Khóa luận nghiên cứu qui trình phát hiện Salmonella trong thủy sản đông lạnh

áng thể không mạnh. Khi các sợi lông bị kết hợp bởi các kháng thể đặc hiệu, lông sẽ bị bất động, vi khuẩn không thể di chuyển được. Kháng nguyên lông được dùng đễ phân loại một số chủng Salmonella. Bảng 1.2. Phân biệt các kháng nguyên O, H, K Kháng nguyên Tính chịu nhiệt Tác động của alcohol 50% Formol 50% O Ổn nhiệt 2h30 ở 100oC Kháng Bị ngăn trở ngưng kết K Biến nhiệt 15’06” ở 100oC Nhạy cảm Kháng H Biến nhiệt 2h ở 100oC Nhạy cảm Kháng . Hình1.5. Các kháng nguyên bề mặt của Salmonella 1.2.5. Điều kiện sinh trưởng Salmonella phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella. Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ. Salmonella kém đề kháng với điều kiện bên ngoài, bị phá hủy bởi quá trình tuyệt trùng bằng phương pháp Pasteur, Tia bức xạ và đun sôi nấu kĩ. Tuy nhiên, Salmonella có thể sống sót trong 1 thời gian dài ở các thực phẩm khối và ướp lạnh. Do đó, khi làm tan thực phẩm đông lạnh vi khuẩn này dễ phát triển trở lại. Chúng phát triển tốt nhất ở 6oC - 42oC thích hợp nhất ở 35oC - 37oC , pH từ 6-9 và thích hợp nhất ở pH= 7,2. Ở nhiệt độ từ 18oC - 40oC vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày. Khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn này rất kém: ở 50oC trong 1 giờ, ở 70oC trong 15 phút và 100oC trong 5 phút . Chúng bị tiêu diệt bởi phenol 5%, Chloramin 1% và chlorur thủy phân 0,2% trong 5 phút. Với nồng độ muối 8 - 19% thì sự phát triển của vi khuẩn ngừng lại. Vi khuẩn này không gây mùi vị khó chịu cho thực phẩm,chúng hiện diện trong tất cả các loại thực phẩm như: trứng, thịt, thủy hải sản, rau. Salmonella có khả năng len men glucose và manitol, sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không phân giải urea, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane.Salmonella không sinh indol, không làm lỏng gelatin. Các tính chất sinh hóa cơ bản của Salmonella được thể hiện ở bảng 1.3. Bảng 1.3. Các tính chất sinh hóa cơ bản của Salmonella Tính chất Kết quả Ghi chú - Khử Nitrate (+) - Lên men Glucid (+) Kèm theo sự tổng hợp acid - Lên men Glucose sinh khí (+) Trừ một số chủng thuộc loài S.typhi và S. gallinarum - Sử dụng Citrate (+) Trừ S. typhi và S. paratyphi A - Sinh H2S (+) Trừ một số chủng thuộc loài S. paratyphi A và S. choleraesuis - Sử dụng Lactose (-) Trừ S. anizonae - Sử dụng Saccharose (-) - Hệ enzyme: + Catalase (+) + Beta –galactosidase (-) Trừ một số loài phụ + Urease (-) + Decarboxylase Lysine (LDC) (+) Trừ S. paratyphi A Ornithine (ODC) (+/-) + Arginine dihydrolase (ADH) (-) + Desaminase Phenylalanine (-) Tryptophane (-) + Tetrathionate reductase (+) - Các tính chất khác + Mannitol (+) + Indole (-) + Acetylmethylcarbinol (VP) (-) « Ghi chú:(+): dương tính; (-): âm tính;(+/-): có thể âm tính hay dương tính tùy theo chủng 1.2.6. Yếu tố độc lực Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố. - Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật. - Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyền như vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột. 1.2.6.1. Nội độc tố Màng ngoài tế bào vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn Salmonella nói riêng, được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là lipopolysaccharide (LPS). LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với đặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipit A. Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi polysaccharide chứa các đơn vị cấu trúc kháng nguyên O. Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharide, ở trung tâm nối kháng nguyên O với vùng lipit A. Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của vi khuẩn. Cấu trúc nội độc tố gần giống cấu trúc của kháng nguyên O. Cấu trúc nội độc tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella. Nội độc tố thường là lipopolysaccharide (LPS) được phóng ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải. Trước khi thể hiện độc tính của mình, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm ba cầu B, lâm ba cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu thực bào, tế bào gan, lách. Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể chịu sự tác động của nội độc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hoá, hệ thống miễn dịch; với các biểu hiện bệnh lý: Tắc mạch máu, giảm trương lực cơ thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hoá, mất tính thèm ăn… Nội độc tố tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ, kích thích hình thành kháng thể. LPS tác động lên các tế bào tiểu cầu, gây sốt nội độc tố, theo cơ chế : - Giải phóng các chất hoạt động mạnh như: Histamin. - Ngưng kết các tiểu cầu động mạch. - Đông vón, tắc mạch quản. LPS tác động lên quá trình trao đổi glucit: LPS làm tăng cường hoạt lực của các men phân giải glucose, các men phân giải glycogen, làm giảm hoạt lực các men tham gia quá trình tổng hợp glycogen… 1.2.6.2. Độc tố đường ruột Về cơ chế miễn dịch và di truyền các Enterotoxin của Salmonella có quan hệ gần gũi với Choleratoxin, nên được gọi là Choleratoxin like enterotoxin (CT). Còn về đặc tính sinh học Enterotoxin của Salmonella không chỉ với giống CT mà còn giống với Enterotoxin của E.coli. Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: Độc tố thẩm xuất nhanh Rapid permeability facto (RPF) và độc tố thẩm xuất chậm Delayed permeability facto (DPF). RPF giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, nó thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1 - 2 giờ và kéo dài 48 giờ và làm trương các tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc, thành phần giống với độc tố chịu nhiệt của E.coli, được gọi là độc tố chịu nhiệt của Salmonella. ST có khả năng chịu được nhiệt độ 100oC trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở nhiệt độ -20oC. Cấu trúc phân tử gồm một chuỗi polysaccharide và một chuỗi polypeptide. RPF kích thích co bóp nhu động ruột, làm tăng sự thẩm thấu thành mạch, phá huỷ tổ chức tế bào biểu mô ruột, giúp vi khuẩn Salmonella xâm nhập vào tế bào và phát triển tăng nhanh về số lượng. Vi khuẩn tích cực tăng cường sản sinh độc tố làm rối loạn cân bằng trao đổi muối, nước và chất điện giải. Quá trình bệnh lý đường ruột và hội chứng tiêu chảy càng thêm phức tạp và nghiêm trọng. DPF của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E.coli, nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella. Nó thực hiện chức năng phản ứng chậm từ 18 - 24 giờ. LT bị phá huỷ ở 70oC trong vòng 30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ. LT có cấu trúc gồm 3 chuỗi polypeptid. DPF làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường bài xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hoá lớp tế bào villi của thành ruột, gây tiêu chảy. 1.2.6.3. Độc tố tế bào Khi cơ thể người và động vật bị tiêu chảy thì kèm theo hiện tượng mất nước và mất chất điện giải là hiện tượng hàng loạt các tế bào biểu mô ruột bị phá huỷ hoặc bị tổn thương ở các mức độ khác nhau. Sự phá huỷ hay tổn thương đó là do độc tố tế bào của Salmonella gây nên, theo cơ chế chung là: Ức chế tổng hợp protein của tế bào Eukaryotic và làm trương tế bào CHO. Ít nhất 3 dạng độc tố của tế bào: - Dạng thứ nhất: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với trypsin. Dạng này được phát hiện ở rất nhiều serovar Salmonella; có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 56 đến 78 kDa; không bị trung hoà bởi kháng thể kháng độc tố Shigella toxin hoặc Shigella - like. Độc tố dạng này tác động theo cơ chế là ức chế tổng hợp protein của tế bào Hela và làm teo tế bào. - Dạng thứ hai: Có nguồn gốc từ protein màng ngoài tế bào vi khuẩn có cấu trúc và chức năng gần giống các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng (ETEC) sản sinh ra. Dạng độc tố này cũng phổ biến ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh. - Dạng thứ ba: Có trọng lượng phân tử khoảng 62 kDa; có liên hệ với độc tố Hemolysin. Hemolysin liên hệ với các độc tố tế bào có sự khác biệt với các Hemolysin khác về trọng lượng phân tử và phương thức tác động lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào. 1.2.7. Cơ chế gây bệnh Tất cả các kiểu huyết thanh Salmonella điều mang cụm gen invasion giúp chi quá trình xâm nhiễm vào thành ruột của người và động vật, mở đầu của tiến trình gây bệnh. Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI-1 (Salmonella pathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hóa thấp nhất là S.bongori đến nhóm tiến hóa cao nhất là S.enterica I. Inva là một bản gen luôn có mặt trong hệ thống gen invasion. Sự xâm nhiễm Salmonella vào cơ thể vật chủ và gây bệnh được thực hiện chủ yếu qua đường tiêu háo với biểu hiện phổ biến nhất là gây tiêu chảy đôi khi là thương hàn và phó thương hàn. Salmonella chủ yếu gây bệnh bằng nội độc tố, và ngoại độc tố - Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật. - Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyền như vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột. Để gây bệnh, Salmonella xâm nhập vào cơ thể theo đường tiêu hóa do thức ăn, nước uống bị nhiễm bẩn, số lượng để gây bệnh khoảng105 đến 107. Các chủng Salmonella thường sinh sản ra một entertoxin có bản chất lipopolysaccharide vốn có khả năng tác động đến nhiều mô khác nhau, đến các chức năng của mô. Tuy nhiên, trong trường hợp nhiễm độc thực phẩm chất độc này chỉ có tác dụng khi nó được giải phóng vào trong ruột từ những vi khuẩn sống và đa dạng trong pha sinh sản. Khi ăn các bào tử sống thì có thể sinh bệnh, song khi ăn các vi khuẩn đã bị chết thì không ảnh hưởng gì. Sau khi đi vào ống tiêu hóa, vi khuẩn bám vào niêm mạc, ruột non rồi xâm nhập qua niêm mạc vào các hạch mạc trên ruột. Ở đây, chúng nhân lên rồi qua hệ thống bạch huyết và ống ngực đi vào máu, lác này dấu hiệu lâm sàn bắt đầu xuất hiện, Từ máu, vi khuẩn đến lá lách và vào các cơ quan khác: - Tới màng payer, vi khuẩn tiếp tục nhân lên. - Tới gan theo mật đổ xuống ruột rồi được đào thải qua phân. - Tới thận, một số vi khuẩn được đào thải ra ngoài theo nước tiểu. Salmonella gây bệnh bằng sự xâm nhập của bản thân vi khuẩn phá hủy tổ chức tế bào bằng nội độc tố của Salmonella khi bị chết. Khả năng gây ngộ độc thức ăn của Salmonella spp cần có 2 điều kiện: - Thức ăn phải bị nhiễm một lượng lớn vi khuẩn vì khả năng gây ngộ độc của Salmonella yếu. - Vi khuẩn vào cơ thể phải phóng ra một lượng độc tố lớn. vấn đề này phụ thuộc nhiều vào phản ứng cơ thể của từng người. điều này giải thích hiện tượng nhiều người cùng ăn một loại thức ăn như nhau nhưng có người bị ngộ độc có người không bị, có người nhẹ, có người bị nặng…Thông thường những người già, người yếu và trẻ em bao giờ cũng bị nặng hơn. 1.2.8. Nguồn gốc gây nhiễm Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn. Tất cả các thức ăn tươi sống có nguồn gốc động vật đều có thể là nguồn vi khuẩn Salmonella. Vi khuẩn này sống tự do trong ruột động vật và có trên lông. Gia cầm có nhiều Salmonella nhất, tiếp theo là các động vật nuôi trong nhà và động vật hoang (vẹt, rùa, chó, ếch, chim mông biển, loài gặm nhấm, rắn).Vi khuẩn này có thể có trong thành phần dẫn xuất các chất từ động vật như gelatin hoặc nước bọt động vật, bởi côn trùng, loài gặm nhấm, chim hoặc các sản phẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm. Ngoài ra có thể