MỞ ĐẦU
Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế vừa là cây mô
hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng. Vì vậy,
thuốc lá là một trong những đối tượng được sử dụng nhiều nhất trong các
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là làm đối tượng chuyển gen.
Khảm lá bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá, bệnh khảm lá gây thiệt hại
nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng thuốc lá, nhất lá đối với thuốc lá
sợi vàng. Bệnh khảm thuốc lá do hai loại virus TMV (Tobacco mosaic virus)
và CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra. Trong đó, TMV loại virus có phổ
ký chủ rất rộng có tới 230 loài thuộc 32 họ và là một trong virus gây hại trên
thực vật được mô tả sớm nhất ở nước ta.
Những phương pháp thông dụng để khắc phục bệnh khảm lá như sử dụng
giống kháng bệnh, giống sạch bệnh và các biện pháp canh tác( trồng luận
canh cây thuốc lá với cây lúa, vệ sinh đồng ruộng .). Tuy nhiên, những biện
pháp này không những chỉ có tác dụng làm giảm bớt sự lây lan và phát triển
của bệnh, chủ yếu chỉ manh tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh
này mà còn đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và ảnh hưởng xấu tới môi
trường.
Hiện nay, nhờ những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền mà người ta đã tạo
ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách
đưa gen mã hóa protein vỏ (coat protein gene) của virus vào genome của thực
vật.
Xuất phát từ cơ sở thực tiễn trên, giống thuốc lá C9-1 đã được lựa chọn cho
nghiên cứu “ Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm
tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá” với các nội dung và mục
đích nghiên cứu: (1) Chuẩn hóa phương pháp chuyển gen vào giống thuốc lá
C9-1 thông qua cấu trúc mang chỉ thị gus; (2) Tạo cây thuốc lá chuyển gen
mang cấu trúc TMV-RNAi; (3) Bước đầu phân tích cây chuyển gen bằng
phương pháp PCR
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN 1
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . 2
MỞ ĐẦU . 3
CHưƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ . 4
1.1.1.Phân loại 4
1.1.2. Giá trị của cây thuốc lá 5
1.1.3 . Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam . 6
1.2. MỘT SỐ BỆNH THưỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ . 8
1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá . 8
1.2.2. Bệnh khảm lá do virus . 10
1.3. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC 14
1.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh: 14
1.3.2.Sử dụng giống sạch bệnh 15
1.3.3. Các biện pháp canh tác 15
1.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học . 15
1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus . 18
1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi . 18
1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT
NAM. . 19
CHưƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP . 21
2.1. VẬT LIỆU 21
2.1.1.Vật liệu thực vật 21
2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen: 21
2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng 22
2.2. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm: . 22
2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo . 22
2.2.1.2. Gieo hạt 22
2.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium
tumafaciens 23
2.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium . 2351
2.2.2.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen . 23
2.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy . 23
2.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen . 24
2.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh . 24
2.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp nhuộm mô hóa tế bào . 24
2.2.4. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng phương
pháp PCR . 25
2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số 25
2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR 25
2.2.5. Phân tích khả năng kháng virus của các cây chuyển gen bằng phương
pháp lây nhiễm nhân tạo . 26
CHưƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 28
3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC
LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS . 28
3.1.1. Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen . 29
3.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây . 29
3.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi 29
3.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh 32
3.1.3. Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào 35
3.2. CÁC KẾT QUẢ BưỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi 35
3.2.1. Tái sinh và chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi . 35
3.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus . 37
3.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân
tạo 37
3.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây 38
3.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số . 38
3.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
51 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 2615 | Lượt tải: 5
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
đã phát triển những thí nghiệm của mình thành phƣơng
pháp CP tạo cây trồng kháng virus. Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng tạo
những dòng cây chuyển gen kháng nhiều loại virus gây bệnh trên thực vật hai
lá mầm và sau đó là thực vật một lá mầm [21]. Tuy vậy, các cây chuyển gen
này chỉ kháng đƣợc duy nhất một chủng virus mang gen mã hóa protein vỏ
mà nó chuyển vào. Điều này gây trở ngại trong việc phát triển các giống cây
trồng kháng virus dựa trên phƣơng pháp CP do độ đa dạng của virus thƣờng
khá cao [32]
Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ
thuật RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất trong việc
chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công
bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc
kháng lại virus ở thực vật. Các bƣớc chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1)
thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector
chuyển mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây
chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây
chuyển gen [38]. Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng
chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme
phiên mã RdRp,…) có khả năng kháng lại chính virus đó đã đƣợc chứng minh
bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại virus khác
nhau nhƣ: Potato virus Y PVY [43][33]cucumber mosaic virus CMV, Plum
pox potyvirus PPV [18], Tobacco mosaic virus TMV và Potato virus Y
PVY[35], Tomato yellow leaf curl virus TYLCV [46]Rice tungro bacilliform
virus RTBV, African cassava mosaic virus ACMV [41] … Trong những
nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo
chiều thƣờng đƣợc sử dụng để chuyển vào cây và sẽ đƣợc biểu hiện thành
RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó
kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây.
17
Ngƣời ta đã nhận thấy rằng khi vùng đệm của hpRNA đƣợc lặp lại với một
trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự bất hoạt gen là cao
nhất[33][44]. Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra đƣợc một dòng cây đậu
chuyển gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng
lên đến 93%. Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và cộng sự [ 26] đã công bố
kết quả tạo ra đƣợc một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc
ihpRNA có khả năng kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic
virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã
đƣợc phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này. Nói chung, hầu hết các
cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm chậm hoặc giảm nhẹ các
triệu chứng bệnh[19]
Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus
đƣợc công nhận và trồng thƣơng mại nhƣ: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm
vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ, Trung
Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic
virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã đƣợc công
nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic
virus, đƣợc công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại
cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo
nghiệm để đƣợc công nhận là giống cây trồng thƣơng mại nhƣ: Sắn chuyển
gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen
kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng
thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus),
Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro
viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery
mottle virus (Potyvirus...
Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh đƣợc sử dụng chuyển vào
cây trồng để tạo tính kháng có thể là các loại khác nhau nhƣ: các cấu trúc của
virus theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngƣợc (antisense), các cấu trúc dạng
kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) và các miRNA nhân tạo có đích là các trình
tự gen của virus gây bệnh, hay kỹ thuật RNAi “RNA interference”, đang đƣợc
quan tâm nhiều và ứng dụng rộng rãi.
