Khóa luận Nghiên cứu tìm hiểu ban đầu về bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - Ấn trong quá trình nuôi cấy và bảo quản tế bào

lời cảm ơn Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp này, em đã nhận được sự dẫn dắt tận tình của PGS TS Trịnh Đình Đạt. Em xin chân thành cám ơn thầy. Em cũng xin cám ơn các thầy cô trong bộ môn Di truyền đã chỉ bảo cho em trong thời gian qua. Trong thời gian được thực tập tại phòng Công nghệ phôi trực thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học - Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia, em đã được các chú, cô, anh, chị giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành khoá luận này. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Xuân Nguyên là người đã chỉ bảo cho em rất tận tình. Đồng thời em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn của mình đến TS Nguyễn Thị Uớc, cử nhân Nguyễn Văn Hạnh, kỹ sư Lê Văn Ty, kỹ sư Nguyễn Hữu Đức, chị Nguyễn thị Thuỳ Anh Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình và bạn bè đã ủng hộ và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp này. Đặt vấn đề Công nghệ sinh học động vật hiện nay đang tạo ra một bước chuyển biến lớn trong việc sản xuất giống các loài vật nuôi cho năng suất cao cũng như trở thành một công cụ hiệu quả trong việc bảo vệ đa dạng sinh học vật nuôi và động vật hoang dã. Thành tựu nổi bật trong lĩnh vực này là tái tạo cá thể động vật từ tế bào phôi và đặc biệt là tế bào sinh dưỡng (Wilmut, 1997), thành tựu này mở ra các khả năng tạo ra các bản sao động vật có tính trạng năng suất giống như cá thể ban đầu, tạo ra một cuộc cách mạng trong tuyển chọn và sản xuất con giống. Từ tế bào sinh dưỡng, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã sử dụng kỹ thuật cấy nhân để tạo ra các động vật nhân bản. Bắt đầu từ cừu Dolly được tạo ra từ tế bào tuyến vú (Willmut), hàng loạt chuột nhiều thế hệ được tạo ra bằng phương pháp tương tự từ tế bào cận trứng (1998). Nhiều phòng thí nghiệm đã thành công trong việc tạo bò nhân bản với hy vọng tạo ra các đàn bò kỷ lục (Pháp 2001, Trung Quốc 2001, Thái Lan 2000). Từ tế bào da tai bò, phòng Công Nghệ Phôi - Viện Công Nghệ Sinh Học thuộc Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia đã tạo ra phôi bò nhân bản đầu tiên tại Việt Nam. Tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang đạt 20 - 25% (Bùi Xuân Nguyên và cs, 1998). Hướng nghiên cứu tạo phôi và động vật nhân bản trở thành hướng nghiên cứu trọng điểm nhằm nâng cao năng suất vật nuôi, bảo vệ đa dạng sinh học vật nuôi, bảo vệ đa dạng sinh học các động vật hoang dã. Đây cũng là hướng nghiên cứu được nhiều trường đại học ở nước ta quan tâm. Nhân nuôi tế bào động vật là một trong các bước quan trọng của công nghệ nhân bản động vật. Cũng tại Viện Công Nghệ Sinh Học, các dòng tế bào vật nuôi và động vật hoang dã được nhân nuôi và bảo quản đông lạnh thành công như tế bào bò sữa cao sản, tế bào Sao la (Pseudoryx nghetinhensis), tế bào bò Tót (Bos gaurus),.. Nhân nuôi tế bào một mặt gia tăng về số lượng từ một nguồn tế bào hữu hạn, mặt khác tạo ra một quần thể tế bào đồng nhất, thích hợp cho việc nhân bản. Do vậy chất lượng tế bào nuôi quyết định trực tiếp đến khả năng tạo phôi, quá trình phát triển của phôi, quá trình phát triển của động vật cũng như tính năng sản xuất của vật nuôi. Nhiễm sắc thể là đơn vị mang thông tin di truyền cơ bản, do đó sự ổn định số lượng, hình thái, cấu trúc nhiễm sắc thể trong quá trình nuôi tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với sự phát triển của tế bào nuôi cũng như khả năng tạo phôi, chất lượng phôi. Chính vì vậy trong khuôn khổ của khoá luận này, chúng tôi chỉ giới hạn nghiên cứu tìm hiểu ban đầu về bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trong quá trình nuôi cấy và bảo quản tế bào. Chương1 : Tổng quan tài liệu 1.1 Sự hình thành nhiễm sắc thể trong điều kiện in vivo Người ta thường nghiên cứu nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của phân bào vì vào thời điểm đó nhiễm sắc thể co xoắn cực đại, bắt màu thuốc nhuộm mạnh nhất và có hình dạng điển hình nhất. Năm 1665, bằng chiếc kính hiển vi đơn giản Robert- Hooke đã có một số quan sát và rút ra nhận xét: "Các mô, các cơ quan của cây cối và động vật đều có nền tảng cấu trúc chung". Trong cùng một cơ thể sinh vật, tế bào ở các mô, các cơ quan tuy có khác nhau về chức năng, hình dạng nhưng đều có cấu tạo chung tương đối giống nhau: màng tế bào (Plasma membrane), bào tương (Cytoplasma), nhân (Nucleus). Tế bào Eukaryota, nhân được bao bọc bởi màng nhân và mang vật chất di truyền là axit nucleic (ADN). Chúng được tập hợp trong các nhiễm sắc thể. Vậy nhiễm sắc thể là một phức hợp các đơn vị di truyền, là sản phẩm của sự tiến hoá mà ngay từ khi mới bắt đầu tồn tại đã có giá trị chọn lọc cao. Mỗi loài sinh vật có một bộ nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài đó về số lượng, hình thái, cấu trúc nhiễm sắc thể: ví dụ: bộ nhiễm sắc thể bò 2n = 60; bộ nhiễm sắc thể trâu 2n = 50; bộ nhiễm sắc thể người 2n = 46; bộ nhiễm sắc thể ruồi giấm 2n = 8 Trong tế bào soma, nhiễm sắc thể tồn tại thành từng cặp tạo nên bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n). Trong các tế bào sinh dục (các giao tử), bộ nhiễm sắc thể có số lượng giảm đi một nữa (n). Trong một số trường hợp sự tăng, giảm về số lượng nhiễm sắc thể là do thiếu hoặc thừa một số nhiễm sắc thể nào đó. Đơn bội hoá hoặc đa bội hoá đều tạo ra những nhiễm sắc thể bất thường. Nhiễm sắc thể của Prokaryota thường là những phân tử ADN trần không có màng nhân bao bọc. Trong khi ở tế bào Eukaryota, cấu trúc nhiễm sắc thể hoàn toàn khác. Bước nhảy vọt về cấu trúc nhiễm sắc thể ở sinh vật bậc cao kèm theo sự xuất hiện của bộ máy nguyên phân và màng nhân đã gây ra sự thay đổi cơ bản về kích thước, số lượng nhiễm sắc thể của chúng trong tế bào, về sự phức tạp của cấu tạo phân tử và cả trong những mối tương quan của những yếu tố di truyền và các cấu thành khác nhau của nhân. Dưới kính hiển vi quang học, nhiễm sắc thể có cấu tạo từ hai sợi nhiễm sắc đó là nhiễm sắc thể đơn (chromatide). Dưới kính hiển vi điện tử các chromatide được cấu tạo từ nhiều sợi nhiễm sắc. Hai sợi nhiễm sắc đơn thể chạy dọc theo suốt chiều dài của nhiễm sắc thể và cuộn xoắn tạo nên sợi nhiễm sắc thể. Ta có thể nhìn thấy hầu hết các dấu hiệu đặc trưng của các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của tế bào soma. Trên sợi nhiễm sắc thể có tâm động (centromer), đây là tiểu bộ phận có chức năng chuyển động đặc trưng cho nhiễm sắc thể ở các sinh vật bậc cao và nó còn là điểm trượt để kéo sợi nhiễm sắc về hai phía trong quá trình phân bào. Khi nhiễm sắc thể pha nghỉ được nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi ta thấy chất nhiễm sắc phân thành hai kiểu khác biệt rõ rệt về cấu tạo. Một kiểu được nhuộm rất nhạt gọi là chất nguyên nhiễm sắc (vùng sáng - euchromatin). Kiểu kia được nhuộm đậm gọi là chất dị nhiễm sắc (vùng tối-heterochromatin). Chất nguyên nhiễm sắc ở trạng thái dãn xoắn, còn chất dị nhiễm sắc ở trạng thái cuộn xoắn cao. Người ta cho rằng vùng sáng chứa gen hoạt động còn vùng tối chứa gen ở trạng thái không hoạt động. Những sinh vật khác nhau chất dị nhiễm sắc phân bố cũng khác nhau. Có trường hợp từng phần hoặc toàn bộ nhiễm sắc thể là chất