bị nhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn này. Thực phẩm có nguồn gốc thực vật ít có nguy cơ nhiễm khuẩn. Vì lí do bị ức chế bởi pH < 4 và có mặt vi khuẩn lactic nên các sản phẩm lên men ít bị nhiễm. Trứng và các sản phẩm trứng ví dụ như bột nhào, nước sốt mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm là nguồn mang nhiều Salmonella, nên trứng của nó cũng bị nhiễm vì vi khuẩn này có thể xuyên qua vỏ trứng và sinh sản trong lòng đỏ trứng. Các sản phẩm sữa như sữa không thanh trùng, phomát từ sữa tươi, kem chất béo sữa, và các sản phẩm từ sữa nói chung được chế biến từ các nông trại, các thiết bị đều có thể gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi choSalmonella, và từ đó gây nhiễm độc cho sản phẩm sữa. Nếu tiến hành axit hóa chậm thì vi khuẩn dễ dàng sinh sản trong phomát nhưng nó bị phá hủy với pH < 4,5. Những sản phẩm có sữa phải được giám sát chặt chẽ bởi chúng không được thanh trùng nữa, vì vậy nếu có Salmonella trong sữa bột thì chúng vẫn có thể sinh sản được bởi chúng có khả năng tồn tại ở điều kiện khô hạn và lây nhiễm sang các sản phẩm khác. 1.2.9. Bệnh, triệu chứng và cách điều trị bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra + Bệnh thương hàn: Triệu chứng: Sốt cao, đau đầu, mệt mỏi, chán ăn, nhịp tim chậm, khoảng 26% có nốt hồng ban trên cơ thể. Người bệnh đau bụng, nôn, táo bón hoặc tiêu chảy phân đen hoặc có máu. Nếu không được chuẩn đón và điều trị kịp thời sẽ gây ra những biến chứng nguy hiểm như chảy máu ruột, thủng ruột hoặc bị rối loạn chức năng não và dễ gây tử vong. Điều trị: Thương hàn không gây tử vong ở hầu hết các ca bệnh. Kháng sinh như Ampicilin, Chloramphenicol, Amoxicillin và Ciprofloxacin Trimethoprum-sulfamethoxazole, được sử dụng phổ biến để điều trị bệnh thương hàn ở các phát triển. Điều trị kịp thời và kháng sinh giảm tỉ lệ tử vong xuống xấp xỉ 1%. Nếu không được điều trị, thương hàn tồn tại trong ba tuần đến một tháng. Chết xảy ra ở 10% và 30% của nững trường hợp không được điều trị. + Bệnh nhiễm trùng máu: Triệu chứng: buồn ngủ hoặc ngủ li bì, sốt cao trên 38oC hoặc hạ nhiệt độ dưới 35oC. Vàng da, tím tái hoặc xám, da xanh (do thiếu máu), suy hô hấp làm cho trẻ thở nhanh hoặc chậm, rối loạn tiêu hóa (tiêu chảy, nôn, bụng trướng căng) gan, lá lách to. Trong trường hợp nặng, bệnh nhi có thể bị suy thận cấp và tiệu ít. Điều trị: Ngày nay, với sự tiến bộ của các phương tiện chuẩn đón, trang thiết bị hỗ trợ tim mạch, hô hấp và kháng sinh thì việc chữa trị nhiễm trùng máu có kết quả rõ rệt, giảm được tử vong rất nhiều. Việc điều trị bao gồm cả công tác chuẩn đoán sớm, loại bỏ nguồn gốc gây nhiễm trùng từ ổ nguyên phát, hỗ trợ tuần hoàn và hô hấp, điều chỉnh thăng bằng kiềm toan, chống rối loạn đông máu và kháng sinh.Trước khi sử dụng kháng sinh nên cấy máu vào các bệnh phẩm khác để làm kháng sinh đồ chọn ra kháng sinh phù hợp, Song, không phải chờ kết quả của kháng sinh đồ mới điều trị mà nên dùng kháng sinh phổ rộng ngay sau khi lấy bệnh phẩm. + Bệnh rối loạn tiêu hóa: Triệu chứng: hiện tượng ăn không tiêu, đầy hơi, chướng bụng, buồn nôn, đi lỏng hoặc táo bón, đau bụng âm ỉ hoặc đau từng cơn... Điều trị: Trước hết vần phải tránh uống rượu, cà phê, thuốc lá (nếu có dùng) vì những thứ này thường làm giảm trương lực co thắt dưới thực quản. Hạn chế ăn các loại thức ăn nhiều mỡ, bởi loại thcứ ăn này làm chậm tống đẩy của dạ dày và dể bị trào ngược thực quản. Không ăn cay, chua, ăn chậm, nhai kỹ, ăn bữa chính buổi tối 3 giờ khi trước khi ngủ.Tư thế nằm đầu cao, không dùng các thuốc kháng aspirin, thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs), thuốc an thần. Về thuốc, bạn có thể dùng các thuốc kháng acid dạ dày như Sucralfat, misoprostol, bismuth... Các thuốc ức chế cụ thể như cimetidin, ranitidin,famotidin,nizatidin, song, hiện các thuốc ức chế bơm proton (PPIs) hiệu quả hơn, có các loại omeprazole, lansoprazole, pantoprazole, esomeprazole, rabeprazole. Nếu có vi khuẩn H.pylori thì kết hợp điều trị với 2 thuốc kháng sinh. Dùng các thuốc đồng vận (prokinetics): Domperidon có tác dụng làm tăng áp lực cơ thắt dưới, ít có triệu chứng của hệ thần kinh trung ương vì thuốc không qua hàng rào máu - não. Metoclopramid dùng trước bữa ăn. Thuốc có thể gây khô miệng, lo lắng, có triệu chứng ngoại tháp, rối loạn vận động ở người cao tuổi. Ngoài ra, có thể dùng các thuốc chống trầm cảm để điều hòa quá trình kích thích ruột. Tuy nhiên, việc dùng thuốc như thế nào cần có hướng dẫn cụ thể của thầy thuốc. 1.2.10. Tình hình nhiễm Salmonella ở Việt Nam và trên Thế Giới. 1.2.10.1. Tình hình nhiễm Salmonella ở Việt Nam Theo Cục trưởng Cục ATVSTP cho biết, hiện nay, mạng lưới kiểm nghiệm ATVSTP đã được hình thành rộng khắp trong cả nước nhưng thực tế năng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an toàn thực phẩm tại các địa phương vẫn rất hạn chế. Trong 330 mẫu hoa quả có tới 2,7% số mẫu có tỷ lệ tồn dư thuốc bảo vệ thực vật cao, nhất là ở táo đỏ, quýt và lê. Đặc biệt, trong số 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt đã phát hiện tới 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây ra các bệnh về đường tiêu hóa. Hơn nữa, khu vực TP Hồ Chí Minh và Đồng Nai là những địa phương có tỷ lệ mẫu thực phẩm nhiễm Salmonella cao nhất, chiếm từ 84 - 95% mẫu được giám sát. 1.2.10.2. Tình hình nhiễm Salmonella trên Thế Giới Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở châu Âu giảm đều đặn từ những năm 1990 trở lại đây, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được phát hiện, sự sai lệch của báo cáo này là rất lớn, số lượng thực tế rất có thể gấp 10 lần như thế. Ở Mỹ, tình trạng có khá hơn, ổn định ở mức 15 ca trên 100.000 người từ năm 2001 do kiểm soát tốt Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gồm các thực phẩm sữa, trứng, nước trái cây, sản phẩm tươi sống, rau, bánh kẹo, và đặc biệt là thịt. Một đợt dịch gần đây ở Mỹ gây ra bởi S.typhimurium nhiễm trong bơ đậu phộng đã gây ảnh hưởng đến hơn 700 người trên khắp nước Mỹ. Từ tháng 7/2009 tới nay, số ca nhiễm khuẩn Salmonella được phát hiện ở Mỹ đã tăng lên 184 người, thuộc 38 bang khác nhau. Cơ quan y tế của nước này vẫn chưa xác định nguyên nhân chính xác khiến số ca nhiễm khuẩn Salmonella tăng nhanh như vậy. Tuy nhiên, mới đây các chuyên gia y tế của bang Oregon cho rằng nguồn lây lan vi khuẩn Salmonella từ các sản phẩm xúc xích. Vừa qua, các cơ quan điều tra Mỹ đã thu hồi hơn 560 tấn xúc xích do nghi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella, tất cả số lượng này đều do Công ty Daniele International sản xuất.Tuy nhiên, ông Jason Maloni, phát ngôn viên của công ty này khẳng định: “Chưa có bằng chứng nào chứng minh các sản phẩm xúc xích của chúng tôi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella”. Sự bùng nổ của số ca nhiễm khuẩn Salmonella ở khu vực tây bắc Thái Bình Dương đã khiến các cơ quan điều tra nghi ngờ rằng nguồn gây bệnh cho ổ dịch này là từ các sản phẩm xúc xích sau khi họ phát hiện rất nhiều người ăn xúc xích mua tại các cửa hàng ở khu vực này bị nhiễm khuẩn Salmonella. Các nhân viên điều tra tại bang Washington cũng cho biết 14 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn Salmonella ở bang này, đã từng ăn xúc xích của hãng Daniele. Ngoài ra, các chuyên gia y tế khẳng định họ đã kiểm tra và phát hiện khuẩn Salmonella có trong các mẫu xúc xích của công ty này. Hiện tại, các nhân viên điều tra liên bang Mỹ vẫn đang làm việc để tìm ra nguyên nhân chính xác gây ra dịch nhiễm khuẩn Salmonella ở nước này. Vì thế, họ vẫn chưa thể kết luận sản phẩm xúc xích của Công ty Daniele có phải là nguồn lây bệnh chính hay không. Vì thế, những sản phẩm xúc xích của công ty này bị thu hồi là do kiểm tra bị nhiễm khuẩn Salmonella. 1.2.11. Cách phòng ngừa Vệ sinh phân, nước, rác. Không ăn thức ăn sống, không uống sữa chưa tiệt trùng. Luôn luôn rửa tay thật kỹ bằng xà bông trước khi ăn, trước và sau khi làm đồ ăn và sau khi đi vệ sinh, thay tã hoặc chơi với thú nuôi trong nhà. Nấu kĩ thực phẩm có nguồn gốc động vật trước khi ăn đặc biệt là thịt gia cầm, thịt lợn, trứng (ít nhất là đun tới 70oC), không dùng trứng sống hoặc chưa nấu kĩ. Bức xạ tần số cao và axit hóa: chiếu tia bức xạ vào thịt gia cầm là phương pháp hiệu quả nhằm phá hủy, tiêu diệt Salmonella. Hơn nữa, vi khuẩn này không sinh sản ở pH < 4. Làm lạnh thực phẩm: vi khuẩn này sinh sản chậm trong khoảng nhiệt độ 5 – 120oC và nhanh ở nhiệt độ thường. Chính vì lí do đó mà không nên để lâu trong tủ lạnh, nhất là ở nhiệt độ thường. Thịt đông lạnh phải được làm tan ỏ phòng lạnh chứ không được rửa bằng nhiệt độ phòng hay bằng nước ấm. Bảo quản thức ăn đã nấu chín trong các hộp chứa nhỏ. Tránh gây tái nhiễm vi khuẩn trong bếp sau khi thức ăn đã được nấu chín, để thực phẩm tươi sống riêng với thực phẩm nấu chín. Thanh tra vệ sinh và giám sát cẩn thận các lò mổ, các nhà máy chế biến thức ăn, các cửa hàng thịt trứng. Thức hiện đúng quy chế vệ sinh trong các khâu sản xuất vận chuyển, bảo quản, dự trữ. Thường xuyên kiểm tra sức khỏe người chế biến hoặc tiếp xúc với thực phẩm, xét nghiệm phân để sớm phát hiện cách ly và điều trị người lành mang trùng. Tuyên truyền giáo dục vệ sinh, ăn chín, uống sôi, rửa tay trước khi ăn và sau khi đi vệ sinh. Trong vùng có nhiều người mắc bệnh hoặc vùng bị lũ lụt, ô nhiễm môi trường nặng cần được sát khuẩn bằng dung dịch Cloramin B, vôi bột. Ở những nơi bệnh thương hàn thường xuyên xảy ra nên tiêm phòng bằng vaccin, tùy từng hiệu lực của từng loại vaccin có thể tiêm nhắc lại sau 2 - 5 năm. Sử dụng Vaccin phòng bệnh thương hàn do Vi khuẩn Salmonella gây ra được sử dụng chứa kháng nguyên V của S.typhi đưa vào cơ thể bằng đường tiêm với 1 liều 25mg có hiệu lực bảo vệ 70%. Tại Việt Nam có 2 loại Vaccin thương hàn thường sử dụng : - Vaccin thương hàn tiêm (injection): tên thương mại Typhim Vi – NSX Viện Bào Chế Pasteur Merieux Connaught – Pháp. - Vaccin thương hàn Zerotyph Cap – Uống. Nhà bào chế Boryung Biopharma Co.Gtd – Hàn Quốc. 1.3. Phương pháp phát hiện Salmonella 1.3.1. Phương pháp truyền thống 1.3.1.1. Nguyên tắc Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một qui trình bao gồm 4 bước: bước tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh, ức chế sự tăng trưởng của Salmonella. ê Bước tăng sinh: Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu mà cần chọn qui trình tăng sinh phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường là 1:9 nhưng có thể thay đổi. ê Bước tăng sinh chọn lọc: Các môi trường tăng sinh chọn lọc dùng dể phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth,Tetrathionate Mueler Kauffmanm Broth (TT)…những nghiên cứu gần đây cho thấy môi trường RV có thể thay thế cho các môi trường khác. Hiện nay, người ta khuyến khích là nên dùng ít nhất 2 loại môi trường tăng sinh chọn lọc để phát hiện tất cả Serotype Salmonella nếu có hiện diện trong mẫu. ê Bước phân lập: Nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử dụng để phân lập Salmonella. Hiện nay, vcác tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích sử dụng ít nhất 2 loại môi trường phân lập khác nhau để tăng cường khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella, đặc biệt là môi trường XLD được sử dụng nhiều nhất. ê Bước khẳng định Nhằm xác định lại các khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập. Bước này được thực hiện trên các