18
1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus
1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi
RNAi là cơ chế ức chế sự biểu hiện vật chất di truyền ở giai đoạn RNA. Ở
thực vật có ba con đƣờng ức chế RNA trong đó con đƣờng đầu tiên là sự
ức chế gen sau phiên mã PTGS (post-transcriptional gen silencing) qua
trung gian là các RNA nhỏ có vai trò ức chế siRNA (short interfering
RNA) đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong những nghiên cứu tạo cây chuyển
gen kháng virus. Quá trình này xảy ra ở tế bào chất và là con đƣờng quan
trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus nơi mà sợi RNA kép hoặc cấu trúc
thứ cấp của RNA virus sợi đơn có thể sao chép gián tiếp. Trong trƣờng
hợp virus DNA, dsRNA có thể đƣợc tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung
liên tiếp [13]. Cơ chế cũng xảy ra tƣơng tự nhƣ ở động vật. Khi có sự xâm
nhập của dsRNA, Dicer bản chất là RNaseIII đặc hiệu cho dsRNA cắt
những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25
nucleotide, gọi là siRNA . Sau đó, các siRNA kép hình thành đƣợc tách ra
làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp
base (base-pairing) nhỏ nhất tiếp tục liên kết với Argonaute trong phức hệ
RISC. Tiếp đó, phức hệ RISC đã gắn đoạn siRNA nhận biết các mRNA
của tế bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA
này. Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base tƣơng đồng với
trình tự của chuỗi đơn siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi
kép siRNA-mRNA thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotid từ đầu 3’.
Sau khi bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu huỷ bởi các RNA nuclease
[16] (Hình 1.6).
19
Hình 1.6: Cơ chế hoạt động RNAi.
1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở
VIỆT NAM.
Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hƣớng ứng dụng kỹ
thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus
gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS.
Lê Trần Bình và PTS. Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên
ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây
chuyển gen kháng virus. Một trong những kết quả của đề tài cấp Viện
KH&CN Việt Nam đƣợc tiến hành trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cứu ứng
dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus”
là đã tạo đƣợc các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dƣa chuột
(CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus
trên. Năm 2009, ứng dụng RNAi, Phạm Thị Vân và cộng sự [7] (Phòng Công
20
Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học) đã tạo đƣợc dòng thuốc
lá chuyển gen ở thế hệ T0 kháng virus CMV với tỷ lệ 64,6%, kháng TMV với
tỷ lệ 74,5% và kháng đồng thời hai loại virus TMV và CMV với tỷ lệ
70,8%[7]. Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng to lớn kỹ thuật RNAi
trong việc tạo giống cây trồng kháng virus.
Kỹ thuật RNAi cũng đã đƣợc tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong đề tài trọng
điểm cấp nhà nƣớc thuộc chƣơng trình phát triển công nghệ sinh học (KC04-
03/06-10) với mục đích tạo cây đu đủ và cây ăn quả có múi chuyển gen kháng
bệnh virus. Đề tài đã đƣợc nghiệm thu cấp nhà nƣớc trong tháng 9/2010. Một
trong những kết quả đạt đƣợc của đề tài là đã tạo ra đƣợc các dòng đu đủ
chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với virus đốm vòng.
Bên cạnh cây trồng chuyển gen kháng virus cũng đã có rất nhiều thành công
trong việc tạo cây có khả năng kháng bệnh cây trồng, kháng vi khuẩn, kháng
côn trùng có hại hay cây chuyển gen chống chịu với điều kiện sinh thái bất lợi
mang lại hiểu quả kinh tế cao[6]. Tất cả đang mở ra một thời kì mới cho nền
nông nghiệp Việt Nam.
21
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1.Vật liệu thực vật
Hạt giống thuốc lá C9-1 do công ty TNHH Một thành viên KTKT thuốc lá lai
tạo.
2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen:
- Chủng Agrobacterium tumafaciens CV58C1 mang vector pCB_GUS
Hình 2.1. Vector pCB_GUS
- Chủng Agrobacterium tumafaciens CV58C1 mang vector TMV_RNAi
22
2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng
- Hóa chất: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose,
Glucose, Trypton, KCl, EDTA, MgCl2, NaOH. Các loại kháng sinh :
kanamycin, rifamycine, cefotaxime, streptomycine, spectinmycine. Các chất
điều hòa sinh trƣởng nhƣ: BAP, NAA, và các hóa chất thông dụng của các
hãng Fermentas, Invitrogen, Mecrck, Sigma...
- Môi trƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi
cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gen gồm: MS, môi trƣờng lây
nhiễm lỏng IM, môi trƣờng tạo mô sẹo, môi trƣờng tạo chồi, môi trƣờng ra rễ
và môi trƣởng nuôi khuẩn LB. Thành phần nhƣ trong phụ lục 1.
- Máy móc và thiết bị: Buồng cấy vô trùng , máy đo pH, máy đo OD, tủ
nuôi lắc, nồi khử trùng, máy ly tâm lạnh,máy điện di, cùng với các thiết bị
khác của Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm:
2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo
Khử trùng toàn bộ dụng cụ trƣớc thí nghiệm
Đặt cốc thủy tinh chứa 100ml Javen vào bình khử trùng. Hạt thuốc lá đƣợc
cho bình pyrex (dung tích 100ml). Bình Pyrex mở hé 1/3 nắp lọ đặt bên cạnh
cốc thủy tinh chứa dung dịch Clo. Bổ sung vào cốc đựng Javen 3ml HCl, hỗn
hợp này sẽ tạo ra khí Clo có tác dụng khử trùng hạt thuốc lá. Đậy kín bình
khử trùng và dán parafin.
Sau 4h lấy hạt đã khử trùng ra để trong box cấy 30 phút để bay hết khí rồi tiến
hành gieo hạt.
2.2.1.2. Gieo hạt
Gieo hạt vào môi trƣờng MS (100 hạt/ bình)
Sau 4 ngày hạt bắt đầu nảy mầm. Khi cây phát triển đƣợc 1 tuần, đánh giá tỉ
lệ nảy mầm và cấy chuyển sang môi trƣờng MS mới.
23
2.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khuẩn
Agrobacterium tumafaciens
2.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium
- Lấy chủng khuẩn từ ống giữ chủng và cấy vạch lên môi trƣờng LB đặc
có bổ sung các kháng sinh chọn lọc ( Cefotaxime 25mg/l, kanamycin 50mg/l
đối với chủng A.tumerfaciens mang vecter chuyển gen chứa câu trúc
pCB_GUS; Rifamycine 50mg/l, streptomycine 100mg/l, spectinomycine
100mg/l đối với chủng vi khuẩn A.tumerfaciens mang vecter chuyển gen chứa
cấu trúc TMV_RNAi) nuôi trong tủ ổn nhiệt 28˚C trong thời gian 48 giờ.
- Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 2
ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc nhƣ khi nuôi ở môi
trƣờng LB đặc. Bình nuôi lỏng đƣợc đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/
phút ở nhiệt độ 28˚C nuôi qua đêm. Lấy 0.5ml dịch huyền phù chuyển sang
50ml LB lỏng (không kháng sinh) nuôi phục hồi khuẩn trong vòng 4h . Ly
tâm 4000v/p trong 10p ở 4˚C và hòa tan trong dung dịch IM (MS, pH 5.8)
lỏng. Sử dụng vi khuẩn A.tumerfaciens có mật độ đạt OD600=0.7 -1.0 để biến
nạp.