dị nhiễm sắc nằm rải rác ở dạng những đoạn xoắn xen kẽ với chất nguyên nhiễm sắc và bọc quanh các tâm động. Về chức năng chất nguyên nhiễm sắc chứa ADN ở trạng thái hoạt động (có thể phiên mã được), còn chất dị nhiễm sắc thì mang ADN ở dạng không phiên mã được. Chất dị nhiễm sắc sao chép muộn hơn chất nguyên nhiễm sắc trong chu kỳ tế bào. Cấu tạo hoá học của nhiễm sắc thể gồm có ADN và một loại protein đặc biệt đó là histon bao quanh ADN, ngoài ra còn có ARN và protit. ADN cùng với histon tạo thành một phức hợp Nucleoprotein chiếm 60 - 90% toàn bộ nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể bao gồm hai nữa gọi là nhiễm sắc tử, mỗi nhiễm sắc tử được tạo thành từ chất Desoxyribonucleoprotein (DNP) và bao gồm khoảng 40% ADN, 60% protein, các nhiễm sắc tử được dính nối với nhau bởi những thể nhỏ dạng chấm hay hạt gọi là tâm động (centromer). Ngoài nhiễm sắc thể thường, trong mỗi tế bào sinh dưỡng còn mang hai nhiễm sắc thể giới tính là XX ở con cái và XY ở con đực. Một số trường hợp đặc biệt ví dụ như ở loài tằm cặp nhiễm sắc thể giới tính XX ở con đực và XY ở con cái, ở chim nhiễm sắc thể giới tính ở con cái là ZO và ở con đực là ZZ. Hình thái nhiễm sắc thể còn được Dhnuki (1965) đề cập đến trạng thái nhiễm sắc thể cuộn xoắn. Ferguson- Smith (1962), Palmer, Funderburk (1965) nghiên cứu về eo thứ hai, Engmanm (1979) nghiên cứu về thể sáp, thể sao kép, thể sao khổng lồ, thể sao liên hợp. Tuy nhiên dưới ảnh hưởng của các nhân tố khác nhau số lượng và hình dạng của các nhiễm sắc thể có thể thay đổi. Ví dụ: Dưới tác dụng của nhiệt độ cao hoặc thấp các nhiễm sắc thể có thể kéo dài ra hoặc co ngắn lại, sự bức xạ ion hoá gây đứt nhiễm sắc thể thành những phần riêng (đứt mạch) và chúng thoát khỏi bộ nhiễm sắc thể. Theo Makino (1944), Kalicop (1968), Bhatacharya (1977) thì số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào soma của các loài vật nuôi khác nhau thì khác nhau. Như vậy, trong phạm vi loài số lượng nhiễm sắc thể là một hằng số ổn định. Bước đầu Barnicot và Huseley (1961) đã xử lý và quan sát nhiễm sắc thể dưới kính hiển vi địên tử thành công. Sau đó Dupraw (1965) đã dùng phương pháp Gall xử lý quan sát nhiễm sắc thể được các sợi cuộn vòng trong nhiễm sắc thể có đường kính 250 Angtron. Năm 1970 Dupraw đã xuất bản toàn bộ những ảnh chụp nhiễm sắc thể qua kính hiển vi điện tử. Ris và Cubai (1976) cũng đã xử lý bằng các tác nhân phụ, tách sợi 250 Angtron thành hai sợi khoảng 100 Angtron, như vậy nhiễm sắc thể ở kỳ giữa, đường kính các sợi có thể từ 230 - 250 Angtron thậm chí lên quá 300 Angtron. Barh và Golomh (1971) đã sử dụng và nghiên cứu nhận dạng nhiễm sắc thể. Từ đó cấu trúc các sợi cuộn của Dupraw đã trở thành cấu trúc nhiễm sắc thể hiện đại. Tế bào là đơn vị cơ bản cấu tạo nên mọi cơ thể sống do đó muốn bảo tồn và phát triển thì mọi cơ thể sống đều phải tiến hành sinh sản. Trong sinh vật tuỳ theo mức độ tiến hoá mà có các hình thức sinh sản khác nhau. Động vật có vú phát triển cao thì tế bào có hai hình thức phân chia đó là hình thức phân chia nguyên phân xảy ra ở hầu hết các tế bào trong cơ thể và hình thức giảm phân để tạo ra tế bào sinh dục. Sự sinh sản của tế bào là quá trình sinh trưởng phân chia có tính chất chu kỳ gọi là chu kỳ tế bào. Trong quá trình phân bào này, số nhiễm sắc thể tăng lên gấp đôi sau đó các nhiễm sắc thể phân phối đều cho 2 tế bào con. Kết quả số nhiễm sắc thể ở mỗi tế bào con giống hệt tế bào mẹ. Phân bào nguyên phân là một quá trình liên tục, nhưng để tiện cho nghiên cứu có thể chia làm bốn thời kỳ liên tiếp nhau: kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau, kỳ cuối. Giữa hai lần phân chia gọi