thử nghiệm sinh hóa và các thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salomonella. Các thử nghiệm sinh hóa được khuyến khích sử dụng là KIA/TSI, Indol, LDC (lysine decarboxylase), ODC (ornithine decarboxylase), urea, Manitol, sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh O hay H. 1.3.1.2. Phương pháp thực hiện a) Bước tăng sinh Đối với mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ. Đối với một số loại thực phẩm có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần thực hiện qui trình tăng sinh đặc biệt như sau: - Đối với mẫu gia cầm tươi sống: đặt gia cầm vào một bao nhựa lớn, thêm vào 1 lít môi trường tăng sinh BPW. Lắc bằng máy lắc khoảng 30 giây để môi trường thấm được vào trong toàn bộ mẫu. - Đối với mẫu sữa khô: cho 25g mẫu vào trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml môi trường BPW, để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó lắc cho đến khi sữa tan hoàn toàn. - Đối với các loại gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị: đồng nhất mẫu ở độ pha loãng 1/100 trong BPW (thay vì 1/10 như bình thường) trước khi nuôi tăng sinh. Biện pháp này nhằm làm giảm nồng độ các hợp chất ức chế sự tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh. - Đối với các loại mẫu như casein, pho mat, bơ và các sản phẩm tương tự khác: thực hiện đồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ẩm đến 40oC. - Đối với sản phẩm chứa coca: đồng nhất mẫu trong môi trường Skim Milk Broth được làm ẩm ở 40oC. - Đối với dừa, các sản phẩm của dừa và các mẫu có hmà lượng chất béo cao: đồng nhất mẫu với BPW, sau đó thêm vào 2 - 3 giọt Triton X-100 trước khi ủ tăng sinh. b) Bước tăng sinh chọn lọc Lắc để trộn đều dung dịch tăng sinh, và chuyển 0,1ml sang 10ml môi trường tăng sinh RV đã được ủ ấm đến 42oC. Ủ ở 42oC trong 18 - 24 giờ. Khi cần thiết cần kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ. Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác như Selenite Cysteine Broth, Tetrethionate Muller- Kauffman cũng được dùng. Mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc trên một đặc điểm phát triển của Salmonella, một số dòng Salmonella trăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng trưởng được trong môi trường khác.Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu thực phẩm cần phải dùng ít nhất 2 loại môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu. Ngoài ra, mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ nuôi cấy khác nhua như môi trường RV được ủ ở 420C, môi trường TT và SC được ủ ở 37oC trong 22 - 24 giờ. c) Bước phân lập và nhận diện Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS...Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng được tất cả các dòng Salmonella phải dùng tối thiểu 2 môi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau: - Môi trường XLD: Khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. - Môi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. - Môi trường BS: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kím tím. Môi trường chung quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang đen nếu kéo dài thời gian ủ. - Môi trường BPLS: có khuẩn lạc Salmonella màu hồng nhạt, trong suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển sang màu đỏ. - Môi trường SS: Tất cả các đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở 37oC trong 22-26 giờ. Sau khi ủ, chọn khuẩn lạc có đặc điểm của Salmonella như trên để thực hiện khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng nguyên. d) Khẳng định Từ mỗi môi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng qua môi trường không chọn lọc như TSA. Ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh. Các thử nghiệm sinh hóa chính là: lên nem gloco, utea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol. Các chủng Salmonella cho kết quả sau: - Thử nghiệm H2S (KIA hay TSI) Salmonella chỉ lên men được dường gluco trong môi trường trên vì thế phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu vàng. Đa số các chủng Salmonella điều có khả năng sinh H2S nên có vạch màu đen trong môi trường. Có thể quan sát thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch hoặc môi trường bị đẩy lên. - Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuôi cấy, môi trường bị kiềm hóa, không đổi màu (màu tím hay xanh). - Thử nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi ph của môi trường nên môi trường không đổi màu. - Lên men manitol, sorbitol (+): môi trường chuyển màu vàng vì bị acid hóa. - Thử nghiệm Indol và VP (-). - Các thử nghiệm kháng nguyên: cần được thực hiện song song với mẫu đối chứng bằng nước muối sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả. Hai loại huyế thanh đa giá cần dùng là Salmonella Polyvalent O và Salmonella Polyvalent H. Phản ứng (+) khi chúng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh nhưng không ngưng kết với nước muối sinh lý. Bảng 1.4. Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong test sinh hóa Thử nghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng H2S TSI/KIA Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, nứt thạch và xuất hiện vạch đen LDC LDC Không đổi màu Urea Urea Không đổ màu Manitol,sorbitol Manitol, sorbitol Bị acid hóa, môi trường chuyển sang màu vàng Indol Trypton Không xuất hiện vòng đỏ khi nhỏ thuốc thử Kovac’s VP VP Không đổi màu khi nhỏ α – napthol 5% và KOH 40% 1.3.1.3. Báo cáo kết quả Qui trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính Salmonella, giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu, không cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu. Để khẳng định được tên chủng Salmonella phân lập được cần phải tiến hành thử nghiệm ngưng kết với các loại kháng huyết thanh đơn giá khác nhau hay cần gửi các chủng Salmonella phân lập được đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật. Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm. Do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Salmonella dùng làm đối chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các môi trường hay mẫu vật sau khi nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa. 1.3.2. Phương pháp hiện đại Bên cạnh những kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh Salmonella, còn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đôi khi để tăng hiệu quả, độ tin cậy cho xét nghiệm người ta đã kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR assay (Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Salmonella trong thực phẩm. 1.3.2.1. Phương pháp PCR Phương pháp PCR là phương pháp tổng hợp DNA in vitro dựa trên khuôn là một trình từ DNA đích ban đầu, sau đó trình tự này được khuếch đại và nhân lên thành hàng triệu bản sao. Một phản ứng PCR để có thể thực hiện được phải có: - DNA mẫu. - Cặp mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược. - Taq polymerase - dNTP’s ( các nucleotide tự do) Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ là một quá trình gồm ba bước: - Bước 1 (biến tính, denaturation): hỗn hợp được gia nhiệt lên đến 94 – 95oC. Mục đích của giai đoạn này là làm cho DNA mạch đôi tách ra thành hai mạch đơn. - Bước 2 (bắt cặp): ở giai đoạn này nhiệt độ hạ xuống khoảng 55 – 65oC. giai đoạn này, các primer sẽ bắt cặp với trình tự thích hợp. - Bước 3 (kéo dài): nhiệt độ ở giai đoạn này được nâng lên 72oC, đây là nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của Taq polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm ba bước sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, sau mỗi chu kỳ thì số lượng DNA mẫu lại tăng lên gấp đôi. Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, đem sản phẩm DNA điện di trên gel agarose và nhuộm với ethydium bromide, sau đó quan sát dưới tia UV. 1.3.2.2. Phương pháp ELISA Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là dực trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên. Tín hiệu của phản ứng kết hợp này được nhận biết thông qua sự phát quang. Trong số các phương pháp miễn dịch thì phương pháp hấp thụ miễm dịch sử dụng enzyme (Enzyme Link ImmunoSorbent Assy – ELISA ) là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất vì phương pháp này đơn giản và cho hiệu quả khá cao. Nguyên tắc của phương pháp ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng để bắt các kháng nguyên mục tiêu. Các kháng nguyên mục tiêu được pháp hiện nhờ một kháng thể thứ hai có gắn với enzyme. Sau đó, bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra sản phẩm có màu hay phát quang. Bằng cách theo dõi sự thay đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên. ELISA hiện nay đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng bộ các bộ kit thương mại (như kit phát hiện Salmonella, Escherichia coli, Listeria…). 1.3.2.3.Phương pháp màng PETRI (Petrifilms) Môi trường dinh dưỡng ở dạng đông khô, được cố định vào màng mỏng gọi là Petrifilm. Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên và nhỏ vào đo 1ml dịch mẫu rồi đậy lại. Một đĩa petri nhựa được đặt lên màng bảo vệ để tạo một khuôn tròn. Môi trường dinh dưỡng sẽ hổ trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian ủ. Có thể đếm trực tiếp khuẩn lạc trên Petrifilm. Petrifilm được sử dụng để kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí, coliform, feacal coliform, tổng số nấm men, nấm mốc. Ưu điểm của kỹ thuật Petrifilm là dễ thao tác, tiết kiệm thời gian ủ và bảo quản. Thời gian sử dụng lâu là do môi trường ở dạng đông khô và không cần xử lý nhiệt như môi trường thông thường. có thể sử dụng nước cất vô trùng để làm ướt môi trường đông khô. Sau khi môi trường đông lại, có thể dùng trực tiếp Petrifilm để đếm tạp khuẩn trên bề mặt. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu Tiến hành lấy mẫu ở các chợ và các siêu thị, chủ yếu là các loại sản phẩm đông lạnh như: tôm, mực.. 2.1.2. Môi trường, hóa chất và dụng cụ 2.1.2.1. Môi trường và hóa chất - Môi trường canh RV (Rappaport Vassiliadis Soya Pepton) Môi trường pha loãng mẫu BPW(Buffered Peptone Water) Môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) Môi trường TSA (Tryptone Soya Agar) Môi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar) Môi trường TT (Tetrethionate Muller – Kauffmanm) Môi trường HE (Hektoen Entric Agar) - Môi trường BS (Bismuth Sulphite Agar) Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS) Canh LDC (Lysine Decarboxylase) Ornithine Decarboxylase Môi trường MR-VP Broth Môi trường Urea Broth Môi trường Mannitol Phenol Red Broth base) - Sucrose - Sorbitol Canh Tryptone Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Barritt Kháng huyết thanh Salmonella đa giá Cồn 70 % và cồn 96 % Nước cất 2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị a) Dụng cụ - Ống nghiệm có nắp Đĩa petri vô trùng Pipette Cân điện tử Bình tam giác Cóc thủy tinh Kéo Đũa khuấy Túi nylon vô trùng Đèn cồn Que cấy vòng Que cấy thẳng Bình chứa môi trường b) Thiết bị Autoclave Tủ lạnh Bếp từ Bể điều nhiệt 42oC Tủ ấm 37oC Tủ cấy Bếp đun Bể ổn nhiệt 2.2. Phương pháp thực hiện 2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu a) Lấy mẫu Chuẩn bị đầy đủ các dụng cụ lấy mẫu khi đi lấy mẫu về phân tích. Chọn một địa điểm sạch, trống và an toàn đặt thùng lấy mẫu xuống. Tiến hành lấy mẫu. Phải lấy mẫu ở tất cả các vị trí. Khi lấy mẫu cho vào túi PE, tránh