2.2.2.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen
Chọn lá có kích thƣớc vừa phải ở các cây con khỏe mạnh 2 tuần tuổi. Dùng
dao cắt bốn cạnh mép lá để gây tổn thƣơng, tạo thành các mảnh lá có hình
vuông kích thƣớc khoảng 0,25 cm2. Lá bị tổn thƣơng sau đó đƣợc đặt úp
trong môi trƣờng lây nhiễm IM để tránh bị khô.
2.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Ngâm khoảng 30 mảnh lá trong đĩa petri chứa 20 ml dung dịch IM có bổ sung
100µl dịch khuẩn Agrobacterium. Các mảnh lá đƣợc ngâm trong dung dịch
trên trong 30 có lắc nhẹ trong vòng 30 phút. Sau đó đặt vào bình chứa môi
trƣờng MS,1mg/l BAP, 30g/l glucose,8g/l agar, pH5,8.
24
Hình 2.3 : Các mảnh lá được ngâm trong dung dịch IM có bổ sung dịch
khuẩn
2.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen
Sau 3 ngày chuyển các mảnh lá sang môi trƣờng tạo chồi chứa MS, 1mg/l
BAP,30g/l glucose,8g/l aga,pH 5,8 và có chứa các kháng sinh 50mg/l
kanamycine, 250mg/l Cefotaxime.
Sau 3- 4 tuần xuất hiện các chồi nhỏ từ các mảnh lá. Tiến hành tách các chồi
nhỏ và cấy trên môi trƣờng MS, 30g/l glucose,8g/l aga,pH 5,8 và có chứa các
kháng sinh 50mg/l kanamycine, 250mg/l Cefotaxime.
2.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh
Khi các xuất hiện các chồi và các chồi đạt chiều cao khoảng 2- 3 cm tiến hành
tách các chồi nhỏ này và chuyển sang môi trƣờng ra rễ ( MS + 0,1mg/l NAA,
30g/l glucose,8g/l aga, pH 5,8)
Sau 3 .tuần các cây in vitro đƣợc đƣa ra ngoài môi trƣờng. Cây non đƣợc
chuyển sang môi trƣờng cát + trấu ( 50% trấu, 50% cát) và chuyển ra trồng
trong nhà lƣới.
2.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phƣơng pháp nhuộm mô hóa tế bào
Thu mẫu từ các cây con sau 2 tuần phát triển trong nhà lƣới. Đối với những
cây đƣợc chuyển cấu trúc pCB_GUS, biểu hiện của gen gus đƣợc kiểm tra
bằng nhuộm trong dung dịch X-gluc (50 mM Na2HPO4 và NaH2PO4; pH7;
10mM[K3(Fe(CN)6]; 10mM K4[(Fe(CN)6]; 10 mM Na2EDTA; 0,1% Triton-
25
100; 1,5mM X-glucuronide). Mẫu lá thuốc lá đƣợc ngâm trong dung dịch X-
gluc và ủ trong tủ ổn nhiệt ở nhiệt độ 37ᵒ C, thời gian ủ từ 24- 48 giờ.
Sau thời gian ủ , mẫu đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất khử trùng và ngâm vào
dung dịch cồn 70% nhằm loại bỏ diệp lục. Sau khi loại bỏ diệp lục, mẫu đƣợc
đƣa lên kính hiển vi soi nổi, quan sát và chụp ảnh.
2.2.4. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng
phƣơng pháp PCR
ADN tổng số từ lá thuốc lá đƣợc tách chiết và sử dụng làm khuôn mẫu cho
phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sự có mặt của gen chuyển
trong các dòng thuốc lá. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel
agarose 0,8%.
2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số
Tách ADN tổng số đƣợc tiến hành theo các bƣớc sau:
(1) Lấy 100mg lá non (trong ống effendorf 1.5ml) nghiền trong nitơ lỏng
cho tới khi thành dạng bột mịn
(2) Bổ sung 500µl dung dịch đệm (0,2M Tris-HCl pH9.0; 0,4M LiCl;
25mM EDTA pH8.0; 1%SDS) vào từng ống. Ly tâm 13000 vòng/ phút, trong
5 phút
(3) Hút 350µl dịch trong ở phía trên ra từng ống effendol mới
(4) Bổ sung 350µl isopropanol vào từng ống, mix đều
(5) Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu tủa
(6) Làm khô bằng máy Speeed Vac
(7) Hòa tan ADN trong 40µl H2O deion
2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với cặp mồi TMV-Fi/ TMV-Ri [8] với trình tự
nhƣ sau:
TMV-Fi: 5’- CACCATGAAACCTTCACCACA-3’
TMV-Ri: 5’- CTAGGTCCAAACCAAACCAG-3’
26
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi/ TMV-Ri
STT Thành phần Thể tích (x1) (µl)
1 H2O deion 10,1
2 Dung dịch đệm 2
3 MgCl2 25mM 2
4 dNTPs 1,6
5 Primer TMV-Fi 0,8
6 Primer TMV- RI 0,8
7 Taq polymerase 1u/µl 0,2
8 Template 2,5
Tổng 20
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
3 Gắn mồi 52 50 giây 25
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.5. Phân tích khả năng kháng virus của các cây chuyển gen bằng
phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo
Các cây chuyển gen sau khi trồng ngoài nhà lƣới cao khoảng 10-30 cm đƣợc
kiểm tra tính kháng virus bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo theo phƣơng
pháp của Herbers và cộng sự (1996) [20]. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
- Mẫu lá bị bệnh đƣợc nghiền trong đệm phosphat 100 mM (~1g mẫu
lá trong 20 ml buffer) với pH = 7.
27
- Lá lây nhiễm đƣợc gây tổn thƣơng nhẹ bằng SiC.
- Cho dịch virus lên phần lá đã gây xƣớc, sau vài phút rửa lá bằng
nƣớc.
10-20 ngày sau khi lây nhiễm, quan sát và đánh giá triệu chứng sẽ xuất hiện
trên cây
28
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG
THUỐC LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS
Hiện nay, chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium là biện
pháp hữu hiệu để tạo cây trồng với những tính trạng mong muốn. Để có thể
chuyển các gen mong muốn vào cây trồng, trƣớc tiên phải xây dựng đƣợc tái
sinh cây hoàn chỉnh và một quy trình chuyển gen hoạt động hiệu quả. Tại Việt
Nam, hệ thống tái sinh và chuyển gen chỉ thị gus mới chỉ đƣợc nghiên cứu
trên giống thuốc lá K326 [8][7] mà chƣa đề cập tới giống C9-1. Giống thuốc
lá C9-1 đƣợc Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá lai tạo, có khả năng thích ứng
với những vùng khí hậu đặc trƣng của Việt Nam lại có phẩm chất, năng suất
tốt. Do vậy, để tạo tiền đề cho những nghiên cứu tạo giống thuốc lá kháng bệnh
và có khả năng thích nghi với điều kiện canh tác tại Việt Nam, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu qui trình tái sinh và chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 này.
