Khóa luận Nghiên cứu quy trình lên men rượu từ Bưởi

h vỏ trái. Hàm lượng dịch trái chiếm khoảng 50-60% trọng lượng trái (tùy theo giống). Thu hoạch trái vào những ngày tạnh ráo. Thời gian thu hái trái tốt nhất là vào buổi sang hoặc chiều mát. Tránh thu hái vào giữa trưa lúc trời quá nắng nóng. Không nên hái khi trái khi còn ướt sương hoặc sau khi mưa vì dễ gây thối trái. Cần phải có thang chuyên dùng để thu hái trái. Phải thu hái bằng kéo hoặc dao sắc để tránh bầm giập nơi cuống trái. Không nên dùng biện pháp rung đập cho trái rụng dễ làm dập vỏ trái và múi bên trong. Khi thu hái xong nên cắt bỏ bớt cuống trái và lá để giảm sây sát và héo do bốc hơi nước nhiều trong khi bảo quản, vận chuyển đến nơi tiêu thụ [4]. 2.6 Tình hình về sản lượng Bưởi ở Việt Nam [6,tr. 17] Theo Sở Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, trong những năm gần đây, diện tích trồng bưởi tăng lên rõ rệt, nhiều loại bưởi ngon đã được ngành nông nghiệp và nhà vườn tuyển chọn trồng và cho trái ngày càng có chất lượng, có tiếng trên thị trường trong và ngoài nước như bưởi Năm Roi (Bình Minh), Bưởi da xanh (Bến Tre), Bưởi Tân Triều (Đồng Nai),…Đặc biệt là Bưởi Năm Roi, đặc sản của tỉnh Vĩnh Long được thị trường các nước châu Âu, Hồng Kông, Đức, Trung Quốc ưa chuộng. Theo số liệu thống kê năm 2006, diện tích trồng Bưởi trong cả nước là 25.000ha, trong đó diện tích đang cho trái là 15.000ha, sản lượng 145.000 tấn/năm. Trong đó, so với cả nước thì diện tích bưởi của tỉnh Vĩnh Long chiếm 26,3% và sản lượng chiếm 41,4%. So với vùng đồng bằng Sông Cửu Long thì diện tích Bưởi Vĩnh Long chiếm tỷ lệ rất cao là 65,75% và sản lượng chiếm 63,2%. Với sản lượng này, trọng lượng Bưởi cho bình quân đầu người trên 54kg, trong khi đó bình quân cả nước là 1,1kg và bình quân của Đồng bằng sông Cửu Long là 5,5kg/người. Hiện nay diện tích trồng Bưởi Năm Roi trong cả nước có khoảng 9,2 ngàn ha, phân bố chính ở tỉnh Vĩnh Long (diện tích 4,5 ngàn ha cho sản lượng 31,3 ngàn tấn, chiếm 48,6% về diện tích và 54,3% và về sản lượng Bưởi Năm Roi của cả nước). Trong đó tập trung ở huyện Bình Minh: 3,4 ngàn ha đạt sản lượng gần 30 ngàn tấn, tiếp theo là tỉnh Hậu Giang (1,3 ngàn ha). 2.7 Thành phần hóa học của Bưởi Vỏ quả Bưởi bên ngoài có nhiều chất narin-gosid do đó có vị đắng. Trong vỏ có tinh dầu, tỷ lệ 0,80 – 0,84%; quả chứa 0,05% tinh dầu và lá cũng có tinh dầu. Tinh dầu vỏ bưởi chứa d-linomen, apinen, linalool, geraniol, citral, ngoài ra còn có các alcol, pectin, acid citric… Dịch quả chín có nhiều chất dinh dưỡng, giá trị dinh dưỡng/100g phần ăn được gồm có: + Calo: 25 – 58 + Protein: 0,5 – 0,74 g + Lipid: 0,2 – 0,56 g + Carbohydrate: 6,3 – 12,4 g + Chất xơ: 0,3 – 0,82 g + Tro: 0,5 – 0,86 g + Canxi: 21 – 30 mg + Phospho: 20 – 27 mg + Sắt: 0,3 – 0,5 mg + Vitamin A: 20 IU + Vitamin B1: 0,04 – 0,07 mg + Riboflavin: 0,02 mg + Niacine: 0,3 mg + Ascorbic acid: 30 – 43 mg [9] 2.8 Một số lợi ích từ Bưởi Bưởi vừa là loại trái cây được nhiều người ưa thích, vứa có tác dụng trong việc phòng bệnh và đôi khi chữa được bệnh. Trước hết, Bưởi là nguồn cung cấp sinh tố C rất phong phú mà sinh tố này có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe. Kết quả nhiều nghiên cứu cho biết sinh tố C : tăng trưởng hệ thống miễn nhiễm giảm rủi ro cảm cúm do nhiễm vi khuẩn, virus ; là chất chống oxy hóa mạnh, giúp làm chậm sự hóa già và tổn thương của tế bào ; giảm cholesterol nhờ đó ít nguy cơ bệnh tim mạch ; giúp cơ thể hấp thụ nhiều chất sắt ; làm vết thương mau lành ; và tránh khỏi bệnh hoại huyết vì thiếu sinh tố này. Những trái bưởi có màu hồng hoặc đỏ là nhờ có chất lycopene, thuộc nhóm carotenoid. Lycopene làm giảm nguy cơ cơn suy tim và ung thư nhiếp tuyến. Nhiều nghiên cứu cho biết ăn Bưởi trái tim sẽ tốt hơn, cholesterol xuống thấp, làm giảm nguy cơ ung thư, tránh được các bệnh nghẽn tắc động mạch : thực vậy, Bưởi có nhiều chất xơ hòa tan pectin. Mà các chất xơ thì có công dụng làm giảm cholesterol trong máu, do đó làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch. Nhiều nghiên cứu cho thấy chất pectin còn công hiệu hơn thuốc cholestyramine vẫn được dùng để làm giảm cholesterol trong máu. Bác sĩ James Ceda quan sát một nhóm người ăn Bưởi đều đặn mỗi ngày thì thấy cholesterol giảm xuống tới 8%. Kết quả nghiên cứu ở Hà Lan cho hay Bưởi giảm nguy cơ ung thư bao tử, còn kết quả bên Thụy Điển nói bưởi giảm nguy cơ ung thư tụy tạng :các nhà nghiên cứu tại Đại học Harvard theo dọi sự dinh dưỡng của hơn 48,000 bác sĩ và nhân viên y tế, thấy rằng những người tiêu thụ thực phẩm có nhiều lycopene sẽ giảm nguy cơ bị ung thư nhiếp tuyến tới 50%. Lycopene có rất nhiều trong bưởi. Ngoài ra, các hóa chất khác trong bưởi như phenolic acid, limonoid, bioflavonoid cũng có tác dụng ức chế với sự tăng trưởng của tế bào ung thư. Nhiều người bị đau nhức khớp xương, ăn bưởi thấy như bớt đau : có lẽ là nhờ Bưởi có những phytochemical ngăn chặn chất prostaglandins làm viêm khớp xương. Bưởi là món ăn được những người muốn giảm cân ưa chuộng : vì ít năng lượng và nhiều chất xơ, ăn nửa trái bưởi đã gần no bụng, nên chỉ có thể ăn thêm được một ít thức ăn khác, nhờ đó mà không mập. Nước hạt Bưởi được giới thiệu như có chứa một chất kháng sinh, trị vi khuẩn và nấm. Đó là kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Sakamato. S Maitani vào năm 1996 [11]. 2.9 Một số sản phẩm từ Bưởi Trong số các loại trái cây, Bưởi là một trong những loại trái cây được rất nhiều người ưu thích bởi một số lợi ích như: làm giảm cholesterol trong máu, chống cao huyết áp, ngăn ngừa ung thư…Có thể nói bưởi không chỉ đơn thuần là một loại thực phẩm giàu dinh dưỡng mà nó còn là một vị thuốc. Hình 2.6 : Rượu Bưởi [8] Hình 2.7 : Mứt Bưởi [8] Vì những lợi ích trên mà ngày nay Bưởi đã được sử dụng làm nguyên liệu để chế biến thành nhiều sản phẩm như: rượu Bưởi, nước ép Bưởi, chè Bưởi, mứt Bưởi, nem Bưởi… Hình 2.8: Nước ép Bưởi [8] Hình 2.9: Chè Bưởi [8] CHƯƠNG 3. GIỚI THIỆU VỀ NẤM MEN Giới thiệu Nấm men là tên chung để chỉ nhóm vi nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường sinh sôi nảy nở bằng phương pháp nảy chồi. Nấm men có thể thuộc ngành Nấm túi(Ascomycetes) hoặc ngành Nấm đảm(Basidiomycetes). Nấm men có kích thước lớn, cấu tạo hoàn chỉnh không di động. