Khóa luận Nghiên cứu phương pháp chiết xuất dịch từ sinh khối vi khuẩn lam spirulina platensis bổ sung vào nước giải khát

chính trong sản xuất nƣớc giải khát, vì vậy các tiêu chuẩn cho nƣớc đƣợc tuân thủ nghiêm ngặt. Đƣờng saccharose hoặc glucose : lựa chọn loại đƣờng khi đƣa vào cơ thể dễ hấp thu, mặt khác dễ hoà tan. Chất bảo quản: Muối benzoat, axit benzoit có tác dụng ức chế hoặc khử hoạt tính của enzym, làm ngừng các quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh. Phá vỡ tế bào Saccharose Nƣớc Axit Citric Nấu syrup Làm nguội Lọc Chất bảo quản, hƣơng liệu chất còn lại Cặn Thu dịch lọc Phối trộn Xử lý hoàn thiện Thanh trùng Sản phẩm Bài khí Rót chai Phá vỡ tế bào Spirulina Ly tâm, lọc 26 Axit citric: dùng để điều chỉnh pH và tạo vị. Ngoài ra còn có tác dụng nhƣ một chất xúc tác cho quá trình nghịch đảo đƣờng tạo đƣờng khử, tăng độ ngọt và chống sự kết tinh. 2.6.2.2 Diễn giải quy trình công nghệ: - Hoà tan đƣờng: Đƣờng trƣớc khi đƣa vào nƣớc uống phải đƣợc hoà tan bằng hệ thống khuấy sục để tạo thành dung dịch syrup, nhiệt độ của dịch syrup từ 50 – 600C nấu trong thời gian 20 – 30 phút nhằm tránh hiện tƣợng lại đƣờng. - Lọc syrup: Sử dụng lọc thô hoặc lọc tinh nhằm tách các tạp chất. - Phá vỡ tế bào Spirulina: Sinh khối Spirulina đƣợc phá vỡ bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (PPVL) hoặc thẩm tích (PPKT) nhằm thu đƣợc lƣợng dịch chứa hàm lƣợng protein tối đa. - Phối trộn: Các thành phần sẽ đƣợc đƣa vào phối trộn và bổ sung chất phụ gia, sử dụng thiết bị phối trộn cơ học, nhiệt độ trong quá trình phối trộn 50 – 60 0 C. - Thanh trùng: Dung dịch đƣợc đƣa vào thanh trùng ở nhiệt độ 500C trong thời gian 30 phút. - Bài khí: Hạn chế ảnh hƣởng xấu đến sản phẩm trong quá trình bảo quản, làm tăng hiệu quả truyền nhiệt. - Rót chai: Sản phẩm sẽ đƣợc đƣa vào máy rót chai, đóng nắp tự động. 27 2.6.3. Kỹ thuật sản xuất nƣớc khoáng Vĩnh Hảo Sơ đồ: Sản xuất nước khoáng Vĩnh Hảo. 2.6.4. Kỹ thuật sản xuất nƣớc tinh khiết Nƣớc tinh khiết đƣợc khai thác từ nguồn nƣớc ngầm, đảm bảo độ tinh khiết nhờ đƣợc xử lý qua hệ thống thẩm thấu ngƣợc và ozon. Thanh trùng bằng tia cực tím. 2.6.5. Kỹ thuật sản xuất rƣợu trái cây Hỗn hợp trái cây đƣợc cho phối trộn với đƣờng và ủ ở nhiệt độ bình thƣờng. Sau 10 – 15 ngày lên men tạo sản phẩm rƣợu. Bơm trực tiếp nƣớc từ nguồn Lọc tinh Chiết rút Chuyển vào nhà máy Lọc thô Chai Khử trùng Súc rửa Sấy Đóng chai Dán nhãn Thành phẩm Kiểm tra chất lƣợng 28 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian: Từ 4/2007 – 8/2007. 3.1.2. Địa điểm: Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận, đƣờng Nguyễn Hội, Tp.Phan Thiết 3.2. Nguồn cung cấp nguyên liệu Nguồn sinh khối vi khuẩn lam Spirulina platensis đƣợc sản xuất bởi sản phẩm thƣơng mại của Công ty Vĩnh Hảo. 3.3. Đối tƣợng nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Vi khuẩn lam Spirulina Platensis. - Đối tƣợng thử nghiệm: Nƣớc khoáng, nƣớc tinh khiết - Aquafina, rƣợu trái cây. 3.4. Vật liệu 3.4.1. Thiết bị - Máy cất đạm. - Ống chuẩn độ. - Lò nung. - Lò siêu âm. - Tủ hút. - Tủ sấy. - Nồi hấp khử trùng. - Máy đo OD. - Cân điện tử. - Máy lắc. 29 3.4.2. Hoá chất - Axit H2SO4 đậm đặc, axit ascorbic, axit nitric. - Muối Na2CO3, CuSO4. - Hỗn hợp thuốc thử methyl đỏ và xanh. - Hỗn hợp xúc tác CuSO4/K2SO4, nƣớc cất, NaOH, thuốc thử Folin. 3.5. Các phƣơng pháp phân tích [1,2,3,4,5,6,7,8,9] 3.5.1. Phƣơng pháp xác định protein bằng phƣơng pháp Kjeldahl 3.5.1.1. Nguyên tắc Dƣới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất chứa nitơ bị phân huỷ và bị oxi hoá đến CO2 và H2O, còn nitơ chuyển thành amoniac (NH3) và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat. Quá trình đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau Bƣớc 1: Vô cơ hoá nguyên liệu t o R – CH – COOH + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 Chất xúc tác NH2 Bƣớc 2: Cất đạm Phản ứng xảy ra trong máy cất đạm (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O Phản ứng xảy ra trong bình hứng NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 + H2SO4dƣ Bƣớc 3: Chuẩn độ lƣợng H2SO4 còn thừa trong bình hứng bằng NaOH. 30 3.5.1.2. Quá trình thực hiện Hình 3.8. Máy cất đạm (A): Bình phát hơi nƣớc, (B): Hệ thống hút chất thử từ bình C sau khi đã cất xong thải ra ngoài, (C): Bình chứa chất thử đã vô cơ hóa (bình phản ứng), (D): Phễu cho chất thử đã vô cơ hóa và chất NaOH vào bình (C), (E): Ống sinh hàn, (F): Bình chuẩn độ, bình hứng NH3, (P2): Khóa dẫn nƣớc từ phễu D xuống bình C, (P1): Khóa dẫn nƣớc từ bình B thải ra ngoài. Quá trình thực hiện theo các bƣớc: Bƣớc 1: Vô cơ hoá nguyên liệu quá trình đƣợc tiến hành trong tủ hút để tránh khí độc SO2, CO2. Nếu mẫu ở dạng bột khô: Cân chính xác 0,2g nguyên liệu, dùng một ống giấy cuộn tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào vài giọt nƣớc cất vô đạm. Tiếp tục cho 0,2g hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 và 5 ml H2SO4 đặc. Tiếp tục cho 0,2g hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 và 5 ml H2SO4 đặc. Để nghiêng bình Kjeldahl trên bếp đặt trong tủ hút và đun từ khoảng 2 – 3 giờ. cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt và có màu xanh da trời nhạt. Để 31 nguội. Chuyển dịch sang bình định mức 100 ml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nƣớc cất vô đạm đến vạch định mức. Bƣớc 2: Cất đạm Rửa máy: Đun sôi bình A và mở nƣớc vào ống làm lạnh lúc khoá P1 và P2 đều đóng, sau đó cho vào phễu trong một ít nƣớc cất (khoảng 10 ml) và cho chảy xuống bình C bằng kẹp P2. Hơi nƣớc của bình A, sẽ từ từ qua erlen F, cứ để nhƣ vậy cho đến khi ở F có khoảng 5 ml nƣớc. Lấy đèn khỏi bình A, hơi nƣớc trong máy sẽ nguội lại, làm giảm áp suất ở A và B, do đó nƣớc trong bình C sẽ rút qua B. Khi nƣớc rút hết, thêm nƣớc vào phễu D và mở kẹp P2 cho nƣớc chảy vào C, kế đó nƣớc sẽ rút qua B. Ta có thể làm nhƣ vậy vài lần. Nếu nƣớc ở bình B đầy, mở kẹp P1 cho nƣớc rút đi. Khoá kẹp P1 và P2 đẩy bếp vào dƣới bình A. Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3 (bình F): cho vào bình hứng F (erlen 250 ml) 10 – 20 ml H2SO4 N/100 và ba giọt thuốc thử hỗn hợp thuốc thử methyl đỏ - methyl xanh, dung dịch có màu tím đỏ. Đặt bình hứng sao cho đầu mút của ống sinh hàn E ngập trong dung dịch H2SO4 N/100 của bình hứng. Quá trình lôi cuốn bằng hơi nƣớc: Lúc này bình A đang đƣợc đun sôi, kẹp P1 và P2 đóng. Đổ vào phễu D 10 ml dung dịch đạm đã vô cơ hoá và pha loãng, mở kẹp P2 để dung dịch này chảy từ từ xuống C, đóng P2 lại. Đổ nƣớc tráng vào bình D và cũng mở kẹp P2 thật nhẹ nhàng để nƣớc chảy từ từ xuống C từng giọt cho đến khi mực nƣớc trong D xuống gần sát đến kẹp P2 thì khoá P2 lại. Sau đó tráng D với một ít nƣớc cất và cũng mở kẹp P2 thật nhẹ nhàng để nƣớc chảy từ từ xuống C từng giọt cho đến khi mực nƣớc trong D xuống gần sát tới kẹp P2 thì khoá P2 lại. Rửa một lần nữa với thao tác tƣơng tự nhƣ trên. Thêm vào phễu D 10 ml NaOH đậm đặc. Mở khoá P2 từ từ để cho NaOH chảy xuống C từng giọt một. Nếu nƣớc trong C chảy mạnh quá thì khoá P2 lại, rồi tiếp tục cho chảy từ từ cho đến khi NaOH chảy gần hết xuống C. Tráng phễu D hai lần với một ít nƣớc cất. Nên nhớ chỉ cho nƣớc chảy xuống gần sát tới kẹp P2 mà thôi. 32 Tiếp tục lôi cuốn trong 5 phút, hạ erlen F xuống sao cho đầu mút của ống sinh hàn nằm trong không khí, đun tiếp 3 phút. Rửa đầu nhọn của ống làm lạnh E bằng một tia nƣớc của bình sịt. Lấy erlen F ra để định phân lƣợng thừa H2SO4. Đem đèn ra khỏi bình A, rửa sạch C (rửa máy) vài lần nhƣ đã hƣớng dẫn ở phần trên. Thực hiện hai lần thử không 3 lần thử thật Bƣớc 3: Chuẩn độ Lƣợng H2SO4 N/100 còn thừa trong bình F đƣợc chuẩn độ bằng NaOH N/100. Quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ tím đỏ sang xanh lá mạ. Xác định hệ số hiệu chỉnh k: lấy hai erlen, cho vào mỗi erlen 20 ml H2SO4 N/100 và vài giọt methyl đỏ - methyl xanh. Sau đó chuẩn độ bởi NaOH N/100 lấy giá trị trung bình của hai lần chuẩn độ. Hệ số hiệu chỉnh K sẽ đƣợc tính theo công thức: 20mlH2SO4 N/100 K = (1) VNaOH N/100 Tính kết quả Gọi Vo là trị số trung bình của 2 lần thử không Vt là trị số trung bình của 3 lần thử thật. Vậy ∆V = Vo – Vt là lƣợng NaOH tƣơng ứng với NH3 phóng thích bởi 10 ml dung dịch đạm đã vô cơ hoá và pha loãng là: ∆V x K = ∆V x K x 10-5 (mol) (2) 100 x 1000 Số gram đạm có trong 10 ml dung dịch đạm đã vô cơ hoá và pha loãng là: 14 x ∆V x K x 10-5 (g) 33 Số gram đạm có trong 100 ml dung dịch đạm vô cơ hoá là: 14 x ∆V x K x 10-5 x 100 = 14 x ∆V x K x 10-4 (g) (3) 10 Vậy: 14 x ∆V x K x 10-4 x 100 A = (4) m Trong đó: A: hàm lƣợng nitơ tổng số. m: lƣợng mẫu đem xác định protein Suy ra lƣợng protein (P) = A x 6,25 (5) 3.5.2 Phƣơng pháp xác định protein bằng phƣơng pháp Lowry 3.5.2.1. Nguyên tắc: Dựa vào cƣờng độ màu xanh của phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphocolphramat để xác định protein. Phức chất màu xanh có độ hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 750nm. Phƣơng pháp Lowry sử dụng phối hợp phản ứng Biure (tác dụng lên liên kết peptid) và phản ứng với thuốc thử folin để tạo phức màu đặc trƣng. Ngoài ra, cƣờng độ màu của phức chất có thể tăng lên trong môi trƣờng phản ứng có chứa muối amon, phenol, vòng imizadol pirimidin, axit uric, các ion kim loại hoặc cƣờng độ màu của phức chất có thể bị giảm khi có mặt etanol, aceton, TCA, axit pecloric. Vì vậy, để đạt cƣờng độ chính xác của dung dịch protein với thuốc thử folin đòi hỏi protein phải đƣợc tinh sạch. Phƣơng pháp Lowry có độ nhạy tƣơng đối cao, cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục gam protein. Tuy nhiên phƣơng pháp này không dùng để định lƣợng các protein không chứa các axit amin vòng thơm nhƣ gelatin. 34 3.5.2.2. Thực hành Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch mẫu thí nghiệm, tính toán sao cho khối lƣợng protein có trong dung dịch khoảng 0,02 – 0,2 mg/ml (20 µg – 200 µg) protein. Thêm vào ống nghiệm 4 ml dung dịch C, lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 0,5 ml thuốc thử folin, lắc đều, để yên từ 30 – 90 phút, màu của phản ứng sẽ chuyển từ màu vàng sang màu xanh so màu trên máy quang phổ hoặc máy so màu ở bƣớc sóng 750 nm. Xác định trị số mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu. Cần thực hiện một sự thử không: thay 1ml dung dịch mẫu thí nghiệm bằng 1ml nƣớc cất. Lập đồ thị chuẩn Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn có các nồng độ: 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 µg/ml từ dung dịch albumin chuẩn 0,1% pha loãng với nƣớc cất theo các tỉ lệ khác nhau: Lấy 10 ống nghiệm, đánh số 1 – 10, cho vào đó các chất tham gia phản ứng nhƣ sau: Bảng 3.1. Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn Ống số Protein 0,1% (ml) H2O (ml) Nồng độ protein (µg/ml) Dung dịch C (ml) Thuốc thử Folin (ml) OD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Khi cho các chất tham gia phản ứng vào các ống nhƣ: dung dịch C, thuốc thử folin phải theo trình tự và thao tác tƣơng tự nhƣ phần dung dịch mẫu thí 35 nghiệm ở trên. Xác định trị số mật độ quang của các ống, từ đó xây dựng đồ thị chuẩn. Tính kết quả Trị số mật độ quang của các ống chứng (từ ống 2 – 10) sau đi trừ đi trị số của ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng đƣợc đồ thị chuẩn biễu diễn sự biến thiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml). Tƣơng tự vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi chiếu vào đƣờng cong mẫu để suy ra lƣợng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml). C x a x V x 100 Ta có: Protein (P) = (%) (6) m x 1000 Trong đó : C: lƣợng protein trong dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml). a: hệ số pha loãng. V: thể tích pha loãng mẫu (ml). m: khối lƣợng mẫu thử (mg). 