là gian kỳ. Nguời ta gọi các biến đổi của tế bào từ lúc bắt đầu lần phân chia thứ nhất cho tới khi bắt đầu lần phân chia thứ hai là một chu kỳ tế bào. Gian kỳ chiếm phần lớn thời gian còn các thời kỳ phân bào chỉ chiếm phần nhỏ. Trong quá trình phân bào (nguyên phân hay giảm phân) chúng ta thấy nhiễm sắc thể luôn thay đổi, nhưng về mặt cấu trúc thì cơ sở của nó là phức hợp ADN - histon đảm bảo cho tính nguyên vẹn của nhiễm sắc thể. Tế bào soma trong trung kỳ hình thái nhiễm sắc thể là ổn định, sự chênh lệch trong các tế bào thuộc phạm vi một cá thể hoặc những cơ thể của một loài là không đáng kể. Vì vậy nghiên cứu cấu tạo nhân của các loài khác nhau tốt nhất là vào kỳ giữa lúc đó mỗi loài được đặc trưng bởi một bộ nhiễm sắc thể về hình thái và số lượng. Phân bào giảm phân là quá trình sinh ra các giao tử đơn bội từ một tế bào lưỡng bội sau hai lần phân chia. Nguyên phân là quá trình truyền lại cho tế bào con toàn bộ thông tin di truyền của tế bào mẹ đảm bảo cho sự ổn định về số lượng, hình thái của bộ nhiễm sắc thể trong các tế bào của cơ thể. Gian kỳ là khoảng thời gian giữa hai lần phân chia, trong gian kỳ khi tế bào không phân chia xảy ra quá trình chuyển hoá mạnh mẽ, tổng hợp các chất khác nhau, cần thiết cho hoạt động đặc biệt của tế bào cũng như sự phân chia của nó. Gian kỳ (interphase) chia làm ba giai đoạn là G1 - S - G2, tiếp sau G tế bào phân chia cho hai tế bào con, sau đó mỗi tế bào con lại bắt đầu một chu trình tế bào. Gian kỳ gồm 3 giai đoạn: _ Giai đoạn thứ nhất bắt đầu ngay sau khi kết thúc phân chia của tế bào gọi là giai đoạn G1. Trong giai đoạn G1 tế bào không chỉ lớn lên và tạo lập hình dáng vốn có cho mình mà còn tích luỹ những chất giàu năng lượng khác nhau, các nucleotid, axitamin, enzym. Trong thời kỳ này tế bào chuẩn bị tăng gấp đôi các cấu trúc di truyền của nó. _ Giai đoạn S (Synthese = tổng hợp) xãy ra sự nhân đôi vật chất di truyền, sự tái sinh của các phân tử ADN. Các protein và ARN được tổng hợp mạnh mẽ. _ Giai đoạn G2 là giai đoạn sau tổng hợp, sự tổng hợp ARN vẫn tiếp tục các nhiễm sắc thể đã chứa hai bản sao của mình tức là các nhiễm sắc tử mang một phân tử ADN, hai sợi tế bào tích luỹ năng lượng và chuẩn bị cho sự phân chia tới, các nhiễm sắc thể xoắn lại và chia làm hai. Dưới kính hiển vi quang học không quan sát thấy nhiễm sắc thể trong gian kỳ, nhưng theo các dấu hiệu thu được khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử thì thấy đa số nhân trong gian kỳ vẫn có hình dạng nhiễm sắc thể, tuy nhiên các nhiễm sắc thể rất mảnh nên dưới kính hiển vi quang học không thấy dược toàn bộ cấu trúc và hình dạng của nhiễm sắc thể mà chỉ thấy được chỗ vặn xoắn của chúng tạo nên các khối chất nhiễm sắc. Các thời kỳ phân chia: Kỳ đầu (Prophase): ở kỳ đầu nhân xuất hiện các sợi lúc đầu mảnh và dài, càng về sau mảnh hơn và ngắn hơn. Trứơc kia người ta cho rằng từ các hạt chất nhiễm sắc tập hợp lại thành sợi dài, về sau sợi đó bị đứt đoạn tạo thành các nhiễm sắc thể, ngày nay người ta đã khẳng định rằng các sợi trong kỳ đầu ngắn hơn và dày hơn các nhiễm sắc thể ở gian kỳ. Vào cuối kỳ đầu, màng nhân và hạch nhân biến mất. Số trung thể tăng lên gấp đôi, mỗi nửa số trung thể di chuyển tới các cực đối lập của tế bào. Xung quanh trung thể xuất hiện các tia nên trông các trung thể giống như những ngôi sao. Từ nguyên liệu của bào tương hình thành nên các sợi của thoi vô sắc. Thoi gồm các sợi không bắt màu đi từ sao nọ sang sao kia. Thoi này có chứa protein giàu lưu huỳnh, ARN, lipoprotein và ATP. Kỳ giữa (Metaphase): Tại kỳ giữa nhiễm sắc thể có hình dạng đặc trưng xuất hiện các sợi thoi toả ra từ hai cực đối diện của tế bào dính