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong đất, có thể là môi trường tự nhiên để giữa giống nấm men đặt biệt là trền bề mặt của nhiều lá cây, lương thực, thực phẩm khác. Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng là protein, lipit, vitamin. Nấm men có khả năng lên men các loại đường thành rượu trong điều kiện hiếu khí thì chúng thành sinh khối tế bào, vì vậy nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm để sản xuất bia, rượu nước giải khát, men bánh mì protein sinh khối,… Tuy nhiên cũng có những loại nấm men có hại cho sản xuất công nghiệp này và gây hư hỏng sản phẩm [3]. Hình thái, kích thước của nấm men Hình thái của nấm men thay đổi phụ thuộc tùy loại nấm men, điều kiện nuôi cấy nấm men, tuổi của ống giống, do đó nấm men có hình thái rất đa dạng hình trứng hay hình bầu dục, hình tròn, hình ống, hình quả dưa chuột, quả chanh, hình bình hành, hình tam giác,… Một số loại nấm men có tế bào hình dài nối tiếp nhau thành những sợi nhỏ gọi là khuẩn ty (Mycelium) hoặc khuẩn ty thể giả (Pseudomycelium). Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, phụ thuộc giống, loài. Nói chung kích thước của nấm men lớn hơn kích thước của tế bào vi khuẩn, trung bình khoảng 3-5 x 5-10µm [3]. Cấu tạo của nấm men Tế bào của nấm men có cấu tạo gần giống tế bào vi khuẩn, tuy có cấu tạo đơn giản nhưng chúng cũng mang đầy đủ tính chất của một cơ thể sống, chúng có cấu tạo từ màng, nguyên sinh chất và nhân gồm các phần sau: Thành tế bào Thành tế bào nấm men dày 25µm (chiếm 25% trọng lượng khô của tế bào). Thành tế bào chủ yếu là glucan (cấu tạo bởi các gốc D-glucose) và mannan (D-manose) hệ glucan và mannan chiếm khoảng 90% trọng lượng vỏ trong đó mannan có thể không có. Thành phần khác có protein 6-7%, hexozamin và phần còn lại là lipit, polyphotphat, các chất chứa kitin. Màng tế bào chất Màng tế bào chất (còn gọi là cytoplasmic membrane) ,dày khoảng 7 – 8nm. Cấu tạo gồm 3 lớp: hai lớp phân tử protein (50% trọng lượng chất khô của màng và 10 – 20% protein tế bào) và một lớp kép phospholipid (20 – 30% trọng lượng khô của màng) nằm ở giữa, 70 – 90% lipit của tế bào tập trung ở phopholipit của màng. Sự phân bố protein và phospholipid ở màng nguyên sinh chất khác nhau ở từng vùng. Sự phân bố đó tạo nên các lỗ hổng trên màng thuận lợi cho sự vận chuyển. Protein của màng có hai dạng: protein cấu trúc và ezyme. Enzym gồm có: permease vận chuyển các chất vào tế bào, các emzym tổng hợp các chất murein, phopholipit, LPS… Hai lớp phospholipid , chiếm khoảng 30-40% khối lượng và các protein nằm phía trong. Phía ngoài hay xuyên qua màng chiếm 60-70% khối lượng. Mỗi phân tử phospholipid chứa một đầu tích điện hay phân cực (đầu phosphate) và một đuôi không tích điện hay phân cực (đầu CO2). Đầu phosphate còn gọi là đầu háu nước, đầu CO2 còn gọi là đầu kị nước . Hai lớp phân tử phospholipid, một lớp CO2 quay vào trong còn một lớp phosphate quay ra ngoài màng làm màng lỏng và cho phép các protein hoạt động tự do. Cách sắp xếp như thế được gọi là mô hình khảm lỏng. Hầu hết màng tế bào chất của vi sinh vật nhân nguyên thủy không chứa các sterol, như cholesterol, do đó không cứng như màng tế bào chất của tế bào có nhân thật. Mycoplasma là vi khuẩn nhân thật không có thành tế bào. Màng tế bào chất có chứa sterol do đó khá vững chắc. Màng tế bào chất có chức năng: Duy trì áp suất thẩm thấu tế bào Khống chế sự vận chuyển trao đổi ra vào tế bào của cá chất dinh dưỡng các sản phẩm trao đổi chất Duy trì một áp xuất thẩm thấu bình thường bên trong tế bào Là nơi sinh tổng hợp một số thanh phần cùa tế bào như vách, giáp mô trong màng có chứa các enzym và ribosom. Là nơi tiếng hành các quá trình phophoril quang hợp. Là nơi tổng hợp các loại emzym. Cung cấp cho hoạt động của tiêm mao. Có quan hệ đến sự phân chia tế bào. 3.3.3 Nguyên sinh chất Nguyên sinh chất của nấm men bao gồm: ty thể, ribosome, không bào, lưới nội chất, bộ golgi, lyzosome. Ty thể: Đây là những ty thể hình que, hình sợi, nhưng hình dạng và số lượng có thể thay đổi khác nhau tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và trạng thái sinh lý tế bào. Những hình thể, hình que, hình sợi kích thước 0,2-0.5 x 0,4-0,1µm luôn luôn di động và tiếp xúc với các cấu trúc khác tế bào. Hình dạng và số lượng ty thể thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và trạng thái sinh lý của tế bào. Cấu tạo của tế bào gồm hai lớp màng: lớp màng trong có hình lượn sóng hay hình răng lược để tăng diện tích tiếp xúc với cơ chất, trong có chứa dịch. Giữa hai lớp có các hạt nhỏ bám trên màng là những hạt cơ bản. Bên trong ty thể là chất dịch hữu cơ. Chức năng của ty thể: Tham gia vào việc thực hiện các phản ứng oxy hóa giải phóng nănglượng ra khỏi cơ chất, làm cho năng lượng được tích lũy dưới dạng ATP Giải phóng năng lượng khỏi ATP và chuyển năng lượng đó thành năng lượng có ích cho hoạt động sống của tế bào Tham gia vào việc tổng hợp một số hợp chất protein, CO2,những hợp chất này tham gia vào cấu tạo màng tế bào. Ribosome: Số lượng ribosome thường thay đổi tùy thuộc vào từng loài từng giai đoạn phát triển và từng điều kiện nuôi cấy. Khác với vi khuẩn, nấm men có hai loại ribosome: loại 70 (30 và 40) tồn tại chủ yếu trong ty thể, loại 80 tồn tại chủ trong mạng lưới nội chất và một số ít tồn tại ở trạng thái tự do. Loại 80 có tính tổng hợp protein mạnh hơn. Không bào: Mỗi tế bào nấm men có một không bào khá lớn và nhiều không bào nhỏ có tác dụng điều hòa áp xuất thẩm thấu, tham gia vào quá trình trao đổi chất tế bào vì nó chứa nhiều hợp chất hữu cơ ở trạng thái trung gian nó được coi như những phần dự trữ quan trọng của tế bào, nó tham gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men. Lưới nội chất: Được phát hiên vào năm 1945 dưới kính hiểm vi đối pha. Kính hiển vi điện tử cho thấy mạng nội chất nối liền với màng ngoài của nhân ở một số vị trí. Mạng nội chất giống như một hệ thống ống túi, tròn hay dẹp, thông thương với nhau và có màng bao quanh. Khoảng giữa hai màng của túi ống được gọi là khoang. Ở hầu hết các tế bào, mặt ngoài của mạng nội chất có các ribosome gắn vào, khi đó đươc nó được gọi là mạng nội chất nhám, nơi không có các ribosome được gọi là mạng nội chất trơn. Nhiệm vụ của màng nội chất không đơn thuần là đường vận chuyển