3.5.3. Phƣơng pháp xác định tro tổng số 3.5.3.1. Nguyên tắc Dùng sức nóng ( 550 – 600oC) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ, phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro có trong nguyên liệu. 3.5.3.2. Thực hành Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung tới 550 – 600oC đến trọng lƣợng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân (G). Cho thêm váo chén nung khoảng 5g mẫu (G). Cân trọng lƣợng chén có mẫu thử với độ chính xác nhƣ trên, thêm vào chén 5 giọt HNO3 đặm đặc và 1 – 2 giọt H2O2 30%. Cho vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 50 – 600 o C. Nung cho 36 đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng nhƣ tàn thuốc (thƣờng trong khoảng thời gian 5 – 6 giờ). Sau đó lấy chén sứ ra, cho ngay vào bình hút ẩm, để nguội và cân với độ chính xác nhƣ trên. Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân tới trọng lƣợng không đổi. Kết quả giữa hai lần nung và cân liên tiếp không đƣợc cách nhau quá 0,0005g cho một gam mẫu thử. Xác định trọng lƣợng chén chứa nguyên liệu đã biến thàng tro trắng sau khi nung và cân đến trọng lƣợng không đổi (G2). Tính kết quả Tổng lƣợng tro đƣợc tính nhƣ sau : (G2 – G) Tổng lƣợng tro (%) = x 100 (%) (7) (G1 – G) Trong đó : G: trọng lƣợng của chén nung (mg) G1: trọng lƣợng của chén và trrọng lƣợng của mẫu thử (mg) G2 : trọng lƣợng của chén và trọng lƣợng của tro trắng sau khi đã nung và cân đến trọng lƣợng không đổi (mg). 3.5.4. Phƣơng pháp phân tích vi sinh 3.5.4.1. TPC Nguyên tắc: Để xác định số lƣợng vi sinh vật trong một đơn vị khối lƣợng thực phẩm bằng phƣơng pháp đếm số lƣợng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng mẫu thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trƣờng nuôi cấy. Các khuẩn lạc đƣợc hình thành trong môi trƣờng sau khi ủ đƣợc xem nhƣ là chúng hình thành từ một tế bào đơn lẻ. Các đĩa môi trƣờng sau khi cấy mẫu đƣợc ủ ở điều kiện nhiệt độ 37oC/24 giờ. 37 3.5.4.2. Coliforms Nguyên tắc: Cấy một lƣợng mẫu xác định trên môi trƣờng thạch chọn lọc. Sau khi ủ ở 37oC/48 giờ, đếm số lƣợng khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trƣng. Môi trƣờng chọn lọc cho Coliforms là môi trƣờng chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời trong môi trƣờng còn chứa muối mật là tác nhân chỉ thị chọn lọc cho vi khuẩn gram âm, chứa các tác nhân chỉ thị các dấu hiệu điển hình khi vi sinh vật trao đổi các thành phần trong môi trƣờng nuôi cấy. Khẳng định các dòng vi khuẩn cho hình dạng khuẩn lạc điển hình bằng môi trƣờng canh chọn lọc Brilliant green bile lactose. Xác định Coliform phân ở nhiệt độ 44oC/48 giờ. Số lƣợng Coiliform hay Coliform phân đƣợc xác định bằng số lƣợng khuẩn lạc điển hình đếm đƣợc, hệ số xác nhận và độ pha loãng mẫu trƣớc khi cấy vào đĩa. 3.5.4.3. E.coli Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện E.coli trong một khối lƣợng mẫu xác định. Cấy mẫu vào môi trƣờng tăng sinh (BGBL), phân lập trên môi trƣờng phân lập (EMB) và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá phù hợp (nghiệm pháp IMViC). 3.5.4.4. Staphylococcus aureus Nguyên tắc: Cấy trang một lƣợng mẫu xác định trên bề mặt môi trƣờng thạch chọn lọc. Sau khi ủ, đếm số khuẩn lạc có những đặc điểm đặc trƣng và không đặc trƣng của Staphylococcus aureus. Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng phản ứng coagulase và các phản ứng đặc trƣng khác. Kết quả đƣợc xác định bằng số lƣợng khuẩn lạc đã đếm, thể tích cấy, độ pha loãng và hệ số xác nhận. 3.5.4.5. Salmonella Nguyên tắc: Để đạt hiệu quả cao, quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải qua giai đoạn tiền tăng sinh. Điều này cần thiết vì Salmonella thƣờng có mặt trong mẫu với số lƣợng nhỏ, bị tổn thƣơng nặng qua quá trình chế biến và sự tồn tại một số lƣợng lớn các loại vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae, các 38 dòng này cạnh tranh và ức chế sự phát triển của Salmonella. Bốn giai đoạn cần tiến hành để phát hiện Salmonella: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh hoá phù hợp đặc trƣng cho Salmonella spp. 3.6. Phƣơng pháp phá vỡ tế bào 3.6.1. Phƣơng pháp vật lí Huyền phù tế bào đƣợc đông lạnh trong nƣớc đá. Sau đó nâng nhiệt một cách đột ngột ở 40oC, với phƣơng pháp này các tế bào bị trƣơng lên và vỡ ra do sự hình thành và tan ra của các tinh thể đá trong quá trình đông lạnh. Sơ đồ: Phá vỡ tế bào theo PPVL 3.6.2. Phƣơng pháp khuếch tán Tiến hành phá vỡ tế bào ở các nồng độ đƣờng 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8%. 0,2%: 0,2g đƣờng trong 100 ml dung dịch + 0,2g tảo. 0,4%: 0,4g đƣờng trong 100 ml dung dịch + 0,2g tảo. 0,6%: 0,6g đƣờng trong 100 ml dung dịch + 0,2g tảo. 0,8%: 0,8g đƣờng trong 100 ml dung dịch + 0,2g tảo. Tủ đông Mẫu tảo Bổ sung 100ml nƣớc cất Lắc Bã Kiểm đạm Phân tích protein Thu dịch Lò siêu âm Lọc (ly tâm) Lấy ra 39 Sơ đồ: Phá vỡ tế bào theo PPKT. 3.7. Sơ đồ phƣơng pháp bổ sung 3.8. Phƣơng pháp cảm quan Sản phẩm thực phẩm phân tích cảm quan đƣợc cho điểm theo phƣơng pháp TCVN 3215 – 79. 3.9. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), một yếu tố, lặp lại 3 lần trong cùng một điều kiện thí nghiệm. Gồm hai nội dung - Nội dung 1: Không phá vỡ tế bào tảo. - Nội dung 2: Phá vỡ tế bào tảo. Chỉ tiêu theo dõi: Protein. Tro. Vi sinh. 3.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Statgraphics và phần mềm Excel. Bổ sung 100ml nƣớc cất Lắc đều Ủ 24h Lọc Thu dịch Kiểm protein Kiểm đạm Bã Tả o + Đ ư ờ ng Nƣớc giải khát Bổ sung dịch tảo PV Axit ascorbic 40 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thành phần dinh dƣỡng vi khuẩn lam Spirulina platensis 4.1.1. Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Kjeldahl 4.1.1.1. Xác định hàm lƣợng protein trong bột tảo khô Cân 0,2g bột tảo chứa trong giấy lọc không đạm, cuộn tròn giấy lọc chứa mẫu cho vào bình kenđan, thêm một ít nƣớc cất, cho thêm 0,2g hỗn hợp xúc tác CuSO4/K2SO4 vào bình, cho thêm 20 ml dung dịch H2SO4 đặm đặc, để yên 10 phút sau đó đặt lên bếp vô cơ hóa trong 3 giờ. Mẫu vô cơ đƣợc để nguội, tráng nhiều lần bằng nƣớc cất và chuyển sang bình cầu chứa hỗn hợp thuốc thử methyl đỏ - methyl xanh. Tiến hành chƣng cất cho đến khi dung dịch trong bình hứng có màu tím đỏ, sau đó chuẩn độ lại lƣợng H2SO4 N/100 đã dùng bằng NaOH N/100 với hỗn hợp thuốc thử nhƣ trên đến khi dung dịch có màu xanh lá mạ. Bảng 4.2. Hàm lượng protein trong bột tảo Khối lƣợng bột tảo (mg) Thể tích NaOH N/100 chuẩn độ (ml) Hàm lƣợng protein (%) 0,2000 13,72 60,03 0,2019 14,25 61,75 0,2042 14,45 61,91 Vậy từ Bảng 4.2 cho thấy hàm lƣợng protein trong tảo lam Spirulina platensis chiếm khoảng 60,03%. Kết quả phân tích này đƣợc sử dụng làm cơ sở để xác định lƣợng protein bổ sung vào nƣớc giải khát sau này và dựa vào kết quả này để đánh giá hiệu quả phá vỡ tế bào khi phá vỡ tế bào tảo bởi phƣơng pháp khuếch tán và phƣơng pháp vật lí. 41 4.1.1.2. Xác định hàm lƣợng protein trong bã tảo Cân 0,2g bột tảo, pha loãng trong 100 ml nƣớc cất, lắc đều, đem lọc, bã lọc đem phân tích protein. Quá trình phân tích đƣợc thực hiện tƣơng tự mục 4.1.1.1. Kết quả: ∆VNaOH = 1,938 ml, K = 1 và hàm lƣợng protein trong bã tảo đƣợc tính theo biểu thức (5) – mục 3.5.1.2. 14 x ∆V x K x 10-4 x 100 Hàm lƣợng nitơ tổng số = m 14 x 1,938 x 1 x 10 -4 x 100 = 0,2 = 1,357% Vậy hàm lƣợng protein trong bã tảo P = 6,25 x 1,357 = 8,48% Kết quả phân tích hàm lƣợng protein trong bã tảo nhằm mục đích để đánh giá hiệu suất phá vỡ tế bào trong mẫu tảo khi phá vỡ tế bào tảo bởi các phƣơng pháp khác nhau. 4.1.2. Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry 4.1.2.1. Protein chuẩn Đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa giá trị OD và hàm lƣợng protein là cơ sở để để định lƣợng hàm lƣợng protein trong mẫu tảo. Qui trình xây dựng đƣờng chuẩn protein đƣợc thể hiện ở mục 3.5.2.2. Kết quả quá trình xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc thể hiện trên Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.1. Giá trị OD càng cao thì hàm lƣợng protein trong mẫu tảo càng cao. 42 Bảng 4.3. Kết quả chỉ số OD tương ứng với nồng độ protein chuẩn Nồng độ protein µg/ml Chỉ số OD 0 0 50 0,144 100 0,235 150 0,320 200 0,400 250 0,456 300 0,520 350 0,590 400 0,647 450 0,728 y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D (7 50 nm ) Biểu đồ 4.1. Đường chuẩn protein Từ kết quả xây dựng đƣờng chuẩn protein trên Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.1 thu đƣợc các dữ liệu nhƣ sau: Phƣơng trình hồi qui: y = 0,0015x + 0.0498 Hệ số tƣơng quan: R = 0,99 Chỉ số R = 0,99 chứng tỏ sự hồi qui của các số liệu thực nghiệm trên đồ thị của phƣơng trình hồi qui tốt, mô hình toán học đƣợc thiết lập càng gần với bản chất của đối tƣợng đƣợc thử nghiệm – kết quả thu đƣợc đáng tin cậy hơn. 43 4.1.2.2. Hàm lƣợng protein trong dịch tảo Cân 0,2g bột tảo, pha loãng trong 100 ml nƣớc cất, lắc đều, đem lọc, hút 5 ml dịch lọc định mức lên 50 ml, từ 50 ml dịch lọc định mức này hút 1 ml vào ống nghiệm, thêm 4 ml dung dịch C, để yên trong 10 phút, thêm 0,5 ml thuốc thử Folin, để yên từ 30 – 90 phút, đến khi dung dịch mẫu có màu xanh. Tiến hành đo OD, kết quả đo OD đƣợc trình bày trong Bảng 4.4. Bảng 4.4. Giá trị OD - protein trong 0,2g bột tảo Khối lƣợng tảo (mg) Số lần lập lại Chỉ số OD 200 1 2 3 0,2420 0,2420 0,2430 Trung bình cộng 0,2423 Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2423 0.4846 0.7269 0.9692 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D (7 50 nm ) Biểu Đồ 4.2. Nồng độ protein ứng với chỉ số OD xác định Từ giá trị OD trung bình trên Bảng 4.4 tham chiếu lên biểu đồ đƣờng chuẩn protein ta đƣợc nồng độ protein trong dung dịch mẫu thí nghiệm là 103,11 µg/ml (Biểu đồ 4.2). Hàm lƣợng protein trong mẫu tính theo tỉ lệ phần trăm là: 44 C x a x V x 100 103,11 x 10 x 100 x 100 Ta có: P = = m x 1000 200 x 1000 = 51,55% Kết quả phân tích hàm lƣợng protein trong bã tảo và dịch tảo trƣớc khi phá vỡ tế bào tảo là cơ sở để đánh giá hiệu suất phá vỡ tế bào trong mẫu tảo trƣớc khi phá vỡ tế bào tảo và sau khi phá vỡ tế bào tảo bởi các phƣơng pháp khác nhau. 4.1.3. Xác định hàm lƣợng tro tổng số trong bột tảo khô Tiến hành cân chén sứ (G), cho vào lò nung ở nhiệt độ 600-650oC/3 giờ, lấy ra cho vào bình hút ẩm rồi cân cho đến khi trọng lƣợng không đổi, cân mẫu tảo ở trọng lƣợng xác định (G1). Cho chén nung chứa mẫu vào lò nung, nung cho đến khi tảo biến thành tro trắng, lấy ra cho vào bình hút ẩm rồi cân đến trọng lƣợng không đổi (G2). Kết quả thu đƣợc thể hiện trên Bảng 4.5 và đƣợc tính theo biểu thức (7) – mục 3.5.3.2. Bảng 4.5. Hàm lượng tro theo phần trăm có trong tảo G (mg) m (mg) G1 (mg) (G + m) G2 (mg) Tổng lƣợng tro (%) 28.323 2.000 28.575 30.423 12,600 28.575 2.013 30.5879 28.836 12,949 29.932 2.016 31.9483 30.194 12,966 31.115 2.015 33.1294 31.376 12,961 32.071 2.029 34.0997 32.335 12,996 Quá trình xác định hàm lƣợng tro tổng số nhằm mục đích xác định hàm lƣợng muối khoáng có trong tảo Spirulina platensis. Do tro là thành phần còn lại của nguyên liệu khi đốt cháy hết các chất hữu cơ. 45 4.2. Nghiên cứu các phƣơng pháp phá vỡ tế bào 4.2.1. Đánh giá hiệu quả phá vỡ tế bào bằng cách xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Kieldahl 