Gen chỉ thị gus thƣờng đƣợc sử dụng để đánh giá hiệu quả của một quy trình
chuyển gen trƣớc khi tiến hành chuyển các gen đích mong muốn. Đây là gen mã
hóa enzyme β-glucuronidase [23], một hydrolase xúc tác cho quá trình phân giải
cơ chất glucuronidase tạo sản phẩm có màu xanh đặc trƣng dễ nhận biết và rất
bền vững. Trong tự nhiên β-glucuronidase không tồn tại trong thực vật hơn nữa
sản phẩm của phản ứng là độc nhất và không độc với tế bào vật chủ, các phƣơng
pháp phân tích sản phẩm đơn giản, thuận tiện, rẻ tiền, nhạy và đặc thù, vì vậy
gen gus đƣợc coi là gen chỉ thị hữu hiệu trong kỹ thuật chuyển gen ở thực vật[5].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pCB-GUS (Phòng Công
Nghệ Tế Bào Thực Vật) để chuyển gen chỉ thị gus vào thuốc lá nhằm đánh
giá hiệu quả của quy trình tái sinh và chuyển gen vào thuốc lá theo phƣơng
pháp của Banerjee và cộng sự [12] có cải tiến. Đây là tiền đề để tiến hành
chuyển cấu trúc TMV-RNAi.
29
3.1.1. Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen
Theo Banerjee và cộng sự [12], mảnh lá bánh tẻ là nguyên liệu thích hợp để
chuyển gen vào cây thuốc lá. Để tạo đƣợc nguồn nguyên liệu, hạt thuốc lá
giống C9-1 đƣợc khử trùng bằng khí Clo trƣớc khi gieo lên môi trƣờng MS để
nảy mầm trong điều kiện vô trùng. Theo Vân và cộng sự [8][7] có thể sử dụng
dung dịch Javel thƣơng phẩm nồng độ 30% để loại nấm mốc và vi khuẩn trên
hạt thuốc lá. Phƣơng pháp này đạt hiệu quả khử trùng 100% cho tỉ lệ nảy
mầm cao trên 90%. Tuy nhiên, đối với hạt có kích thƣớc nhỏ nhƣ hạt thuốc lá
, việc lắc rửa nhiều lần tiêu tốn nhiều thời gian cũng nhƣ làm mất một số
lƣợng đáng kể hạt. Trong thí nghiệm này, hạt thuốc lá C9-1 đƣợc khử trùng
bằng khí clo theo phƣơng pháp của Toopping (1988) [39] nguồn khí Clo tạo
ra từ phản ứng giữa dung dịch HCl và Javel sẽ khử trùng bề mặt các hạt thuốc
lá. Các cây con sau khoảng 4 tuần trên môi trƣờng MS có kích thƣớc lá từ 4-
6cm là nguồn nguyên liệu tốt nhất để tái sinh và chuyển gen ở cây thuốc lá.
3.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây
3.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm
chồi
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá K326 đã đƣợc Vân và cộng sự
[12][13] thiết lập. Theo quy trình này, các lá bánh tẻ đƣợc cắt thành những
mảnh có kích thƣớc 1cm2 và đặt lên môi trƣờng tái sinh GM (MS cơ
bản,1mg/l BAP, 30g/l glucose,8g/l agar, pH5,8) 2 ngày trƣớc khi biến nạp sau
đó đƣợc nuôi cộng sinh với dung dịch huyền phù của Agrobacterium trong 2
ngày và chuyển sang môi trƣờng GM có bổ sung kháng sinh chọn lọc cũng
nhƣ kháng sinh diệt khuẩn. Giống thuốc lá C9-1 có lá nhỏ và mảnh hơn giống
K326, lặp lại việc đặt các mảnh lá trên môi trƣờng GM trƣớc biến nạp cho
hiệu quả tái sinh cây thấp. Do vậy, đối với giống C9-1, các mảnh lá hình
vuông kích thƣớc khoảng 0,5 cm2 đƣợc cắt ra từ cây in vitro và ngâm vào
dung dịch huyền phù Agrobacterium (OD600=0.7-1) có lắc nhẹ trong 30 phút.
Việc giảm kích thƣớc các mảnh lá xuống một nửa đồng thời lắc nhẹ trong
30
dịch huyền phù vi khuẩn làm tăng thể tích tiếp xúc giữa vết thƣơng thực vật
và dịch khuẩn, là một trong những biện pháp có thể làm tăng khả năng xâm
nhập của vi khuẩn vào trong tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu quả chuyển gen.
Sau 30 phút, thấm khô và đặt các mảnh lá vào bình chứa môi trƣờng GM và
chuyển sang môi trƣờng GM mới. Do vector pCB-GUS có mang đoạn gen
kháng kanamycine, nên các môi trƣờng sau biến nạp đều đƣợc bổ sung
50mg/l kanamycine để chọn lọc các cụm chồi chuyển gen. Trong nghiên cứu
này, những kết quả về cụm chồi/cây đề cập đến là những cụm chồi/cây sống
sót trên môi trƣờng chọn lọc có chứa kanamycine. Cefotacime (400mg/l) cũng
đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nhằm loại bỏ vi khuẩn còn sót lại trên các mảnh
lá.
