Khóa luận Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối và hàm lượng β-Glucan ở một số chủng nấm hương nuôi cấy trong môi trường lỏng

n lên đến kích thước đường kính 1,0 - 2,0 mm. Sau quá trình tiếp hợp giữa hai sợi nấm sơ cấp đơn nhân sẽ hình thành nên các sợi nấm thứ cấp song nhân. Các sợi nấm tăng trưởng theo kiểu tạo ra các móc (clamp) và để lại dấu vết giữa các tế bào. Khi gặp điều kiện bất lợi các sợi nấm song nhân có thể tạo ra các bào tử màng dày (bào tử áo – chlamydospore) giúp sợi nấm sống sót qua các trường hợp bất lợi này. Bào tử màng dày khi điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm tạo ra những sợi nấm mới. Khi sợi nấm thứ cấp đã phát triển dày đặc trên cơ chất sẽ bắt đầu quá trình phân hóa để tạo ra quả thể. Trước khi ra quả thể thì hệ sợi nấm Hương này phát triển sinh khối đến mức tối đa chuẩn bị cho quá trình ra quả thể. 2.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Hương Nấm Hương ngoài sử dụng trực tiếp nguồn xenlulô còn cần thêm nitơ. Đạm thích hợp cho nấm chủ yếu ở dạng hữu cơ như: pepton, axit amin, urê và nhiều loại muối amôni. Nấm Hương không thể sử dụng đạm vô cơ như: nitrat hay nitrit. Nồng độ thích hợp cho sự tăng trưởng của hệ sợi như là: Sulfat ammon 0,03% hay Tartrat ammon 0,06% tùy thuộc vào nguồn đạm cung cấp. Nhưng nếu nồng độ đạm cao hơn 0,02% như với sulfat ammon sẽ ức chế sự phát triển của thể quả. Sự hình thành thể quả cần có đường và đạm. Yêu cầu đối với nồng độ đường phải cao, tối thiểu là 8% đối với đường saccharose. Nhu cầu dinh dưỡng khoáng của nấm Hương như: Mn, Fe, Zn cần 2mg/l. Ngoài ra còn cần Mg, S, K, P để thúc đẩy sự tăng trưởng của nấm. Để sợi nấm phát triển tốt nhất cần bổ sung thêm vitamin B1 với lượng 100µg/l. Giá trị pH thích hợp cho sợi nấm phát triển trong môi trường lỏng là 4,5 - 5,0. Ở pH 8, nấm mọc rất chậm [2]. Nấm Hương mọc ký sinh trên những cây có lá to và thay lá mỗi mùa như dẻ, sồi, phong. Nấm Huơng thích hợp với khí hậu ôn đới, ưa ẩm. Các thông số môi trường cơ bản cho sự phát triển của nấm Hương [22]: Nhiệt độ sợi nấm phát triển tốt nhất là 24 - 260C. Nhiệt độ quả thể nấm hình thành và phát triển khoảng 15 - 160C. Độ ẩm cơ chất: 65 - 70%. Độ ẩm không khí: ≥ 80%. Độ pH trung tính. Ánh sáng không cần thiết trong giai đoạn sợi nấm phát triển. Giai đoạn hình thành quả thể cần ánh sáng khuếch tán. Độ thông thoáng trung bình. 2.1.3. Giá trị dinh dưỡng của nấm Hương Nấm Hương có giá trị dinh dưỡng cao. Trong 100g nấm Hương khô (phần ăn được) có chứa 13g nước, 19g prôtêin, 1,8g lipit, 54g hydrat cacbon, 7,8g chất xơ, 4,9g chất khoáng. Vitamin trong nấm Hương cũng rất phong phú: vitamin B1, B2, B12, vitamin PP, provitamin D. Ngoài ra trong nấm Hương chứa đầy đủ các loại axít amin, có tới 9 loại axít amin không thay thế (Izôlơxin, Lơxin, Lixin, Mêthiônin, Phênylalanin, Valin, Tyrozin, Trytophan, Alanin). Hơn nữa trong nấm Hương và hệ sợi nấm Hương có tới 40 loại enzym, một số enzym đáng chú ý như là enzym β (1-3) glucozidaza, kitinaza, lipoidaza, ligninaza, pepsin, loxintinaza, pectinaza, saccaraza, transferaza, hemixenlulaza, amylotransferaza, inulaza, glycozidaza, insulinaza, asparaginaza, peroxydaza, lactaza, tyrozin oxydaza…[2, 21]. Theo Mizuno yếu tố tạo nên hương thơm, vị ngon của nấm là monosodium glutamate, nucleotit, amino axit tự do, chuỗi peptit, axit hữu cơ (axit malic, axít fumalic, axít glutaric, axít oxalic, axít lactic,… ) và đường [16]. 2.2. HOẠT CHẤT β-GLUCAN 2.2.1. Định nghĩa β-glucan là một polysaccarit của D-glucose với các liên kết glicozit. β-glucan là một nhóm các phân tử glucan khác nhau ở khối lượng phân tử, tính hòa tan, độ nhớt và cấu hình trong không gian. β-glucan thường có trong thành tế bào thực vật, hạt ngũ cốc, nấm men, nấm và vi khuẩn. Trong tự nhiên β-glucan có nhiều trong nấm như là nấm Sò, nấm Hương... [14]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-glucan với liên kết (1,3/1,6) có hoạt tính sinh học cao hơn β-glucan với liên kết (1,4/1,6). Sự khác nhau giữa các mối liên kết và cấu trúc hóa học β-glucan sẽ ảnh hưởng đến tính hòa tan, hoạt động và hoạt tính sinh học của chúng. β-glucan càng phân nhánh mạnh hoạt tính sinh học càng cao [14]. Bảng 2.1. Một số loại β-glucan Name Tên Glycosidic Linkage Liên kết Glicozit Notes Ghi chú cellulose cellulose β-1,4 β-1, 4 curdlan curdlan β-1,3 β-1, 3 laminarin laminarin β-1,3 and β-1,6 β-1, 3 và β-1, 6 chrysolaminarinchrysolaminarin β-1,3 β-1, 3 lentinan lentinan β-1,6:β-1,3 β-1, 6: β-1, 3 isolated from Lentinus edodesđược tách chiết từ edodes Lentinula lichenin lichenin β-1,3 and β-1,4 β-1, 3 và β-1, 4 pleuran pleuran β-1,3 and β-1,6 β-1, 3 và β-1, 6 isolated from Pleurotus ostreatus được tách chiết từ ostreatus Pleurotus zymosan zymosan β-1,3 β-1, 3 Hình 2.1. Liên kết β-1,3 glicozit và β-1,6 glicozit Hình 2.2. Liên kết β-1,3; glicozit β-1,6 glicozit và β-1,3:β-1,6 glicozit của phân tử β-glucan 2.2.2. Hoạt tính sinh học của β-glucan 2.2.2.1. Hoạt tính chống ung thư Tháng 12/1985 Công ty Ajinomoto, Yamanouchi và Morishita đã tách chiết β-glucan từ hệ sợi nấm Hương và đã tạo ra chế phẩm như là một dược phẩm chống ung thư, đặc biệt là ung thư dạ dày có hiệu quả cao. Cơ chế cơ bản là tăng cường miễn dịch, nâng cao khả nǎng của đại thực bào, một trong những tế bào quan trọng nhất của hệ thống miễn dịch và giết chết tế bào ung thư [16]. Hầu hết các phân đoạn polysaccarit tách từ nấm Hương có hoạt động kích thích đại thực bào, gia tǎng yếu tố tạo protein pha cấp tính (APPIF), yếu tố gây giãn mạch và xuất huyết (VDHIF), yếu tố tạo IL - 1 (IL - 1PF), IL - 3 và yếu tố kích thích quần thể (CSF). Các yếu tố này đều xuất hiện, đạt tới cực đại chỉ sau vài giờ cho uống hoặc tiêm lentinan. Do vậy hiệu lực chống ung thư thực nghiệm sarcoma 180 rất rõ ràng [7]. Các dòng tế bào ung thư khác cũng đã được kiểm tra có kết quả rất thuyết phục. Trên lâm sàng, lentinan đã được kiểm tra kỹ về hoạt tính chống ung thư, đặc biệt hầu như không có tác dụng phụ, do đó được áp dụng như một trị liệu pháp có hiệu quả cao cho các bệnh nhân ung thư. Nhìn chung, trong những trường hợp ung thư đường dạ dày - ruột, kể cả đến giai đoạn 3, kết quả vẫn rất khả quan. Trị liệu phối hợp giữa lentinan với tegafur uracil làm tǎng thời gian sống hơn nhiều so với chỉ dùng tegafur uracil đơn độc. Trường hợp ung thư dạ dày, mức sống sau 1, 2 và 3 nǎm sau khi uống tegafur uracil tǎng chỉ cỡ : 