không để tay chạm vào miệng túi và tránh không để mẫu dính lên miệng túi dễ gây nhiễm mẫu và kết quả sẽ không chính xác. Không được lấy quá ít mẫu, tối thiểu phải là 200g. Sau khi lấy mẫu, hàn miệng túi PE lại, dùng bút ghi rõ tên sản phẩm, nhà sản xuất, ngày sản xuất lên túi mẫu. Cất mẫu vào thùng đựng mẫu, cho dụng cụ vào một túi PE khác và không dùng lại dụng cụ này. Sau khi lấy mẫu xong, cho tấc cả các túi mẫu vào thùng giữ nhiệt và đậy kín lại sau đó đem đến nơi phân tích mẫu. b) Bảo quản mẫu Mẫu sau khi lấy xong, nếu không phân tích ngay, cho vào ngăn đá tủ lạnh bảo quản mẫu. Chú ý mẫu phải được phân tích trong vòng 24h từ khi lấy. 2.2.2. Chuẩn bị mẫu Rã đông trước khi phân tích, rã ở nhiệt độ phòng. Cân mẫu: các dụng cụ lấy mẫu cân, đựng mẫu phân tích và nơi cân cần đảm bảo vô trùng. Lượng mẫu cần cân tùy theo loại vi sinh cần phân tích. 2.2.3. Phương pháp Định tính Salmonella bằng phương pháp trải đĩa và test sinh hóa. Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong một lượng mẫu xác định. Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh chọn lọc RV, phân lập trên môi trường XLD và khẳng định bằng các môi trường thử nghiệm sinh hoá (môi trường TSI, Ure Broth, lên men Mannitol, LDC both, thử nghiệm Indol, thử nghiệm Voges- Proskauer). 2.2.4. Qui trình thu thập mẫu và tiến hành kiểm nghiệm Salmonella Sản phẩm thủy sản Thu tại các chợ và siêu thị Đánh giá các chỉ tiêu Vi sinh Cảm quan Test Salmonella Nhận xét, kết luận Hình 2.1. Qui trình thu thập mẫu và tiến hành kiểm nghiệm Salmonella. 2.2.5. Qui trình phân tích Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh (BPW), ủ ở 37oC, 18 - 24 giờ. Cấy 0,1ml dung dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc (RV), ủ ở 42oC, 18 - 24 giờ. Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc phân biệt (XLD,HE,BS,SS...),ủ ở 37oC, 24 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua đêm. Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả: Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không. Urea:(-), indol: (-), VP: (-), LDC: (+), ODC: (+), Manitol: (+), Sobitol: (+). Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh: Poly: O, Poly: H. Kết luận: Salmonella dương tính/ âm tính trong 25g mẫu. Hình 2.2. Qui trình phân tích phát hiện Salmonella 2.2.5.1 Thuyết minh qui trình a) Chuẩn bị mẫu Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có), cho vào bao nylon vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường PBW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. b) Cấy mẫu Tăng sinh: Cấy 0,1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV, Ủ ở 42 ± 0,5 oC trong 24 giờ. Phân lập: Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng của salmonella trên môi trường XLD: tròn, lồi, trong suốt , có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (hồng)… Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc và ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ c) Thử nghiệm khẳng định Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa. Thực hiện như sau: ê Thử nghiệm trên môi trường TSI Hấp khử trùng môi trường TSI ở 121oC trong 15 phút và phân phối môi trường vào các ống vô trùng để làm ống thạch nghiêng. Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của giống thuần sâu vào đáy của ống thạch nghiêng. Sau khi cấy xong thì ủ ở 37oC trong vòng 24h – 48h. ê Thử nghiệm Urea Broth Cấy vi sinh vật đã được phân lập vào môi trường canh urea có chứa chất chỉ thị là bromocresol purple Ủ ở 37oC trong khoảng 12h – 18h. Thử nghiệm (+): Môi trường chuyển sang màu vàng. Thử nghiệm (-): Môi trường không đổi màu. ê Lên men mannitol Môi trường sử dụng là môi trường phenol red broth base có pH 7.4, chỉ thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH < 6.8. Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng vi sinh vật cần khẳng định. Ủ 37oC trong 18 – 24h. Khả năng lên men của chúng được đánh giá dựa vào sự sinh hơi và sinh acid. Sinh acid (+): Môi trường màu cam chuyển sang vàng. Sinh hơi (-): Có bọt khí trong ống Durnham. ê Thử nghiệm LDC Sử dụng môi trường Falkow. Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng vi sinh vật cần khẳng định. Chất chỉ thị màu trong môi trường là Bromocresol purple. - Phản ứng (+): môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu, canh khuẩn đục. - Phản ứng (-): môi trường từ tím chuyển sang vàng. ê Thử nghiệm khả năng sinh Indol Cấy VSV thử nghiệm qua môi trường canh trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s Quan sát sau vài phút. - Thử nghiệm (+): trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen. - Thử nghiệm (-): không xuất hiện vòng đỏ. ê Thử nghiệm Voges – Proskauer Cấy vi sinh vật vào trong môi trường glucose phosphate (MR-VP Broth). Ủ ở nhiệt độ 37oC trong vòng từ 2 - 5 ngày. Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% trong cồn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 %. với tỷ lệ 3:1. Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút. - Thử nghiệm (+):xuất hiện màu đỏ hay hồng sáng trên mặt môi trường. - Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu. 2.2.6. Nhận định tính sinh hóa đặc hiệu Bảng 2.1. Phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong 25g mẫu Tính chất sinh hoá Dương hoặc âm tính Tỷ lệ % với vi khuẩn Salmonella TSI lactose - 99,2 TSI sucrose - 99,5 TSI glucose + 100 TSI glucose sinh hơi + 91,2 TSI hydro-sulfua + 91,6 Phân giải urê - 100,0 Lên men mannitol + Phản ứng Indol - 98,2 Phản ứng V.P - 100,0 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết Quả 3.1.1. Kết quả cảm quan Về màu sắc của mẫu thì có màu đặc trưng của từng loại. Về mùi của mẫu thì cũng có mùi đặc trung của từng loại, không có mùi ôi thiu... Tóm lại các mẫu thủy sản được lấy trong tình trang rất tốt, không biểu hiện gì xấu. Tuy nhiên, những giá trị cảm quan này không có mối quan hệ với khả năng bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh trên thủy sản đông lạnh. Do đó, những giá trị cảm quan này chỉ cung cấp các thông tin về trạng thái bên ngoài của mẫu. 3.1.2. Kết quả đánh giá mức độ nhiễm Salmonella trên sản phẩm thủy sản đông lạnh. Chúng tôi tiến hành lấy mẫu thuỷ sản ở một số chợ và siêu thị. Thực hiện các bước test Salmonella và cho một số kết quả như sau. Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên các đĩa môi trường: + Môi trường XLD: Chúng tôi tiến hành cấy trên 5 đĩa và phát hiện có 3 đĩa nhiễm Salmonella. Khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. Hình 3.1. Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD + Môi trường HE: Tiến hành cấy trên 5 đĩa và phát hiện có 2 đĩa nhiễm Salmonella. Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số dòng có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. Hình 3.2. Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường HE + Môi trường BS: Tiến hành trên 5 đĩa và phát hiện 3 đĩa nhiễm Salmonella. Khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kím tím, môi trường xung quanh khunẩ lạc chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang màu đen nếu kéo dài thời gian ủ. Hình 3.3. Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường BS Đồng thời chúng tôi tiến hành trên một số thử nghiệm sinh hoá cho một số kết quả như sau: + Thử nghiệm trên môi trường TSI: Hình 3.4. Thử nghiệm trên môi trường thạch TSI Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong môi trường TSI do vậy phần nghiêng của môi trường TSI có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Salmonella có khả năng sinh H2S do vậy xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường TSI. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới ống nghiệm. + Thử nghiệm Urea Broth: Hình 3.5. Thử nghiệm Urea Broth Vì Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường. Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu tím. + Lên Men manitol: Hình 3.6. Lên men manitol Môi trường sau khi nuôi cấy salmonella bị acid hóa và chuyển thành màu vàng. + Thử nghiệm LDC: Hình 3.7. Thử nghiệm LDC Sau khi nuôi cấy Salmonella môi trường chuyển thành kiềm, môi trường vẫn giữ nguyên màu tím. + Thử nghiệm khả năng sinh Indol: Hình 3.8. Thử nghiệm Indol Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s Quan sát sau vài phút. - Thử nghiệm (+): trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen. + Thử nghiệm Voges – Proskauer: Hình 3.9. Thử nghiệmVoges – Proskauer Sau khi cho thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% trong cồn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 %. với tỷ lệ 3:1. Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút. - Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu. Đánh giá theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với quy đinh mức độ nhiễm Salmonella là 0 CFU/25g Nhưng với một số mẫu mà chúng tôi đã lấy và tiến hành phân tích thì có một số mẫu bị nhiễm Salmonella chiếm khoảng 20 - 30%.Việc tạp nhiễm Salmonella có thể là đo nguồn phân phối không hợp vệ sinh, không dùng các dụng cụ bảo hộ lao động. Hay cũng có thể do nhiễm từ nguồn không khí, và môi trường xung quanh khu vực buôn bán. Tình trạng nhiễm Salmonella trên chứng tỏ mức độ VSATTP còn rất thấp, vì tỉ lệ theo TCVN là 0 CFU/25g. Còn lại những mẫu âm tính với Salmonella có thể sử dụng được, nhưng cũng phải đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, vì không chỉ có Salmonella mới gây ra những ca ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, không nhiễm Salmonella không có nghĩa là không nhiễm các vi sinh vật khác.  CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Sau quá trình nghiên cứu chúng tôi nhận thấy rằng số lượng nhiễm Salmonella chiếm khoảng 20 – 30%, diều này chứng tỏ vấn đề về VSATTP còn thấp. Bởi vì Salmonella là một loài vi khuẩn khá nguy hiểm, chúng gây ra bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết và một số bệnh khác. Đáng nói là loài này thường tạp nhiễm vào thực phẩm, điều này vô cùng nguy hiểm vì theo TCVN, mức độ nhiễm Salmonella là 0 CFU/25 g. Mạng lưới kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm tuy trải rộng khắp cả nước, nhưng năng lực kiểm dịch chưa được cao ở các địa phương , nhất là ở các thành phố lớn. 4.2. Đề nghị Tiến hành thử nghiệm với một số lượng mẫu lớn hơn. Tiến hành thêm các thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh và nhuộm. Ngoài ra, cần tiến hành nhiều thử nghiệm kiểm tra chỉ tiêu samonella trên các loại thực phẩm khác như thịt chế biến, thịt đông lạnh, trứng tươi,... Lập ra mạng lưới kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm dày đặc, năng lực kiểm tra cao. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng việt [1]. Trần Linh Thước, 2007, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm. [2]. Nguyễn Thị Linh Phương, 2006, đồ án ốt nghiệp, Đánh giá mức độ nhiễm Salmonella trên các quầy thịt ở chợ Văn Thánh. [3]. Nguyễn Hữu Liêm, 2006, khoá luận tốt nghiệp, Tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella. [4]. Lê Đình Hùng, Vương Thị Việt Hoa, Phạm Vân Ánh, Trần Hoàng Kim Sa, Tìm hiểu các biện pháp nhằm tăng cường khả năng phát hiện Salmonella trong sản phẩm thủy sản đông lạnh, Tạp san Khoa Học Kỹ Thuật Nông Lâm Nghiệp, số 2/2001. [5]. Phan Thị Thu Quế, 2005, Công nghệ chế biến thuỷ hải sản đông lạnh. [6]. PGS.TS Võ Thị Dương Huy, 2007, Vi khuẩn học. Tài liệu Internet [7]. [8].