4.2.1.1. Hàm lƣợng protein khi phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán (PPKT) Tiến hành phá vỡ mẫu tảo bằng cách phối trộn với đƣờng ở các nồng độ đƣờng 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8% và 200 mg tảo pha loãng trong 100 ml nƣớc cất, lắc đều, ủ 24 giờ ở nhiệt độ thƣờng. Mẫu ủ đƣợc lọc, bã lọc đem vô cơ, chƣng cất và chuẩn độ. Quá trình phân tích đƣợc thực hiện tƣơng tự mục 4.1.1.1. Ngoại trừ bƣớc vô cơ hóa 20 phút đầu khi đặt lên bếp vô cơ phải trực tiếp theo dõi, để tránh hiện tƣợng mẫu vô cơ bị phun trào làm hao hụt lƣợng protein, sự phun trào này là do sự hiện diện của đƣờng. Hàm lƣợng protein trong dịch thu đƣợc trình bày trong Bảng 4.6 và hàm lƣợng protein trong bã tảo đƣợc tính theo biểu thức (5) – mục 3.5.1.2. Bảng 4.6. Lượng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ theo PPKT Nồng độ đƣờng ∆VNaOH (ml) Hàm lƣợng protein (%) 0,2 % 1,714 7,50 0,4 % 1,808 7,91 0,6 % 1,753 7,67 0,8 % 1,726 7,55 Kết quả phân tích hàm lƣợng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ bằng phƣơng pháp khuếch tán nhằm mục đích để đánh giá hiệu suất phá vỡ tế bào trong mẫu tảo. 4.2.1.2. Hàm lƣợng protein khi phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp vật lý (PPVL) Tiến hành phá vỡ mẫu tảo bằng cách ủ trong tủ đông ở các thời gian khác nhau 2 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày. Sau đó, sốc nhiệt bằng lò siêu âm, đem 46 lọc, bã lọc đem vô cơ, chƣng cất và chuẩn độ. Quá trình phân tích đƣợc thực hiện tƣơng tự mục 4.2.1.1. Kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện trên Bảng 4.7 và hàm lƣợng protein trong bã tảo đƣợc tính theo biểu thức (5) – mục 3.5.1.2. Bảng 4.7. Hàm lượng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ bằng PPVL. Thời gian phá vỡ tế bào ∆VNaOH (ml) Hàm lƣợng protein (%) 2 ngày 1,703 7,45 5 ngày 1,723 7,54 7 ngày 1,723 7,54 10 ngày 1,751 7,66 Kết quả phân tích hàm lƣợng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ bằng phƣơng pháp vật lí nhằm mục đích để so đánh giá hiệu suất phá vỡ tế bào trong mẫu tảo. Vậy kết quả thu nhận protein khi phá vỡ theo hai phƣơng pháp khuếch tán và vật lí đều thu đƣợc lƣợng protein hòa tan trong tảo Spirulina platensis. 4.2.2. Đánh giá hiệu quả phá vỡ tế bào bằng cách xác định hàm lƣợng protein theo kết quả thu nhận protein theo phƣơng pháp Lowry 4.2.2.1. Hàm lƣợng protein khi phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán Tiến hành phá vỡ mẫu tảo bằng cách phối trộn với đƣờng ở các nồng độ đƣờng 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8% pha loãng trong 100 ml nƣớc cất, lắc đều, ủ 24 giờ ở nhiệt độ thƣờng. Mẫu ủ đƣợc lọc, hút 5 ml dịch lọc định mức lên 50 ml, hút 1 ml vào ống nghiệm, thêm 4 ml dung dịch C, để yên trong 10 phút, thêm 0,5 ml dung dịch Folin để yên từ 30 – 90 phút, đến khi dung dịch mẫu có màu xanh. Tiến hành đo OD. Chỉ số đo OD đƣợc tham chiếu lên đƣờng chuẩn ở Biểu đồ 4.1. Kết quả hàm lƣợng protein thu nhận đƣợc từ sự phá vỡ tế bào theo PPKT đƣợc trình bày trên Bảng 4.8 và đƣợc tính theo biểu thức (6) - mục 3.5.2.2. 47 Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2497 0.4994 0.7491 0.9988 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D (7 50 nm ) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2633 0.5266 0.7899 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D (7 50 nm ) a) b) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2553 0.5106 0.7659 1 0212 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D ( 7 5 0 n m ) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.251 0.502 0.753 1.004 0 100 20 30 400 500 Protein (µg/ml) O D ( 7 5 0 n m ) c) d) Biểu Đồ 4.3. Nồng độ protein thu được tương ứng với hàm lượng đường sử dụng trong thí nghiệm a) Nồng độ protein ở 0,2 % đường,b) Nồng độ protein ở 0,4 % đường, c) Nồng độ protein ở 0,6 % đường, d) Nồng độ protein ở 0,8 % đường. 48 Bảng 4.8. Giá trị OD – protein trong dịch tảo phá vỡ theo nồng độ đường Mẫu phá vỡ ở nồng độ Chỉ số OD Trung bình cộng OD Hàm lƣợng P (%) 0,2 % đƣờng 0,248 0,250 0,251 0,2497 53,13 0,4 % đƣờng 0,263 0,263 0,264 0,2634 56,04 0,6 % đƣờng 0,255 0,255 0,256 0,2553 54,33 0,8 % đƣờng 0,251 0,251 0,251 0,2510 53,41 Nhận xét: Từ kết quả nhận đƣợc ở Biểu đồ 4.3 và Bảng 4.8 cho thấy hàm lƣợng protein thu đƣợc ở nồng độ 0,4% đƣờng là cao nhất. 4.2.2.2. Hàm lƣợng protein khi phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp vật lý Tiến hành phá vỡ mẫu tảo bằng cách ủ trong tủ đông ở các thời gian khác nhau 2 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày. Sau đó, sốc nhiệt bằng lò siêu âm, đem lọc, hút 5 ml dịch lọc định mức lên 50 ml, hút 1ml vào ống nghiệm, thêm 4 ml dung dịch C, để yên trong 10 phút, thêm 0,5 ml dung dịch Folin để yên từ 30 - 90 phút, đến khi dung dịch mẫu có màu xanh. Tiến hành đo OD. Chỉ số đo OD đƣợc tham chiếu lên đƣờng chuẩn ở biểu đồ 4.1. Kết quả hàm lƣợng protein thu nhận đƣợc từ sự phá vỡ tế bào theo PPVL đƣợc trình bày trên Bảng 4.9 và tính theo biểu thức (6) - mục 3.5.2.2. 