bên trong tế bào. Màng của tế bào nội chất là nơi chứa các protein và các protein này có cả hai chức năng, vừa là thành phần cấu trúc vừa là enzym xúc tác các phản ứng hóa học. Hiện nay, có nhiều bằng chứng cho thấy rằng ít nhất là một số protein cấu tạo mạng nội chất hoạt động như enzym, một số của những enzym này được gắn thêm một đường đa ngăn, giúp đưa protein đến đúng nơi nhận trong tế bào. Mạng nội chất còn có nhiệm vụ như một xưởng chế tạo, các enzym của chúng xúc tác sự tổng hợp các phospholipid và cholesterol được dùng để tạo ra màng mới hay các protein được tổng hợp bởi ribosome trên nội chất là thành phần của màng lipit. Bộ gogil: Là hệ thống túi dẹp có màng bao và xếp gần như song song nhau, mặt gần nhân gọi là mặt cis và mặt đối diện gọi là mặt trans. Các túi chuyên chở bên trong lipit và protein mới được tổng hợp, được tách ra từ màng nội chất hòa vào các túi dẹp của bộ gogil ở mặt cis. Các chất này trong bộ gogil được biến đổi,sắp xếp lại và sau đó các túi mới được tách ra từ mặt trans. Các túi này vận chuyển các phân tử đến các bào quan khác và sinh chất. Các túi được tách ra khỏi bộ gogil có vai trò quan trọng làm tăng bề mặt của màng tế bào. Khi túi được chuyển đến bề mặt của màng sinh chất chúng được gắn vào màng này, và sau đó vở phóng thích nội dung ra bên ngoài tế bào trong quá trình ngoại xuất bào, một phần hay tất cả màng của túi được hòa vào màng sinh chất hay trở về bộ gogil. Lyzosome: Là những khối hình cầu đường kính từ 0,2-0,4µm, có khi lớn đến 1-2m. Lyzosome được bao bọc bởi một màng lipoprotide. Lyzosome chứa những enzym thủy phân có vai trò tiêu hóa nội bào. Nhân tế bào Nhân của tế bào nấm men là nhân thật, nhân đã có sự phân hóa, có kết cấu hoàn chỉnh và ổn định, và có màng nhân. Nhân có hình tròn hay hình bầu dục, bắt đầu có những biểu hiện của tế bào tiến hóa, đó là phân chia theo hình thức giảm phân. Màng nhân, gồm hai lớp có nhiều lỗ thủng (ở tế bào nấm men già, trên mỗi tế bào có khoảng 200 lỗ chiếm 6-8% diện tích màng), trong có chất nhân, hạch nhân và các nhiễm sắc thể. Thành phần hóa học: quan trọng nhất của nhân là nucleoprotein và các enzym. Nhân có vai trò chủ yếu là mạng hệ thống thông tin di truyền chứa trong DNA, điều khiển hoạt động của enzym và nhiều hoạt động khác của tế bào. 3.3.5 Plasmid Ở nấm men Saccharomices cerevisiae được gọi là 2µm có vai trò quan trọng trong chuyển gen của kĩ thuật di truyền. Loại plasmid này là một DNA vòng 6300 đôi base [3]. Vai trò của nấm men Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trường chứa đường, pH thấp (đất nước không khí, lương thực, thực phẩm, hoa quả) nhiều loại nấm men có khả năng lên men rượu vì vậy từ lâu người ta đã biết sử dụng nấm men để nấu rượu,bia, sản xuất cồn, glycerin,… Nấm men sinh sản nhanh, sinh khối của chúng giàuprotein, vitamin vì vậy còn được sử dụng trong công nghiệp sản xuất thức ăn bổ sung cho người và gia súc. Nấm men được sử dụng làm bột nở bánh mì, gây hương nước chấm một số dược phẩm và gần đây còn được sử dụng để sản xuất lipid. Bên cạnh đó cũng có những nấm men có ích cũng có những nấm men gây bệnh cho người và gia súc, làm hỏng lương thực, thực phẩm,… [3] Phân loại nấm men Nấm men gồm 349 loài nấm khác nhau. Chúng thuộc 39 giống nấm, căn cứ vào khả năng sinh bào tử mà có thể chia thành 4 nhóm chính: Nhóm nấm men có bào tử túi (ascospurus): gồm 22 giống khác nhau.Thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes). Nhóm gần gũi với nấm đảm gồm 4 giống. Chúng có chu trình tương tự với các nấm thuộc bộ Ustilaginales của lớp nấm đảm (Basidiomycetes) Nhóm nấm men có bào tử bắn: gồm có 3 giống thuộc họ Porolio mycetaceae. Nhóm nấm men không sinh bào tử: một số giống sinh nội bào tử vô tính gồm 12 giống thuộc về lớp nấm bảo toàn. Trong thực tế chúng được phân thành hai nhóm: nhóm nấm men nổi và nhóm nấm men chìm. Nhóm nấm men nổi:  Nhiệt độ lên men 10-250C Lên men mạnh, quá trình lên men xảy ra trên bề mặt của môi trường, khi quá trình lên men kết thúc các tế bào kết chùm, chuỗi tạo thành lớp dày nổi trên bề mặt. Khả năng sử dụng đường tam lên men kém Thuộc nhóm độc lập: Saccharomices cerevisiae  Lên men được các đường: glucoza, fructoza, sacarora, malttoza , 1/3 rafinaza và các destrin đơn giản. Nhóm nấm men chìm:  Nhiệt độ lên men 0 – 100C Khi lên men các tế bào cũng kết chùm hoặc chuỗi, song lại lắng xuống đáy thùng lên men rất nhanh. Khả năng lên men đường tam tốt đạt 100% Thuộc nhóm đập lập: Saccharomices carlbergensis được Hansen phân lập vào năm 1833 và đặt tên là Carlbergunterhefe. Đến 1881 – 1883, được đưa vào sử dụng trong công nghiệp bia ở Đan Mạch, Kopernhagen lần đầu tiên. Đặc tính: lên men mạnh trong lòng môi trường, khi hết nguồn cacbon trong môi trường thì có xu hướng kết chùm, chuỗi và lắng nhanh xuống đáy thùng lên men, trong bia nhanh. Lên men glucoza, mannoza, fructoza, saccharoza, maltoza. Đặc biệt là các rafinoza, và các destrin đơn giản, lên men tốt thậm chí ở nhiệt độ thấp từ 6 –  1000C (các giống khác không có khả năng này) [3]. Nuôi cấy và nhân giống nấm men Nuôi cấy Nuôi cấy nấm men tùy thuộc vào đặc điểm sinh lý của vi sinh vật đối với oxi, ta coi quá trình đó là hiếu khí hay kị khí, không bắt buộc (kỵ khí tùy tiện). Đối với nấm men kỵ khí thực hiện theo phương pháp nuôi cấy chìm, nghĩa là những vi sinh vật nuôi cấy sâu trong môi trường, thỉnh thoảng khuấy để tăng sự trao đổi của tế bào vi sinh vật với môi trường trong suốt quá trình không sục khí. Với quá trình lên men kỵ khí không bắt buộc, như trong lên men rượu các giống men khi có oxy thì chuyển sang sinh trưởng, tăng sinh khối, khi thiếu oxy thì chuyển sang hướng tích tụ etanol. Vì vậy lên men rượu thời kì đầu thường cung cấp không khí để nấm men phát triển tốt, thực hiện theo hai phương pháp nuôi cấy: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu: Nuôi cấy bề mặt : Theo phương pháp này giống vi sinh vật hiếu khí sau khi gieo cấy sẽ phát triển trên bề mặt và dần lan xuống phía dưới theo các khe hở giữa các cấu tử thành phần môi trường. Môi trường nuôi cấy bề mặt là môi trường rắn và xốp. Vi sinh vật phát triển sử dụng oxi của không khí để ô hấp và làm tác nhân oxi hóa trong quá trình biến đổi hóa sinh, đồng thời thải CO2 và tỏa nhiệt. Môi trường dinh dưỡng sau khi