Khóa luận Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng Sapa (cymbidium iridioides) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

việc sử dụng các đĩa giếng gồm 24 đĩa với kích thước 1,6 cm để làm vật liệu chứa. Mỗi đĩa đựng một thể tích môi trường xác định sao cho tỉ lệ thể tích không khí trên thể tích môi trường thích hợp. Một màng nhựa mỏng có kích thước đàn hồi đã cách li mỗi cá thể theo trật tự để ngăn ngừa sự thay đổi giữa các đĩa riêng biệt và sự nhiễm vi sinh vật. Đĩa được bịt kín với hai lớp màng (urgo) phương pháp này có ưu điểm là sự phân bố ngẫu nhiên các mẫu cấy TCL trong mỗi đĩa. Nhờ đó giảm được kích cỡ của của các đĩa giếng và lát mỏng tiếp xúc được với các điều kiện đồng nhất của môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2 ) dẫn đến giảm sự biến động. Quy trình kỹ thuật về nuôi cấy mô tế bào Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước: Bước 0: chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in - vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu in - vitro. Bước 1: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in - vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn , đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá, chồi ngọn, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc .. Bước 2: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vấn đề này phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều xitokynin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là 25- 270C và 16 giờ chiếu sáng/ ngày, cường độ ánh sáng 2000- 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh suplơ cần quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối. Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Bước 4: Thích ứng cây in - vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: + Cây trong ống nghiệm đã đạt được những tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá, số rễ, chiều cao cây). + Có giá thể tiếp nhận cây in - vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. + phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [17]. Các vấn đề cần quan tâm trong nhân giống in - vitro Tính bất định về mặt di truyền (genetic in stability) Mục đích của nhân giống in - vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất (Tue-to-type) với số lượng rất lớn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra những biến dị soma. Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh. Dạng biến dị phổ biến là bạch tạng, sọc lá, sinh trưởng của cây bất thường, hệ số nhân in - vitro cũng giảm sút. Nhiều cây khi trồng trên đồng ruộng có số lá trên 100 lá vẫn chưa ra hoa kết quả trong khi cây bình thường có thể xử lý ra hoa khi cây có mặt 40 lá. Sự nhiễm mẫu (explantcontamination) Các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy. Tuy nhiên một số loại vi khuẩn như Agrobacterium, Bacillus, Corylabactorium, Erwinnia và Pscudomnas có thể xâm nhập vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1 – 2 tuần nuôi cấy). Để khắc phục được hiện tượng trên, trước hết cần phải lựa chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn. Người ta cũng có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện tượng nhiễm khuẩn và nấm mốc. Nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và có phản ứng lên kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi sử dụng kháng sinh. Chất kháng sinh thường gây ra những huỷ hoại ở ti thể và lạp thể nên có ảnh hưởng đến di truyền tế bào chất. Sự tiết độc tố từ mẫu cấy (Toxic compounds) Trong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hoá nâu hay đen mẫu, mẫu này có thể khuyếch tán trong môi trường. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol. Thí dụ các chất phenol: encomicaxit và tyramine đã làm hoá nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôicấy. Các phương pháp phòng trừ sự hoá nâu: + Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy (0,1 - 0,3%) phương pháp này đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và Aerides. Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ một số chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết khác. + Bổ sung Poly Vinyl Pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt. + Sử dụng mô non gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng. + Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và citric vài giờ trước khi cấy. + Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng oxi thấp, không có ánh sáng (1 – 2 tuần). + Cấy chuyển mẫu liên tục sang môi trường tươi trong 1 - 2 tuần. Hiện tượng thuỷ tinh hoá (vitri fication, hyperhy dricity) Trong quá trình nhân nhanh in - vitro thường xuất hiện hiện tượng cây bị “thuỷ tinh hoá” – thân lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khó sống khi đưa ra ngoài môi trường do bị mất nước rất mạnh. Hiện tượng này thường xảy ra khi nuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường ít agar, sự trao đổi khí thấp. Cây bị thuỷ tinh hoá thường có hàm lượng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tử phân cực nên dễ hấp thụ nước. Cây in - vitro thường có mật độ khí khổng cao, khí khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong quá trình nuôi cấy nên khi đưa ra môi trường tự nhiên dễ mất nước. Để khắc phục hiện tượng thuỷ tinh hoá có thể tiến hành một số giải pháp: + Giảm sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng độ đường hoặc các chất gây áp suất thẩm thấu cao. + Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trường. + Giảm sự sản sinh etylen trong bình nuôi cấy. + Xử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh trưởng. + Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi [17]. Quy trình trồng và chăm sóc cây Địa lan nhân bằng nuôi cấy mô Tuy việc trồng lan trên thực tế không khó khăn lắm, nhưng lan là một loài hoa phát triển theo một nhịp điệu nghiêm ngặt trong đời sống của nó. Đối với cây con sau giai đoạn ống nghiệm, dù là từ gieo hạt hay từ nuôi cấy mô, cho đến khi trưởng thành, chỉ cần chúng ta xử lý sai trong mỗi giai đoạn phát triển của nó hay nói một cách khác là không phù hợp với sinh lý, sinh thái của nó có thể làm cho chúng chết hàng loạt, hoặc chậm lớn, chậm ra hoa, thậm chí không ra hoa. Cây lan sau khi đã được nhân nhanh bằng phương pháp in - vitro sẽ được đưa ra vườn ươm. Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dưỡng sang trạng thái sống hoàn toàn tự dưỡng do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh phù hợp để cây con có thể phát triển tốt nhất [20]. Giai đoạn lấy từ trong ống nghiệm ra Đây là thời điểm mà người ta thường ít chú ý. Nhưng nếu không làm cẩn thận, nó có thể ảnh hưởng xấu đến việc phát triển của cây con sau này. Việc lấy cây con ra phải thật nhẹ nhàng, tránh làm dập lá, gẫy rễ, nhất là trong lúc rửa sạch hết thạch của môi trường dinh dưỡng còn bám vào rễ. Đối với các giống như Vanda, rễ to, cây cứng, làm sạch thạch dễ dàng hơn đối với những cây quá mảnh mai như Cymbidium, Dendrobium. Đối với rễ của Cymbidium trong ống nghiệm có lông bám khá chắc thạch của môi trường dinh dưỡng và rễ thường đan với nhau nên phải tỉ mẩn, cẩn thận. Phải rửa thật sạch thạch, tách riêng từng cây và loại bỏ những mô callus còn sót nếu không cây sẽ bị nhiễm khuẩn khi đưa ra ươm trong vườn [20]. Sau khi rửa sạch cây, dùng nước sạch có pha thêm một ít thuốc trừ nấm, thuốc sát khuẩn với nồng độ loãng (khoảng 1g/lít) nhúng cây con vào mục đích để trừ nấm hại cây con khi cây còn quá mảnh mai, yếu ớt [20]. Giai đoạn ở trong chậu chung Giai đoạn ở trong chậu chung là giai đoạn khó khăn và quan trọng nhất của việc trồng cây lan con. Rebecca Tyson Northen (nhà trồng lan người Mỹ) trong cuốn “Home Orchid Growing” (1974) chỉ dẫn như sau: Lan con lấy từ ống nghiệm ra được cho vào dung dịch sát khuẩn, sau dùng kẹp để gắp cây con vào trồng trong chậu chung. Chất liệu trồng là ba phần vỏ thông xay nhuyễn, với một phần cát, hoặc tám phần Osmunda (một chất liệu như rễ dớn của ta) xay nhuyễn, một phần cát và một phần than vụn. Tất cả chất liệu này đều được luộc kỹ để diệt nấm và diệt trùng. Pha loãng dung dịch phân bón, một phần tư muỗng cà phê phân bón với một ga-lông (bằng 4,5 lít nước) ngay tức khắc sau khi trồng phun vào cây. Đời sống cộng đồng của chúng kéo dài một năm. Water Richter (một nhà trồng lan nổi tiếng người Đức) trong cuốn “Orchideen, Pilezen, Vermehren, Zuchten” thì viết như sau: “Để trồng cây từ ống nghiệm ra người ta chuẩn bị chất nuôi cây gồm than bùn, than củi và cát với tỉ lệ ngang nhau, hạt khá nhỏ, độ ẩm bình thường. Đồ đựng là các chậu đất hoặc đĩa, 1/3 phía dưới người ta cho mảnh sành. Phía trên là các chất nuôi cây để khoảng cách từ 2-3 cm. Giai đoạn ở trong chậu chung đối với từng loại lan là khác nhau và chế độ che sáng cũng khác nhau thường tránh để ánh sáng trực tiếp chiếu vào cây. Đánh giá cây con khỏe mạnh và có thể chuyển sang giai đoạn chậu con thì phải đạt ở tiêu chuẩn sau đây: Giả banh và lá phải xanh, cứng, không còn quá mọng nước như khi mới lấy ở ống nghiệm ra. Rễ còn nguyên vẹn, có màu trắng xanh, đầu rễ bắt đầu phát triển, nhú lên xanh đậm rất đẹp. Khi trồng vào chậu cây con sống bình thường như cây lớn (tất nhiên phải che nắng thích hợp, tránh cho cây bị nắng quá làm cháy lá và không để mưa to làm long gốc). Giai đoạn trồng vào chậu nhỏ Sau khi cây trồng trong chậu chung ổn định một thời gian cần thiết phải chuyển sang giai đoạn chậu nhỏ để cây phát triển tốt hơn. Giai đoạn này tùy thuộc vào từng loại cây và tùy theo yêu cầu thực tế của cây mà tiến hành. Giai đoạn này, cần có 2 thứ là chậu và chất liệu trồng. + Về chậu: Thường dùng là chậu đất, chậu nhựa mềm, chậu nhựa cứng, đường kính khoảng 3 - 5 cm, chiều cao cũng vậy có lỗ thoát nước ở dưới. Chậu cần được rửa sạch trước khi trồng. + Về chất giữ cây: Có nhiều khuynh hướng và kinh nghiệm của người trồng. ở các nước ôn đới, người ta thường dùng: Loại chất liệu sẵn có trong thiên nhiên như osmuda, splagnum, than bùn, than củi, cát, vỏ cây, đất . Loại chất liệu nhân tạo tổng hợp như polystyren, polyuretan. ở nước ta, người ta sử dụng nhiều loại chất liệu như: xơ dừa, than củi, rễ lục bình, dớn... để trồng lan. Tuy nhiên đối với cây Cymbidium thì chất liệu trồng rất đa dạng và cầu kỳ: đất trồng cây, cát, xỉ than, vỏ cây, vỏ dừa, xơ dừa, rễ dương xỉ, bã phân vi sinh, bã cà phê với một tỷ lệ pha trộn tùy theo kinh nghiệm từng người trồng. Giai đoạn thay chậu nhỏ và trồng vào chậu lớn Việc chuyển chậu có thể thực hiện trong khoảng thời gian cây con đã ở trong chậu nhỏ từ 10 - 24 tháng hoặc hơn. Khi chuyển cây không được căn cứ vào tháng tuổi của cây ở trong giai đoạn chậu nhỏ mà phải căn cứ vào tình trạng của từng cây mà quyết định. Nếu cây bé trồng vào chậu lớn, cây sẽ phát triển chậm nhưng nếu cây lớn trồng vào chậu bé thì cũng dẫn tới tình trạng tương tự. Sau thời gian chuyển chậu được một tuần trở ra mới được bón các chất dinh dưỡng cho cây vì trong quá trình chuyển chậu, ít nhiều bộ rễ bị xây xát nhẹ, nếu bón phân hóa học ngay, có thể làm hỏng bộ rễ. Duy trì cường độ ánh sáng 40.000 lux, để trong 6 tháng đến 1 năm. Sau đó, ta chuyển cây vào nơi có cường độ ánh sáng khoảng 50.000 lux và để trong 6 tháng thì cây bắt đầu ra hoa. Có thể với một số cây Địa lan phát triển thành cụm lớn ta có thể chuyển sang loại chậu to hơn nữa hoặc tách cụm thành những chậu bé hơn Một số kỹ thuật trồng Địa lan cơ bản Kĩ thuật trồng cây con vào chậu Trước khi trồng cần chuẩn bị: + Chậu đã được rửa sạch. + Giá thể phải được rửa sạch, khử trùng, chế biến theo công thức của từng người. Nếu là các chất liệu như than củi, vỏ cây, rễ cây dương xỉ thì được chặt nhỏ kích thước khoảng 2-5 mm. Nếu là xơ dừa thì xé ra cho tơi và cắt thành đoạn khoảng một đốt ngón tay. Xơ dừa được ngâm kĩ khoảng một tuần, rửa sạch rồi luộc kỹ và sau đó rửa lại thật sạch nhiều lần cho hết chất chát. Sau đó phơi thật khô. Nên chọn xơ dừa già vì xơ dừa già lâu mục. Chọn những cục than to hoặc đá, mảnh sành kích thước khoảng 2-3 cm, đặt vào đáy chậu để giúp thoát nước và thông thoáng bộ rễ, chiếm khoảng 1/3 dung tích. Sau đó đặt giá thể lên trên, khoảng 2 lớp mỏng rồi trồng cây con vào, giữ cho cây đứng thẳng cho tiếp giá thể lên và chú ý đặt nhẹ nhàng cho rễ cây ở hết bên dưới giá thể và tránh làm gẫy và hư hại rễ. Công việc này đòi hỏi làm phải hết sức nhẹ nhàng và tỉ mỉ [12]. Khi cây mới được trồng vào chậu, lúc tưới phải tránh làm lung lay, rễ vây khó bám vào xơ dừa và than. Nếu trời mưa quá to có thể làm cây long, nghiêng ngả, đầu rễ bị hư hại [20]. Kỹ thuật chuyển chậu Việc chuyển chậu cũng cần được chuẩn bị thật tốt như khi trồng cây con vào chậu nhỏ. Về chậu: cần có kích thước lớn ít nhất gấp 2,5 lần chậu con. Rửa sạch chậu. Về giá thể: Được khử trùng là tốt nhất. Một số loại như vỏ cây, vỏ dừa... kích thước cần lớn hơn khoảng 5-10 mm. Khi chuyển chậu, nên dùng một chậu nhựa lớn, sạch. Đổ nước có pha thuốc diệt trùng, diệt nấm sẵn (tỉ lệ 1/1000). Mức nước ngang với chiều cao của chậu con. Xếp các chậu con vào chậu nước thuốc sát trùng, để khoảng 10-15 phút. Diệt hết các rệp cây hoặc giá con từ các chậu bò ra (nếu có). Khảng 15 phút sau rễ cây bám vào thành chậu đã bong ra hết, ta nhẹ nhàng cầm cây sát gốc rút nhẹ lên, bộ rễ và giá thể sẽ long lên toàn bộ cả cụm, đem rửa sạch bộ rễ. Để cây dưới ánh nắng tán xạ khoảng 20 phút sau đó đem trồng. Ta đặt cụm cây đó vào giữa chậu lớn, một tay giữ cây, một tay cho giá thể vào tới sát miệng chậu. Kỹ thuật tưới nước cho cây Tưới nước cho cây phải căn cứ trên hai nguyên tắc: Nhu cầu về nước của cây mình trồng dựa trên sinh lý, sinh thái cụ thể của chúng. Tình hình thực tế về khí hậu trong từng tuần, từng tháng của nơi mình trồng lan (gồm khí hậu trong vùng và khí hậu của môi trường, tức là khí hậu của vườn lan). Khi tưới, cần hết sức nhẹ nhàng, tránh làm cây bị long gốc, rễ khó bám vào giá thể và thành chậu, nên tưới phun mù là tốt nhất. Nước tưới cho lan Đối với lan con, nước tưới phải thật sạch, nước giếng, nước mưa là tốt nhất. Đối với những nơi có hệ thống cống rãnh ngầm, bể phân tự hoại, ta không nên dùng nước giếng. Vùng có nhiều đá vôi, nước giếng cũng không tốt cho lan. Cũng không nên dùng nước mưa đầu mùa, vì trong không khí và nhất là mái nhà, máng chưa được rửa sạch, bản thân nước mưa trong thời gian đầu cũng chứa nhiều bụi và vi khuẩn [15]. Nước máy cũng rất tốt, nhưng vì có thuốc sát trùng nên người ta khuyên dùng nước máy đựng trong bể chứa. Sau 24 giờ, các hóa chất như Cl2 đã bốc hơi hết. Trong tự nhiên nước thông thường có pH trong khoảng từ 4-9. Có người khuyên dùng axit oxalic, axit nitric 10%, axit citric để tạo nước có độ hơi axit nếu nước có pH cao (pH khoảng 5 là tốt nhất). Kỹ thuật thúc mầm cây Được thực hiện vào mùa xuân sẽ cho hiệu quả cao hơn nếu thực hiện vào mùa thu. Chọn những cây khỏe mạnh để thúc mầm. Có thể thực hiện một trong hai biện pháp sau: Biện pháp cơ giới: Tách nhánh ép mầm. Đây là biện pháp tách cụm để thúc cho mầm mới phát sinh. Kết quả cho thấy khi tách 2 nhánh/cụm sẽ cho hiệu quả tốt. Biện pháp hóa học. Đây là biện pháp sử dụng các chất kích thích như BAP thấm bông đắp lên giả hành hoặc chọc nhỏ thẳng vào đỉnh sinh trưởng từ 3- 4 lần cách nhau tuần/lần. Aspirin, KH2PO4, H3BO3... với nồng độ 1/1000 tưới cho cây khoảng cách 2 lần/tuần. Phòng trừ bệnh cho cây Trên thực tế, khi chúng ta trồng những cây lan con từ trong ống nghiệm ra (bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật) là chúng ta đã loại được những bệnh nguy hiểm nhất cho lan là các bệnh do virus [15]. Bình thường, nếu chúng ta dùng nước sạch tưới cho lan, và tạo cho các cây lan con một môi trường riêng biệt, sạch sẽ không có điều kiện cho lan con bị lây chéo các bệnh khác của lan lớn hoặc cây khác thì lan con sống khỏe mạnh cho tới khi trưởng thành. Tuy nhiên, để đảm bảo cho lan con không có bệnh, nhất là các bệnh do nấm, chúng ta nên áp dụng chế độ phun thuốc phòng bệnh nấm cho lan theo chế độ định kì tháng/lần. Nếu thấy lá lan bị vàng úa rất nhanh hàng loạt hoặc thối đọt hàng loạt việc đầu tiên là phải cách ly các cây đó ngay để tránh bệnh lây sang toàn bộ vườn lan, sau đó phun thuốc trừ bệnh phù hợp. Trên giàn lan, nếu ta thấy có triệu chứng xuất hiện một số loại sâu như sâu đo, sâu róm, sâu khoang, rệp dính, dòi đục lá, bọ xít, muỗi, rệp thì nên dùng các loại thuốc trừ sâu thông thường và nên dùng với liều lượng thấp hơn một chút. Nên phun định kỳ 2 tháng một lần để diệt các loại sâu, rệp hại lan. Ngoài các bệnh do nấm, vi khuẩn và sâu, chúng ta cũng cần đề phòng một số côn trùng khác như cuốn chiếu, giun, gián (ăn rễ lan), dế và nhất là các loại ốc sên. Cũng nên nhắc lại là khi lan đang bị bệnh (do nấm hoặc vi khuẩn) tuyệt đối không cung cấp các chất dinh dưỡng cho cây. Cây lan thường bị một số bệnh nguy hiểm hại cây, bệnh nhiều khi gây thiệt hại rất lớn cho người trồng lan như bệnh đốm than, bệnh đốm lá, bệnh thối hoa, bệnh thối mềm vi khuẩn, rệp sáp vàng, bệnh khảm lá [13]. Phần 3: vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu vật liệu Các mẫu giống thí nghiệm được cung cấp tại phòng Công nghệ Sinh học thực vật, Viện Sinh học Nông nghiệp- Đại học Nông Nghiệp 1 Hà Nội, giống địa lan Hồng hoàng Sapa(Cymbidium iridioides) do vườn Quốc gia Hoàng liên cung cấp Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy in - vitro là các thể protocorm, chồi, cây con. Các giá thể trồng cây: dớn, xơ dừa. Phân bón: phân vô cơ tự chế, phân bón Trung Quốc. Nội dung nghiên cứu Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung khoai tây vào môi trường đến sự nảy mầm của hạt: CT1( Đ/C): VW + 100 ml/ lít nước dừa + 10g/ lít đường + 1g/ lít pepton + 0,65% agar. CT2: Đ/C + 25 g khoai tây. CT3: Đ/C + 50 g khoai tây. CT4: Đ/C + 75 g khoai tây. Thí nghiệm 2: Xác định môi trường khởi động thích hợp cho sự phát sinh hình thái của lát cắt Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái lát mỏng ở các nồng độ khác nhau: CT1( Đ/C): MS + 2% đường + 0,65 % agar. CT2: Đ/C + 0,3 ppm BA. CT3: Đ/C + 0,5 ppm BA. CT4: Đ/C + 1,0 ppm BA. CT5: Đ/C + 1,5 ppm BA. CT6: Đ/C + 2,0 ppm BA. CT7: Đ/C + 3,0 ppm BA. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái lát mỏng CT1 ( Đ/C): Môi trường MS + 2% đường + 0,65 % agar. CT2: Đ/C + 0,3 ppm kinetin. CT3: Đ/C + 0,5 ppm kinetin. CT4: Đ/C + 1,0 ppm kinetin. CT5: Đ/C + 1,5 ppm kinetin. CT6: Đ/C + 2,0 ppm kinetin. CT7: Đ/C + 3,0 ppm kinetin. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin và BA tới quá trình nhân nhanh thể protocorm. Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân và tỷ lệ chồi của thể protorcorm: ( Đ/C): Môi trường MS + 2% đường + 0,65 % agar. CT1: Đ/C + 0,3 ppm kinetin. CT2: Đ/C + 0,5 ppm kinetin. CT3: Đ/C + 0,7 ppm kinetin. CT4: Đ/C + 1,0 ppm kinetin. CT5: Đ/C + 1,5 ppm kinetin. CT6: Đ/C + 2,0 ppm kinetin. CT7: Đ/C + 3,0 ppm kinetin. 3.2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân và tỷ lệ chồi của thể protorm ( Đ/C): Môi trường MS + 2% đường + 0,65 % agar. CT1: Đ/C + 0,3 ppm BA. CT2: Đ/C + 0,5 ppm BA. CT3: Đ/C + 0,7 ppm BA. CT4: Đ/C + 1,0 ppm BA. CT5: Đ/C + 1,5 ppm BA. CT6: Đ/C + 2,0 ppm BA. CT7: Đ/C + 3,0 ppm BA. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa( ND) đến hệ số nhân, chất lượng của chồi: CT1( Đ/C): Môi trường MS + 2% đường + 0,65 % agar. CT2: Đ/C + 5% ND. CT3: Đ/C + 10% ND. CT4: Đ/C + 15% ND. CT5: Đ/C + 20% ND. CT6: Đ/C + 25% ND. CT7: Đ/C + 30% ND. Thí nghiệm 5: ảnh hưởng của than hoạt tính và a -NAA đối với sự ra rễ của cây. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đối với sự ra rễ của cây CT1( Đ/C): Môi trường MS+ 2% đường+ 0,65 % agar. CT2: Đ/C+ 0,25 g THT. CT3: Đ/C+ 0,50 g THT. CT4: Đ/C+ 1,00 g THT. Nghiên cứu ảnh hưởng của a-NAA đối với sự ra rễ của cây CT1( Đ/C): Môi trường MS+ 2% đường+ 0,65 % agar. CT1: Đ/C+ 0,1 ppm a - NAA. CT2: Đ/C+ 0,2 ppm a - NAA. CT3: Đ/C+ 0,3 ppm a - NAA. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng việc xử lý giá thể đối với cây ra vườn ươm CT1: Dớn+xơ dừa (1:1): không xử lý. CT2: Dớn+ xơ dừa (1:1): có xử lý. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ che đối với cây ra vườn ươm. CT1: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và có che. CT2: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và không che. CT3: Dớn + xơ dứa (1:1 : có xử lý và có che. CT4: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và không che. Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Đối chứng: Phân bón chuyên dụng cho lan của Trung Quốc CT1: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K( 30: 10: 10 ). CT2: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K(20: 20: 20 ). CT3: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K( 30: 10: 10 )+ vitamin+ vi lượng. CT4: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K(20: 20: 20 )+ vitamin+ vi lượng. Phương pháp nghiên cứu Cách bố trí thí nghiệm + Thí nghiệm trong phòng: Được bố trí tại phòng Công nghệ Sinh học- Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội Số giờ chiếu sáng: 16- 18/ 24 giờ. Cường độ chiếu sáng: 2000- 3000 lux. Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy: 25- 270C. ẩm độ trong phòng nuôi cấy: 70%. + Thí nghiệm vườn ươm: Đươc bố trí trong điều kiện ánh sáng tán xạ và cây được tưới dưới dạng phun sương. Toàn bộ thí nghiệm trong phòng và ngoài vườn ươm đều được bố trí ngẫu nhiên 3 lần lặp lại, số cá thể/ lần lặp lại là 15- 20 cá thể. Số mẫu cấy ở mỗi lần lặp lại là: 5 mẫu cấy trên một lần lặp lại. Đánh giá thí nghiệm sau 8 tuần theo dõi. Số cây được trồng trên mỗi giá thể là 5 cây trên một lần lặp lại. Phương pháp tiến hành Để thu được kết quả chúng tôi tiến hành làm ở các công thức thí nghiệm như sau: Phương pháp gieo hạt Mẫu thí nghiệm là quả địa lan được lấy từ vườn lan Hoàng liên cung cấp, mẫu lấy phải đảm bảo sạch bệnh và đầy đủ yêu cầu mong muốn. Sau khi chọn lựa mẫu đem rửa sạch bằng nước máy, tiếp đó rửa bằng nước xà phòng. Rồi đem mẫu đi khử trùng bằng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút + 1 phút, rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng. Mục đích tránh cho mẫu nhiễm hoá chất ngấm sâu gây độc hại dẫn đến tình trạng mẫu chết trước khi cấy vào môi trường tái sinh. Sau đó ta gieo hạt trên các môi trường có bổ sung nồng độ khoai tây khác nhau. Cắt lớp mỏng tế bào Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng các thể protocorm tương đối đồng đều nhau làm vật liệu và dùng dao vô trùng cắt các thể protocorm dưới kính hiển vi thành các lát mỏng có kích thước 0,3- 0,5 mm. Rồi sau đó cấy các lát mỏng được cắt từ một thể protocorm vào môi trường MS + 2% đường + 0,68% agar có bổ sung kinetin. BA. Tìm hiểu hệ số nhân của thể protocorm Để tìm hiểu tác động của chất điều tiết sinh trưởng, môi trường đến hệ số nhân của thể protocorm. Chúng tôi đã tách các protocorm từ một cụm tương đối đồng đều nhau để cấy trên cùng một nền môi trường MS có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng( BA, kinetin ) ở các nồng độ khác nhau. Quá trính tạo rễ Để tìm hiểu vấn đề này, chúng tôi đã dùng dao vô trùng tách các chồi có chiều cao từ 5,5- 6,5 cm từ một cụm chồi. Sau đó cắt bỏ hết các phần ở rễ cây. Cấy chồi đó trên môi trường có bổ sung thêm các chất kích thích quá trình tạo rễ(than hoạt tính, α – NAA) Phương pháp xử lý giá thể, cách che sáng Xơ dừa và dớn theo tỷ lệ 1: 1 được ngâm từ 2- 3 ngày rồi rửa sạch. Sau đó phối trộn với dung dịch thuốc nấm khuẩn, thuốc trừ sâu deterex+ dinh dưỡng chuyên dùng cho lan của Trung Quốc (20: 20: 20). Để ngâm 1 ngày 1 đêm vớt ra, để ráo nước đến độ ẩm nhất định (8%) và trống cây không tưới nước 3- 4 tuần Che sáng: phủ giấy mỏng đến giảm ánh sáng và giảm bốc hơi nước trong vòng 3- 4 tuần Các chỉ tiêu theo dõi: 1. Tỷ lệ sống (%) = ồ mẫu sống ồ mẫu cấy ban đầu x 100 2. Tỷ lệ tạo chồi (%) = ồ chồi tạo ra ồ thể protocorm tạo ra x 100 3. Tỷ lệ tạo protocorm (%) = ồ mẫu tạo protcorm ồ mẫu sống x 100 4. (%) số protocorm/lát cắt = Mẫu tạo protcorm Tỷ lệ mẫu sống x 100 5. Hệ số nhân = ồ mẫu thu được ồ mẫu cấy ban đầu 3.3.3. Số liệu, kết quả được xử lý thống kê sinh học trên máy tính theo chương trình IRRISTAT. 10. Số lá mới trên cây = số lá lần cuối – số lá lần đầu 9. Độ tăng chiều cao cây = chiều cao lần cuối – chiều cao lần đầu 8. Độ dài rễ trung bình = ồ chiều dài rễ ồ số rễ 7. Số rễ trung bình/cây = ồ số rễ ồ số cây 6. Tỷ lệ ra rễ (%) = ồ cây ra rễ ồ cây ban đầu x 100 Phần 4: Kết quả và thảo luận Tạo nguồn vật liệu vô trùng Đây là giai đoạn đưa đối tượng nuôi cấy từ điều kiện bình thường vào điều kiện vô trùng trong ống nghiệm. Đối với tất cả các loại cây trồng khác nhau việc khử trùng thích hợp, có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy in - vitro. Chúng tôi tiến hành khử trùng trên quả địa lan Hồng Hoàng, tham khảo tài liệu chúng tôi tiến hành khử trùng kép 7 phút + 1 phút. Sau đó cấy trên các nền môi trường có bổ sung khoai tây ở các nồng độ 25g/ lít, 50g/ lít và 75g/ lít. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 1. ảnh 1: Quả địa lan hồng hoàng Sapa (Cymbidium iridioides) Bảng 1. ảnh hưởng của việc bổ sung khoai tây vào môi trường đến sự nảy mầm của hạt địa lan Hồng hoàng ( sau 8 tuần theo dõi ) Chỉ tiêu theo dõi Công thức Sự biến đổi màu sắc, hình thái Tỷ lệ nảy mầm sau 8 tuần 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần CT1(ĐC):VW + 100ml ND + 1% đường +0,1% pepton + 0,65% agar - - - - * CT2: ĐC + 25g khoai tây/ lít - - - + ** CT3: ĐC + 50g khoai tây/ lít - - + +++ **** CT4: ĐC + 75g khoai tây/lít - - + ++ *** Ghi chú: * : nảy mầm < 5% **: nảy mầm 50% ***: nảy mầm > 50% ****: nảy mầm 80 – 90% -: chưa xuất hiện mầu +: xuất hiện mầu xanh ++: mầu xanh ngọc +++: mầu xanh thẫm Việc bổ sung khoai tây có ảnh hưởng rõ rệt tới sự phát sinh hình thái, mầu sắc. Sau 3 tuần ở CT2 và CT3 đã xuất hiện màu xanh. Sau 4 tuần CT3 đã xuất hiện màu xanh đậm hơn, trong khi đó CT1 chưa có sự thay đổi màu sắc. Sau 8 tuần theo dõi: ở các công thức đều có sự nảy mầm. Tỉ lệ nảy mầm, chất lượng mầm khác nhau rõ rệt, ở CT3 tỉ lệ nảy mầm cao nhất 80 – 90 % và chất lượng mầm khoẻ, tốt. Tỷ lệ nảy mầm thấp ở CT1 đạt khoảng 5%. Vì vậy sử dụng 50g khoai tây là tốt nhất. Nghiên cứu nhân nhanh bằng phương pháp cát lát mỏng Cắt lát mỏng tế bào là phương pháp được ứng dụng hiệu quả trong nhân giống vô tính in - vitro. Chúng tôi áp dụng phương pháp này cho giống Hồng Hoàng, mục đích nhân nhanh được giống quý có chất lượng cao để đáp ứng thị trường. Có nhiều tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước lát mỏng đến quá trình phát sinh hình thái lát cắt đặc biệt có nghiên cứu ảnh hưởng kích thước lát cắt trên cây phong lan, địa lan thương mại tại Viện Sinh học Nông nghiệp - ĐHNNI đều có chung một kết quả, kích thước lát mỏng thích hợp nhất cho quá trình phát sinh hình thái lát cắt có độ dày 0,3 – 0,5 mm. Vì vậy chúng tôi quyết định sử dụng kích thước lát cắt 0,3 – 0,5 mm và tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin, BA đến khả năng phát sinh hình thái lát cắt. Nguyên liệu sử dụng là các thể protocorm hoàn toàn sạch bệnh và được cắt theo lát cắt ngang. Sau đó cấy vào môi trường MS + 2% đường + 0,65% agar có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng BA, kinetin ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thu được ở bảng 2, 3, đồ thị 1 và 2. Bảng 2. ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái lát cắt (sau 8 tuần nuôi cấy) Chỉ tiêu theo dõi Công thức Tỷ lệ mẫu hình thành thể protocorm(%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi(%) Hệ số nhân (số protocorm/lát mỏng) CT1(ĐC): MS +2% đường +0,65% agar. 60,71 39,29 2,71 CT2: ĐC+ 0,3ppm BA 64,28 35,72 4,06 CT3: ĐC+ 0,5ppm BA 82,14 17,86 5,70 CT4: ĐC+ 1,0ppm BA 86,21 13,79 4,03 CT5: ĐC+ 1,5ppm BA 82,76 17,24 3,56 CT6: ĐC+ 2,0ppmBA 75,86 24,14 3,44 CT7: ĐC+ 3,0ppm BA 79,30 20,70 2,94 LSD(5%) 0,14 CV (%) 2,60 Đồ thị 1: ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái lát cắt . 4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm Cytokinin đến quá trình nhân nhanh thể protocorm trên giống hồng hoàng Bảng 3. ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh hình thái lát cắt (sau 8 tuần nuôi cấy) Chỉ tiêu theo dõi Công thức Tỷ lệ protocorm hình thành(%) Tỷ lệ chồi hình thành (%) Hệ số nhân protocorm/ lát mỏng (CT1)ĐC1: MS +2% đường +0,65% agar. 57,14 42,86 2,62 CT2: ĐC+ 0,3ppm Kinetin 71,43 28,57 4,10 CT3: ĐC+ 0,5ppm Kinetin 82,14 17,68 4,62 CT4: ĐC+ 1,0ppm kinetin 87,57 21,43 6,26 CT5: ĐC+ 1,5ppm kinetin 85,71 14,29 4,32 CT6: ĐC+ 2,0ppm kinetin 75,00 25,00 4,11 CT7: ĐC+ 3,0ppm kinetin 67,86 31,14 3,89 LSD(5%) 0,12 CV (%) 1,90 2.62 4.1 4.62 6.26 4.32 4.11 3.89 0 1 2 3 4 5 6 7 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 công thức Hệ số nhân Đồ thị 2: ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh hình thái lát cắt CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 ảnh 3: ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh hình thái lát cắt (sau 8 tuần nuôi cấy) ảnh 2: ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái lát cắt (sau 8 tuần nuôi cấy) CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 Từ kết quả bảng 2 và 3 cho thấy việc bổ sung chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy đều có khả năng kích thích sự phát sinh hình thái của lát mỏng, tỷ lệ mẫu tạo protocorm đều cao hơn đối chứng. Bảng 2: Khi bổ sung BA với nồng độ 0,3- 3,0 ppm trên môi trường MS +2% đường + 0,65% agar, tỷ lệ protocorm cao nhất khi bổ sung 1,0 ppm BA, ở các nồng độ tiếp theo giảm dần, BA không chỉ cho thấy ảnh hưởng rõ rệt của nó tới tỷ lệ lát cắt hình thành thể protorm mà còn cho thấy quy luật ảnh hưởng của nó lên khả năng tạo thể protocorm của mỗi lát cắt, số lát cắt hình thành thể protocorm tỷ lệ thuận với protocorm được tạo ra.Tuy nhiên nếu ta vượt quá giới hạn nồng độ nhất định thì BA lại là tác nhân kìm hãm khả năng hình thành thể protocorm Bảng 3: Khi bổ sung 0,3 – 1,0 kinetin thì tỷ lệ lát cắt hình thành thể protocorm tăng lên từ 2,62 – 6.26 lần, đường biểu tác động của kinetin có dạng đường cong một đỉnh, ở nồng độ 1,0 kinetin số protocorm trên lát cắt đạt giá trị cực đại. ở các nồng độ tiếp theo chỉ tiêu sẽ giảm dần nhưng vẫn cao hơn đối chứng. Kết quả ở thí nghiệm cho phép chúng tôi xác định được môi trường thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái của mẫu ban đầu là: MS + 15% ND + 2% đường + 1,0 ppm BA (1,0 ppm kinetin) + 0,65% agar Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm Cytokinin đến quả trình nhân nhanh thể protocorm Thí nghiệm thuộc giai đoạn này nhằm tìm ra được môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh thể protocorm. Đây là giai đoạn quyết định hiệu quả và tốc độ của công nghệ vi nhân giống. Các protocorm tạo ra phải đồng nhất, các chồi tạo cây hoàn chình có tỉ lệ sống cao, phát triển mạnh, ít biến dị. Kinetin và BA thuộc nhóm Cytokinin có tác dụng kích thích tạo thể protocorm mạnh mẽ, được sử dụng trong các môi trường nhân nhanh protocorm. Vì vậy kinetin, BA là những hợp chất không thể thay thế được trong quá trình nuôi cấy in - vitro. Để nghiên cứu ảnh hưởng đến hệ số nhân giống địa lan bản địa trong ống nghiệm, chúng tôi tiến hành bổ sung kinetin, BA vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 4 và 5, đồ thị 3 và 4. Bảng 4: ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh thể protocorm (sau 8 tuần nuôi cấy) Chỉ tiêu theo dõi Công thức Tỷ lệ protocorm hình thành(%) Tỷ lệ chồi hình thành (%) Hệ số nhân (lần) ĐC: MS + 2% đường + 0,65% agar 20,00 80,00 1,12 CT1: ĐC+ 0,3ppm BA 25,50 74,50 1,28 CT2: ĐC+ 0,5ppm BA 27,28 72,72 1,43 CT3: ĐC+ 0,7ppm BA 30,56 69,44 1,59 CT4: ĐC+ 1,0ppm BA 35,40 64,60 1,72 CT5: ĐC+ 1,5ppm BA 28,58 71,42 2,35 CT6: ĐC+ 2,0ppm BA 28,00 72,00 1,97 CT7: ĐC+ 3,0ppm BA 23,90 76,10 1,78 LSD(5%) 0,84 CV(%) 2,80 Đồ thị 3: ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh protocorm Bảng 5: ảnh hưởng của kinetin đến quá trình nhân nhanh thể protocorm (sau 8 tuần nuôi cấy) Chỉ tiêu theo dõi Công thức Tỷ lệ protocorm hình thành (%) Tỷ lệ chồi hình thành (%) Hệ số nhân (lần) (CT1)ĐC: MS + 2% đường + 0,65% agar 17,70 83,30 1,20 CT1: ĐC + 0,3ppm kinetin 21,90 78,10 1,28 CT2: ĐC + 0,5ppm kinetin 23,69 73,61 1,64 CT3: ĐC + 0,7ppm kinetin 26,20 73,80 1,77 CT4: ĐC + 1,0ppm kinetin 27,00 73,00 1,90 CT5: ĐC + 1,5ppm kinetin 30,50 69,50 2,16 CT6: ĐC + 2,0ppm kinetin 36,67 63,33 1,94 CT7: ĐC + 3,0ppm kinetin 20,60 79,40 1,60 LSD(5%) 0,94 CV (%) 3,10 Đồ thị 4: ảnh hưởng của kinetin đến quá trình nhân nhanh protocorm ảnh 5: ảnh hưởng của kinetin đến quá trình nhân nhanh thể protocorm (sau 8 tuần nuôi cấy) ĐC CT 1 CT 2 CT 5 CT 6 CT 7 CT 4 CT 3 ảnh 4: ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh thể protocorm (sau 8 tuần nuôi cấy) ĐC CT 1 CT 2 CT 5 CT 6 CT 7 CT 4 CT 3 Từ kết quả ở bảng 4 và 5 cho thấy việc bổ sung chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy đều có khả năng kích thích tạo protocorm và chồi. Kết quả bảng 4 cho thấy việc bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy đã làm tăng hệ số nhân so với đối chứng, hệ số nhân tăng từ (1,12 – 2,35 lần) và tỷ lệ thuận với nồng độ của BA bổ sung vào môi trường từ nồng độ 0,3 – 1,5 ppm ở, cùng với sự tăng hệ số nhân thì tỷ lệ mẫu hình thành chồi cũng như chất lượng chồi giảm. Qua theo dõi thí nghiệm ở nồng độ 2ppm BA trở lên đã xuất hiện các chồi nhỏ li ti biến dạng, không có khả năng phát sinh cây hoàn chỉnh, do vậy không được coi là chồi hữu hiệu, chất lượng chồi kém. Việc tăng nồng độ là không cần thiết, vì BA làm tăng hệ số nhân thể protocorm, nhưng lại kích thích chồi nách phát triển Qua bảng 5 cho thấy, việc bổ sung kinetin cũng có qui luật tương tự như BA, ở nồng độ 1,5ppm cho hệ số nhân cao nhất (2,16 lần), sau đó chỉ tiêu này giảm và thấp nhất ở công thức đối chứng (1,20 lần). Như vậy cho phép chúng tôi xác định được môi trường nhân nhanh protocorm là: MS + 2% đường + 1,5ppm BA (1,5ppm kinetin) +0,65% agar Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa lên hệ số nhân và chất lượng của chồi Nước dừa là một hợp chất tự nhiên, đã được sử dụng vào nuôi cấy in -vitro từ những năm 1949, được ứng dụng khá rộng rãi tỏng các môi trường nhân nhanh in - vitro: phong lan, dứa... Trong nước dừa có chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, ARN, ADN. Đặc biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất có hoạt tính auxin, các glucoxit của cytokinin. Các thí nghiệm trong giai đoạn này nhằm tạo ra được môi trường thích hợp cho quá trình nhân nhanh. Quyết định hiệu quả và tốc vi nhân giống. Giai đoạn này cần đạt hệ số nhân nhanh cao, chất lượng của chồi, cho hiệu quả, tiết kiệm thời gian, chi phí. Các chồi tạo ra đông nhất về mặt di truyền. Chúng tôi tách các cụm gồm 2- 3 chồi vào môi trường MS + 2% đường + 6,5g agar, sau đó bổ sung nước dừa ở các nồng độ khác nhau. Sau 8 tuần theo dõi, kết quả thu được ở bảng 6, đồ thị 5 Bảng 6. ảnh hưởng của nước dừa đến hệ số nhân, chất lượng của chồi địa lan Hồng hoàng (sau 8 tuần theo dõi) CTCL Công thức Hệ số nhân chồi Chiều cao chồi Số lá trên chồi Chất lượng chồi CT1 (ĐC): MS + 2% đường + 0,65% agar 1,35 3,41 3,00 + CT2: ĐC+ 5% ND 1,53 4,29 3,29 ++ CT3: ĐC+ 10% ND 1,76 4,08 3,23 ++ CT4: ĐC+ 15% ND 1,94 4,62 3,14 +++ CT5: ĐC+ 20% ND 1,78 4,57 3,58 +++ CT6: ĐC+ 25% ND 1,69 3,42 3,08 ++ CT7: ĐC+ 30% ND 1,61 3,85 3,15 ++ LSD(5%) 0,11 CV (%) 3,70 Ghi chú: + : Trung bình (Chồi bé, lá xanh nhạt) ++: Khá (Chồi mảnh, lá xanh đậm) +++: Tốt (Chồi mập, lá xanh đậm) Công thức 1.35 1.53 1.76 1.94 1.78 1.69 1.61 0 0.5 1 1.5 2 2.5 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 Hệ số nhân Đồ thị 5: ảnh hưởng của nước dừa đến hệ số nhân và chất lượng của chồi ảnh 6: ảnh hưởng của nước dừa đến hệ số nhân và chất lượng chồi (sau 8 tuần nuôi cấy) CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 Bảng 6 cho thấy nước dừa có ảnh hưởng khá rõ tới chồi. Trên tất cả các công thức có bổ sung thêm nước dừa đều có hệ số nhân lớn hơn so với công thức đối chứng. Đồng thời CT4 15% ND cho kết quả cao nhất với hệ số nhân (1,94) chiều cao (4,62 cm), số lá (3,58 lá). Các công thức có bổ sung nước dừa thì chất lượng chồi tốt. Tuy nhiên nếu nồng độ nước dừa cao quá thì hệ số nhân giảm và chất lượng chồi giảm. Như vậy có thể thấy chúng ta có thể bổ sung nước dừa ở 15% vào các môi trường làm nguyên liệu nhân nhanh. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh ở giai đoạn này chúng tôi tiến hành tách các chồi riêng rẽ có kích thước 6,5 – 7,5 cm, mập, khoẻ đưa vào nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung thêm NAA và than hoạt tính ở các nồng độ khác nhau với mục đích xác định môi trường thích hợp cho việc ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm. Kết qủa nghiên cứu được trình bày ở bảng 7 và 8, đồ thị 6 và 7 Bảng 7. ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ cây địa lan Hoàng (sau 60 ngày nuôi cấy) CTTD CT Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ/cây Chiều dài rễ Chiều cao cây Sau 5 ngày Sau 15 ngày Sau 20 ngày Sau 30 ngày CT1(Đ/C): 0,00 0,00 63,50 100,00 1,30 1,81 7,08 CT2+0,25 THT 0,00 56,50 85,00 100,00 2,17 2,46 7,41 CT3+0,50 THT 25,00 75,00 100,00 - 2,34 2,55 7,28 CT4+1,00 THT 52,50 100,00 - - 2,55 2,98 7,52 LSD (5%) 0,12 0,20 CV(%) 3,00 4,40 Đồ thị 6. ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ Bảng 8: ảnh hưởng của α-NAA đến hình thành rễ cây địa lan (sau 60 ngày nuôi cấy) CTTD Công thức Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ/cây Chiều dài rễ Chiều cao cây Sau 5 ngày Sau 15 ngày Sau 20 ngày Sau 30 ngày CT1(Đ/C): MS + 2% đường + 0,65% agar 0,00 0,00 54,50 100,00 1,32 1,62 7,06 CT2 + 0,1aNAA 0,00 35,00 78,50 100,00 1,42 1,67 7,15 CT3 + 0,2aNAA 0,00 52,50 86,00 100,00 1,45 1,73 7,36 CT4 + 0,3aNAA 0,00 73,50 100,00 - 1,75 1,77 7,52 LSD(5%) 0,95 0,14 CV (%) 3,40 4,30 Đồ thị 6: ảnh hưởng của α-NAA đến sự ra rễ ảnh 7: ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự hình thành rễ (sau 60 ngày) CT 1 CT 2 CT3 CT4 ảnh 8: ảnh hưởng của a - NAA đến sự hình thành rễ (sau 60 ngày) CT 1 CT 2 CT3 CT4 Từ kết quả bảng 7 và 8 cho thấy cây địa lan in-vitro có thể ra rễ ngay trên môi trường không cần bổ sung chất điều tiết sinh trưởng. Tuy nhiên quá trình ra rễ kéo dài hơn rất nhiều (30 ngày sau cấy).So với việc ta bổ sung 0,3 NAA hay 1,0 g than hoạt tính thì sau 20 ngày nuôi cấy 100% (15 ngày than hoạt tính) số cây đã ra rễ. Bên cạnh đó, việc bổ sung NAA và than hoạt tính đã làm tăng chất lượng bộ rễ. Theo Bhojwani và Razdan (1983) thì NAA ở nồng độ 0,1ppm -2ppm được dùng phổ biến nhất với mục đích tạo rễ, chồi in - vitro ở đa số các loài cây trồng. Môi trường ra rễ cho địa lan invitro là: MS +2% đường + 0,3 ppm NAA (hoặc 1g THT) + 0,65% agar. Các nghiên cứu ở giai đoạn sau nuôi cấy mô Đây là giai đoạn có ý nghĩa quan trọng, quyết định khả năng ứng dụng của toàn bộ quá trình vi nhân giống vào thực tiễn sản xuất. Quá trình chuyển cây từ môi trường nhân tạo sang môi trường có nhiều tác động của môi trường. Để tạo cho cây ra vườn có tỷ lệ sống cao chúng tôi tiến hành: xử lý giá thể vá che sáng cho cây ra vườn ươm. Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp xử lý giá thể đến sự sinh trưởng phát triển của cây địa lan Hồng hoàng giai đoạn bồn mạ. Biện pháp xử lý giá thể được thực hiện như sau: xơ dừa + dớn, theo tỷ lệ 1:1 ngâm 2-3 ngày rồi rửa sạch. Sau đó dùng giá thể đó phối trộn với thuốc nấm khuẩn, thuốc trừ sâu và dinh dưỡng chuyên dùng cho lan của Trung Quốc Để ngâm 1 ngày 1 đêm vớt ra để ráo đến độ ẩm nhất định 8% tiến hành trồng. Kết qủa được trình bày ở bảng 9. Bảng 9: ảnh hưởng của việc xử lý giá thể đến sự sinh trưởng, phát triển của cây địa lan Hồng hoàng đưa ra ngoài vườn ươm (sau 8 tuần theo dõi) CTTD CT Sau 8 tuần Tỉ lệ sống (%) Chiều cao trung bình trên cây (cm) Độ tăng chiều cao cây (cm) Số lá trung bình trên cây (lá) Số lá mới trung bình trên cây (lá) CT1: Xơ dừa + Dớn (1:1) không xử lý. 91,43 8,22 1,32 4,73 0,30 CT2: Xơ dừa + Dớn (1:1) có xử lý. 93,75 8,46 1,54 4,82 0,44 Kết quả bảng 9 chứng tỏ: ở giai đoạn vườm ươm cây địa lan in - vitro tỏ ra khá thích hợp với giá thể xơ dừa: dớn (1:1) nhất là giá thể lại có bổ sung thuốc nấm, trừ sâu và dinh dưỡng. Trên nền giá thể này sau 8 tuần theo dõi là 93,75%. Độ tăng chiều cao và số lá cũng cao hơn so với giá thể không được xử lý. Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp che tối khi cây địa lan đưa ra vườn ươm Việc xử lý được tiến hành như thí nghiệm 4.6.1. Tuy nhiên sau khi trồng, phủ giấy mỏng ngoài lưới che chung ở vườn ươm đến giảm ánh sáng và giảm bốc hơi nước trong vòng 3- 4 tuần. Lưu ý trong khoảng thời gian này không tưới bất kỳ loại nước hay dinh dưỡng nào. Kết qủa thu được trình bày ở bảng 10, đồ thị 8 Bảng 10. ảnh hưởng của biện pháp che tối khi cây địa lan Hồng hoàng đưa ra vườn ươm (sau 8 tuần theo dõi) CTTD CT Sau 8 tuần Tỉ lệ sống (%) Chiều cao trung bình trên cây (cm) Độ tăng chiều cao cây (cm) Số lá trung bình trên cây (lá) Số lá mới trung bình trên cây (lá) CT1: Xơ dừa + Dớn (1:1) có xử lý, có che. 96,77 8,55 1,90 4,93 0,55 CT2: Xơ dừa + Dớn (1:1) có xử lý, không che. 93,75 8,46 1,54 4,82 0,44 CT3: Xơ dừa + Dớn (1:1) không xử lý, có che. 88,52 8,22 1,32 4,87 0,37 CT4: Xơ dừa + Dớn (1:1) không xử lý, không che. 91,43 8,04 1,32 4,73 0,30 LSD (5%) 0,27 CV (%) 9,60 1.9 1.54 1.32 1.32 0 0.5 1 1.5 2 CT1 CT2 CT3 CT4 công thức Tăng chiều cao cây (cm) Đồ thị 8: ảnh hưởng của biện pháp che tối đến cây đưa ra vươn ươm ảnh 9: Biện pháp che tối khi đưa cây ra ngoài vườn ươm Qua bảng 10 cho thấy: giá thể được xử lý và có che. Sau 8 tuần tỷ lệ sống cao nhất ở công thức có che, có xử lý (96,77%). Nhưng tỷ lệ sống thấp nhất so với các công thức là công thức không xử lý, có che. Như vậy trong kỹ thuật trồng địa lan, việc đưa cây từ in-vitro ra vườm ươm che sáng cho cây là rất tốt tuy nhiên trên nền giá thể có xử lý về thuốc trừ sâu và dinh dưỡng. Để thuận lợi cho cây sinh trưởng và phát triển tốt. Vườn nuôi trồng địa lan nên được che sáng sao cho giảm 40% ánh sáng trực xạ là tốt nhất. Kết quả nghiên cứu phù hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả (Nguyễn Thịên Tịch..., 1987) [19]. ảnh hưởng của dinh dưỡng khác nhau đến sự sinh trưởng Phát triển của cây ở vườm ươm, cùng giá thể trồng, tưới bổ sung dinh dưỡng cũng là một biện pháp rất quan trọng. Để nghiên cứu tỉ lệ đạm, lân, kali, vitamin và vi lượng thích hợp cho việc tưới bổ sung thường xuyên cho địa lan. Chúng tôi bố trí các loại dinh dưỡng khác nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 11, đồ thị 9. Bảng 11: ảnh hưởng của dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây địa lan Hồng hoàng (sau 8 tuần theo dõi) CTTD CT Chiều cao trung bình trên cây (cm) Độ tăng chiều cao trung bình trên cây (cm) Số lá trung bình trên cây (lá) Số lá mới trung bình trên cây (lá) Chiều dài lá trung bình trên cây (cm) Chiều rộng lá trung bình trên cây (mm) CT1: Phân chuyên dụng cho lan của TQ. 9,84 1,34 5,69 0,70 7,50 5,31 CT2: 30:10:10(N:P:K). 10,12 1,32 5,73 0,96 7,53 5,60 CT3: 20:20:20(N:P:K). 9,76 1,43 5,60 0,60 7,48 5,40 CT2: 30:10:10(N:P:K) + Vitamin + Vi lượng. 10,37 1,60 5,93 1,18 8,03 5,37 CT4: 20:20:20(N:P:K) + Vitamin + Vi lượng. 