol 5. Redenbaugh K. et al., 1986. Somatic seed: encapsulation of asexual plant embryo. Biotechnology *Tài liêu từ internet ?config 53 PHỤ LỤC Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 1 tuần One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: tn1.ss Level codes: tn1.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------------------------ Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------------------------ Between groups 1672.8675 3 557.62249 3.230 .0442 Within groups 3452.8019 20 172.64009 ------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 5125.6693 23 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- ---------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.528615 P = 0.123637 Bartlett's test: B = 1.67499 P(9.52264) = 0.0230917 Hartley's test: 21.2296 Multiple range analysis for tn1.ss by tn1.t ------------------------------------------------------------------------------------------ Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------------------------ 4 6 60.656667 X 3 6 62.676667 X 2 6 75.410000 X X 1 6 80.430000 X ----------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 12.7333 15.8279 2 - 4 14.7533 15.8279 2 - 1 -5.02000 15.8279 3 - 4 2.02000 15.8279 3 - 1 -17.7533 15.8279 * 4 - 1 -19.7733 15.8279 * ----------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 54 Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 2 tuần One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: Tn1.ss Level codes: tn1.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ----------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ----------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1649.8414 3 549.94713 2.312 .1069 Within groups 4756.3131 20 237.81565 ----------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 6406.1544 23 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------------------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.566161 P = 0.0720209 Bartlett's test: B = 1.7141 P(9.94876) = 0.0190068 Hartley's test: 20.1912 Multiple range analysis for tn1.ss by tn1.t -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 6 58.020000 X 4 6 58.983333 X 2 6 70.250000 X X 1 6 78.016667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 12.2300 18.5768 2 - 4 11.2667 18.5768 2 - 1 -7.76667 18.5768 3 - 4 -0.96333 18.5768 3 - 1 -19.9967 18.5768 * 4 - 1 -19.0333 18.5768 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 55 Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 3 tuần One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------------------- Data: Tn1.ss Level codes: Tn1.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ----------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1490.3449 3 496.78165 3.882 .0245 Within groups 2559.2726 20 127.96363 ---------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 4049.6176 23 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.644031 P = 0.0191185 Bartlett's test: B = 1.47409 P(7.16388) = 0.0668539 Hartley's test: 8.17543 Multiple range analysis for tn1.ss by tn1.t ----------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ----------------------------------------------------------------------------------------------- 3 6 55.280000 X 4 6 55.586667 X 2 6 70.725000 X 1 6 71.633333 X ----------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 15.4450 13.6268 * 2 - 4 15.1383 13.6268 * 2 - 1 -0.90833 13.6268 3 - 4 -0.30667 13.6268 3 - 1 -16.3533 13.6268 * 4 - 1 -16.0467 13.6268 * ----------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 56 Thí nghiệm 1: Tỷ lệ nẩy mầm sau 3 tuần One-Way Analysis of Variance ---------------------------------------------------------------------------------------- Data: Tn1.nm Level codes: Tn1.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ----------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ----------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups .2740917 3 .0913639 22.559 .0003 Within groups .0324000 8 .0040500 ----------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .3064917 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.598765 P = 0.258378 Bartlett's test: B = 1.52419 P(2.79038) = 0.425086 Hartley's test: 15.3158 Multiple range analysis for Tn1.nm by tn1.t ----------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ---------------------------------------------------------------------------------------------- 4 3 .2633333 X 3 3 .3066667 X 2 3 .5566667 X 1 3 .6100000 X ----------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 0.25000 0.11986 * 2 - 4 0.29333 0.11986 * 2 - 1 -0.05333 0.11986 3 - 4 0.04333 0.11986 3 - 1 -0.30333 0.11986 * 4 - 1 -0.34667 0.11986 * ----------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 57 Thí nghiệm 1: Tỷ lệ nẩy mầm sau 4 tuần One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN12.nm Level codes: TN12.