thanh trùng được tải lên các khay sạch với chiều dày từ 3 – 5cm và nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong buồng nuôi cấy có độ ẩm không khí là 90%. Phương pháp này thích hợp cho nuôi cấy nấm mốc, một số trường hợp là xạ khuẩn. Nguyên liệu nuôi cấy môi trường: Nuôi cấy trên môi trường rắn hoặc bán rắn , cơ chất dinh dưỡng là cám có trộn các loại bột ngũ cốc đậu tương, và một số thành phần dinh dưỡng khác. Nguồn cacbon có trong môi trường này là ngô gạo, mì, bobo, đại mạch, đậu tương được nghiền vỡ thành mảnh vụn có kích thước khoảng 1-3 mm, cùng với cám gốm gạo, cám mì và trấu. Cám trấu trong môi trường còn có tác dụng làm xốp để tăng sự hiếu khí cho vi sinh vật. Chuẩn bị môi trường bằng cách trộn các thành phần cho đều với nước sao cho đô ẩm 55 -60 % và được hấp thanh trùng. Cấy giống vi sinh vật từ dịch nhân giống hoặc các bào tử và khối môi trường đã thanh trùng và để nguội ủ thành đống vài giờ, sau đó tải ra khay với chiều dày khoảng 2-5 cm, (càng mỏng) hiếu khí càng tốt. Vi sinh vật phát triển sẽ thải CO2 tỏa nhiệt ra xung quanh làm nóng và khô môi trường, hệ sợi làm cho môi trường kết thành tảng. Khi đó cần phải thông gió phun mù, hoặc giữ ẩm tương là 90% để tránh làm khô môi trường. Nhược điểm của phương pháp: Tốn diện tích mặt bằng Khó cơ khí hóa tự động hóa Chi phí cao Nuôi cấy bề sâu: Phương pháp nuôi cấy này dùng cho cả vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí. Đối với vi sinh vật kỵ khí trong quá trình nuôi không cần sục khí, nếu khuấy trộn với vi sinh vật hiếu khí thì phải sục khí liên tục. Nuôi cấy chìm hay nuôi cấy bề sâu đều dùng môi trường dinh dưỡng lỏng (hay còn gọi là môi trường dịch thể). Chủng vi sinh vật được gieo cấy vào môi trường phân tán khắp mọi điểm và chung quanh bề mặt tế bào được tiếp xúc với bề mặt dinh dưỡng. Đặc điểm này đòi hỏi phải trong suốt quá trình nuôi cấy phải cung cấp oxy bằng cách sục khí liên tục. Chính yêu cầu này làm cho các trang thiết bị nuôi cấy chìm thêm phức tạp, vì phải đảm bảo cung cấp oxy hòa tan cho nhu cầu sinh trưởng và  tạo thành sản phẩm của chủng nuôi cấy, vừa khuấy trộn liên tục mà vẫn đảm bảo không bị tạp khuẩn xâm nhập, hơn nữa thiết bị làm việc ở điều kiện bên trong cao hơn bên ngoài. Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi để sản xuất nấm men, protein đơn bào từ nấm men, các sản phẩm vi sinh làm phân bón cố định đạm, thuốc trừ sâu, các enzym, axit amin, vitamin và các chất kháng sinh, các chất kích thích sinh học,... ngoài ra nó được ứng dụng trong xử lý nước thải theo phương pháp hiếu khí. Ưu điểm của phương pháp: Ít tồn mặt bằng xây dựng và thiết bị dây chuyền Chi phí thấp Quy mô lớn Thiết bị lên men dễ cơ khí hóa tự động hóa. Ngoài ra còn có nhiều phương pháp nuôi cấy khác như: phương pháp cấp đơn, phương pháp cấp nhiều, phương pháp bán liên tục. Nhân giống Cũng như trong phòng thí nghiệm và qui mô pilot, muốn thực hiện một quá trình lên men ở quy mô công nghiệp, ta phải tiến hành nhân giống, đảm bảo số lượng tế bào với tuổi sinh lý đang ở thời kì hoạt động mạnh nhất để cấy vào môi trường lên men. Nhân giống ở đây có thể qua 2 – 3 bước, ta thường gọi là nhân giống cấp 1, cấp 2, cấp 3... Giống từ ống gốc mới được cấy chuyền ta biết chắc có hoạt lực cao ở nhiệt độ thích hợp 12-36 giờ. Nhân giống cấp 1 được tiến hành trên máy lắc với nhiệt độ và thời gian tùy thuộc vào yêu cầu công nghệ. Giống cấp 1 được cấy sang môi trường nhân giống câp 2 trong nồi nhân giống (tương tự nồi lên men) có sục khí và ổn nhiệt. Tùy thuộc vào quy mô sản xuất mà người ta có tiến hành nhân giống cấp 3. Thành phần môi trường nhân giống và lên men gần giống nhau . Thông thường hàm lượng carbon ở môi trường nhân giống thấp hơn lên men, nhưng các thành phần khác thì cao hơn như chất kích thích sinh trưởng. Nên điều chỉnh nhiệt đô thấp hơn môi trường lên men vì sẽ giảm chống sốc nhiệt. Chủng sau khi nhân giống đưa vào lên men cần đảm bảo: Dịch giống không được tạp nhiễm, đặc biệt là thực khuẩn thể. Các tế bào đảm bảo ở độ tuổi sinh lý ở thời gian sinh trưởng tốt nhất, có hoạt tính thường là nữa sau của pha chỉ số. Các chỉ số như OD, pH, màu sắc, mùi vị, đúng như quy định của từng dây chuyền công nghệ. Dịch giống đảm bảo những yêu cầu này mới tiến hành đưa vào lên men [3]. Những giống nấm men thường được gặp trong sản xuất rượu vang Nấm men là tên chung để chỉ vi sinh vật có cấu tạo đơn bào. Tế bào của các loài nấm men có các hình dạng như: hình elip, hình ovan hoặc hình tròn. Chúng sinh sản bằng lối nảy chồi, sử dụng đường trong quá trình hô hấp và lên men. Có 15 giống được biết và một giống trong chúng được ưa chuộng cho việc sản xuất rượu vang nho đó là Saccharomyces. Saccharomyces là một giống đại diện cho hầu hết các nấm men được sử dụng trong làm bánh mì, bia và rượu vang và quan trọng nhất trong chúng là S.cerevisiase, nó còn được gọi là S.ellipsoideus. Còn với những nấm men không phải là giống Saccaromyces thì thường có hại cho rượu. Hình 3.1: Saccharomyces [8] Hình 3.2: Saccharomyces cerevisiase[8] Giống nấm men tốt cho việc làm rượu vang (Saccharomyces cerevisiase) gồm có những dòng: Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces carlbergiensis, Saccharomyces logo, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces vini, Saccharomyces sake, Saccharomyces distaticus, Saccharomyces fiutuum, Saccharomyces italicus, Saccharomyces oxydans, … Hình 3.3: Saccharomyces uvarum[8] Hình 3.4: Saccharomyces bayanus[8] Hình 3.5: Saccharomyces oviformis[8] Hình 3.6: Saccharomyces carlbergiensis [8] Hình 3.7: Saccharomyces vini [8] Nhiều nghiên cứu cho thấy hệ nấm men trong nước quả lên men có số lượng và thành phần giống, loài không đồng nhất. Các chi, giống, loài của nấm men khác nhau thì khác nhau về: tốc độ sinh trưởng, hoạt lực lên men, khả năng tạo cồn, chịu nóng, chịu lạnh, khả năng chịu cồn cao cũng như khả năng sinh các sản phẩm lên men thứ cấp ảnh hưởng đến hương vị của rượu vang [3]. Những yêu cầu đối với nấm men được lựa chọn cho sản xuất Hương vị đặc trưng của từng loại rượu sẽ phụ thuộc chủ yếu vào đặc tính nguyên liệu và quy mô công nghệ, đồng thời nó còn phụ thuộc vào chủng nấm men được sử dụng cho lên men. Những nấm men được phân lập và sử dụng cho sản xuất cần phải đạt một số yêu