49 Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2477 0.4954 0.7431 0.9908 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D (7 50 nm ) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2507 0.5014 0.7521 1.0028 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D ( 7 5 0 n m ) a) b) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2507 0.5014 0.7521 1 0028 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D ( 7 5 0 n m ) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.255 0.51 0.765 1.02 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D ( 7 5 0 n m ) c) d) Biểu Đồ 4.4. Nồng độ protein ứng với OD xác định: a) Nồng độ protein trong 2 ngày, b) Nồng độ protein trong 5 ngày, c) Nồng độ protein trong 7 ngày, d) Nồng độ protein trong 10 ngày. 50 Bảng 4.9. Giá trị OD – protein trong dịch tảo phá vỡ theo PPVL Mẫu phá vỡ ở thời gian Chỉ số OD Trung bình cộng OD Hàm lƣợng P (%) 2 ngày 0,247 0,248 0,248 0,2477 52,71 5 ngày 0,250 0,251 0,251 0,2507 53,33 7 ngày 0,250 0,251 0,251 0,2507 53,32 10 ngày 0,255 0,255 0,255 0,2550 54,25 Nhận xét: Từ kết quả nhận đƣợc ở Biểu đồ 4.4 và Bảng 4.9 cho thấy hàm lƣợng protein thu đƣợc trong thời gian 10 ngày là cao nhất. Vậy theo phƣơng pháp Kjeldahl chúng ta có thể xác định đƣợc hàm lƣợng protein trong bột tảo, bã tảo và cả dịch tảo. Nhƣng để kết quả đƣợc đồng nhất trong cùng một thời gian thí nghiệm, trong cùng một mẫu sử dụng, cần phải sử dụng phƣơng pháp Lowry để xác định hàm lƣợng protein trong dịch tảo. Từ tổng hàm lƣợng protein của dịch tảo đƣợc xác định theo phƣơng pháp Lowry và bã tảo theo phƣơng pháp Kjeldahl so sánh với hàm lƣợng protein trong bột tảo nguyên đƣợc xác định theo phƣơng pháp Kjeldahl, nếu hai giá trị đồng nhất hoặc mức độ sai số chỉ khoảng ± 0,1 thì kết quả đáng tin cậy. Đây là cơ sở để đánh giá hiệu suất phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán và theo phƣơng pháp vật lí. 51 4.3. So sánh kết quả protein 4.3.1. Hàm lƣợng protein trong mẫu tảo trƣớc phá vỡ và sau khi phá vỡ tế bào Bảng 4.10. Hàm lượng protein trong các mẫu tảo khác nhau. Mẫu Nghiệm thức Chỉ số OD trung bình Hàm lƣợng protein (%) Bột tảo T0 0,2423a 51,55 0,2% đƣờng T1 0,2497c 53,13 0,4% đƣờng T2 0,2634f 56,04 0,6% đƣờng T3 0,2553e 54,33 0,8% đƣờng T4 0,2510d 53,41 2 ngày T5 0,2477b 52,71 5 ngày T6 0,2507cd 53,33 7 ngày T7 0,2507cd 53,33 10 ngày T8 0,2550e 54,25 Ghi chú: : Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê, T0: không phá vỡ tế bào mẫu, T1 – T8: phá vỡ tế bào mẫu 52 51,55% 53,13% 56,04% 54,33% 53,41% 52,71% 53,33% 54,25% 49 50 51 52 53 54 55 56 57 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Nghiệm thức H àm lư ợn g pr ot ei n (% ) Biểu đồ 4.5. Hàm lượng protein trong mẫu tảo trước và sau khi phá vỡ. Qua Bảng 4.10 và Biểu đồ 4.5 cho thấy giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê (phụ lục 1). Hàm lƣợng protein thu đƣợc trong dịch tảo khi phá vỡ tế bào bằng phƣơng pháp vật lý hay phƣơng pháp thẩm thấu đều cho giá trị tƣơng đƣơng hay cao hơn so với trong bột tảo nguyên. Kết quả này cho phép kết luận rằng các phƣơng pháp trên có khả năng phá tế bào tảo hoàn toàn. 53 4.3.2. Hàm lƣợng protein trong mẫu tảo khi phá vỡ tế bào tế bào theo nồng độ đƣờng và thời gian Bảng 4.11. Hàm lượng protein trong mẫu tảo Mẫu Nghiệm thức Chỉ số OD trung bình Hàm lƣợng protein (%) 0,2% đƣờng T1 0,2497b 53,13 0,4% đƣờng T1 0,2634b 56,04 0,6% đƣờng T1 0,2553b 54,33 0,8% đƣờng T1 0,2510b 53,41 2 ngày T2 0,2477a 52,71 5 ngày T2 0,2507a 53,33 7 ngày T2 0,2507a 53,32 10 ngày T2 0,2550a 54,25 Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê, T1: phá vỡ tế bào mẫu theo nồng độ đường, T2: phá vỡ tế bào mẫu theo thời gian. Qua Bảng 4.11 cho thấy giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê (phụ lục 2). Nhận xét: Từ Bảng 4.11 cho thấy phá vỡ tế bào tảo theo phƣơng pháp khuếch tán sẽ cho hàm lƣợng protein cao hơn so với phƣơng pháp vật lí. 54 4.3.3. Hàm lƣợng protein trong mẫu tảo khi phá vỡ theo các nồng độ đƣờng khác nhau (PPKT) Bảng 4.12. Hàm lượng protein trong mẫu tảo Mẫu Nghiệm thức Chỉ số OD trung bình Hàm lƣợng protein (%) 0,2% đƣờng T1 0,2497a 53,13 0,4% đƣờng T2 0,2634c 56,04 0,6% đƣờng T3 0,2553b 54,33 0,8% đƣờng T4 0,2510a 53,41 Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê, T1: phá vỡ tế bào mẫu theo nồng độ 0,2% đường, T2: phá vỡ tế bào mẫu theo nồng độ 0,4% đường, T3: phá vỡ tế bào mẫu theo nồng độ 0,6% đường, T4: phá vỡ tế bào mẫu theo nồng độ 0,8% đường. Qua Bảng 4.12 cho thấy giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê (phụ lục 3). Trong đó hàm lƣợng protein trong dịch tảo cao nhất là ở nồng độ đƣờng 0,4%. Vậy theo PPKT nồng độ đƣờng 0,4 % là nồng độ thích hợp nhất để cho hàm lƣợng protein cao nhất. 55 4.3.4. . Hàm lƣợng protein trong mẫu tảo khi phá vỡ theo các thời gian khác nhau (PPVL) Bảng 4.13. Hàm lượng protein trong mẫu tảo Mẫu Nghiệm thức Chỉ số OD trung bình Hàm lƣợng protein (%) 2 ngày T1 0,2477a 52,71 5 ngày T2 0,2507b 53,33 7 ngày T3 0,2507b 53,32 10 ngày T4 0,2550c 54,25 Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê, T1: phá vỡ tế bào mẫu theo thời gian 2 ngày, T2: phá vỡ tế bào mẫu theo thời gian 5 ngày, T3: phá vỡ tế bào mẫu theo thời gian 7 ngày, T4: phá vỡ tế bào mẫu theo thời gian 10 ngày. Qua Bảng 4.13 cho thấy giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê (phụ lục 4). Trong đó hàm lƣợng protein trong dịch tảo cao nhất là ở thời gian 10 ngày. Tất cả các kết quả so sánh protein đều đƣợc xử lý trên phần mềm Statgraphics. 4.4. Kết quả phân tích vi sinh Đồng thời với đánh giá cảm quan, chúng tôi tiến hành phân tích vi sinh trong sản phẩm: nƣớc khoáng Vĩnh Hảo, nƣớc tinh khiết và rƣợu trái cây. Mỗi sản phẩm thử nghiệm ba lần, trên một nồng độ, mỗi nồng độ lặp lại trên ba đĩa. Mẫu đƣợc phân tích tại phòng thử nghiệm vi sinh Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận Cân 25g bột tảo vào trong bao PE, thêm vào dung dịch pha loãng mẫu Buffered Pepton Water, đồng nhất mẫu và tiến hành qui trình phân tích Salmonella. Đồng thời cân 10g bột tảo vào một bao PE khác, thêm dung dịch pha loãng mẫu SPW để đạt đến 100g, đồng nhất để đƣợc nồng độ pha loãng 10-1. 