với trung tử nằm ở hai cực. Các sợi thoi lần lượt dính với các tâm động của nhiễm sắc thể. Các nhiễm sắc thể tập trung ở mặt phẳng xích đạo của tế bào, mỗi cặp sợi nhiễm sắc. Nghĩa là mỗi nhiễm sắc thể con kết xoắn cực đại. Kỳ sau (Anaphase): ở kỳ sau các đôi nhiễm sắc thể tách ra thành các nhiễm sắc thể đơn thể quay ngược đầu rời xa đường xích đạo tiến về hai cực của tế bào, đó là vai của nhiễm sắc thể đơn. Thoi vô sắc biến đi, bào tương ở xung quanh dày và co thắt mạnh hơn. Càng về sau vai của nhiễm sắc thể càng mờ đi không thấy rõ nữa vì các sợi nhiễm sắc đã cởi xoắn. Kỳ cuối (Telophase): Sự vận chuyển của các nhiễm sắc thể con về hai cực của tế bào kết thúc. Như vậy 2 nhóm nhiễm sắc thể ở hai cực có số lượng và thành phần giống nhau. Màng nhân hình thành bao bọc bởi mỗi nhóm nhiễm sắc thể. Các nhiễm sắc thể dãn xoắn, hình thành nhân con. Các sợi thoi biến mất, tế bào chất được phân chia bao lấy nhân ở hai cực tế bào. Trong thời kỳ phân bào, các bào quan phân phối từng đôi đều cho các tế bào con. Ty thể thường phân ra thành các hạt bé hơn đôi khi lại kéo dài ra, bộ máy golgi cắt ra từng đoạn phân bào nguyên phân trải qua hai quá trình chia nhân và chia bào tương. Trong quá trình phân chia nhân mỗi nhiễm sắc thể tạo ra hai nhiễm sắc thể con từ gian kỳ song chúng chưa tách rời nhau. Đến cuối kỳ đầu hai nhiễm sắc thể con mới bắt đầu tách rời nhau. Như vậy số lượng nhiễm sắc thể là 2n đi về mỗi cực của tế bào cho nên kết thúc kỳ phân chia, mỗi tế bào con có đủ bộ lưỡng bội 2n giống tế bào mẹ về cả số lượng, hình thái, kích thước. Theo Ford (1973) khi nuôi cấy tế bào trong chu kỳ phân chia tế bào, thời kỳ G1 chiếm khoảng 12 - 24 giờ, thời kỳ S chiếm khoảng 7 giờ, thời kỳ G2 chiếm khoảng 4 - 6 giờ. Thời gian phân chia nguyên phân rất ngắn khoảng 1 giờ 30 phút trong đó: Kỳ đầu 30 phút Kỳ giữa15 phút Kỳ sau 15 phút Kỳ cuối 30 phút Nghiên cứu nhiễm sắc thể là dựa vào việc xác định rõ các giai đoạn phân chia của tế bào để có thể thu được kết quả tốt như kỳ giữa của quá trình nguyên phân. Tuy nhiên trong quá trình sinh sản và phát triển cá thể không phải lúc nào tế bào cũng duy trì được hoàn toàn chính xác về số lượng và hình dạng nhiễm sắc thể mà sẽ có những biến động. Những biến đổi của nhiễm sắc thể chia thành hai loại: _ Biến đổi về số lượng nhiễm sắc thể _ Biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể 1.2 Những nghiên cứu nhiễm sắc thể trong điều kiện in vitro 1.2.1 Lược sử nghiên cứu chung về nhiễm sắc thể Nghiên cứu nhiễm sắc thể người và động vật đã được nhiều nhà khoa học chú ý tới, đặc biệt là vật nuôi. Nghiên cứu nhiễm sắc thể động vật nói chung và động vật nông nghiệp nói riêng được tiến hành từ đầu thế kỷ XIX. _ Năm 1665 Robert - Hooke nhà nghiên cứu người Anh đã tạo ra kính hiển vi quang học đầu tiên trên thế giới. Bằng chiếc kính hiển vi đơn giản ông đã có một số quan sát làm cho người ta hiểu rằng các mô, các cơ quan của cây cối và động vật đều có nền tảng và cấu trúc chung. _ Năm 1838 - 1839 nhà thực vật học Slayden và nhà động vật học Schwan ở Đức đã phát hiện ra cơ thể sinh vật đều được cấu tạo từ các tế bào, học thuyết tế bào ra đời. Theo Enghen đây là một trong ba phát minh vĩ đại nhất của khoa học tự nhiên ở thế kỹ 19. _ Năm 1831 Robert Braum tìm thấy thể nhiễm sắc trong nhân _ Từ năm 1862 - 1915 Beveri (Đức) và Wilsen (Mỹ) cho rằng nhiễm sắc thể khác nhau mang trong nó tính di truyền khác nhau. _ Năm 1869 lần đầu tiên nhà sinh vật học người Thuỵ Sỹ F.Misher đã phát hiện ra axit nucleic trong nhân tế bào. _ Từ năm 1887 - 1902 Beveri phát triển lý luận về nhiễm sắc thể. _ Năm 1927 Kalinte công bố số lượng nhiễm sắc thể ở bò là 2n = 60 _ Năm 1956 Tjo và Levan dùng kỹ thuật nuôi cấy tế bào của bào thai và dùng sốc nhược trương đã đếm chính xác số lượng nhiễm sắc thể của người là 2n = 46. Trong thời gian này với phương pháp nghiên cứu nhiễm sắc thể khác như: nuôi cấy bạch cầu máu ngoại vi, nuôi cấy tuỷ xương,...