cầu sau: + Có hoạt lực lên men cao đối với nước quả + Sử dụng đường cho lên men gần hoàn toàn + Khả năng kết lắng tốt, làm trong dịch rượu nhanh + Chịu được độ cồn cao và độ acid của môi trường cũng như các chất sát trùng + Tạo được rượu thơm ngon thanh khiết Hiện nay phương pháp lên men rượu vang tự nhiên không còn được ưa chuộng nữa vì quá trình lên men tự nhiên khó kiểm soát và hiệu suất rượu thường không cao. Phổ biến hiện nay trong lên men vang thường sử dụng các giống thuần chủng để tiến hành lên men. Nước quả sau điều chỉnh pH, độ đường thường được xử lý bằng SO2 để diệt các vi sinh vật tồn tại trong nó và sau đó tiến hành bổ sung các giống men đã được phân lập thành giống thuần chủng. Phương pháp sản xuất rượu vang từ những chủng men thuần khiết đang có nhiều triển vọng vì: + Thời gian lên men nhanh. + Quá trình lên men không bị ngừng giữa chừng. + Hàm lượng đường trong dịch quả được lên men triệt để. + Nồng độ cồn thu được trong lên men từ các giống thuần cao hơn so với lên men tự nhiên 0,1 – 10. + Vang sang màu nhanh hơn và có thể cho hương vị thanh khiết hơn [3]. CHƯƠNG 4. QUY TRÌNH LÊN MEN RƯỢU BƯỞI Cơ sở khoa học của quá trình lên men rượu [6,tr.18-24] Cơ chế của quá trình lên men rượu đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu từ vài thế kỷ trước như: Năm 1789 Lavoisier bằng các thí nghiệm của mình đã chứng tỏ được rằng bên cạnh sản phẩm chính của quá trình lên men rượu là C2H5OH và CO2 còn có một số sản phẩm phụ khác. Đến năm 1810, Gay-Lussac nghiên cứu sâu hơn và tìm ra rằng: trong quá trình lên men rượu thì 45% glucose tạo ra 23% C2H5OH và 22% CO2. Dựa trên cơ sở đó ông đã đưa ra phương trình tổng quát như sau: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 27Kcal Năm 1857, Louis Pastuer đã công bố kết quả nghiên cứu của ông “sự phân giải đường thành rượu và CO2 là sự hô hấp của nấm men trong điều kiện yếm khí” và kết luận: Cứ 100% glucose tạo ra 51,1% C2H5OH; 49,4% CO2; 3,2% acid succinic và khoáng, 1% các sản phẩm khác. Vào khoảng 1871-1872, Manaxeni thử nghiền tế bào nấm men với cát và thạch anh rồi mới cho vào dịch đường thì hiện tượng lên men vẫn xảy ra. Đến năm 1879, Bucher tiến hành nghiền nát tế bào nấm men rồi chiết lấy dịch trong không chứa xác nấm men và cho vào dịch đường thì nhận thấy dịch đường này vẫn có khả năng lên men. Từ đó người ta gọi các chất chứa trong dịch tế bào nấm men là zymase. Đây chính là tập hợp của nhiều enzyme chuyển hóa đường thành rượu và CO2. Về sau các nhà khoa học đã đi sâu nghiên cứu về cơ chế lên men, vi sinh vật và các yếu tố kỹ thuật khác nhau thì nhận thấy rằng: Thực chất lên men là quá trình oxy hóa-khử sinh học để cung cấp năng lượng cho tế bào vi sinh vật, qua đó hydro tách ra khỏi cơ chất và chuyển đến chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ. Sau đó hợp chất hữu cơ được khử đi vào môi trường dinh dưỡng và tích tụ lại trong đó. Trong lên men rượu thì C2H5OH và CO2 là sản phẩm tích tụ chiếm ưu thế, ngoài ra còn có rất nhiều các sản phẩm khác như các acid, ester, aldehyde và các rượu cao phân tử. Bằng phương pháp sắc ký người ta có thể xác định được trên 500 chất khác nhau. Nhưng về cơ bản có thể chia thành 4 nhóm là alcol, aldehyde, acid và ester. Nấm men là tác nhân chính của quá trình lên men rượu, với đường là cơ chất chính. Quá trình chuyển hóa đường thành rượu qua một chuỗi phản ứng rất phức tạp liên quan mật thiết đến quá trình phosphoryl hóa các hợp chất hữu cơ. Phương trình chuyển hóa như sau: C6H12O6 + 2H3PO4 + 2ADP 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP Đường cùng các chất dinh dưỡng khác của môi trường lên men đưa vào trong tế bào nấm men, chỉ nhữn chất dinh dưỡng cần thiết qua màng tế bào và được cơ thể nấm men giữ lại. Tại đây, qua những hiện tượng trao đổi chất của tế bào, một cơ chế phức tạp bao gồm một chuỗi các phản ứng hóa sinh, biến đổi đường glucose thành acid pyruvic. Sau đó acid pyruvic trong điều kiện yếm khí dưới tác dụng của enzyme pyruvac decarboxylase sẽ chuyển thành acetaldehyde. Cuối cùng acetaldehyde dưới tác dụng của enzyme alcohol dehydrogenase biến đổi thành rượu etylic. Phương trình tổng quát: quá trình EMP C6H12O6 CH3COCOOH Glucose acid pyruvic Enzyme pyruvat dercarboxylase CH3COCOOH CH3CHO + CO2 Enzyme alcohol dehydrogenase CH3CHO + NAD.H+ + H+ CH3CH2OH + NAD+ Acetaldehyde ethanol Dựa vào mục đích và những biến đổi chính diễn ra trong quá trình lên men, ta chia quá trình lên men rượu vang thành 2 giai đoạn. Lên men chính: Ở giai đoạn này diễn ra biến đổi quan trọng nhất là đường dưới tác dụng của nấm men chuyển hóa thành rượu tạo cho vang một độ rượu thích hợp. Đồng thời trong quá trình trao đổi chất của nấm men sẽ hình thành nên một số sản phẩm trung gian và sản phẩm phụ như: rượu cao phân tử, aldehyde, acid hữu cơ và một số ester. Lên men phụ: Ở giai đoạn này lượng đường còn sót lại sau giai đoạn lên men chính sẽ tiếp tục chuyển hóa thành rượu. Tuy nhiên, các biến đổi quan trọng trong giai đoạn này là việc khử các aldehyde làm giảm nồng độ của chúng, sự hình thành nên một số ester, sự tạo thành tủa của một số loại protein và tannin…sẽ góp phần làm tăng giá trị cảm quan cho rượu vang thành phẩm sau này. Quy trình lên men rượu từ Bưởi Dịch Bưởi Lọc Pha loãng Giống Saccharomyces cerevisae F28 Điều chỉnh về 0Bx Điều chỉnh về pH Nhân giống cấp 1 Bổ sung dd Na2SO3 theo tỷ lệ 50mg/l dịch bưởi Nhân giống cấp 2 Bổ sung tỷ lệ men Lên men chính Rượu Bưởi 4.3 Thuyết minh quy trình lên men rượu từ bưởi 4.3.1 Nguyên liệu 4.3.1.1 Dịch bưởi Bưởi phải chọn những quả đạt độ chín chế biến mềm nhưng không hư thối và có hương vị đặt trưng. Nếu quả chưa thật chín thì màng tế bào vẫn còn cứng, hàm lượng đường thấp, hàm lượng acid có thể cao nên khi ép thường thu được thể tích ít hơn so với độ chín chế biến. Khi thu hoạch quả nên thu hoạch ở độ chín chế biến vì lúc này dịch quả thu được hàm lượng đường tăng, hàm lượng acid giảm phù hợp với công nghệ lên men. Chọn quả phải loại bỏ những quả hư thối, quả bệnh để tránh mang vào nước quả những bào tử nấm, khuẩn cản trở hoạt động của nấm men. Bưởi phải đạt các chỉ tiêu sau: Chỉ tiêu cảm quan + Đảm bảo độ tươi, chín vàng + Không bị hư thối, sâu bệnh, biến dạng Chỉ tiêu hóa lí  + Mức độ chín đảm bảo hàm lượng đường