2,9% và 0%. Trong khi các bệnh nhân tiêm dưới da thêm lentinan, mức 1mg 2 lần/tuần hoặc 2mg 1 lần/tuần, đạt mức sống tương ứng là 19,5%, 10,4% và 6,5% [7]. Kết quả tương tự cũng đạt được trong các ca ung thư ruột già. 2.2.2.2. Hoạt tính chống virus, vi khuẩn β-glucan và các dẫn xuất của nó có tác dụng chống virus, vi khuẩn và ký sinh trùng thông qua sự tăng cường các phản ứng miễn dịch bằng cách gia tăng số lượng, kích thước, khả năng của đại thực bào, tăng cường hoạt động của lymphocyte T và B, về thực chất cũng giống với cơ chế chống ung thư. Gần đây các nhà nghiên cứu tại Trường Đại học Y ở Yamaguchi Nhật Bản đã thông báo rằng Lentinan có hiệu ứng “ bảo vệ” (protective effect). Đó là ức chế sự phá hủy tế bào bình thường do ảnh hưởng của virus HIV. Trên lâm sàng đã cho thấy khi sử dụng Lentinan cùng với hợp chất AZT (azido-Thymidine) có thể ngăn chặn virus HIV cao hơn chỉ sử dụng AZT đơn độc đồng thời giảm độc tính của AZT, đặc biệt sulphat lentinan ức chế rất mạnh hoạt tính của reverse transcriptase (enzym sao chép ngược của HIV) [21]. Lentinan còn có khả năng giúp những người bị lao phổi chống lại độc tố của vi khuẩn lao. Nếu sử dụng Lentinan 1g/ngày, mỗi tuần 2 lần thì có thể ngăn chặn hoàn toàn độc tố của vi khuẩn lao trong cơ thể [3, 20]. 2.2.2.3. Hoạt tính kháng sinh Vi sinh vật có thể gây bệnh theo hai cách sau: Một là chúng gây viêm bằng cách phá hủy các mô xung quanh. Hai là vi khuẩn sinh ra các độc tố. Các nhà khoa học đã khẳng định Lentinan kích hoạt việc tăng sản xuất các yếu tố huyết thanh khác nhau liên quan đến miễn dịch và sự gây viêm. Sudirman et al. (1996) đã kiểm tra khả nǎng kháng khuẩn của các chủng nấm shiitake trồng ở Indonesia, chống Rigidoporus lignosus (vi nấm gây mục trắng cây cao su), Bacillus subtilis,... [3]. Chihara [7] đã chứng minh khả năng của Lentinan trong kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm bệnh và ký sinh trùng. Đặc biệt, Lentinan làm giảm mạnh ảnh hưởng trong hóa trị liệu lao, chống bội nhiễm khuẩn ở các bệnh nhân HIV. 2.2.3. Ứng dụng của β-glucan Ứng dụng của β-glucan trong thực phẩm: β-glucan trong tự nhiên rất sạch, có khả năng giữ nước cao, không tạo gel, không bị phân hủy bởi enzym tiêu hóa ở người, vì vậy chúng thích hợp như một nguồn xơ thực phẩm. Khi β-glucan đi qua ruột già, nó bị phân hủy một phần bởi hệ vi khuẩn ruột mà không làm mất tính giữ nước của chúng. Quá trình lên men này tạo ra các chuỗi axít béo ngắn (chủ yếu là acetat, propionat, butyrat) có lợi cho tế bào nhầy lót ruột. Dung tích giữ nước của β-glucan lớn hơn rất nhiều so với những chất xơ thực vật và hạt khác. Do đó, β-glucan được sử dụng làm phụ gia thực phẩm để tăng sự tiêu hóa và chữa rối loạn tiêu hóa [6]. Đặc biệt với hoạt tính sinh học cao β-glucan đang được ứng dụng nhiều trong sản xuất thực phẩm chức năng. Ứng dụng của β-glucan trong y dược: Nhiều nghiên cứu đã cho thấy β-glucan có tác động lên hệ thống miễn dịch thông qua cơ chế kích thích đại thực bào, nâng cao khả năng của đại thực bào hoặc tạo ra các chất trung gian hoạt hóa oxy và các nhân tố khác giết chết vật thể lạ. Trên lâm sàng β-glucan được sử dụng trong hỗ trợ điều trị ung thư. Đối với bệnh nhân ung thư phải điều trị bằng hóa chất hoặc chiếu xạ β-glucan có khả năng tăng nhanh sự phục hồi máu khi chiếu xạ, kích thích sự phục hồi tủy xương sau hóa trị liệu và ngăn cản biến chứng nhiễm bệnh trong quá trình điều trị. Bên cạnh đó, β-glucan còn có hiệu quả kháng khối u, giảm kích cỡ khối u [6, 7]. Ứng dụng của β-glucan trong mỹ phẩm: β-1,3-glucan còn có khả năng cảm ứng hoạt tính của tế bào Langerhans khi bôi lên da. Tế bào Langerhans là một loại tế bào đại thực bào chuyên hóa nằm trên da hoạt động tương tự như đại thực bào. β-1,3-glucan làm se lỗ chân lông, giảm số lượng, độ sâu, độ dài của nếp nhăn, cảm ứng tổng hợp collagen và elastin, giảm màu đỏ, giảm kích thích và sự khô da, giảm số lượng và kích cỡ tổn thương trên da. β-1,3-glucan có thể thêm vào kem bôi da, mỹ phẩm thuốc mỡ, kem cạo râu và nói chung là các sản phẩm tiếp xúc trực tiếp với da [6]. Ứng dụng của β-glucan trong nuôi trồng thủy sản: Tôm sú là mặt hàng xuất khẩu chủ lực của nhiều nước châu Á, trong đó có Việt Nam. Nhưng các loại bệnh virus và vi khuẩn ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng tôm và dẫn đến ảnh hưởng tới kinh tế hộ nông dân nói riêng, kinh tế đất nước nói chung. Có một số nghiên cứu sử dụng β-glucan như một chất kích thích hệ thống miễn dịch tiềm năng trong nuôi trồng thủy sản [6]. Chang cheng-Fang và cs.(2000) đã nghiên cứu hiệu quả của β-1,3-glucan lên sự sống sót của tôm sú lớn (Penaeus monodon). Tôm được bổ sung β-1,3-glucan (2g/kg trọng lượng) trong 40 ngày. Kết quả nhận được cho thấy lượng tôm sống sót trong lô có bổ sung β-1,3-glucan cao hơn hẳn (p<0,001) so với lô đối chứng [6]. Kết quả thí nghiệm của Rostad Gunnar và cs.(1995) cho thấy khi bổ sung β-glucan vào thức ăn hàng ngày của cá hồi Atlantic (Salmo salar) với hàm lượng 1g/kg thức ăn trong 12 tuần trước khi nhiễm nguồn bệnh, lượng cá sống sót tăng lên rất nhiều [6]. 2.2.4. β-glucan trong nấm Hương Trong nấm Hương chứa một lượng β-glucan, tên là Lentinan. Lentinan là một β-glucan có chứa các liên kết glicozit β-1,3: β-1,6. Lentinan là một polysaccarit không chứa nitơ, trọng lượng phân tử xấp xỉ 500 000 Da [14]. Lentinan được chiết suất từ thể quả cũng như từ sinh khối sợi nấm. Hình 2.3. Công thức cấu tạo Lentinan β-D-glucopyranosyl-(1→6)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranose Lentinan là hợp chất quan trọng của hệ sợi nấm Hương cũng như của thể quả nấm. Lentinan tạo nên các tính chất dược lý của nấm Hương. Các nhà nghiên cứu đã ghi nhận rằng Lentinan có khả năng tăng cường các phản ứng miễn dịch, có tính chất chống ung thư mạnh, có tác dụng chống virus, tính kháng sinh [20,21]. Theo nghiên cứu của Manzi và Pizzoferrato (1999) về hàm lượng β-glucan chứa trong một số loại nấm ăn thì trong nấm Hương (Lentinula edodes) lượng β-glucan khoảng 0,22g/100g chất khô, trong nấm Sò (Pleurotus ostreatus) là khoảng 0,30g/100g chất khô, trong nấm Sò vua (Pleurotus eryngii) là khoảng 0,32g/100g chất khô, trong nấm Sò xám (Pleurotus pulmunarius) là khoảng 0,53g/100g chất khô. Như vậy, hàm lượng β-glucan có trong các loại nấm ăn dao động trong khoảng 0,22g – 0,53g/100g chất khô [19]. 2.2.5. Các phương pháp tách chiết β-glucan Bản chất β-glucan là một polysaccarit do đó các phương pháp tách chiết β-glucan cũng dựa trên nguyên lý chung tách chiết các polysaccrit. Cơ bản có 2 phương pháp tách chiết β-glucan là phương pháp hóa học và phương pháp enzym. - Phương pháp hóa học: thường sử dụng dung môi natri hydroxide (NaOH) hay kali hydroxide (KOH), hoặc natri hydro cacbonat (NaHCO3), hoặc natri cacbonat (Na2CO3) để chiết β-glucan. Sau đó tiến hành ly tâm thu hồi và tinh chế. Phương pháp hóa học thích hợp với các mẫu phân tích chứa lớn hơn 20% glucan tổng số. Theo nghiên cứu của Mỹ các phương pháp này đạt hiệu suất thu hồi 50-80%, quy trình đơn giản, không tốn kém tuy nhiên thời gian tách chiết lâu [24]. - Phương pháp enzym: sử dụng enzym β-1,3-glucanase để tách chiết β-glucan sau đó tiến hành tinh chế. Phương pháp enzym thích hợp với các mẫu phân tích có chứa hàm lượng β-glucan thấp. Phương pháp này đạt hiệu suất thu hồi hơn 80%, thời gian tách chiết ngắn nhưng yêu cầu về thiết bị hiện đại, chi phí cao [17]. 2.3. MỘT SỐ SẢN PHẨM THƯƠNG MẠI TỪ NẤM HƯƠNG Ngoài sản phẩm nấm Hương tươi, hiện nay còn một số sản phẩm từ nấm phổ biến như sau: - Thể quả thu hái tự nhiên được sấy khô, hoặc nghiền thành bột mịn rồi đóng viên con nhộng hay viên nén. - Bột thể quả nấm nuôi trồng nhân tạo. - Dịch chiết thu được do chiết nước nóng hay chiết bằng ethanol từ bột thể quả, dịch chiết cô đặc. - Các chế phẩm sấy khô và nghiền mịn từ giá thể hỗn hợp gồm hệ sợi nấm, giống nấm và môi trường rắn ăn được (thường là hạt). - Sinh khối hoặc dịch chiết từ sinh khối sợi nấm hoặc từ môi trường lên men. - Chế phẩm LEM (Lentinula Edodes Mycelium): chiết suất từ hệ sợi nấm Hương lên men giá thể bã mía. LEM được tách chiết từ hệ sợi nấm, ở dạng bột. Trong 1 kg bột chứa 6-7g LEM. - Chế phẩm LAP là dung dịch hệ sợi nấm Hương + 4 lần thể tích ethanol. LAP ≈ 0,3g LEM. Các sản phẩm trên được thấy phổ biến ở các nước có ngành công nghiệp nấm phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ [4, 5]. 2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT NẤM HƯƠNG 2.4.1. Tình hình ngoài nước Nấm Hương được nuôi trồng nhân tạo tại Trung Quốc từ cách đây trên 1000 năm tức là từ thời Bắc Tống (960 - 1127). Đầu thế kỷ XX nấm Hương đã được nuôi trồng nhân tạo ở quy mô công nghiệp tại Nhật, Pháp, Mỹ. Gần đây Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên là những nước trồng nhiều nấm Hương nhất trên thế giới. Tổng sản lượng hàng năm đạt trên 1 triệu tấn. Sản phẩm nấm được sử dụng chủ yếu ở dạng tươi và sấy khô. Các nước này còn phát triển sản xuất sinh khối sợi nấm Hương và đang cung cấp cho thị trường trong và ngoài nước một số sản phẩm dạng bột và dạng lỏng rất có giá trị về dinh dưỡng và phòng trị bệnh. Đặc tính làm lành vết thương của nấm đã được biết đến từ hàng ngàn năm nay, với báo cáo đầu tiên về khả năng y học của chúng được đánh dấu khoảng 3000 năm trước, mặc dù đặc tính này do một số thành phần khác nhau của nấm nhưng β-glucan lôi kéo sự chú ý hơn cả. Năm 1969 các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh rằng nấm Hương có chứa một loại polysaccarit tên là Lentinan. Chất này có tác dụng nâng cao tính miễn dịch của cơ thể và có tác dụng chống khối u [1]. Người ta đã phát hiện ra rằng hiệu lực kháng khối u của glucan là kêt quả kích thích tế bào miễn dịch chứ không phải là độc tính trực tiếp của glucan đối với tế bào khối u. Từ đầu những năm 1970, một số viện nghiên cứu ở Nhật Bản đã thử tách chiết β-glucan từ nấm lớn và nó trở thành hướng nghiên cứu chính ở Nhật Bản. Trong 50 năm qua, rất nhiều nhà khoa học và viện nghiên cứu đã góp phần to lớn vào việc định loại. tách chiết, định lượng, định tính các thành phần khác nhau của β-glucan. Các nhà khoa học và các bác sỹ trong nhiều lĩnh vực ngày càng chú ý hơn đến việc sử dụng β-glucan để giải quyết nhiều vấn đề liên quan đến đáp ứng miễn dịch [1]. Có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến hoạt tính sinh học của β-glucan nhưng kết quả đôi khi trái ngược nhau. Điều này chủ yếu là do sử dụng β-glucan có trọng lượng phân tử khác nhau và sự thay đổi hóa học do β-glucan được nhận từ các nguồn nấm khác nhau. Hiệu quả miễn dịch của β-glucan phụ thuộc vào mức độ phân nhánh của phân tử, độ dài của polyme và cấu trúc bậc 3 của nó [6]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-glucan có nhiều trong nấm như là nấm Linh Chi, nấm Sò, nấm Hương, nhiều nhất là trong thành tế bào nấm men bánh mỳ. β-glucan trong yến mạch và lúa mạch có rất ít hoặc không có hoạt tính. Nhưng trong nước của yến mạch có thể giảm nguy cơ bệnh tim [6]. Do những giá trị dinh dưỡng và tác dụng phòng, chữa bệnh của nấm Hương cũng như hệ sợi nấm Hương đem lại nên gần đây các nhà khoa học trên thế giới đang ngày càng chú ý đến việc nghiên cứu thu sinh khối sợi nấm, vì điều kiện phát triển hệ sợi không yêu cầu khắt khe như nuôi lấy thể quả, thời gian nuôi cấy lại rút ngắn. Đã có một số nghiên cứu trong và ngoài nước tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp và công nghiệp chế biến để làm giá thể nuôi cấy nấm trên môi trường rắn và lỏng. Điều này có ý nghĩa rất lớn vừa giảm thiểu được ô nhiêm môi trường vừa tạo ra được thực phẩm. 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Từ lâu nấm Hương rất quen thuộc đối với người Việt Nam. Tuy nhiên việc ươm trồng loại nấm này ở nước ta vẫn chưa được phát triển nên phần lớn nấm được sử dụng ở dạng quả thể nấm khô nhập khẩu từ Trung Quốc. Có thể tìm thấy nấm Hương dạng quả thể khô ở khắp các siêu thị ở nước ta, và có bán trên thị trường do nhu cầu sử dụng rộng rãi của người dân. Hiện nay có một số tỉnh trồng nấm Hương với quy mô nhỏ vì còn phù thuộc vào điều kiện thời tiết, nó chỉ hợp với với nhiệt độ vào mùa đông ở miền Bắc nước ta. Một số tỉnh triển khai trồng nầm như: Cao Bằng, Hà Giang, Lạng Sơn, Lào Cai … Các nghiên cứu liên quan đến công nghệ trồng nấm Hương từ trước đến nay chủ yếu là dạng truyền thống tức là sử dụng giá thể rắn để trồng nấm thu quả thể. Hiện nay chưa có một công bố kết quả nghiên cứu liên quan đến sản xuất sinh khối sợi nấm. Các nghiên cứu về tách chiết hoạt chất nấm cũng không nhiều, chủ yếu tập trung trên nấm dược liệu như nấm Linh Chi. Năm 2000, Phòng Công nghệ sinh học và Kỹ thuật hạt nhân Đà Lạt Trường Đại học Tây Nguyên đã công bố kết quả lên men dịch thể hệ sợi nấm Hương. Kết quả cho thấy có thể thu sinh khối thuần khiết với hiệu suất cao sau 20-30 ngày nuôi cấy, tùy theo