10,04 1,50 5,71 0,91 7,95 5,23 LSD (5%) 0,80 0,12 CV (%) 3,10 7,50 Đồ thị 9: ảnh hưởng của dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây điạ lan Hồng hoàng ảnh 10: ảnh hưởng của dinh dưỡng tới sự sinh trưởng và phát triển của cây địa lan ngoài vườn ươm (sau 8 tuần) CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 Qua bảng 11 cho ta thấy nhìn chung giữa các công thức chưa có sự sai khác nhau nhiều. Tuy nhiên công thức phân 30:10:10 + vitamin + vi lượng của môi trường MS cho kết quả tốt hơn cả. Điều này được thể hiện ở các chỉ tiêu: chiều cao cây, số lá, chiều dài lá, chiều rộng lá. ở công thức 20:20:20 cho kết quả kém hơn cả. Như vậy ở giai đoạn đầu cây bắt đầu bước vào thời kỳ sinh trưởng phát triển nhanh thì việc cung cấp phân bón với yếu tố đạm cao là rất cần thiết cho cây địa lan vào giai đoạn này.Điều này càng khẳng định nguồn dinh dưỡng giàu N là rất cần thiết cho cây. Phần 5. kết luận và kiến nghị Kết luận Từ kết quả thu được chúng tôi rút ra kết luận: 1. Môi trường thích hợp để gieo hạt địa lan Hồng hoàng là VW + (100ml ND +10g đường saccaroza + 1g peptôn + 65g agar + 50g khoai tây)/lít. Việc bổ sung khoai tây vào môi trường gieo hạt có tác dụng tích cực đến sự nảy mầm của hạt. Vậy lượng khoai tây bổ sung thích hợp là 50 g/ lít 2. Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào có hiệu quả rất cao đối với việc nhân nhanh. Bằng phương pháp này có tác dụng thúc đẩy mạnh mẽ sự phát sinh thể protocorm có thể thu được 27 – 30 thể protocorm từ một protocorm ban đầu sau 8 tuần nuôi cấy. Môi trường xác định để nuôi cấy lớp mỏng thích hợp là: MS + 1ppm kinetin (hoặc 0,5ppm BA) +2% đường saccaroza + 0,65% agar. 3. Môi trường thích hợp để nhân nhanh thể protocorm là: MS + 2% đường saccaroza +1,5ppm BA (hoặc 1,5ppm K) + 0,65% agar hệ số nhân đạt cao nhất 2,12( kinetin ) và 2,35(BA). 4. Nồng độ nước dừa có hiệu quả cao trong việc nhân nhanh, bằng phương pháp này ND có tác dụng làm tăng số lượng, chất lượng chồi nuôi cấy. Môi trường thích hợp cho nhân nhanh: MS +15%ND + 2% đường saccaroza + 0,65 % agar 5. Môi trường thích hợp để tạo cây hoàn chỉnh là: MS + 2% đường saccaroza + 0,3ppm NAA (hoặc 1,0g than hoạt tính)+ 0,65% agar. Trên môi trường này sau 20 ngày nuôi cấy 100% số cây ra rễ, số rễ trên cây đạt 1,89 và 2,56. 6. Giá thể thích hợp để ra cây địa lan là: Xử lý bằng thuốc nấm khuẩn, thuốc trừ sâu deterex+ dinh dưỡng chuyên dùng cho lan Trung Quốc (20: 20: 20). Sử dụng che sáng đối với cây đưa ra vườn ươm 7. Trong các loại dinh dưỡng đã dùng, phân bón có tỷ lệ 30: 10: 10+ vitamin+ vi lượng tỏ ra thích hợp nhất cho lan con Đề nghị - Nghiên cứu, tìm hiểu khi tổ hợp một số loại phytohoomon trong giai đoạn nhân nhanh có khác so với dùng riêng hay không. - Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của cây trên nền giá thể khác nhau. - Cho sử dụng các kỹ thuật đã được xác định trên vào việc xây dựng quy trình nhân nhanh địa lan Hồng hoàng. - Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hoá các khâu đã xác định ban đầu. Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt: 1. Nguyễn Tiến Bân (1990), Các cây họ kín (Magnolioplyta) ở Việt Nam. Tuyển tập các công trình nghiên cứu sinh thái và tài nguyên, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr 34-41. 2. Võ Văn Chi – Lê Khả Kế (1969), Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam, NXB Khoa Học, tr 57-80. 3. Võ Văn Chi – Dương Đức Tiến (1978), Phân loại thực vật – Thực vật bậc cao, NXB Đại học và THCN, tr 38. 4. Nguyễn Văn Chương, Trịnh Văn Thịnh (1991), Từ điển Bách Khoa Nông Nghiệp, Trung tâm quốc gia biên soạn Từ điển Bách khoa Việt Nam, Hà Nội, tr 67-69 5. Dự án đầu tư, phát triển hoa cây và cây kiểng tại TP HCM, 14-7-2005, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn TPHCM 6. Dự án xây dựng khu Nông-lâm nghiệp, công nghệ cao tại Trung tâm phát triển lâm nghiệp Hải Phòng, 5-2003, Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn TP Hải Phòng. 7. Vũ Hài, Trần Quý Hiển (2001), Nghề làm vườn, NXB Giáo Dục. 8. Phạm Hoàng Hộ (1973), cỏ cây miền Nam, quyển 1,2, Bộ giáo duc – Trung tâm dược liệu, tr 195 9. Phạm Hoàng Hộ (1992), Cây Cỏ Việt Nam, quyển 3, NXB Trẻ, tr 918. 10. Trần Hợp (1990), Phong Lan Việt Nam, tập 1-2, NXB Khoa học và Kĩ Thuật, tr 68-72. 11. Nguyễn Hữu Huy - Phan Ngọc Cấp (1995), Mấy nét về cội nguồn phong lan, Đặc sản quý của các nước nhiệt đới, Việt Nam hương sắc, số 1, tr 15-16. 12. Phạm Thúc Huân (1989), Hoa lan cây cảnh và vấn đề sản xuất kinh doanh xuất khẩu, NXB TPHCM. 13. GS-TS Trần Văn Mão (2001), TS Nguyễn Thế Nhã, Phòng trừ sâu bệnh loại cây cảnh, NXB Nông nghiệp. 14. Nguyễn Công Nghiệp (1995), Trồng hoa lan, NXB TPHCM. 15. Phạm Thị Liên (2001), Nghiên cứu đánh giá và phát triển một số giống địa lan ở miền Bắc Việt Nam, luận án tiến sĩ nông nghiệp. 16. Nguyễn Xuân Linh, Phạm Thị Liên, Nguyễn Thị Kim Lý, Đoàn Duy Thanh (2001), Kỹ Thuật trồng hoa, NXB Hà Nội. 17. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2004), giáo trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp, tr 49-50, tr 54-55. 18. Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Báo cáo thống kê đề tài nhánh, Viện sinh học Nông ngiệp - Đại học Nông nghiệp I. 19. Nguyễn Thiện Tịch, Đoàn Thị Hoa, Trần Sỹ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Nhân (1998), Kỹ thuật trồng hoa lan, tr 216. 20. Vũ Văn Yến, Trồng lan trong ống nghiệm (1987), NXB TPHCM. 21. Nguyễn Khánh Vân, Nguyễn Thị Hiền, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp, Các biểu đồ Việt Nam. Trang Web: Tiếng Anh: Koopowitz,-H (1986), “Effect of Biostimin on growth of meristematic tissue and protocom formation of some orchids in in vitro culture”. American – Orchid – Society – Bulltin 55: N0.167, p.273-287. Mau, - RFL (1983), “Development of the orchid weevil, Orchidophilus aterrimus (Waterhouse)”, Proceedings-of-the-Hawaiian-Entomological-Society: p.293-297. Nesbitt,-LT, nesbitt,-MK (1985), “Terrestrial orchids, their culture” Austrilian – Plants.13:105, p.219-223. Pais,-MS; Barroso,-J; Fevereiro,- P; Oliveira,-M (1983), “Intergeneric fusion of terrestrial orchid protoplast induced by different fussion promoting agents Protoplasts” Poster proceedings: p.74-75. Tisserat,-B; Vandercook,-CE (1986), “Computerized long – term tissue culture for orchids” American- Orchid- Society- Bulletin. 51:2, p.185-198. Valmayor, -H.L (1989), Growing dendrobiums for cutflower production, Los Banos, Laguna (Phillipines). PCARRD. Mục lục