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .2380639 3 .0793546 5.890 .0201 Within groups .1077792 8 .0134724 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .3458431 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.423889 P = 0.764855 Bartlett's test: B = 1.30398 P(1.75728) = 0.624276 Hartley's test: 7.37675 Multiple range analysis for TN12.nm by TN12.t -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 3 .3968254 X 4 3 .4262372 X 1 3 .6641026 X 2 3 .7160062 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.05190 0.21860 1 - 3 0.26728 0.21860 * 1 - 4 0.23787 0.21860 * 2 - 3 0.31918 0.21860 * 2 - 4 0.28977 0.21860 * 3 - 4 -0.02941 0.21860 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 58 Thí nghiệm 2:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 1 tuần One-Way Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------------------- Data: TN2.ss Level codes: tn2.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ----------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ----------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 144.6845 3 48.22816 .100 .9578 Within groups 3863.6698 8 482.95872 ---------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 4008.3543 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ----------------------------------------------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.361364 P = 1 Bartlett's test: B = 1.03615 P(0.235114) = 0.971731 Hartley's test: 2.07152 Multiple range analysis for TN2.ss by tn2.t ---------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ---------------------------------------------------------------------------------------------- 4 3 69.486667 X 2 3 75.213333 X 3 3 76.106667 X 1 3 79.070000 X ---------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 -0.89333 41.3896 2 - 4 5.72667 41.3896 2 - 1 -3.85667 41.3896 3 - 4 6.62000 41.3896 3 - 1 -2.96333 41.3896 4 - 1 -9.58333 41.3896 ---------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 59 Thí nghiệm 2:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 2 tuần One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------------------- Data: tn2.ss Level codes: tn2.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 68.09663 3 22.698875 .317 .8131 Within groups 573.17567 8 71.646958 --------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 641.27229 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.503208 P = 0.490437 Bartlett's test: B = 1.95629 P(4.44283) = 0.217447 Hartley's test: 14.7063 Multiple range analysis for tn2.ss by tn2.t -------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------------------------- 4 3 57.703333 X 2 3 59.106667 X 1 3 59.696667 X 3 3 64.076667 X ------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 -4.97000 15.9417 2 - 4 1.40333 15.9417 2 – 1 -0.59000 15.9417 3 - 4 6.37333 15.9417 3 - 1 4.38000 15.9417 4 - 1 -1.99333 15.9417 ------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 60 Thí nghiệm 2:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 3 tuần One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------------------------- Data: tn2.ss Level codes: tn2.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 308.28820 3 102.76273 6.689 .0143 Within groups 122.90087 8 15.36261 ----------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 431.18907 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- ----------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.834815 P = 0.0180291 Bartlett's test: B = 3.97505 P(9.1368) = 0.0275263 Hartley's test: 108.678 Multiple range analysis for tn2.ss by tn2.t -------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------------------------- 3 3 36.123333 X 4 3 37.266667 X 1 3 44.843333 X 2 3 48.193333 X ---------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 12.0700 7.38191 * 2 - 4 10.9267 7.38191 * 2 - 1 3.35000 7.38191 3 - 4 -1.14333 7.38191 3 - 1 -8.72000 7.38191 * 4 - 1 -7.57667 7.38191 * ----------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 61 Thí nghiệm 2: Tỷ lệ nẩy mầm sau 3 tuần One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------------------------- Data: tn2.nm Level codes: tn2.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups .2080917 3 .0693639 8.266 .0078 Within groups .0671333 8 .0083917 -------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .2752250 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances -------------------------------------------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.480636 P = 0.560372 Bartlett's test: B = 1.3808 P(2.13625) = 0.544614 Hartley's test: 12.4103 Multiple range analysis for tn2.nm by tn2.t --------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------------------------- 4 3 .3900000 X 3 3 .4000000 X 1 3 .5233333 X 2 3 .7166667 X ---------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 0.31667 0.17253 * 2 - 4 0.32667 0.17253 * 2 - 1 0.19333 0.17253 * 3 - 4 0.01000 0.17253 3 - 1 -0.12333 0.17253 4 - 1 -0.13333 0.17253 ----------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 62 Thí nghiệm 2: Tỷ lệ nẩy mầm sau 4 tuần One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN22.nm Level codes: TN22.