thể tích bình lên men và điểu kiện sục khí [3]. Nghiên cứu đã mở ra hướng phát triển về nuôi cấy nấm trong môi trường lỏng. Gần đây các nghiên cứu liên quan đến hoạt chất sinh học, sản xuất thực phẩm chức năng đang ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Năm 2005 Nguyễn Thị Chính và CS đã tiến hành các nghiên cứu về công nghệ sản xuất nấm dược liệu, bao gồm các nghiên cứu về nấm Hương như là nghiên cứu đặc tính sinh học và công nghệ nuôi trồng nấm Hương, hoạt tính kháng sinh của Lentinula edode. Nghiên cứu gần đây về β-glucan là tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men của viện Công nghiệp Thực phẩm (2005). Điều này cho thấy nhu cầu ngày càng lớn về thực phẩm chức năng và hướng phát triển của nghành thực phẩm chức năng trong tương lai. 2.5. NUÔI CẤY HỆ SỢI NẤM HƯƠNG TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG 2.5.1. Phương pháp lên men chìm đối với vi sinh vật Khái niệm: Là quá trình nhân nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có sục khí để bổ sung oxy hoặc nuôi tĩnh. Giống vi sinh vật sau khi được cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồi chuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (pha log). Ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt lượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng dần đến khi nhiều có thể trào ra khỏi bình lên men, làm mất bớt dịch và tăng khả năng nhiễm vi sinh vật lạ không mong muốn. Ưu điểm của phương pháp: - Hiệu suất sử dụng không gian cao (ba chiều), lượng hoạt chất được sinh tổng hợp trên thể tích sử dụng cao, hiệu suất lên men cao. - Vì quá trình lên men diễn ra trong lòng chất lỏng nên tránh được nhiễm khuẩn. - Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu đáp ứng được nhu cầu sinh lý của vi sinh vật. - Các thiết bị cơ giới hóa và tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít nhân công. Tuy nhiên kỹ thuật lên men chìm đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật, các thiết bị chịu áp lực và đòi hỏi đảm bảo vô trùng tuyệt đối. Các phương pháp lên men chìm - Lên men gián đoạn: Quá trình này còn gọi là lên men theo mẻ có hoạt động như là một hệ thống đóng kín. Sự phát triển vi sinh vật được phân chia thành 4 pha đặc thù: Pha lag (pha tiềm tàng), pha log (pha lũy thừa), pha dừng, và pha suy tàn. logxx III IV II I t |h| Hình 2.4. Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật (I- Pha lag, II- Pha log, III- Pha ổn định, IV- Pha suy tàn) - Lên men bổ sung: Kỹ thuật lên men bổ sung ứng dụng thích hợp cho các trường hợp sau: Nồng độ cơ chất khá thấp nhưng lại cần ổn định (lên men nấm men). Nồng độ cơ chất cần khá cao và không đổi. Phải bổ sung tiền chất liên tục. 2.5.2. Môi trường nuôi cấy lỏng cho nấm Hương Nuôi cấy nấm Hương trong môi trường lỏng cần chú ý tới nhu cầu dinh dưỡng như sau: - Về nguồn cacbon, nấm Hương có thể đồng hóa rộng rãi nhiều nguồn cacbon khác nhau như đường đơn, đường kép, đường đa (như tinh bột, chất xơ, chất gỗ). - Về nguồn nitơ, nấm Hương có thể sử dụng nitơ hữu cơ như protein, peptit, axit amin hay urê hoặc đạm vô cơ như các muối amôn. Nấm Hương không đồng hóa được nitơ trong nitrat, nitrit. Tỷ lệ C:N trong môi trường ở giai đoạn nuôi sợi nên dùng tỷ lệ 25-40:1. Nhưng tỷ lệ C:N tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm là 30:1. Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Rossi và CS khi sử dụng môi trường rỉ đường thì tỷ lệ C:N là 107:1, còn khi bổ sung thêm 40% cám gạo thì tỷ lệ C:N là 38:1. Theo nghiên cứu này bổ sung cám gạo vào môi trường đến một lượng nhất định thu được kết quả tỷ lệ C:N phù hợp nhất là 30:1 cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [18]. - Về nhu cầu nguyên tố khoáng, ngoài Mg, S, P, K nấm hương còn cần một số nguyên tố khoáng vi lượng như Fe, Zn, Mn…Mỗi lít dung dịch nuôi cấy nên bổ sung thêm khoảng 2mg đối với từng loại Fe, Zn, Mn. Khi nuôi trồng nấm Hương cần lưu ý bổ sung vitamin B1. Các vitamin khác nấm Hương đều có thể tự tổng hợp. Trong 1 lít môi trường nuôi cấy cần bổ sung 100μl vitamin B1. Một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật như gibberellin (GA3), axit indolaxetic (IAA), kinetin (KT)…cũng có tác dụng xúc tiến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [1]. Các môi trường nuôi cấy để nuôi hệ sợi cũng phải có đầy đủ nguồn cácbon, nitơ, chất khoáng… đáp ứng cho nhu cầu phát triển của hệ sợi nấm Hương. 2.5.3. Ảnh hưởng của chủng giống Theo một số kết quả nghiên cứu thấy rằng cùng một loài nấm Hương, nhưng các chủng giống nấm khác nhau tốc độ phát triển của chúng cũng khác nhau. Mata và CS khi nuôi cấy 11 chủng giống nấm Hương trên đĩa Petri với môi trường MEA đã thu nhận được đường kính sợi nấm dao động từ 4,9 đến 7,1cm. Chủng Q616 có đường kính phát triển thấp nhất là 4,9cm, chủng M115 và V084 có đường kính phát triển lớn nhất sau 7 ngày nuôi cấy. Các chủng còn lại có đường kính từ 5,9cm đến 6,8cm [8]. Theo nghiên cứu của De Carvalho thì đường kính phát triển của 2 chủng Lentinula edodes em BDA và Lentinula edodes em SDA trên môi trường thạch là khác nhau. Sau 10 ngày, kết quả đo đường kính phát triển của chúng tương ứng là 9,2cm và 4,5cm [13]. Như vậy các chủng nấm Hương khác nhau thì tốc độ phát triển khác nhau, sinh khối thu được cũng khác nhau và hàm lượng β-glucan chứa trong nó cũng khác nhau. 2.5.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng đối với nấm Hương Nồng độ ôxy: Nấm Hương thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy trong quá trình nuôi hệ sợi nấm Hương nên bổ sung ôxy bằng thiết bị lắc, khuấy hay sục khí. Theo nghiên cứu của Hassegawa trong môi trường nuôi cấy lỏng với sự cung cấp ôxy thông qua chế độ nuôi có lắc và không lắc (nuôi tĩnh) sử dụng môi trường YEM ở nhiệt độ 25oC. Khi nuôi cấy tĩnh chỉ thu được hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tối đa là 4mg/ml. Trong khi nuôi cấy có lắc với tốc độ 150 vòng/phút thì hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tăng lên 5mg/ml [9]. Nhiệt độ môi trường: Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương. Sợi nấm phát triển ở dải nhiệt độ từ 5 đến 35oC nhưng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 20 đến 25oC. Đây là nhiệt độ phù hợp với điều kiện khí hậu ở nhiều vùng của nước ta. Còn dưới nhiệt độ 10oC và trên nhiệt độ 32oC sự sinh trưởng của hệ sợi nấm bị hạn chế. Đến nhiệt độ 35oC sợi nấm bắt đầu ngừng phát triển [1]. Độ pH môi trường: Trong nuôi cấy lỏng, theo nghiên cứu của Hassegawa và CS thì pH tối ưu cho sợi nấm Hương phát triển trên môi trường dung dịch là 4,5 [9]. Cường độ ánh sáng: Ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến quá trình phát triển hệ sợi. Khi nuôi trên môi trường thạch đĩa, thường nuôi ở trong tủ ấm, không có ánh sáng, hệ sợi nấm Hương vẫn phát triển tốt. Đối với nuôi cấy môi trường lỏng (trong thiết bị lên men) thì thường sử dụng nuôi ở ánh sáng phòng hay trong tối [22]. Phần III ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Các chủng nấm Hương nghiên cứu đều do Viện Di truyền nông nghiệp cung cấp. 1. Chủng nấm Hương Ld có nguồn gốc xuất xứ từ Ý. 2. Chủng nấm Hương Lg có nguồn gốc xuất xứ từ Trung Quốc. 3. Chủng nấm Hương Lc có nguồn gốc xuất xứ từ Cao Bằng. 