Thí nghiệm chuyển gen gus vào cây thuốc lá C9-1 đƣợc lặp lại 2 lần, mỗi lần
với 30 mảnh lá nguyên liệu. Sau 10 ngày tại những vết cắt ở các mảnh lá xuất
hiện những cụm tế bào cứng, có màu xanh lá ( hình 3.1)
Theo nghiên cứu trƣớc về quá trình tái sinh cây thuốc lá, đây là tiền đề cho
việc tái sinh chồi [8][7]. Kinetin là chất điều khiển sinh trƣởng thuộc nhóm
cytokine, có tác dụng kích thích tạo và phát triển chồi. Vai trò của kinetin
trong tạo chồi đã đƣợc chứng minh trên nhiều đối tƣợng thực vật, ở cả cây
một lá mầm và hai lá mầm. Với 30mảnh lá /lần biến nạp (lặp lại thí nghiệm 2 lần)
thu đƣợc trung bình 24,5± 2,12 mảnh lá có cảm ứng, đạt tỷ lệ khoảng 81,6± 7,07
(bảng 3.1). Song song với thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm đối chứng đƣợc
thiết lập bằng cách đặt các mảnh lá thuốc lá C9-1trực tiếp lên môi trƣờng GM và
GM có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và kháng sinh chọn lọc. Toàn bộ mảnh lá
không chuyển gen đƣợc đặt lên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh đều vàng dần
và chết. Trong số 2x4 mảnh lá đặt lên môi trƣờng cảm ứng không bổ sung kháng
sinh có trung bình 3,5 ± 0,7 mảnh lá tạo mô sẹo, đạt tỷ lệ khoảng 87,5± 17,6
31
Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá
Lô thí nghiệm Số mẫu thí
nghiệm
Số mẫu cảm ứng Tỷ lệ (%)
pCB-GUS 2x30 24,5± 2,12 81,6± 7,07
WT1 2x4 0 0
WT2 2x4 3,5 ± 0,7 87,5± 17,6
Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng
sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng
sinh
Sau khoảng 2 tuần, bắt đầu quan sát đƣợc những chồi nhỏ. Tách các chồi nhỏ
và cấy trên môi trƣờng MS cơ bản, không bổ sung chất điều khiển sinh
trƣởng. Sau 3 tuần, 100% mảnh lá lô không chuyển gen đều thu đƣợc chồi,
với tỉ lệ trung bình là 3,4± 0,25 chồi/mảnh lá. Số lƣợng mẫu tạo chồi trung
bình ở lô chuyển gen là 3,2± 0,25 với số chồi trung bình 3,2± 0,25 chồi/mảnh
lá (bảng 3.2). Nhƣ vậy, không có sự khác biệt đánh kể trên các lô cây chuyển
gen và không chuyển gen, chứng tỏ quá trình tái sinh cây thuốc lá thiết lập
trong thí nghiệm này có hiệu quả. Trong qui trình tái sinh cây thuốc K326,
các mảnh lá sau khi cảm ứng chồi vẫn đƣợc tiếp tục phát triển trên môi trƣờng
có bổ sung kinetin 1mg/l. Qui trình tái sinh giống C9-1 ban đầu cũng đƣợc lặp
lại tƣơng tự nhƣ giống K326. Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy
ở lô đối chứng không bổ sung kinetin, hiệu quả tạo chồi cao hơn đáng kế. Do
vậy, chúng tôi lựa chọn môi trƣờng không có chất điều khiển sinh trƣởng làm
môi trƣờng tối ƣu cho phát triển cụm chồi đối với giống C9-1. Điều này có
thể giải thích do sự khác biệt về kiểu gen giữa 2 giống thuốc lá, chỉ cần bổ
sung một lƣợng nhỏ kinetin (1mg/l) trong thời gian ngắn (2-3 tuần) là thích
hợp để kích thích cảm ứng chồi của mô lá thuốc lá C9-1.
32
Bảng 3.2: Kết quả tạo chồi
Lô thí
nghiệm
Số mẫu thí
nghiệm
Số mẫu tạo
chồi
Tỷ lệ (%) Tổng số
chồi
Số chồi
trung bình
pCB-GUS 24,5± 2,12 19,5± 0,7 79,75± 4,03 63± 7,07 3,2± 0,25
WT1 0 0 0 0 0
WT2 3,5 ± 0,7 3,5± 0,7 100 12± 1,4 3,4± 0,25
Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng
sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng
sinh
3.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh
Tạo rễ là khâu cuối cùng trong nuôi cấy in vitro và có ý nghĩa quan trọng đối
với kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. Những nghiên cứu về tái sinh và chuyển
gen trên cây thuốc lá ghi nhận IBA, NAA và IAA là những hormone sinh
trƣởng đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu tạo rễ. Nồng độ các chất điều khiển
sinh trƣởng dao động trong khoảng 0,1 mg/l. Vẫn tiếp tục lặp lại qui trình tái
sinh thuốc lá đã công bố của Vân và cs, môi trƣờng MS bổ sung 0,1mg/l
NAA đƣợc thử nghiệm tạo rễ thuốc lá C9-1 in vitro. Cụm chồi 4 tuần tuổi có
chiều cao 1cm đƣợc tách nhỏ và chuyển sang môi trƣờng tạo rễ. Sau 4-5 tuần,
quan sát thấy rễ xuất hiện ở hầu hết các chồi, tỷ lệ gần 90% (bảng 3.3). Các
chồi đều phát triển xanh tốt và tạo nhiều lá mới. Quan sát thấy các chồi không
chuyển gen trên môi trƣờng đối chứng cũng có quá trình tạo rễ tƣơng tự.
33
Bảng 3.3. Tỷ lệ chồi ra rễ trên môi trường RM
Lô thí nghiệm Số chồi cấy trên
môi trƣờng ra rễ
Số chồi ra rễ Tỷ lệ (%)
pCB-GUS 63± 7,07 55± 8,4 87.1± 1,9
WT1 0 0 0
WT2 12± 1,4 10,5± 0,7 87,7± 4,4
Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng
sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng
sinh
Khi các cây in vitro đạt chiều cao từ 5- 7 cm tiến hành đƣa ra ngoài bầu đất.
Giá thể thích hợp là 50% trấu, 50% cát. Hai loại giá thể này có độ xốp tốt tuy
nhiên khả năng giữ nƣớc kém vì vậy phải chú ý việc chăm sóc tƣới nƣớc cho
cây. Chăm sóc khoảng 2 tuần trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Khi cây non có bộ rễ hoàn chỉnh đƣợc chuyển từ giá thể cát, trấu sang trồng
trên giá thể với thành phần chủ yếu là đất đất phù sa trong điều kiện nhà lƣới.
Từ những kết quả trên, chúng tôi đề ra quy trình chuyển gen và tái sinh cây
thuốc lá (giống C9-1) nhƣ sau:
- Mảnh lá bánh tẻ kích thƣớc 0,5cm2 đƣợc ngâm trong dịch huyền phù
Agrobacterium (OD600=0.7-1) trong 30 phút và đồng nuôi cấy trên môi trƣờng
cảm ứng chồi (MS+1mg/lBAP) trong 3 ngày
- Sau 2-3 tuần trên môi trƣờng cảm ứng, chuyển sang môi trƣờng tạo
cụm chồi (MS)
- Sau 3-4 tuần, tách các chồi đơn và chuyển sang môi trƣờng ra rễ
(MS+0,1mg/l NAA)
- Cây rễ hoàn chỉnh 4-5 tuần tuổi đủ điều kiện để chuyển sang trồng
trong bầu trấu-cát (tỷ lệ 1: 1)
34
A B C
D E F
G
H I
Hình 3.1. Kết quả chuyển gen gus vào cây thuốc lá
A: Mảnh lá ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn
B: Mảnh lá được đặt trên môi trường cảm ứng
C: Mảnh lá bắt đầu cảm ứng sau 10 ngày quan sát
D: Các mảnh lá không biến nạp đặt trên môi truong bổ sung kháng sinh vàng
dần và chết
E: Cụm chồi xuất hiện trên môi trường chọn lọc
F: Tách chồi chuyển sang môi trường ra rễ
35
G: Cây trồng trong môi trường ra rễ sẵn sàng cho ra bầu
H: Cây thuốc lá chuyển gen trồng trong bầu cát: trấu
I: Cây trồng trong điều kiện nhà lưới sau 2 tuần
3.1.3. Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào
Lấy phần ngọn thân mần của 8 cây thuốc lá sinh trƣởng trên môi trƣờng có
chứa kanamycine chọn lọc ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc. Sau
24- 48h mẫu nhuộm đƣợc tẩy hết diệp lục bằng dung dịch ethanol 70% và
quan sát trên kính hiển vi soi nổi.
a b
Hình 3.2. Biểu hiện gen gus trên ngọn thân mầm(a) và trên lá (b)
Hình 3.2 cho thấy, mức độ biểu hiện gen gus khá rõ. Màu xanh đặc trƣng ở phần
trên và dƣới của ngọn thân mà lá mầm. Kết quả đã chứng minh, gen gus đƣợc
chuyển thành công vào cây thuốc lá. Điều này cũng có ý nghĩa là quy trình tái sinh
và chuyển gen trên có thể áp dụng để chuyển các gen đích mong muốn, rong trƣờng
hợp này là cấu trúc TMV-RNAi.