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .1024765 3 .0341588 5.100 .0291 Within groups .0535860 8 .0066982 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .1560625 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.335218 P = 1 Bartlett's test: B = 1.08099 P(0.515576) = 0.915456 Hartley's test: 2.8392 Multiple range analysis for TN22.nm by TN22.t -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 3 .4777778 X 3 3 .5039683 X 1 3 .5379915 X 2 3 .7142191 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.17623 0.15414 * 1 - 3 0.03402 0.15414 1 - 4 0.06021 0.15414 2 - 3 0.21025 0.15414 * 2 - 4 0.23644 0.15414 * 3 - 4 0.02619 0.15414 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 63 Thí nghiệm 3: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo sau khi bảo quản One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN32.nm Level codes: TN32.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .7630944 5 .1526189 22.154 .0000 Within groups .0826667 12 .0068889 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .8457611 17 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.51371 P = 0.163166 Bartlett's test: B = 260862 P(125.298) = 0 Hartley's test: 7.34998E31 Multiple range analysis for TN32.nm by TN32.t -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 3 .1000000 X 2 3 .1533333 X 1 3 .1866667 X 3 3 .2000000 X 5 3 .2466667 X 6 3 .7166667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 -0.04667 0.14769 2 - 4 0.05333 0.14769 2 - 5 -0.09333 0.14769 2 - 6 -0.56333 0.14769 * 2 - 1 -0.03333 0.14769 3 - 4 0.10000 0.14769 3 - 5 -0.04667 0.14769 * denotes a statistically significant difference. 64 Thí nghiệm 4: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo trê n các giá thể One-Way Analysis of Variance ---------------------------------------------------------------------------------------------- Data: tn4.nm Level codes: tn4.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1847.6009 2 923.80043 6.408 .0324 Within groups 865.0445 6 144.17409 ----------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 2712.6454 8 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ----------------------------------------------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.895096 P = 0.0330148 Bartlett's test: B = 2.50508 P(4.50812) = 0.104972 Hartley's test: 21.5492 Multiple range analysis for tn4.nm by tn4.t ----------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ---------------------------------------------------------------------------------------------- 1 3 53.653333 X 2 3 68.636667 XX 3 3 88.630000 X --------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 2 - 3 -19.9933 23.9965 2 - 1 14.9833 23.9965 3 - 1 34.9767 23.9965 * --------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 65 Bảng số liệu Thí nghiệm 1:Tỷ lệ hạt nhân tạo sống sót chưa biến đổi arcsin alginate 20 g/l 30g/l 40 g/l 50g/l 1 tuần 90 82 75 89 1 tuần 100 100 75 76 1 tuần 88 77 86 60 2 tuần 89 73 73 89 2 tuần 100 100 62 68 2 tuần 80 63 80 60 3 tuần 85 73 64 80 3 tuần 99 100 57 65 3 tuần 80 60 80 58 Thí nghiệm 1:Tỷ lệ nẩy mầm ở các nồng độ alginate sau 3 tuần 20 g/l 30 g/l 40 g/l 50 g/l lần 1 0,69 0,56 0,27 0,20 lần 2 0,64 0,58 0,36 0,27 lần 3 0,50 0,53 0,29 0,32 Thí nghiệm 1:Tỷ lệ nẩy mầm ở các nồng độ alginate sau 4 tuần 20 g/l 30 g/l 40 g/l 50 g/l Lần 1 0,70 0,77 0,33 0,33 Lần 2 0,69 0,83 0,50 0,59 Lần 3 0,60 0,55 0,36 0,36 66 Thí nghiệm 2: Tỷ lệ sống sót ở các môi trường dinh dưỡng chưa biến đổi arsin MS 1/2 MS 1/4 MS 1/8 MS 1 tuần 0,83 1,00 1,00 0,65 1 tuần 1,00 0,83 0,80 0,67 1 tuần 0,90 0,75 0,82 1,00 2 tuần 0,91 0,70 0,79 0,90 2 tuần 0,65 0,69 0,78 0,60 2 tuần 0,64 0,73 0,86 0,60 3 tuần 0,45 0,60 0,33 0,38 3 tuần 0,40 0,57 0,37 0,36 3 tuần 0,64 0,50 0,34 0,36 Thí nghiệm 2: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm sau 3 tuần MS 1/2 MS 1/4 MS 1/8 MS lần 1 0,45 0,8 0,33 0,4 lần 2 0,67 0,73 0,5 0,35 lần 3 0,45 0,62 0,37 0,42 Thí nghiệm 2: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm sau 4 tuần MS 1/2 MS 1/4 MS 1/8 MS Lần 1 0,48 0,73 0,43 0,45 Lần 2 0,54 0,80 0,58 0,58 Lần 3 0,59 0,62 0,50 0,40 67 Thí nghiệm 3: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm sau khi bảo quản Không dinh dưỡng Nước cất Nước đường Agar Agar đường MS Lần 1 0,24 0,18 0,3 0,1 0,11 0,7 Lần 2 0,22 0,08 0,2 0,1 0,4 0,73 Lần 3 0,1 0,2 0,1 0,1 0,23 0,72 Thí nghiệm 4: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm chưa biến đổi arcsin MS Cầu giấy Bông gòn 0,60 0,87 1,00 0,73 0,80 0,83 0,62 0,92 1,00