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất tiến hành ` a) Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu - Cân phân tích. - Máy quang phổ tử ngoại – khả biến U-1800 của Nhật Bản. - Máy ly tâm HERMLE Z300 của Đức. - Máy lắc ORBIT 1900 của Nhật Bản. - Tủ cấy vi sinh vật. - Tủ sấy mẫu. - Tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật. - Dụng cụ thủy tinh các loại: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác 250ml, ống đong, phễu, cốc, đũa thủy tinh, Micropipet loại 1 ml và 0,2ml. - Dụng cụ kim loại như que cấy, que trang, dụng cụ đục thạch. - Các dụng cụ khác như bông thấm nước, bông không thấm nước, đèn cồn, giấy báo, nồi nấu, dao thái, giấy đo pH, thang đo pH. b) Hóa chất nghiên cứu - Hóa chất bổ sung môi trường: axít lactic, đường glucose, cám gạo,.... - Hóa chất phân tích β-glucan: D-glucose tinh khiết, phenol, axít sulfuric 96%, cồn 96o. c) Môi trường nuôi cấy - Môi trường thạch PDA: 200g khoai tây, 20g glucose, 20g agar. Tính cho 1 lít. - Môi trường lỏng PDR: 200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. Tính cho 1 lít. 3.1.3. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm - Trung tâm Nghiên cứu và Kiểm tra chất luợng nông sản thực phẩm - Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch. Địa chỉ: Số 4 - Ngô Quyền - Hà Nội. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối của một số chủng nấm Hương trên môi trường thạch PDA. - Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối của một số chủng nấm Hương trong môi trường lỏng PDR. - Xác định và so sánh hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi nấm ở một số chủng nấm Hương phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng. 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.3.1.1. Thí nghiệm nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của các chủng nấm Hương khác nhau trên môi trường thạch PDA Tiến hành nuôi cấy các chủng nấm Hương khác nhau trên môi trường thạch PDA, pH trong khoảng 5, nhiệt độ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm là 25oC. Sau đó, xác định đường kính phát triển hệ sợi nấm của các chủng giống sau từ 3 đến 9 ngày nuôi cấy. Từ kết quả thu được đánh giá tốc độ phát triển của các chủng nấm Hương trên môi trường thạch đĩa để kết luận chủng giống nào phát triển tốt nhất trên môi trường rắn làm cơ sở cho sự nghiên cứu phát triển của các chủng giống này trong môi trường nuôi cấy lỏng tiếp theo. Nhân và làm sạch giống trên đĩa thạch: Tiến hành nhân giống trên đĩa thạch từ ống giống. Chuẩn bị 5 đĩa/giống x 3 giống = 15 đĩa. So sánh theo sinh khối trên đĩa thạch: Sau khi nhân giống 10 ngày, tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của 3 chủng nấm Hương trên môi trường thạch PDA thông qua đo đường kính hệ sợi nấm. Chuẩn bị 5 đĩa/giống x 3 giống = 15 đĩa. 3.3.1.2. Thí nghiệm nghiên cứu so sánh khả năng phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương trong môi trường lỏng PDR Tiến hành cấy chuyển từ các đĩa thạch đã được bảo quản ở 5oC sau 10 ngày nhân giống như đã nêu ở mục 3.3.1.1 sang môi trường lỏng PDR. Chuẩn bị 5 bình/giống x 3 giống = 15 bình. Nuôi cấy ở cùng điều kiện của môi trường phòng thí nghiệm (20 - 30oC), pH trong khoảng 4 - 5, tốc độ lắc 120 vòng/phút (lắc 8 giờ/ngày chia làm 2 lần). Lấy mẫu để xác định khối lượng sinh khối khô vào ngày 22. Kết quả cần xác định là khả năng phát triển sinh khối của các chủng giống để xem chủng nào có khả năng phát triển tốt nhất trong môi trường lỏng. 3.3.1.3. Thí nghiệm phân tích hàm lượng β-glucan trong sinh khối ở các chủng nấm Hương Để đánh giá hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi của 3 chủng nấm Hương Ld, Lg, Lc tiến hành thu sinh khối sợi nấm khô từ 3 chủng ở mục 3.3.1.2 và phân tích hàm lượng β-glucan trong sinh khối. Số lượng mẫu bố trí là 3 giống x 3 lần lặp = 9 mẫu phân tích. Từ kết quả thu được đánh giá chủng nấm nào cho hàm lượng β-glucan cao nhất. 3.3.2. Phương pháp chuẩn bị môi trường 3.3.2.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường thạch đĩa PDA Chuẩn bị khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) 200g + 20g glucose + 20g thạch agar và nước cho đủ 1 lít. Khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) 200g đun sôi đến chín kỹ rồi lọc qua vải lọc 2 lần. Sau đó mới thêm 20g glucose + 20g thạch agar, bổ sung cho đủ 1 lít rồi đun cho tan thạch. Điều chỉnh pH trong khoảng 5 bằng axít lactic. Phân vào các bình tam giác, đậy nút bông rồi hấp khử trùng ở điều kiện nhiệt độ 121oC, áp suất 1at trong 20 phút. Sau khi khử trùng môi trường để nguội xuống khoảng 50oC tiến hành đổ vào đĩa Petri vô trùng khoảng 20ml/đĩa (ф 9) rồi dùng tay xoay tròn cho môi trường dàn đều trong đĩa. Sau đó đậy nắp để thạch đông thì lật ngược lại cho vào tủ ấp. Sau 2 ngày kiểm tra đĩa thạch nào bị nhiễm mốc xanh hay đen thì loại bỏ. Các đĩa sử dụng phải vô trùng mới mang đi cấy giống nấm. 3.1.2.2. Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy lỏng PDR Môi trường PDR (200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. Tính cho 1 lít): Khoai tây gọt vỏ cắt nhỏ được 200g định mức 1 lít nước đem đun chín kỹ rồi bổ sung 25g cám gạo vào và khuấy đều. Đem lọc qua vải lọc 2 lần rồi lọc tiếp bằng vải lọc malt 2 lần. Sau đó định lượng đến 1 lít, bổ sung 20g đường glucose. Đun nóng cho tan đường rồi điều chỉnh pH đến khoảng 4 - 5. Phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 121oC, áp suất 1at trong 30 phút. 3.3.3. Phương pháp nuôi cấy 3.3.3.1. Phương pháp đặt thạch Thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Dùng que cấy móc, khử trùng bằng dung dịch cồn 70oC và hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Khi móc nguội dùng lấy sợi nấm trong ống nghiệm giống gốc rồi chấm vào 3 điểm trên đĩa thạch. Sau đó lật ngược lại nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 25oC. Sau 10 ngày khi sợi nấm phát triển rộng thì tiến hành đục lỗ thạch (nơi có sợi nấm phát triển) bằng cái đục tròn rỗng có đường kính 5mm. Dùng kẹp đã khử trùng gắp mảng thạch đường kính 5mm đó đặt vào tâm đĩa thạch khác và tiếp tục nuôi ở nhiệt độ 25oC trong tủ ấm. Theo dõi sự phát triển thông qua đo đường kính của hệ sợi nấm. 3.3.3.2. Phương pháp nhân nuôi chủng nấm Hương trong môi trường lỏng Cấy chuyển sang môi trường lỏng: Tiến hành trong tủ cấy vô trùng, đục lỗ thạch bằng dụng cụ đục lỗ có đường kính 5mm như đã nêu ở mục 3.3.3.1, gắp cho vào mỗi bình 5 miếng thạch. Đậy nút bông và đặt trên máy lắc. Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 120 vòng/phút (8h/ngày), trong 22 ngày. 3.3.4. Phương pháp xác định lượng sinh khối tươi và khô Sử dụng loại giấy lọc có đường kính 9mm, sấy vải lọc ở nhiệt độ 120oC trong thời gian 4h. Sau đó để nguội trong bình hút ầm có silicagel. Cân các giấy lọc để biết khối lượng của chúng. Dùng các giấy lọc đó để lọc sinh khối từ các bình tam giác sau khi nuôi cấy. Dùng phễu để đỡ tờ giấy lọc. Sau khi chảy hết môi trường qua giấy lọc sẽ đem sấy sinh khối cùng giấy lọc. Sấy ở nhiệt độ 60oC trong 18h rồi đem để nguội trong bình hút ẩm trước khi cân. Tính toán khối lượng sinh khối khô thông qua chênh lệch khối lượng. Lượng sinh khối được tính theo mg trên 1 ml môi trường. Giá trị trung bình được tính từ 5 mẫu song song. 3.3.5. Phương pháp phân tích hàm lượng β-glucan Theo nghiên cứu của Manzi và Pizzoferrato hàm lượng β-glucan trong nấm Hương khoảng 0,22g/100g chất khô [19]. Như vậy, để tách chiết và phân tích được lượng β-glucan trong nấm Hương là rất khó, yêu cầu thiết bị hiện đại. Mặt khác theo nghiên cứu ở Mỹ hàm lượng glucan tổng số tách chiết từ thành tế bào nấm men bánh mỳ thu được là 80%, trong đó β-glucan chiếm khoảng 50% [6]. Như vậy, để đánh gía hàm lượng β-glucan hoàn toàn có thể tiến hành thông qua đánh giá hàm lượng glucan tổng số. 3.3.5.1. Chiết xuất β-glucan từ sinh khối sợi nấm khô Sử dụng sinh khối sợi nấm khô thu được từ thí nghiệm ở mục 3.3.1.2 tiến hành phân tích xác định hàm lượng glucan ở các chủng nấm Hương. Cân 100 mg sinh khối khô và 10 ml nước cất đem hấp ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1at trong 15 phút. Sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút. Lọc qua giấy lọc whatman. Dịch lọc thu được pha trộn với 4 lần ethanol 96%, lắc mạnh và để qua đêm ở 4 oC. Sau đó ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Phần nổi lên được bỏ đi và phần huyền phù phía dưới được ủ với NaOH 1M ở 60 oC trong 1h [10]. Lượng glucan được xác định bằng phương pháp phenol-sulfuric. Phương pháp phenol-sulfuric xác định glucan dựa trên việc hấp thụ tại bước sóng 490 nm của phức chất tạo bởi phenol và cacbohydrate. Hàm lượng glucan được xác định bằng cách so sánh với một đường chuẩn. Sử dụng máy quang phổ hấp thụ, chọn bước sóng 490 nm, xây dựng đường chuẩn, đo các mẫu phân tích. Tùy từng điều kiện phương pháp phenol-sulfuric có độ chính xác đến ± 2% [12]. Xây dựng đường chuẩn Quy trình lập đường chuẩn glucan như sau: Pha phenol 4%: cân 4g phenol, hòa tan trong bình định mức 100ml bằng nước cất, sau khi phenol tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức. Cân 1g D-glucose tinh khiết (chất chuẩn), hòa tan trong bình định mức 1lít bằng nước cất sau khi glucose tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức. Ta có dung dịch chuẩn với nồng độ 1mg/ml (1000ppm). Từ dung dịch chuẩn ta pha thành dãy chuẩn với các nồng độ: 0,2mg/ml; 0,1mg/ml; 0,05mg/ml; 0,02mg/ml; 0,01mg/ml; tương ứng với các nồng độ 200ppm; 100ppm; 50ppm; 20ppm; 10ppm. Lấy 5ml mỗi nồng độ chất chuẩn đưa vào các lọ 10ml. Thêm lần lượt vào tất cả các lọ chuẩn 0,5ml dung dịch phenol 4% sau đó thêm lần lượt vào tất cả các lọ 2,5ml dung dịch H2SO4 96%. Chuyển dãy chuẩn ra các cuvet và đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng là 490 nm. 3.3.5.3. Tính toán xác định hàm lượng glucan trong sinh khối sợi nấm khô - Từ đường chuẩn xác định được nồng độ mẫu phân tích. - Hàm lượng glucan được tính theo công thức sau: Hàm lượng glucan (%) = Trong đó: x là số gam xác định từ đường chuẩn 8 là hệ số pha loãng KLMPT là khối lượng mẫu ban đầu đem phân tích = 0,1g - Giá trị trung bình được tính từ 3 mẫu song song. 3.3.6. Phương pháp xử lý thống kê Số liệu được xử lý thống kê bằng Microsoft Excel. Phần IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá sự phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương trên môi trường thạch PDA Để chọn chủng nấm Hương phát triển tốt nhất trên môi trường rắn chúng tôi tiến hành nhân nuôi các chủng nấm Hương trên môi trường thạch đĩa PDA với cùng điều kiện nhiệt độ, thời gian nuôi cấy. Kết quả đo đường kính phát triển hệ sợi của các chủng nấm Hương trên môi trường PDA được xác định sau từ 3 ngày đến 9 ngày của quá trình nuôi cấy. Kết quả được trình bày trong bảng 4.1 như sau: Bảng 4.1. Đường kính (mm) hệ sợi của các chủng giống nấm Hương trên môi trường PDA Ngày xác định Đường kính hệ sợi (mm) Chủng nấm Ld Chủng nấm Lg Chủng nấm Lc 3 18,80 ± 0,45 14,05 ± 0,11 10,10 ± 0,14 4 28,65 ± 0,42 24,00 ± 0,18 20,15 ± 0,22 5 39,50 ± 0,31 35,05 ± 0,11 29,70 ± 0,27 6 51,15 ± 0,22 46,05 ± 0,27 39,60 ± 0,12 7 66,70 ± 0,27 56,10 ± 0,52 51,15 ± 0,49 8 77,50 ± 0,35 70,60 ± 0,42 60,95 ± 0,71 9 84,90 ± 0,22 80,95 ± 0,91 74,60 ± 0,42 Sau 3 ngày nuôi cấy, đường kính phát triển của hệ sợi nấm của 3 chủng nấm Hương Ld, Lg, Lc lần lượt là: 18,8mm, 14,05mm và 10,1mm. Như vậy, tốc độ phát triển của chủng giống Ld cao nhất và chủng giống Lc là thấp nhất. Ngày thứ 6 đường kính phát triển của hệ sợi nấm chủng giống Ld là 51,15mm, chủng giống Lg là 46,05mm, chủng giống Lc là 39.6mm. Sau 6 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA chủng giống Ld vẫn tiếp tục phát triển tốt nhất. Kết quả đo đường kính phát triển của 3 chủng giống nấm Hương Ld, Lg, Lc trên môi trường PDA sau 9 ngày lần lượt là 84,9mm, 80,95mm, 74,6mm. Như vậy, trong quá trình phát triển trên môi trường PDA, sự khác biệt về tốc độ phát triển của các chủng giống nấm Hương vẫn được duy trì. Trong