đã có nhiều tác giả công bố số lượng và hình thái nhiễm sắc thể ở gia súc và gia cầm. Dựa vào sự phân tích nhiễm sắc thể trong nguyên phân và phân tích nhiễm sắc thể khổng lồ ở loài Anopheles sundaicus, S. Sukowati và V. Baimai (1996) đã kết luận rằng: loài Anopheles sundaicus gồm ba dạng, ba dạng này đều có kiểu nhân trong nguyên phân là giống nhau là 2n = 6. Thành tựu đầu tiên về nghiên cứu nhiễm sắc thể người do Chrustchoft và Berlin dùng tế bào bạch cầu, tế bào máu ngoại vi nuôi cấy môi trường tổng hợp. Năm 1935 Chrustchoft và cộng sự đã công bố phương pháp nuôi cấy tế bào bạch cầu đa nhân. Nghiên cứu nhiễm sắc thể trên người đã được phát triển sớm ở nhiều phòng thí nghiệm ở nhiều nước. Một số lượng lớn các mẫu đã được nghiên cứu, phân tích, sự phát hiện dị dạng nhiễm sắc thể và mối liên quan của nó tới quá trình sống đã giúp cho sự phát triển ngành tế bào học và di truyền người thu được những thành tựu đáng kể như ngày nay. Bên cạnh đó các nhà khoa học Nhật Bản và Tây Âu đặc biệt quan tâm nghiên cứu tới nhiễm sắc thể ở vật nuôi. Nuôi cấy tế bào trong môi trường thử nghiệm từ năm 1880 từ khi Roux giữ đĩa phôi gà trong nước muối sinh lý ấm vài ngày. Anold (1887) đã ghép một mảnh mô vào ếch, sau một thời gian có tế bào bạch cầu đa nhân vây quanh. Ông đã lấy mảnh mô và giữ trong đĩa nước muối sinh lý ấm rồi quan sát sự chuyển động và sống của nó trong thời gian ngắn. Năm 1903 Folly đã giữ tế bào bạch cầu bằng những giọt treo lơ lửng trong nước muối sinh lý ấm với thời gian một tháng. Becbe và Swing (1906) đã miêu tả việc cấy tế bào bạch cầu đơn nhân trong máu động vật có sức đề kháng và mẫn cảm. Năm 1907 Rossnarisian đã tách mảnh mô từ những ống vùng giữa rốn phôi và đám tế bào lympho ếch. Các mảnh mô này có thể sống vài tuần lễ và có nhiều sợi thần kinh xuất hiện ở các tế bào. Thời gian sau Carell đã phát hiện chất chiết xuất từ phôi thai có khả năng kích thích và tăng cường ảnh hưởng tới sự phát triển của một số tế bào nhất định. Waren và Leweis (1911 - 1912) đã bắt đầu tìm hiểu những nhân tố khi cho vào môi trường cần thiết cho sự sinh trưởng và quá trình sống của tế bào. Công việc này được Fisher tiếp tục nghiên cứu và trong những năm tiếp theo những nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu như: Sanhevtecly, Morgan, White, Waymouth và Eagle đã giúp cho sự phát triển những môi trường tổng hợp dùng để nuôi cấy tế bào ngày càng hoàn thiện (Paul, 1960). Có thể nói rằng tất cả các nghiên cứu nhiễm sắc thể người và động vật trước năm 1940 chỉ được tiến hành bằng việc cắt các mảnh mô. Nói chung là các mảnh mô này đựợc cố định trong dung dịch osurium hoặc chronium bao gồm cả dung dịch cố định, thuốc nhuộm với các chất kết tinh màu tím hoặc là thuốc nhuộm hematocylin. Makino (1944) đã dùng mô dịch hoàn để nghiên cứu nhiễm sắc thể bò trong môi trường hổn hợp Champy và Fleming. Hỗn dịch không có axit axetic đặc trong dung dịch cố định mẫu được tiến hành nhuộm trong Haidenhai- sắt- Hematocylin. Slizinsky (1945) đã thử nghiệm sử dụng thuốc nhuộm carmin axetic cố định để nghiên cứu nhiễm sắc thể ở tuỷ người. Nhưng tất cả các kết quả đều không mỹ mãn khi sử dụng những nguyên liệu này cho tới năm 1950 kỹ thuật nuôi cấy nhiễm sắc thể đã được tiến hành những năm 1950 như sau: Phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào trong môi trường tổng hợp dùng chất kích