glucose, fructose, saccharose,… + Không có mùi rượu, mùi giấm, cũng như các mùi lạ khác,… + Đảm bảo các thành phần dinh dưỡng như: gluxit, protit, lipit, nước,vitamin A, vitamin B1, B2, vitamin C, Vitamin PP,…. + Hàm lượng thuốc trừ sâu không vượt mức giới hạn +Không có hàm lượng kim loại nặng (Coban, Thủy ngân, Asent,…) hoặc rất thấp đối với kim loại nhẹ. Chỉ tiêu vi sinh + Hàm lượng E.Coli: không có + Vi khuẩn khác: không có + Nấm men có trong quả là chủng Saccharomyces [7] Bưởi sau khi đã được lựa chọn và phân loại những trái hư thối. Sau đó, đem đi rửa sạch bụi bẩn, gọt vỏ xanh và tách cùi trắng (có thể chế biến một số sản phẩm từ vỏ xanh, cùi trắng). Tách bỏ vỏ múi, lấy ruột múi đem đi nghiền nát, vắt lấy nước bỏ bã và lọc lại một lần nữa, ta có dịch bưởi để lên men. 4.3.1.2 Giống vi sinh vật [6,tr.42] Môi trường dùng để nhân giống S.cerevisae F28 là môi trường M166 - môi trường giá đậu - đường: Cân 300g giá đậu, thêm 1000ml nước đun sôi 30 phút, lọc lấy phần dịch trong, thêm nước cho đủ 1000ml, cho thêm 30g đường. Nấm men Saccharomyces cerevisae F28 có cấu tạo đơn bào, hình trứng, kích thước tương đối lớn. Chúng sinh sản bằng lối nảy chồi, sử dụng đường trong quá trình hô hấp và lên men. Hình 4.1 : Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi Khuẩn lạc được ủ 2 ngày ở nhiệt độ 320C bằng phương pháp cấy ria, trải đĩa sẽ có màu trắng, mọc lồi trên môi trường thạch, đường kính vào khoảng 1,5-2mm. Hình 4.2: Khuẩn lạc của Saccharomyces cerevisae F28 F28 4.3.2 Các bước thực hiện Bước 1: Pha loãng Dịch bưởi càng pha loãng thì hàm lượng đường tổng thấp, 0Bx càng thấp. Đối với dịch bưởi nguyên chất thì có mùi thơm dịu của bưởi, vị chua ngọt hài hòa, 0Bx cao, hàm lượng đường cao. Dịch bưởi sau khi pha loãng thì hàm lượng đường giảm, 0Bx thấp, vị nhạt. Vì vậy tỷ lệ 1:1 (dịch bưởi: nước) là thích hợp để tiến hành lên men rượu Bước 2: Điều chỉnh hàm lượng chất khô ( 0Bx) Nấm men sử dụng đường là nguồn cơ chất chủ yếu để sinh trưởng phát triển và tạo ra sản phẩm chính là cồn, các acid hữu cơ và CO2. Nếu nồng độ đường trong dịch lên men cao thì quá trình lên men vẫn xảy ra nhưng tốc độ chậm, và tốc độ lên men dường như ngừng lại khi nồng độ đường vượt quá 30%. Lý do là nếu nồng độ đường của dịch lên men quá cao sẽ gây ra áp suất thẩm thấu lớn, khi đó nó sẽ phá hủy trạng thái bình thường của nấm men, hậu quả là nấm men bị ức chế, cồn etylic sản xuất ra được ít, rượu nhạt. Còn nếu hàm lượng đường quá ít thì độ rượu thu được sẽ thấp và rượu vang dễ bị hỏng do nhiễm vi sinh vật. Do đó việc xác định hàm lượng đường thích hợp để lên men là yếu tố cần thiết mang lại hiệu quả trong quá trình lên men rượu. Vì vậy 0Bx = 22 thì hàm lượng chất khô còn lại là ít nhất và độ cồn thu được là cao nhất, nồng đường tạo ra vừa phải. Bước 3: Điều chỉnh độ pH Nồng độ H+ của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của nấm men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong một môi trường pH nhất định. Đối với các loại nấm men để sản xuất rượu vang, pH thích hợp nhất để chúng hoạt động là từ 4 đến 6. Nếu pH thấp hơn thì nấm men có thể thay đổi hình thái, tế bào nhỏ hơn, khả năng lên men của nấm men sẽ giảm. Do đó việc xác định giá trị pH thích hợp là điều kiện cần thiết nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình lên men. Vì vậy pH=4,0 là pH lý tưởng, nấm men hoạt động rất mạnh, lượng đường sót lại còn rất ít, hơn nữa độ rượu thu được cao. Bước 4: Bổ sung dung dịch Na2SO3 theo tỉ lệ 50mg/l dịch bưởi Muối natri sunfat co tác dụng chống oxi hóa, làm giảm hoặc tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn có hại trong đó có vi khuẩn lactic. Nếu dùng quá liều lượng rượu sẽ có mùi khó chịu và diệt một số vi khuẩn có ích, cho nên sử dụng đúng liều lượng theo tỉ lệ 50mg/l . Sau khi lên men xong thì dịch lên men, ngoài rượu ra còn có thành phần hòa tan khác và xác các nấm men làm cho rượu thu được không được trong. Để lắng tự nhiên thì thời gian rất dài rượu mới có thể được như ý muốn. Vì vậy, ở giai đoạn này bổ sung dung dịch Na2SO3 còn có tác dụng làm trong rượu sau khi lên men, để thêm giá trị cảm quan và ổn định độ trong của rượu trong thời gian dài. Bước 5: Lên men chính Giống từ ống gốc mới được cấy chuyền ta biết chắc có hoạt lực cao giữa ở nhiệt độ thích hợp 12-36 giờ. Nhân giống cấp 1 được tiến hành trên máy lắc với nhiệt độ và thời gian tùy thuộc vào yêu cầu công nghệ. Giống cấp 1 được cấy sang môi trường nhân giống câp 2 trong nồi nhân giống (tương tự nồi lên men) có sục khí và ổn nhiệt. Số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên men diễn ra tốt và hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm cũng tốt hơn. Nếu lượng tế bào nấm men cho vào quá ít thì tốc độ lên men chậm, sinh khối tế bào nấm men quá nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ cho nấm men phát triển, tế bào nấm men sẽ chết dần, sản phẩm sinh ra mùi lạ, vị lạ đồng thời phí đi một lượng đáng kể men không có ích. Do đó việc xác định tỷ lệ nấm men thích hợp là rất cần thiết. Vì vậy, tỉ lệ nấm men thích hợp là 10% với chất lượng dịch nhân giống là 1,3 x 108 tế bào/ml và giữ quá trình lên men ở nhiệt độ phòng. Thời gian lên men chính, sau khi kết thúc quá trình lên men chính nấm men thường giảm hoặc ngừng phân giải đường thành rượu và khí CO2, lúc này hầu hết tế bào nấm men sẽ chết và xảy ra hiện tượng tự phân làm tăng chất dinh dưỡng. Đây là điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật xâm nhiễm và phát triển. Do đó việc xác định thời gian lên men thích hợp là rất quan trọng nhằm tiết kiệm thời gian lên men, hạn chế vi sinh vật tạp nhiễm cũng như thu được độ rượu cao. Mỗi ngày nên xả bớt lượng khí CO2 tạo ra để tránh hiện tượng gây vỡ bình và khí CO2 nhiều sẽ ức chế nấm men phát triển. Lên men sau 7 ngày, thu được sản phẩm. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 4.4.1 Thành phần dinh dưỡng trong môi trường lên men Nguồn glucid cần thiết cho vi sinh vật nhằm tạo năng lượng và cung cấp khung carbon để sinh tổng hợp các thành phần cần thiết cho tế bào. Môi trường thuận lợi cho lên men rượu vang có nồng độ đường trong khoảng 18-25%. Khi nồng độ đường lớn hơn 25% thì quá trình lên men vẫn xảy ra nhưng tốc độ chậm, và tốc độ lên men dường như ngừng lại khi nồng độ đường vượt quá 30%. Lý do là nếu nồng độ đường của dịch lên men quá cao sẽ gây ra áp suất thẩm thấu lớn, khi đó nó sẽ phá hủy trạng thái bình thường của nấm men, hậu quả là nấm men bị ức chế, cồn etylic sản xuất ra được ít, rượu nhạt. Còn nếu ít đường quá thì dộ rượu thu được sẽ thấp và rượu vang dễ bị hỏng do nhiễm vi sinh vật. Nitơ cũng là chất cần thiết cho sự lên men của nấm men. Nấm men Saccharomyces cerevisase có thể sử dụng nitơ dưới dạng một số hợp chất hữu cơ và vô cơ như: các acid amin, peptic, muối amôn (NH4H2PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4, NH4Cl …) chúng không sử dụng được nitơ dưới dạng muối nitrate, nitrite. Các nguyên tố khoáng như: Mn, Zn, Mo, Cu, Ni, Cl, Na, Si, O, Mg…rất cần thiết trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật mặc dù chỉ với hàm lượng nhỏ. Chúng tham gia vào chu trình enzyme, hoặc là các yếu tố tăng trưởng. 4.4.2 Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến quá trình phát triển và lên men của nấm men. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men nằm trong khoảng 25-280C. Nếu lên men ở nhiệt độ thấp (t0360C) thì nấm men bị ức chế và lên cao hơn thì nấm men chết dần, thuận lợi cho vi khuẩn sinh acid acetic, tạo nhiều ester, aldehyde và tổn thất rượu. Trong giới hạn nhiệt độ nấm men hoạt động được, lên men ở nhiệt độ thấp (18-220C) thường cho kết quả tốt hơn lên men ở nhiệt độ cao vì: nhiệt độ lên men thấp sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn và nấm men dại, thời gian kéo dài, hiệu suất chuyển đường thành rượu cao hơn và quá trình tạo hương cho sản phẩm cũng tốt hơn, do hương thơm tạo thành khuếch tán sâu vào trong dung dịch. 4.4.3 pH của môi trường Nồng độ H+ của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của nấm men, chúng có khả năng thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong một môi trường pH nhất định. Đối với các loại nấm men để sản xuất rượu vang, pH thích hợp nhất để chúng hoạt động là từ 4 đến 6. Tuy nhiên, khi lên men dịch quả chua thì pH từ 2,8-3,8 nấm men vẫn có thể hoạt động được. Nếu pH thấp hơn thì nấm men có thể thay đổi hình thái, tế bào nhỏ hơn, khả năng lên men của nấm men sẽ giảm. 4.4.4 Nồng độ cồn Cồn etylic là sản phẩm chính được tạo thành của quá trình lên men rượu từ đường nhưng đồng thời có thể ức chế sự sinh trưởng của nấm men, khi nồng độ cồn tăng lên 5% thể tích thì sự sinh sản bắt đầu ngưng trệ, nếu nồng độ rượu tiếp tục tăng lên đến 7-8% thể tích thì bắt đầu giảm lên men và chuyển sang giai đoạn lên men yếu. Ảnh hưởng nồng độ cồn etylic vào các loại nấm men không giống nhau. Đa số loại nấm men ở nhiệt độ tối ưu chịu được độ cồn khoảng 14-16% thể tích. Bảng 4.1: Ảnh hưởng của độ rượu đến hoạt động của nấm men Loài nấm men Độ rượu cực đại nấm men có thể tồn tại (%V) Saccharomyces oviformis 18-19 Saccharomyces ellipsoideus 18 Saccharomyces pasterrianus 10 Nấm men rượu vang 18-19 Nấm men dại 4-5 . 4.4.5 Nồng độ các khí trong dịch lên men Nồng độ khí O2 Nấm men Saccharomyces lên men rượu vang là loại vi sinh vật kỵ khí tùy tiện. Khi trong môi trường đủ lượng oxi, nấm men phân hủy đường tạo năng lượng và tăng sinh khối. Khi thiếu oxi nấm men sẽ lên men chuyển đưởng thành rượu và CO2 tạo năng lượng để duy trì hoạt động sống. Việc cung cấp oxi cần thiết cho nấm men trong giai đoạn tăng sinh khối. Tuy nhiên, độ thoáng khí của môi trường rất bất lợi cho quá trình lên men rượu. Khi chuyển sang giai đoạn lên men, môi trường phải yếm khí hoàn toàn, sự phát triển của nấm men hầu như không có, sự lên men tạo cồn mạnh mẽ. Nếu môi trường đang lên men được cung cấp oxi thì quá trình lên men sẽ bị ức chế, nấm men sẽ chuyển sang giai đoạn hô hấp hiếu khí. Đây là hiệu ứng Pastuer kìm hãm sự lên men rượu dưới ảnh hưởng vủa oxi. Nồng độ khí SO2 So với các loài vi sinh vật khác, nấm men rất bền với SO2. Vì vậy người ta thường sử dụng SO2 trong sản xuất rượu vang nhằm để ức chế và tiêu diệt một số vi khuẩn bất lợi cho quá trình lên men (vi khuẩn lactic, acetic). Tuy nhiên, nồng độ SO2 thì lại gây ức chế cho quá trình lên men. Theo N.K.Mogilauski, hàm lượng SO2 trong môi trường lên men cao sẽ kéo dài thời gian lên men. Cụ thể như sau: Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ SO2 đến thời gian lên men Nồng độ SO2 trong dịch lên men Thời gian lên men(giờ) 50 18-24 75 48-72 100 120-144 1000-1500 8000-8700 Nồng độ CO2 CO2 tạo thành trong quá trinh lên men rượu thì một phần nhỏ hòa tan vào trong môi trường, một phần tách lên trên bề mặt của môi trường và tích tụ lại tạo thành một lớp ngăn cách giữa không khí bên ngoài thiết bị và dịch lên men. Lượng CO2 tích tụ trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men chứ không làm yếu khả năng lên men. Nấm men bắt đầu sinh sản yếu ở nồng độ CO2 là 0.25% và thực sự ngừng sinh sản ở nồng độ 1.5%. 4.4.6 Các vi khuẩn có hại cho nấm men Ngoài nấm men trong nước quả còn có nhiều loại vi khuẩn. Với nấm men chúng sẽ tạo sự chuyển hóa có ích cho nước quả và quá trình làm rượu, còn vi khuẩn thì thường là tác động đến các thành phần của nước quả hoặc của rượu sinh ra và chuyển thành các chất có hại cho rượu vang. Chẳng hạn như vi khuẩn lactic phân hủy acid malic, acid tartric, đường và glycerin làm cho rượu có vị chua, vị đắng và mùi hôi,… và vi khuẩn acetic chuyển cồn thành acid acetic và biến rượu vang thành giấm. Tuy nhiên vi khuẩn lactic cũng có điểm lợi là chúng lên men malolactic để làm giảm độ chua của rượu dịu bớt đi. Dịch lên men không chỉ là một môi trường dinh dưỡng tốt cho nấm men mà còn cho các vi sinh vật khác. Trong nước, trong không khí cũng như các nguồn nguyên liệu tham gia vào thành phần môi trường luôn chứa một lượng vi sinh vật có hại cho lên men rượu. Trong điều kiện lên men rượu thường gặp nhất các loại vi sinh vật sau đây: Vi khuẩn lactic: Đây là loại vi khuẩn yếm khí, chúng gồm hai loại: lactic điển hình và lactic không điển hình. Lactic điển hình sẽ biến đường thành sản phẩm duy nhất là acid lactic: C6H12O6 2CH3CH(OH)COOH + 18Kcal Vi khuẩn lactic không điển hình sẽ sử dụng đường và tạo ra acid lactic, ngoài ra còn tạo ra một lượng đáng kể các chất khác như: alcol, acid acetic, cacbonic, diacetyl và ceton. Các sản phẩm phụ được tạo ra phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, độ pH, mức độ yếm khí,… Vì vậy các sản phẩm tạo thành không ổn định. Lactic điển hình có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 49 – 510C còn lactic không điển hình có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 37 – 380C. Vi khuẩn acetic: Đây là loại vi khuẩn háo khí không tạo thành bào tử, có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 20 – 350C, tối đa 420C chúng phát triển tốt trong môi trường có alcol thấp, oxy hóa alcol thành acid acetic: C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O + 116 Kcal Trong môi trường không có alcol, vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa đường thành acid gluconic. Ngoài ra chúng còn oxy hóa các alcol khác, ví dụ như dưới tác dụng của vi khuẩn acetic chúng biến alcol butylic thành acid butylic: CH3-CH2-CH2OH CH3-CH2-CH2-COOH Và alcol propylic sẽ biến thành acid propylic: CH3-CH2-CH2OH CH3-CH2-COOH Vi khuẩn lactic thường phát triển trên bề mặt dịch lên men để lâu ngày, trong điều kiện lên men rượu chúng ít có khả năng phát triển vì vi khuẩn này rất hiếu khí. Vi khuẩn butylic và các vi sinh vật khác: Nếu lấy dịch quả chưa lên men đem cấy trên hộp đĩa petri trong môi trường thích hợp sẽ phát triển nhiều vi khuẩn có khả năng tạo bào tử. Chúng gồm vi khuẩn butylic, aceton butylic, subtilis,… nhưng điều kiện lên men rượu, tất cả các vi khuẩn này không phát triển vì pH tối thích của chúng đều nằm trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu. Vì vậy nhiễm khuẩn chủ yếu trong lên men rượu là vi khuẩn lactic. Nhìn chung, các loại vi khuẩn thường là có hại cho quá trình làm rượu, do đó khi lên men rượu vang (nhất là lên men không xác quả) không có chứa nhiều chất tannin thì người ta thường tìm cách ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn đi. Những biện pháp có thể là: điều chỉnh pH thấp, sử dụng SO2, thanh trùng… Nhằm mục đích tránh những hư hỏng cho rượu vang trong giai đoạn sau này [5]. 4.5 Tiêu chuẩn cảm quan đánh giá chất lượng rượu vang quả [6,tr.39-40] Đánh giá cảm quan là kỹ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để nhận biết, mô tả và định lượng các tính chất cảm quan của một phẩm như màu sắc, hình thái, mùi, vị và cấu trúc. Ở đây chúng tôi sử dụng phương pháp cho điểm chất lượng tổng hợp của sản phẩm để đánh giá về chất lượng cảm quan của sản phẩm rượu Bưởi. Phương pháp đánh giá dựa vào phương pháp cho điểm được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của một sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, mùi, vị và trạng thái. Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm. Giá trị điểm tăng theo mức tăng của chất lượng sản phẩm. Do các chỉ tiêu có vai trò đối với chất lượng chung của sản phẩm ở mức khác nhau nên các giá trị cho được đối với mỗi chỉ tiêu được nhân thêm một giá trị tương ứng gọi là hệ số trọng lượng. Các chỉ tiêu có vai trò lớn hơn thì có hệ số trọng lượng cao hơn. Tổng điểm của các chỉ tiêu là điểm chất lượng của sản phẩm. Điểm này quyết định mức chất lượng của sản phẩm được đánh giá . Bảng 4.3: Bảng điểm đánh giá các chỉ tiêu của sản phẩm rượu Bưởi (TCVN 3217 – 79) Tên chỉ tiêu Điểm chưa có trọng lượng Yêu cầu Độ trong và màu sắc 5 Trong, không vẩn đục, màu vàng nhạt sáng, màu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm. 4 Trong, không vẩn đục, màu vàng nhạt. 3 Trong, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm, màu vàng. 2 Hơi đục, màu không đặc trưng cho sản phẩm, màu vàng sậm. 1 Đục nhiều, lắng cặn, màu không đặc trưng cho sản phẩm, màu vàng sậm đen. 0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng, có xuất hiện màu lạ Mùi 5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm. 4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm nhưng hơi khó nhận thấy. 3 Hơi nồng, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm. 1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm. 0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng. Vị 5 Hòa hợp, yêm dịu, hậu vị tốt, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm. 4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vị vừa phải, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm bình thường. 3 Chưa hòa hợp, hơi gắt và sốc, hậu vị yếu, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Đắng, sốc, thoảng vị lạ, ít đặc trưng cho sản phẩm. 1 Đắng, sốc, không đặc trưng cho sản phẩm. 0 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm hỏng. Rượu Bưởi được đánh giá cảm quan qua 4 chỉ tiêu với các hệ số trọng lượng như sau: Bảng 4.4: Hệ số trọng lượng của các chỉ tiêu Chỉ tiêu Hệ số trọng lượng Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2 Ngoài ra, đánh giá chất lượng rượu còn đánh giá về: Đánh giá chất lượng vi sinh. Đánh giá chất lượng hóa sinh. Đánh giá hàm lượng vitamin. Các chỉ tiêu về nồng độ cồn, chất khô, đường, axid. PHẦN III. KẾT LUẬN Đề tài “ Nghiên cứu quy trình lên men rượu từ Bưởi” đã góp phần đa dạng hóa các sản phẩm rượu trái cây. Đồng thời Bưởi là 1 trái cây rất phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt là khi vào mùa bưởi (khoảng tháng 7,8,9 âm lịch) giá thành Bưởi sẽ rất thấp, có thể tận dụng nguồn nguyên liệu này để sản xuất ra loại rượu Bưởi có giá thành thấp hơn các loại rượu trái cây khác, mà vẫn đáp ứng được các chỉ tiêu về vi sinh, cảm quan, chất lượng.... Góp phần giúp làm tăng thêm giá trị sử dụng của loại quả này. Nước ép Bưởi lên men rất nhẹ , nồng độ khoảng 80C nên phụ nữ trẻ em, người già đều dùng được. Là sản phẩm đặc sản cô đặc từ bưởi nguyên chất nên có thể dùng để sử dụng hoặc làm quà biếu cho người thân trong diệp lễ tết là rất tốt. Rượu Bưởi sản xuất để càng lâu uống càng ngon , càng bỗ dưỡng vì nó lên men chuyển hóa hoàn toàn từ chất khó hấp thụ sang dễ hấp thụ qua cơ thể. Khi thưởng thức, nó cho ta một hương vị ấm áp và thanh ngọt. Rượu Bưởi có tác dụng chữa đầy hơi, ăn khó tiêu, nhức mõi, … ngoài ra còn có nhiều công dụng khác. Như vậy từ những lợi ích mà trái Bưởi mang lại, thông qua đề tài này tôi mong muốn sẽ có thêm nhiều công trình nghiên cứu liên quan tới rượu Bưởi hơn nữa, để góp phần hoàn thiện hơn trong công nghiệp sản xuất rượu Bưởi, ngày càng nâng cao chất lượng của sản phẩm, đáp ứng nhu cầu cao của con người.