đó, chủng giống Ld có đường kính hệ sợi phát triển tốt nhất còn chủng giống Lc có đường kính hệ sợi nhỏ nhất. Trong cùng điều kiện về môi trường nuôi cấy PDA, nhiệt độ 25oC trong tủ ấm, thời gian nuôi cấy thì tốc độ phát triển của ba chủng nấm Hương trong nghiên cứu này là khác nhau. Sự khác biệt này là do bản chất về chủng giống. Kết quả thu được trong nghiên cứu này cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu của các tác giả nước ngoài trước đây. Theo kết quả nghiên cứu của De Carvalho thì đường kính phát triển của hai chủng Lentinula edodes em BDA và Lentinula edodes em SDA trên môi trường thạch sau 10 ngày dao động từ 45mm đến 92mm [13]. Mata và CS khi nuôi cấy 11 chủng giống nấm Hương trên đĩa Petri với môi trường MEA đã thu nhận được đường kính sợi nấm sau 7 ngày dao động từ 49 đến 71mm [8]. Sự dao động này có thể giải thích như sau: do sự khác nhau về bản chất giống, môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy khác nhau thì tốc độ phát triển của các chủng nấm cũng khác nhau. Vậy kết quả thu được trong nghiên cứu này là hoàn toàn hợp lý. Hình 4.1. Sự phát triển của 3 chủng nấm Hương sau 6 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch PDA (Từ trái qua phải là các chủng Ld, Lg, Lc) Như vậy: Chủng giống nấm Hương Ld có đường kính phát triển hệ sợi lớn nhất và tốc độ phát triển hệ sợi lớn nhất nên là chủng giống nấm Hương phát triển tốt nhất trên môi trường thạch PDA. Hình 4.2. Sự phát triển của 3 chủng nấm Hương sau 9 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch PDA (Từ trái qua phải là các chủng Ld, Lg, Lc) 4.2. Đánh giá sự phát triển của các chủng nấm Hương trong môi trường lỏng PDR Từ mục 4.1 chủng nấm Hương Ld có đường kính hệ sợi nấm lớn nhất trên môi trường rắn và để có kết luận có nên chọn chủng giống Ld sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi cần nghiên cứu sự phát triển của cả 3 chủng giống trong môi trường nuôi cấy lỏng. Kết quả xác định hàm lượng sinh khối sợi khô nấm khô của 3 chủng nấm Hương Ld, Lg, Lc nuôi cấy sau thời gian 22 ngày, trong môi trường lỏng PDR ở cùng điều kiện nhiệt độ, pH môi trường là 4,5, tốc độ lắc 120 vòng/phút (8giờ/ngày) lần lượt là 5,36, 4,24, 3,57 mg/ml. Bảng 4.2. Khối lượng sinh khối sợi nấm khô của các chủng nấm Hương nuôi cấy trong môi trường lỏng PDR sau 22 ngày Chủng giống nấm Hương Khối lượng sinh khối sợi nấm khô (mg/ml) Ld 5,36 ± 0,04 Lg 4,24 ± 0,04 Lc 3,57 ± 0,02 Chủng nấm Hương Ld có khối lượng sinh khối khô lớn nhất, chủng nấm Hương Lc có khối lượng sinh khối khô nhỏ nhất sau 22 ngày nuôi cấy. Trên môi trường rắn PDA chủng nấm Hương Ld cho đường kính phát triển lớn nhất đồng thời trên môi trường lỏng PDR chủng Ld cho sinh khối sợi khô lớn nhất, cho thấy chủng Ld phát triển tốt nhất trên cả 2 môi trường rắn và lỏng. Trong cùng điều kiện nuôi cấy về nhiệt độ, pH môi trường, tốc độ lắc chủng nấm Hương Ld cho khối lượng sinh khối khô lớn nhất điều này là do bản chất giống. Kết quả ở phần nghiên cứu này cho chúng ta kết luận chủng giống nấm Hương Ld có khả năng phát triển tốt nhất trên cả 2 môi trường rắn và môi trường lỏng. Theo kết quả nghiên cứu của De Carvaho khi nuôi cấy một số chủng giống nấm trong môi trường lỏng với chế độ lắc 180 vòng/phút, lắc liên tục 24 giờ, lượng sinh khối thu được lớn nhất sau 20 ngày nuôi cấy là 4,83 ± 0.21 mg/ml [13]. Theo nghiên cứu của Hassegawa (2005) tiến hành nuôi cấy tĩnh một số chủng nấm Hương trong môi trường lỏng thì khoảng 28 ngày khối lượng sinh khối sợi khô thu được là 2,84 ± 0,24 mg/ml [9]. Như vậy thời gian nuôi cấy để thu được khối lượng sinh khối lớn nhất là trong khoảng từ 20 dến 28 ngày. Chon mốc sau 22 nuôi cấy để thu sinh khối chỉ mang tính chất tương đối. Sự dao động về khối lượng sinh khối sợi khô được giải thích như sau: do sự khác nhau về bản chất giống, điều kiện nuôi cấy khác nhau, thời gian nuôi cấy khác nhau, lượng giống đầu vào khác nhau. Vậy khối lượng sinh khối sợi nấm khô thu được của chủng Ld là hoàn toàn phù hợp. Kết quả ở phần nghiên cứu này cho chúng ta kết luận chủng giống Ld phát triển tốt nhất trên cả 2 môi trường rắn và lỏng. 4.3. Đánh giá hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi nấm ở một số chủng nấm Hương phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng β-glucan là hoạt chất sinh học quan trọng trong nấm Hương. β-glucan tạo nên các tính chất dược lý của nấm Hương. Các nhà nghiên cứu đã ghi nhận rằng β-glucan có khả năng tăng cường các phản ứng miễn dịch, có tính chất chống ung thư mạnh, có tác dụng chống virus, tính kháng sinh. Đo đó nếu chủng giống cho khối lượng sinh khối sợi lớn nhưng hàm lượng β-glucan thấp thì cũng không đạt yêu cầu. Vậy quyết định chọn chủng giống nấm Hương, ngoài chỉ tiêu khối lượng sinh khối sợi nấm khô lớn nhất thì chỉ tiêu hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi nấm cũng là một chỉ tiêu quan trọng. Để đánh giá hàm lượng β-glucan của 3 chủng giống nấm Hương nuôi cấy trong môi trường lỏng, tiến hành thí nghiệm theo phương pháp đã mô tả ở mục 3.3.5. 4.3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn Kết quả đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ D-glucose để xác định hàm lượng glucan tổng số được thể hiện trên hình 4.3. Dãy chuẩn với các nồng độ: 10ppm, 20ppm, 50ppm, 100ppm, 200ppm đều tạo thành các điểm nằm hoặc rất gần đường thẳng y = 0,0026 + 0,0056. Đường chuẩn có hệ số tuyến tính R2 = 0,996. Như vậy, đường chuẩn đã dựng có độ tin cậy cao. Hình 4.3. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ D-glucose 4.3.2. Kết quả xác định hàm lượng glucan Dựa vào đường chuẩn, phương trình đường chuẩn y = 0,0026x + 0,0056 và kết quả đo quang phổ hấp thụ tại bước sóng 490 nm của các mẫu phân tích, xác định được nồng độ của các mẫu phân tích. Hàm lượng glucan được xác đinh thông qua công thức đã mô tả ở mục 3.3.5.3. Kết quả thu được trình bày trong bảng 4.3 như sau: chủng nấm Hương Ld có hàm lượng glucan lớn nhất là 0,59%. Chủng nấm Hương Lc có hàm lượng glucan nhỏ nhất là: 0,43%. Bảng 4.3. Hàm lượng glucan của các chủng nấm Hương Chủng giống nấm Hương Độ hấp thụ quang Nồng độ chất chuẩn (ppm) Hàm lượng glucan (%) Sai số Ld 0.19 73,75 0,59 ± 0,01 Lg 0,17 62,57 0,50 ± 0,01 Lg 0,15 54,18 0,43 ± 0,01 Chủng nấm Hương Ld cho kết quả hàm lượng sinh khối sợi khô lớn nhất trong 3 chủng nấm Hương đã nghiên cứu ở mục 4.2 là chỉ tiêu cần thiết để tuyển chọn chủng nấm Hương, ngoài ra chủng Ld này còn đáp ứng được chỉ tiêu về hàm lượng β-glucan. Vậy chọn chủng nấm Hương Ld vừa cho sinh khối sợi khô lớn nhất đồng thời hàm lượng β-glucan cũng lớn nhất. Theo nghiên cứu ở Mỹ hàm lượng β-glucan tách chiết từ thành tế bào nấm men bánh mỳ là lớn nhất. Hàm lượng glucan tổng số thu được là 80%, trong đó β-glucan là 50% [6]. Theo nghiên cứu của Shih (2008) hàm lượng glucan tổng số trên nấm Grifola frondosa là khoảng 0,72% [10]. Theo nghiên cứu của Manzi và Pizzoferrato [19] hàm lượng β-glucan trong nấm Hương khoảng 0,22g/100g chất khô, hàm lượng β-glucan trong nấm Sò trong khoảng 0,32 – 0,53g/100g chất khô. Sự dao động về hàm lượng β-glucan có thể được giải thích như sau: các loại nấm khác nhau thì hàm lượng β-glucan là khác nhau, bản chất giống cũng quyết định đến hàm lượng β-glucan trong mỗi giống, phương pháp tách chiết glucan khác nhau dẫn đến hiệu suất thu hồi glucan cũng khác nhau. Hơn nữa về mặt lý thuyết xác định hàm lượng β-glucan trên sinh khối khô được coi là với độ khô tuyệt đối nhưng trên thực tế sinh khối sợi nấm khô trong nghiên cứu chỉ đạt độ khô từ 3 - 5%. Điều này giải thích vì sao chủng Ld trong nghiên cứu này có hàm lượng glucan tổng số thấp hơn so với hàm lượng glucan tổng số theo những nghiên cứu đã công bố trước đó. Như vậy sau nghiên cứu này kết luận trong 3 chủng nấm Hương đã nghiên cứu là Ld, Lg, Lc thì chủng Ld là chủng cho hàm lượng glucan tổng số cao nhất. Phần V KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày ở các phần trên, chúng tôi có một số kết luận sau đây: Trong 3 chủng nấm Hương nghiên cứu: Ld, Lg, Lc thì chủng nấm Hương Ld (chủng có nguồn gốc xuất xứ từ Ý) có khả năng phát triển sinh khối hệ sợi tốt nhất. Điều này được thể hiện khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa và trong môi trường lỏng. Hàm lượng β-glucan trong 3 chủng nấm Hương nghiên cứu: Ld, Lg, Lc thì chủng nấm Hương Ld cho hàm lượng β-glucan cao nhất. Kết luận chọn chủng nấm Hương Ld cho các nghiên cứu tiếp theo. 5.2. ĐỀ NGHỊ - Tiếp tục hoàn thiện để xây dựng được qui trình sản xuất giống theo phương pháp nuôi cấy lỏng. - Tiếp tục nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng β-glucan. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng (2003). Công nghệ nuôi trồng nấm. NXB Nông nghiệp Hà Nội, 244 tr. Lê Duy Thắng (2001). Kỹ thuật trồng nấm, NXB Nông nghiệp Hà Nội. Lê Xuân Thám, Võ Thị Phương Khanh, Nguyễn Anh Dũng, 2000. ”Bổ sung vào nhóm nấm chống ung thư ở Việt Nam: Nấm Hương (Nấm Donko, nấm shiitake)”. Tạp chí dược học, số 1/2000. Bùi Thị Thu Trang (2009). Nghiên cứu sự phát triển của hệ sợi nấm Hương (Lentinula edodes) trong môi trường nuôi cấy lỏng. Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Mở, Hà Nội. Trường ĐH Khoa học Tự nhiên (2005). Phát triển công nghệ sản xuất nấm dược liệu phục vụ tăng cường sức khỏe. Hà Nội. Viện Công nghiệp Thực Phẩm (2005). Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đường chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm _ Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất beta glucan từ thành tế bào nấm men dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm. Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh Chihara G. (1990). Lentinan and it’s raleted polysaccharides as host defence potentiator: their application to infectiuos diseases and cancer. In:Immunotherapeutic Prospects of lnfectious Diseases, 9-18. Gerado M., Philippe D., Jean M. S. (2001). Selection of trains of Lentinula edodes and Lentinula boryana adapted for efficient mycelial growth on wheat straw. Rev. Lberoam Micol. 18, 118-112. Hassegawa R.H., Kasuya M.C.M. (2005). ”Growth and antibacterial activity of Lentinula edodes in liquid media supplemented with agricultural wastes”. Electronic Journal of Biotechnology, 8(2), 213-216. Ing-Lung Shih, Bi-Wen Chou, Chien-Cheng Chen, Jane-Yii Wu, Chienyan Hsieh (2008). “Study of mycelial growth and bioactive polysaccharide production in batch and fed-batch culture of Grifola frondosa”. Bioresource Technology, 99, pp. 785-793. Ishikawa N. K., Kasuya M. C. M., Vanetti M. C. (2001). ”Antibacterial activity of Lentinula edodes grown in liquid medium”. Brazilian Journal of Microbiology, 32, 206-201. John Wiley& Sons, Inc (2001). “Colorimetric Quantification of Cacbohydrates”. Current Protocols in Food Analytical Chemistry, E1.1.1-E1.1.8. Maira Peres de Carvaho (2007). “Investigation of the antibacterial activity of basidiomycetes Lentinuala boryana and lentinula edodes”. Porto Alegre, 15(2), 173-179. Mantovani et al. (2008). ”β-Glucans in promoting health: Prevention against mutation and cancer”. Mutation Research, 658, pp.154-161. Megazyme International Ireland Ltd. (2008). Mushroom and Yeast beta-glucan. Mizuno T. (1993). “Food function and medicinal effect of mushroom fungi”. Food & Food Ingredients, 158. Nagaoka, Hitoshi (2000). Method for extracting a Basidiomycelium-containing culture medium using β-1,3-glucanase. US Patent 6090615. Rossi I. H., Monteiro A. C., Machado J. O., Barbosa J. C. (2003). “Supplementation of sugarcane bagasse with rice bran and sugarcane molasses for shiitake (lentinula edodes) spawn production”, Brazilian Journal of Microbiology, 34, 61-65. Pamela Manzi, Laura Pizzoferrato (1999). ”Beta-glucans in edible mushrooms”. Food chemistry, 68, pp. 315-318. Smith, Rowan and Sullivan (2002). Medicinal Mushrooms: Their therapeutic properties and current medical usage wint special emphasis on cancer treaments.UK, 80-142. Solomon P. W. (1999). Shiitake (Lentinus edodes), Marcel Dekker, INC., New York, 656-660. United States Patent 4874419. Substrate for growing shiitake mushrooms. United States Patent 5934012. Process for production of mushroom inoculum. United States Patent 7138519. Process for extracting of glucan from cereals and products abtained thereform. University of Utah Research Park, Salt Lake City (1990). “Mannitol Metabolism in Lentinus edodes, the Shiitake Mushroom”, Applied and Environmental Microbiology, 35, 250-253. PHỤ LỤC Hình 4.4. Sự thay đổi đường kính hệ sợi nấm của các chủng nấm Hương Hình 4.5. Nuôi sinh khối sợi nấm trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút Hình 4.6. Sự phát triển sinh khối sợi nấm Hương sau 22 ngày nuôi cấy trong môi trường lỏng PDR của các chủng nấm Ld (trên cùng), Lg (ở giữa), Lc (hình dưới cùng)