56 Mẫu này đƣợc dùng để phân tích tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC), E. coli, Coliforms và S. aureus. Kết quả sau khi phân tích đƣợc trình bày trên Bảng 4.14. Bảng 4.14. Kết quả phân tích vi sinh các sản phẩm nghiên cứu Mẫu TPC (CFU/g) Coliforms (CFU/g) E.coli S. aureus (CFU/g) Salmonella Bột tảo 0 0 - 0 - Nƣớc uống Vĩnh Hảo 0 0 - 0 - Aquafina 0 0 - 0 - Rƣợu trái cây 30 0 - 0 - Ghi chú: (-): không có sự hiện diện của vi sinh vật Từ Bảng 4.14 cho thấy sinh khối tảo, nƣớc uống Vĩnh Hảo và nƣớc tinh khiết không có sự hiện của các vi sinh vật đƣợc khảo sát, rƣợu trái cây có sự hiện diện của TPC. Chứng tỏ các sản phẩm làm nền đảm bảo an toàn về mặt vi sinh 4.5. Hiệu suất phá vỡ tế bào tảo Spirulina platensis Từ các kết quả phân tích lƣợng protein trong dịch lọc và trong bã tảo chúng tôi tiến hành đánh giá hiệu quả của các phƣơng pháp phá màng tế bào tảo và thu hồi hàm lƣợng protein. Kết quả đƣợc tổng hợp trong Bảng 4.15. 57 Bảng 4.15. Hiệu suất phá vỡ tế bào và thu hồi protein trong tảo Mẫu Nghiệm thức Hàm lƣợng P bã lọc Hàm lƣợng P dịch lọc Tổng (%) Hiệu suất phá vỡ (%) Dịch tảo T0 8,48 51,55 60,03 PPKT 0,2% đƣờng T1 7,50 53,13 60,63 88,4 0,4% đƣờng T2 7,91 56,04 63,95 93,3 0,6% đƣờng T3 7,67 54,33 62,00 90,4 0,8% đƣờng T4 7,55 53,41 60,96 89,0 PPVL 2 ngày T5 7,45 52,71 60,16 87,9 5 ngày T6 7,54 53,33 60,87 88,9 7 ngày T7 7,54 53,33 60,87 88,9 10 ngày T8 7,66 54,25 61,91 90,3 90,3% 88,9% 87,9% 89% 90,4% 93,3% 88,4% 85 86 87 88 89 90 1 92 93 94 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Nghiệm thức H iệ u su ất p há v ỡ tế b ào Biểu đồ 4.6. Hiệu suất phá vỡ tế bào giữa PPKT và PPVL. 58 Kết quả trên Bảng 4.15 cho thấy hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch sau khi phá tế bào đạt cao nhất là 56,04 % khi phá vỡ tế bào tảo bằng phƣơng pháp khuếch tán. Phuơng pháp này đơn giản, chi phí thấp. Theo chúng tôi đây là phƣơng pháp khá hiệu quả để thu protein hòa tan dùng để bổ sung vào trong các sản phẩm nƣớc uống sau này Nhận xét: Mỗi phƣơng pháp phá vỡ tế bào tảo Spirulina pltensis đều làm tăng lƣợng protein hòa tan, trong đó hiệu suất phá vỡ tế bào cao nhất là ở nồng độ hòa tan 0,4 % đƣờng (Bảng 4.15). 4.6. Nghiên cứu chọn tỉ lệ bổ sung vi khuẩn lam Spirulina platensis Chúng tôi cùng với cán bộ kỹ thuật của Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận tiến hành khảo sát nhiều tỉ lệ phối trộn vào các loại nƣớc uống và dịch tảo khác nhau. Sau khi khảo sát chúng tôi nhận thấy tỉ lệ thích hợp để bổ sung giữa nƣớc uống và dịch tảo là 17:1 là đảm bảo cho chất lƣợng sản phẩm về mặt phẩm cảm quan. Để đánh giá chất lƣợng của sản phẩm phối trộn này chúng tôi đã đánh giá chất lƣợng cảm quan và chất lƣợng về mặt vi sinh. Theo dõi chất lƣợng sản phẩm về mặt cảm quan: Chúng tôi tiến hành theo dõi sự biến đổi của sản phẩm sau 4 tuần. Kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 4.16. Bảng 4.16. Chất lượng sản phẩm về mặt cảm quan. Thời gian Màu Mùi Vị Sau 1 ngày Đục hơn Mùi tảo Vị của các sản phẩm làm nền Sau 1 tuần Đục hơn Mùi tảo Vị của các sản phẩm làm nền Sau 2 tuần Trong hơn Mùi nhẹ hơn Vị chanh Sau 3 tuần Có sự thay đổi thêm một mức Sau 4 Tuần Trong Không mùi Vị chanh 59 Theo dõi chất lƣợng về mặt vi sinh: Các sản phẩm sau 4 tuần cho phối trộn với dịch tảo, đƣợc thử nghiệm vi sinh. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 4.17. Bảng 4.17. Chất lượng sản phẩm về mặt vi sinh. Mẫu TPC (CFU/g) Coliforms (CFU/g) E.coli S. aureus (CFU/g) Salmonella Vihaspi 0 0 - 0 - Aquaspi 0 0 - 0 - Spiwine 30 0 - 0 - Ghi chú: Vihaspi: là sản phẩm được tạo ra từ nước khoáng Vĩnh Hảo có bổ sung dịch tảo Spirulina platensis, Aquaspi: là sản phẩm được tạo ra từ nước tinh khiết Aquafina có bổ sung dịch tảo Spirulina platensis, Spiwine: là sản phẩm được tạo ra từ nước rượu trái cây có bổ sung dịch tảo Spirulina platensis Vậy kết quả thử nghiệm vi sinh sau khi bổ sung dịch tảo vào các sản phẩm làm nền so với trƣớc khi bổ sung dịch tảo không có sự khác biệt. Điều này chứng tỏ sự bổ sung dịch tảo vào các sản phẩm không làm thay đổi chất lƣợng sản phẩm về mặt vi sinh. 4.7. Đánh giá chất lƣợng sản phẩm Sau 4 tuần theo dõi chất lƣợng sản phẩm, kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Chất lƣợng về mặt cảm quan: Màu: Màu tự nhiên của các sản phẩm làm nền. Mùi: Không mùi. Vị: Vị chanh. Chất lƣợng về mặt vi sinh: Không có sự hiện diện của các loài vi sinh vật có hại, đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng về mặt vi sinh. Nhận xét: Sau các kết quả đánh giá chất lƣợng sản phẩm vế mặt vi sinh và cảm quan đều cho thấy sản phẩm đảm bảo về mặt vi sinh và cảm quan. 60 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ các kết quả thử nghiệm trên cho phép rút ra kết luận nhƣ sau: Mẫu tảo phá vỡ tế bào giúp phá vỡ protein không hòa tan thành protein hòa tan. Trong phƣơng pháp phá vỡ mẫu bằng phƣơng pháp khuếch tán, thì ở nồng độ đƣờng 0,4% sẽ cho hiệu suất phá vỡ tế bào cao nhất. Trong phƣơng pháp phá vỡ tế bào bằng phƣơng pháp vật lí thì hiệu suất phá vỡ tế bào tỉ lệ thuận với thời gian xử lý. Trong đó phá vỡ ở thời gian 10 ngày cho hiệu suất phá vỡ cao nhất. Trong hai phƣơng pháp phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán và theo phƣơng pháp vật lí thì phƣơng pháp khuếch tán cho hiệu suất phá vỡ tế bào cao hơn. Để đảm bảo về chất lƣợng sản phẩm, thì tỉ lệ bổ sung thích hợp nhất là 1:17 tức là tỉ lệ giữa dịch tảo và sản phẩm làm nền. 5.2. Đề nghị Do giới hạn về thời gian và điều kiện thí nghiệm nên chƣa hoàn chỉnh một số vấn đề trong nghiên cứu này. Nếu đề tài đƣợc tiếp tục, chúng tôi có các đề xuất sau: Thử nghiệm thêm các chỉ tiêu về các axit amin, các sắc tố và chất khoáng. Nghiên cứu thêm các phƣơng pháp phá vỡ tế bào khác để thu đƣợc lƣợng protein cao nhất có trong tảo. Nghiên cứu các phƣơng pháp khử mùi và khử màu tảo để có tỉ lệ bổ sung sinh khối tảo với một lƣợng lớn bổ sung vào thực phẩm. 61 Chƣơng 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Thành Đạt, 1996. Vi Simh Vật Học. Nhà Xuất bản Giáo Dục. 2. Nguyễn Tiến Dũng, 2006. Giáo trình Kiễm phẩm Tủ sách Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3. Vƣơng Thị Việt Hoa, 2003. Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm. Tủ sách Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Đức Lƣợng. Thí Nghiệm Công Nghệ sinh học Tập 1. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. 5. Lƣơng Đức Phẩm, 2002. Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm. Nhà xuất bản Nông nghiệp – Hà Nội. 6. Lê Hữu Thƣớc, 1988. Tảo Spirulina - Nguồn dinh dưỡng và dược liệu quý. NXB KHKT Hà Nội. 7. Lê Ngọc Tú, 1999. Hóa học thực phẩm. Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội. 8. Nguyễn Thị Ánh Tuyết. Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. 9. Lê Bạch Tuyết, 1996. Các quá trình Công nghệ cơ bản trong sản phẩm. Nhà xuất bản Giáo Dục. TIẾNG ANH 10. Golbeck. J. H, 1994. The Molecular Biology of Cyanobacteria (Bryant, D. A., ed.) 11. Mahasin G.Tadros. Characterization of Spirulina Biomass for Celss Diet Potential – 11/1988 12. Schmetterer. G, 1994. The Molecular Biology of Cyanobacteria (Bryant, D. A., ed.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 409-435. 62 TÀI LIỆU TRÊN MẠNG 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. &cat_id=1 24. 25. ảo_xoắn - 35k 26. - 34k 27. =10565 28. 29. 30. - 77k 31. 32. www20.24h.com.vn/news.php/62/157533 - 131k 33. www.nea.gov.vn/thongtinmt/noidung/vnn1_25_4_04.htm - 14k 34. www.webtretho.com/forum/archive/index.php/t-27258.htm 35. www.vnfa.com/bqsk/sk_rxoc.html 36. www.austrapharmvn.com/vietnam/product.php?mode=detail&id=33 - 33k 37. www.vnn.vn/khoahoc/tintuc/2004/05/135084/ - 13k 38. microbewiki.kenyon.edu/index.php/Spirulina 63 39. www.markastore.ro/os/catalog/catalog/popup_im... 40. www.terapeut.ro/commerce/crema-antirid-coenzi... 41. www.scielo.br/scielo.php?pid=S0104-6632200600... 42. www.shop-spirulina.com/.../190?osCsid=179400117 43. e-shop.herbalcreations.gr/catalog/product_inf... 44. www.thanhnien.com.vn/Suckhoe/2005/7/26/116925.tno 45. www.nea.gov.vn/tapchi/Toanvan/05-2k1-24.htm 64 PHỤ LỤC: Kết quả xử lí số liệu. Phụ Lục 1. Khảo sát sự khác biệt hàm lƣợng protein khi không phá vỡ và phá vỡ tế bào mẫu tảo theo nồng độ đƣờng và theo thời gian. 1.1. Bảng ANOVA One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: H.p Level codes: H.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 8.10519E-004 8 1.01315E-004 210.423 .0000 Within groups 8.66667E-006 18 4.81481E-007 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 8.19185E-004 26 0 missing value(s) have been excluded. 65 1.2. Trắc nghiệm LSD giữa các nghiệm thức Multiple range analysis for H.p by H.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0 3 .2423333 X 5 3 .2476667 X 1 3 .2496667 X 6 3 .2506667 XX 7 3 .2506667 XX 4 3 .2510000 X 8 3 .2550000 X 3 3 .2553333 X 2 3 .2633333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 0 - 1 -0.00733 0.00119 * 0 - 2 -0.02100 0.00119 * 0 - 3 -0.01300 0.00119 * 0 - 4 -0.00867 0.00119 * * denotes a statistically significant difference. 66 Phụ lục 2. Khảo sát sự khác biệt hàm lƣợng protein khi phá vỡ tế bào mẫu tảo theo nồng độ đƣờng và theo thời gian. 2.1. Bảng ANOVA One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: K.ddt Level codes: K.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 8.81667E-005 1 8.81667E-005 4.493 .0455 Within groups 4.31667E-004 22 1.96212E-005 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 5.19833E-004 23 0 missing value(s) have been excluded. 67 B.2.2. Trắc nghiệm LSD giữa các nghiệm thức Multiple range analysis for K.ddt by K.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 12 .2510000 X 1 12 .2548333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 0.00383 0.00375 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 68 Phụ Lục 3. Khảo sát sự khác biệt hàm lƣợng protein khi phá vỡ tế bào mẫu tảo theo nồng độ đƣờng. 3.1. Bảng ANOVA One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: DD.dd Level codes: DD.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 3.41667E-004 3 1.13889E-004 151.852 .0000 Within groups 6.00000E-006 8 7.50000E-007 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 3.47667E-004 11 0 missing value(s) have been excluded. 69 3.2. Trắc nghiệm LSD giữa các nghiệm thức Multiple range analysis for DD.dd by DD.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 .2496667 X 4 3 .2510000 X 3 3 .2553333 X 2 3 .2633333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.01367 0.00163 * 1 - 3 -0.00567 0.00163 * 1 - 4 -0.00133 0.00163 2 - 3 0.00800 0.00163 * 2 - 4 0.01233 0.00163 * 3 - 4 0.00433 0.00163 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 70 Phụ Lục 4. Khảo sát sự khác biệt hàm lƣợng protein ở các thời gian khác nhau trong cùng phƣơng pháp vật lí (phƣơng pháp sốc nhiệt). 4.1. Bảng ANOVA One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TT.tt Level codes: TT.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 8.20000E-005 3 2.73333E-005 109.333 .0000 Within groups 2.00000E-006 8 2.50000E-007 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 8.40000E-005 11 0 missing value(s) have been excluded. 71 4.2. Trắc nghiệm LSD giữa các nghiệm thức Multiple range analysis for TT.tt by TT.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 .2476667 X 2 3 .2506667 X 3 3 .2506667 X 4 3 .2550000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.00300 0.00094 * 1 - 3 -0.00300 0.00094 * 1 - 4 -0.00733 0.00094 * 2 - 3 0.00000 0.00094 2 - 4 -0.00433 0.00094 * 3 - 4 -0.00433 0.00094 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.