3.2. CÁC KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ
CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi
3.2.1. Tái sinh và chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi
36
Kết quả biểu hiện gen gus cho thấy khả năng ứng dụng quy trình tái sinh và
chuyển gen để chuyển cấu trúc TMV-RNAi. Chúng tôi tiến hành chuyển cấu
trúc RNAi vào cây thuốc lá theo quy trình tái sinh và chuyển gen đã trình bày
ở trên. Song song với các cây chuyển gen, các cây đối chứng không chuyển
gen cũng đƣợc nuôi cấy theo quy trình tƣơng tự trên môi trƣờng có bổ sung
kháng sinh (kanamycin 50mg/l + cefotaxime 250mg/l) và không bổ sung
kháng sinh.
Bảng 3.5. Kết quả biến nạp cấu trúc TMV-RNAi vào cây thuốc lá
Lô thí
nghiệm
Số
mẫu
Tạo
mô
sẹo
Tỷ lệ
tạo
mô
sẹo
(%)
Mẫu
tạo
chồi
Tỷ lệ
tạo
chồi
(%)
Tổng
số
chồi
Chồi
trung
bình
Chồi
ra rễ
Tỷ lệ
chồi
ra rễ
(%)
TMV 2x40 33±
1,4
82,5±
3,5
25,5±
2,12
77,2±
3,1
73±
8,4
2,85±
0,07
62±
4,2
85,2±
4,1
WT1 2x4 0 0 0 0 0 0 0 0
WT2 2x4 4± 0 100 3,5±
0,7
87,5±
17,6
11,5±
2,1
3,3±
0,03
10±
1,4
87,3±
3,8
Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng
sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng
sinh
Tiến hành 2 lần biến nạp với 40 mảnh lá/ lần thu đƣợc trung bình 85% cây
sống sót trên môi trƣờng chọn lọc (bảng 3.5). Lô thí nghiệm thứ nhất trải qua
quá trình tái sinh, chuyển gen và chọn lọc thu đƣợc 70 cây con in vitro. Khi
cây đủ lớn tiến hành cho cây ra ngoài bầu với giá thể 50% cát , 50% trấu. Sau
10 ngày nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm cây đƣợc đƣa ra trồng ngoài
nhà lƣới với giá thể chủ yếu là đất. Sau 1 tuần, chúng tôi đã thu đƣợc 58 cây
con cho các thí nghiệm phân tích tiếp theo.
37
Bảng 3.6. Tỷ lệ sống sót của cây thuốc lá trên bầu cát, trấu và ngoài nhà lưới
Lô thí
nghiệm
Số cây ra
bầu
Số cây
sống sót
trên bầu
Tỷ lệ
sống sót
(%)
Số cây ra
ngoài
nhà lƣới
Số cây
sống sót
ngoài
nhà lƣới
Tỷ lệ
cây
sống sót
(%)
TMV 70 64 91,4 64 58 90,6
WT 4 3 75 3 3 100
Ghi chú: WT là cây đối chứng không chuyển gen
3.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus
3.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm
nhân tạo
Các dòng thuốc lá chuyển gen sau 2-3 tuần phát triển khoẻ mạnh trong nhà
lƣới đạt có 5-6 lá thật với kích thƣớc lá khoảng 10cm đƣợc thử nghiệm khả
năng kháng virus TMV theo phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo (Herber et al.,
1996)[20]. Kết quả sau lần lây nhiễm đầu tiên đã thu đƣợc 20 cây không
nhiễm bệnh.
Với các mẫu thuốc lá không nhiễm bệnh này chúng tôi tiến hành thu maauc
và chuẩn bị tách ADN tổng số sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
38
Hình 2.4. Cây thu được sau lây nhiễm
a. Cây không bị nhiễm bệnh b. Cây biểu hiện bệnh sau lây nhiễm
3.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây
ADN tổng số từ những mẫu thuốc lá này đƣợc tách chiết và sử dụng làm
khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sự có mặt
của gen chuyển trong các mẫu thuốc lá. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra
trên gel agarose 0,8 %.
3.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số
Để thực hiện phản ứng PCR trƣớc tiên phải tiến hành tách ADN tổng số có
chất lƣợng tốt. Bƣớc đầu tiên trong quá trình tách chiết ADN là nghiền mẫu
trong nitơ lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn bổ sung dung dịch đệm,
dung dịch này có tác dụng tách pha tốt trong quá trình ly tâm.
a. b.
39
Hình 3.3. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 0,8%
Kết quả điện di cho thấy các băng đều và rõ nét, chúng tôi kết luận đã tách
chiết thành công ADN tổng số phục vụ cho phản ứng PCR.
3.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR
Các cây không nhiễm bệnh đƣợc thu mẫu để khẳng định sự có mặt của cấu
trúc chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR.
Kết quả phân tích cho thấy, có 18 cây/ 20 cây cho kết quả dƣơng tính với
phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV/Fi- TMV-Ri (hình 3.4). Đối
chứng dƣơng là plasmid TMV-RNAi làm khuôn mẫu. Đối chứng âm là sản
phẩm PCR sử dụng khuôn mẫu là ADN tổng số tách chiết từ lá thuốc lá
không chuyển gen (2 mẫu) đều cho kết quả âm tính. Điều này đảm bảo đoạn
gen chuyển không có sẵn trong cây không chuyển gen. Nhƣ vậy, kết quả
dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi/TMV-Ri
của 20 cây thuốc lá đã chuyển gen chứng tỏ đây là những cây thuốc lá có
mang cấu trúc gen cần chuyển.
40
Hình 3.4. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong 20 mẫu
thuốc lá C9-1.
M: Thang ADN chuẩn 1 kb, (-) Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng
khuôn là ADN tách từ cây thuốc lá không chuyển gen; 1- 20: 20 cây thuốc lá
chuyển gen; (+) Đối chứng dƣơng là plasmid TMV-RNAi
41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Đã tái sinh thành công cây thuốc lá C9-1 từ và áp dụng đƣợc quy trình
quy trình chuyển gen cho cây thuốc lá C9-1sử dụng vi khuẩn Agrobacterium
tumerfacien, cây thuốc lá chuyển gen biểu hiện hoạt tính GUS. Quy trình này
có thể ứng dụng trong việc chuyển các gen đích mong muốn.
2. Biến nạp thành công cấu trúc RNAi mang đoạn gen mã hóa vỏ virus
TMV vào cây thuốc lá và thu đƣợc 58 cây thuốc lá chuyển gen
3. Lây nhiễm thành công vào cây thuốc lá C9-1 đã chuyển gen nhằm thử
tính kháng virus TMV, kết quả thu đƣợc có 20/ 58 cây kháng tốt.
4. Kết quả kiểm tra 20 cây thuốc lá chuyển gen cho thấy, có 18 mẫu cho
kết quả dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV-
Fi/TMV-Ri, chứng tỏ đây là những cây thuốc lá có mang cấu trúc chuyển gen.
Kiến nghị
1. Cần tiếp tục tiến hành đánh giá tính kháng của các dòng thuốc lá
chuyển gen bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo vơi virus TMV. Sau khi
lây nhiễm nhân tạo, kiểm tra sự có mặt của virus TMV bằng các phản ứng
PCR.
2. Tiếp tục theo dõi và đánh giá tính kháng của các mẫu thuốc lá chuyển
gen ở thế hệ tiếp theo nhằm tạo đƣợc dòng thuốc lá có khả năng kháng TMV
ổn định qua nhiều thế hệ
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1]: TS. Lê Trần Bình. Công nghệ sinh học thực vật rong cải tiến cây trồng,
Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam, 1997, NXB Nông Nghiệp.
[2]: Chu Hoàng Hà (2010): Nghiên cứu tạo cây trồng kháng bệnh do virus
gây ra bằng công nghệ ức chế RNA (RNAi)
[3]: Trần Văn Hai, Giáo trình Hóa bảo vệ thực vật- Khoa Nông Nghiệp, Đại
học Cần Thơ.
[4]: Vũ Triệu Mân (2007), Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội, giáo trinh Bệnh
cây chuyên khoa, chuyên ngành Bảo vệ thực vật.
[5]:Đỗ Tiến Phát (2009), Xây dựng quy trình tái sinh và thử nghiện khả năng
chuyển gen gus vào cây thông nhựa ( Pinus merkussi Jungh & De Vries),
Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội
[6]: Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật. NXB Khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội.
[7]: Phạm Thị Vân , Nguyễn M inh Hùng , Hà Viết Cƣờng , Lê Văn Sơn , Lê
Trần Bình và Chu Hoàng Hà (2009) Tạo cây thuốc lá kháng virus TMV bằng
kỹ thuật RNAi . Hội thảo Quốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam , 25-26/7 tại
Viện Nghiên cƣ́u Bông và phát triển NN Nha Hố - Ninh Thuận. Tr. 32-40.
[8]: Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần
Bình(2008). Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dƣa chuột bằng kỹ thuật
RNAi. Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4A): 679-687
[9]: Phạm Thị Vân (2009), Nghiên cứu tạo cây thuốc lá kháng bệnh khảm
virus bằng kỹ thuật RNAi, Luận văn thạc sĩ khoa học, Viện sinh thái và Tài
nguyên sinh vật.
[10]: Nguyễn Văn Chín, Nguyễn Ngọc Bích (2008) Theo dõi tình hình sâu
bệnh hại thuốc lá làm cơ sở dự báo và nghiên cứu biện pháp phòng trừ
phục vụ sản xuất thuốc lá nguyên liệu” Báo cáo khoa học. Công ty TNHH
43
Một thành viên Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Tổng công ty thuốc lá Việt
Nam:
Tài liệu tiếng Anh
[11]: Akehurt B.C 1981: Tobacco.longman group Ltd, New York. 764pp.
[12]: Banerjee A.K, Part S, Hannapel D.J (2006), “ Eficient production of
transgenic potato ( S.tuberosum L.ssp.andigena) plants via Agrobacterium
tumerfaciens- mediated transformation.” Plant Science, 170, pp.732-738.
[13]: 32Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants. Nature 431(7006) :
356-63
[14]: RN (1999) Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus:
discovery mechanisms and exploitation. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 354:
659-664
[15]: Bonfim K, Faria JC, Nogueira EO, Mendes EA, Aragão FJ (2007)
RNAi-mediated resistance to Bean golden mosaic virus in genetically
engineered common bean (Phaseolus vulgaris). Mol Plant Microbe Interact.
20(6) : 717-26
[16]: Chicas and Macino, 2001. Charateristics of post- transcriptionnal gene
silencing EMBO 2 (11): 992-6
[17]: Colliins W.K; Hawks S.N.Jr: Principles of the flue cured Tobacco
production. N.C. Stale Univercity 2
nd
E.d.1993.300
[18]di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin
RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for
efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res. 14(6): 989-
94
[19]Gottula J, Fuchs M (2009) Toward a quarter century of pathogen-
derived resistance and practical approaches to plant virus disease control.
Adv Virus Res. 75:161-83
44
[20]: Hersbers, K, Meuwly P, Frommer WB, Metraux JP, Sonnewald U
(1996a), Systemic Acquired. Resistance. Mediated by the Ectopic Expression
of Invertase. Posible Hexose sensing in the secretory Pathway. Plant Cell 8:
793- 803
[21]: Hull R, Davies JW (1992) Approaches to nonconventional control of
plant virus diseases. Crit Rev Plant Sci 11: 17-33
[22]: Ilardi V., Mazzei M., Loreti S., Tomassoli L., barba M., 1995.
Biomoleccular and serological methods to identify strains of cucumber
mosaic cucumovirus on tomato. EPPO Bulletin 25: 321- 327
[23]: Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) β-Glucuronidase from
Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447–
8451
[24: Jefferson R.A (1987), “ Asaying chimeric gens in plants: The gus gen
fussiuon system”, Plant Molecculer Biology Reporter, (5), pp. 387- 405.
[25: Juliana D, Annika P, Jurith M and Iris S ( 2006), “ The use of the
phosphomanose isomerase/ mannose seclection system to recover transgenic
apple plants” Plant Cell Rep (25), pp. 1149- 1156.
[26] Kamachi S, Mochizuki A, Nishiguchi M, Tabei Y (2007) Transgenic
Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus
based on RNA silencing. Plant Cell Rep. 26(8): 1283-8
[27: Owen A.M., Downes, J.D., Sahakian, B.J., Polkey, C.E. and Robbins
T.W. (1990). Planning and spatial working memory following frontal lobe
lesions in Man. Neuropsychologia, 28 (10), 10211034
[28: Owen & Palukaitis, Virology 166: 495, 1988
[29: Palukaitis, P., Roossinck, M. J., Dietzgen, R. G., and Francki, R. i. B.
1992. Cucumber mosaic virus. Adv. Virus Res. 41: 281-348
[30: Palukaitis, P., and Zaitlin, M. 1997. Replicase – mediated resistance to
plant virus disease. Adv. Virus Res. 48: 349-377
45
[31: Roossinck MJ (2002): Evolutionnary history of cucumber mosaic virus
as deduced by phylogentic analyses. J. Virol. 76: 3382- 3387
[32]Scholthof K-BG, Scholthof HB, Jackson AO (1993) Control of Plant
virus diseases by Pathogen-derived resistance in transgenic plants. Plant
Physiol 102: 7-12
[33]Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG,
Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.
Nature 407: 319-20
[34] Stryer Lubert (1988) Third Edition. W. H. Freeman and Company
Biochemstry. ISBN 0-7167- 1843
[35]Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010)
Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences
of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different
Ability to Protect Tobacco from Viral Infection. Appl Biochem
Biotechnol. Epub ahead of print
[36]: Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG,
Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.
Nature 407: 319-20
[37]: Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010)
Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of
Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to
Protect Tobacco from Viral Infection. Appl Biochem Biotechnol. Epub ahead
of print
[38]: Tenllado F, Llave C, Díaz-Ruíz J (2004) RNA interference as a new
biotechnological tool for the control of virus diseases in plants.Virus Res.
102(1): 85-96
[39] Topping JF(1988), Tobacco tranformation Methods ò Molecular Biology, 81: 365
46
[40]Tyagi H, Rajasubramaniam S, Rajam MV, Dasgupta I (2008) RNA-
interference in rice against Rice tungro bacilliform virus results in its
decreased accumulation in inoculated rice plants. Transgenic Res. 17(5):
897-904
[41]Vanderschuren H, Alder A, Zhang P, Gruissem W (2009) Dose-
dependent RNAi-mediated geminivirus resistance in the tropical root crop
cassava. Plant Mol Biol. 70(3):265-72
[42]: Wahyuni, W.S., Dietzegen, R. G., Hanada, K., and Francki, R.I.B. 1992.
Seorological and biological variatinon bwtwwen and within subgroup I and II
strains of cucumber mosaic virus. Plant Pathol. 41: 282- 297
[43]:Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and
gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense
and antisense RNA. Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64.
[44] 42Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q,
Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP,
Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for
efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J.
27(6): 581-90
[45]: Wesley SV et al (2001) Constructs for efficient, effective and high
throughput gene silencing in plants. Plant J 27: 581–590
[46]: Zrachya A, Kumar PP, Ramakrishnan U, Levy Y, Loyter A, Arazi T,
Lapidot M, Gafni Y (2007) Production of siRNA targeted against TYLCV
coat protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to
the virus. Transgenic Res. 16(3): 385-98
Trang web:
[47]:
[48]:
[49]:
la/2008/4/226146.vip
47
[50]: Quyết định 88/2007/QĐ-TTg,
[51]:
gi/DV2962-giong-ca-chua-chiu-nhiet-va-khang-benh-xoan-la-virus-4637/
[52]:
48
Phụ lục
Phụ lục 1. Thành phần các môi trƣờng MS
THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƢỜNG MS (Murashige và
Skoog, 1962)
SKOOG I SKOOG II SKOOG III
NH4NO3: 1650mg/l FeSO4.7H2O: 27,8mg/l KI: O,83 mg/l
KON3: 1900 mg/l MnSO4.4H2O: 22,3mg/l Na2MoO4.2H2O:
0,25mg/l
KH2PO4: 170mg/l H3BO4: 6,2mg/l CuSO4.5H2O:
0,0025mg/l
MgSO4.7H2O: 370mg/l ZNSO4.7H2O: 8,6mg/l CoCl2.6H2O : 0,025 mg/L
CaCl2.2H2 : 440
mg/L
Na2EDTA : 37,3
mg/L
Và các nguyên tố đa lƣợng N P K Ca Mg S, vi l ƣ ợng Fe Zn B Co N Mn Cu
Al Mo I
49
Phụ lục 2: Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng Thành phần
Nuôi cấy cơ bản MS(I-V) +30g/l glucose, 8g/l agar, pH5,8.
Lây nhiễm ½ MS(I-V) , pH 5,8
Tạo mô sẹo MS (I-V) +1mg/l BAP+ 30g/l glucose+ 8g/l agar,
pH5,8.
Tạo chồi MS (I-V) +250mg/l cefotaxime + 50mg/l
kanamycine + 30g/l glucose +8g/l agar, pH5,8.
Ra rễ MS (I-V) + 0,1mg/l NAA + 30g/l glucose+ 8g/l agar,
pH5,8.
LB lỏng Bacto pepton 10g/l + NaCl 10g/l + Yeast extract 5g/l.
pH 7
LB aga LB lỏng + 16 g/l aga
Dung dịch X-Gluc 50 mM Na2HPO4 và NaH2PO4; pH7;
10mM[K3(Fe(CN)6]; 10mM K4[(Fe(CN)6]; 10 mM
Na2EDTA; 0,1% Triton-100; 1,5mM X-glucuronide
Phụ lục 2.
50
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................................. 1
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................... 2
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................................... 3
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 4
1.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ ................................................................. 4
1.1.1.Phân loại...................................................................................................................... 4
1.1.2. Giá trị của cây thuốc lá ............................................................................................ 5
1.1.3 . Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam ....................... 6
1.2. MỘT SỐ BỆNH THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ ............................................... 8
1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá ................................................................................... 8
1.2.2. Bệnh khảm lá do virus ........................................................................................... 10
1.3. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC ............................................................................................ 14
1.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh: .................................................................................. 14
1.3.2.Sử dụng giống sạch bệnh ........................................................................................ 15
1.3.3. Các biện pháp canh tác.......................................................................................... 15
1.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học ............................................................... 15
1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus ......... 18
1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi ............................................................................. 18
1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT
NAM. ....................................................................................................................................... 19
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................... 21
2.1. VẬT LIỆU........................................................................................................................ 21
2.1.1.Vật liệu thực vật ........................................................................................................ 21
2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen: .................................................................. 21
2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng.................................................................................... 22
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................................. 22
2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm: ................................................................................... 22
2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo ............................................................................... 22
2.2.1.2. Gieo hạt.............................................................................................................. 22
2.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium
tumafaciens ........................................................................................................................ 23
2.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium................................................... 23
51
2.2.2.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen ............................................................................. 23
2.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy ......................................................................... 23
2.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen................................................................. 24
2.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh................................................................................... 24
2.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phƣơng pháp nhuộm mô hóa tế bào ............. 24
2.2.4. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng phƣơng
pháp PCR ........................................................................................................................... 25
2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số .................................................................................... 25
2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR.................................................................................. 25
2.2.5. Phân tích khả năng kháng virus của các cây chuyển gen bằng phƣơng
pháp lây nhiễm nhân tạo ................................................................................................. 26
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 28
3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC
LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS ......................................... 28
3.1.1. Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen ....................................... 29
3.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây ..................................................................................... 29
3.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi ...... 29
3.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh .............................................................. 32
3.1.3. Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào...................... 35
3.2. CÁC KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi.......................................................................................... 35
3.2.1. Tái sinh và chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi ......................................... 35
3.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus ......................................... 37
3.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân
tạo .................................................................................................................................... 37
3.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây ................................................ 38
3.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số ......................................................................... 38
3.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR .............................................................................. 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 42
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- bai_hoan_chinh_1_7511.pdf