thích phân bào phytohaemaglutinin (PHA) có khả năng kích thích bạch cầu đơn nhân. _ Sử dụng Colchicin để cố định quá trình phân bào ở trung kỳ giai đoạn tốt nhất để đếm và quan sát hình dạng nhiễm sắc thể. _ Sử dụng dung dịch cố định lạnh axit axetic: methanol. _ Dùng dung dịch nhược trương trước khi tiến hành dùng dung dịch cố định Hsue và Pomerat (1953). Theo Levitsky (1924) nhiễm sắc thể có thể sắp xếp theo một trình tự nhất định thành bộ nhiễm sắc thể và khi nhuộm quan sát được thể hiện những đặc điểm của nhiễm sắc thể kỳ giữa trong quá trình phân chia nguyên nhiễm. Bởi vậy về hình dạng, số lượng của nó khá đặc trưng cho bộ nhiễm sắc thể của mỗi loài, nhiễm sắc thể đó đã thể hiện sự khác nhau về hình dạng, kích thước vị trí tâm động giữa các cặp nhiễm sắc thể. Biểu đồ thể hiện bộ nhiễm sắc thể gọi là nhiễm sắc thể đồ (Idiograme, Navashin, 1922). Tại hội nghị Denver (1960), một tiêu chuẩn phân loại nhiễm sắc thể người ở kỳ giữa được thống nhất. Các đôi nhiễm sắc thể kỳ giữa thường được sắp xếp theo thứ tự giảm dần về chiều dài của nhiễm sắc thể, phân biệt nhiễm sắc thể dựa vào các đặc điểm cấu trúc sau: _ Chiều dài của nhiễm sắc thể so với toàn bộ (Lr: chiều dài liên hệ tương đối) _ Tỷ lệ chiều dài giữa cánh dài và cánh ngắn tính theo độ tương đối: (q/p) _ Chỉ số tâm là tỉ lệ giữa chiều dài của cánh ngắn và chiều dài của nhiễm sắc thể: p/(p+q) Một điều thường xảy ra trong phân loại nhiễm sắc thể là việc xác định vị trí của tâm. Levan và cộng sự (1964) đã đề ra một tiêu chuẩn phân loại trong hội nghị nhằm xác định vị trí của tâm nhiễm sắc thể. Tuỳ theo vị trí của tâm mà nhiễm sắc thể được phân loại như sau: _ Nhiễm sắc thể tâm giữa gồm các nhiễm sắc thể có tâm động nằm giữa chia nhiễm sắc thể thành hai phần bằng nhau (hai vai nhiễm sắc thể bằng nhau) (Metacentric). _ Nhiễm sắc thể nằm gần giữa gồm các nhiễm sắc thể có tâm động nằm vùng gần giữa thân chia nhiễm sắc thể thành hai phần không bằng nhau, hai cánh nhiễm sắc thể có độ dài khác nhau, (Submetacentric). _ Loại nhiễm sắc thể tâm đỉnh hay cận tâm: đó là các nhiễm sắc thể có tâm động nằm gần đầu mút cho nhiễm sắc thể chỉ còn hai cánh dưới (Acrocentric) _ Nhiễm sắc thể có tâm mút (Telocentric) Nhờ hệ thống phân loại hình thái nhiễm sắc thể mà ta có thể lên được nhiễm sắc thể đồ và kiểu nhân (karyotype). Tại hội nghị Chicago (1966) đã thoả thuận về việc viết công thức nhiễm sắc thể: số lượng nhiễm sắc thể đầu tiên, sau đó là nhiễm sắc thể giới tính và cuối cùng bất kỳ dị dạng nào phát hiện được. Hội nghị quốc tế lần thứ tư (Paris, 1971), băng chuẩn được sử dụng để xác định các đôi nhiềm sắc thể đã được phát hiện. 1.2.2 Nghiên cứu tế bào in vitro và nhiễm sắc thể ở Việt Nam _ Năm 1969 lần đầu tiên bộ môn Tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 tiến hành nghiên cứu số lượng và hình thái nhiễm sắc thể. ở lợn, kết quả các giống lợn Móng cái, lợn ỉ Việt Nam có bộ nhiễm sắc thể 2n = 38. _ Năm 1970 - 1976 bộ môn giải phẫu và bộ môn tổ chức phôi thai-Trường ĐHNN1 tiến hành nghiên cứu số lượng nhiễm sắc thể trâu Việt Nam 2n = 48 _ Năm 1978 bộ môn giải phẫu và bộ môn tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 tiến hành nghiên cứu số lượng nhiễm sắc thể bò Việt Nam 2n = 60 _ Năm 1983 - 1984, Phạm Văn Lập, Tạ Toàn, Tống Lệ Khanh - Khoa Sinh Học - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên đã tiến hành nghiên cứu kiểu nhân của muỗi sốt rét Anospheles sinensis. _ Năm 1988 bộ môn giải phẫu và bộ môn tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 tiến hành nghiên cứu số lượng, hình thái nhiễm sắc thể vịt ở Việt Nam 2n = 60 _ Năm 1992 bộ môn giải phẫu và bộ môn tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 tiến hành nghiên cứu số lượng, hình thái nhiễm sắc thể một số giống vịt: vịt cỏ, vịt Kakicampell, Super Meat dòng ông và Super Meat dòng bà. Kết quả cho thấy 2n = 80 _ Năm 1993 bộ môn giải phẫu, bộ môn tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 và viện chăn nuôi tiến hành nghiên cứu số lượng, hình thái nhiễm sắc thể một số giống dê. Kết quả 2n = 60 _ Năm 1994 bộ môn giải phẫu, bộ môn tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 và viện chăn nuôi tiến hành nghiên cứu số lượng, hình thái nhiễm sắc thể một số giống gà ở Việt Nam. Kết quả gà ri 2n = 56. _ Năm 1996, Nguyễn Mộng Hùng, Nguyễn Lan Hương đã nghiên cứu kiểu nhân của lươn Monopterus albus sống ở hai miền Nam và Bắc Việt Nam. Kết quả cho thấy bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội của lươn miền Bắc và miền Nam là 24. _ Nuôi tế bào động vật nhằm phục vụ cho việc cấy nhân tạo động vật nhân bản được tiến hành từ năm 1998 tại phòng Công Nghệ Phôi - Viện Công Nghệ Sinh Học , các tác giả đã nuôi thành công tế bào cận noãn (cumulus) của bò sữa cao sản, tế bào đệm (fibroblas) của Sao la, tế bào bò tót. Từ các nguồn tế bào này, các tác giả đã hình thành một ngân hàng tế bào các động vật cao sản để áp dụng vào sản xuất và tế bào các động vật hoang dã nhằm cấy nhân để phục hồi các động vật này. Chương 2 : Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1 đối tượng nghiên cứu của đề tài 2.1.1 Nguồn gốc tiến hoá của các giống bò Bò thuộc lớp Artiodaetyla Bộ phụ Ruminantia Họ Bovidae Chi Bovini Chi Bovini theo Bohlken (1958) có 3 loài: Bovina (bò) Bubalina (trâu Châu á) Syncerina (trâu Châu Phi) Nhóm Bovina gồm 4 dưới loài: Bos, Poephagus, Bibos, Bison _ Bos chỉ có một loài Bos primigenius, Bojanus là tổ tiên của bò nhà hiện nay đã tuyệt chủng _ Poephagus mutus, Przewalski là bò Tây Tạng hoang và con cháu đã thuần hoá của nó là bò Banteng của Đông nam châu á. Bò Bangteng của Đông nam châu á là Bibos javanicus hoặc Bibos bangteng (Wagner) và bò Gaur. ở Bắc ấn Độ và bán đảo Malaixia là Bibos geuirus, Smith. _ Hai loài của giống Bison là Bison châu Mỹ (Linnaeus) và Bison bonarus châu âu (Linaeus). Bò Hà - ấn là kết quả của quá trình lai giữa bò Hà Lan và bò lai Sind Sơ đồ lai: P : Bò vàng Việt Nam x Bò Sind ấn Độ F1 : Bò lai Sind x Bò Hà Lan F2 : Bò Hà - ấn Hình 1: ảnh Bò Hà - ấn cái 2.1.2 Đặc điểm một số giống bò 2.1.2.1 Bò Thanh Hoá Bò Thanh Hoá là một giống bò tốt hiện nay ở miền Bắc nước ta. Bò Thanh Hoá có tầm vóc loại trung, khối lượng có thể đạt: _ Bò cái bình quân 200 - 250 kg, bò cái tốt 280 - 290 kg. _ Bò đực bình quân 220 - 300 kg, bò đực tốt 300 - 340 kg. _ Bò cày bình quân 300 - 350 kg, bò tốt 360 - 370 kg. Sắc lông hầu hết có màu vàng tươi, cũng có con màu cánh gián; ở vùng bụng có yếm màu hơi nhạt hơn, da mỏng, mịn. Bò Thanh Hoá đẻ năm một, bê sơ sinh có khối lượng 16 - 21 kg, tăng trọng sau một tháng đến 15 - 19 kg. Năng suất thịt cao (trung bình đạt 50 - 52%), có khả năng cho sữa (bình quân 2 lít, con tốt 3 - 4 lít/ngày), tỷ lệ mỡ trong sữa 4,69%. 2.1.2.2 Bò Nghệ An Hình dáng bò Nghệ An trông thanh tú. Sắc lông màu nâu thẫm, có con đen hẳn. Mặt hơi lõm, u vai cao có ngấn. Trán số ít con phẳngcòn đa số là gồ ghề. Sừng dài hướng về phía trước, chóp sừng nhọn màu đen. Đùi thắt và ít nở nang. Đuôi dài. Chân ngắn và gân guốc. Chiều cao trung bình từ 1 - 1,1m. Khối lượng của bò cái trung bình 200 - 250 kg, bò đực 350 - 400 kg. Năng suất thịt 40 - 45%. Có khả năng cày bừa và kéo xe tốt. 2.1.2.3 Bò Lạng Sơn Bò thích ở những nơi nhiều cỏ và thoáng. Nhìn chung bò có tầm vòc nhỏ và không cân đối. Đa số có màu lông vàng, bò cái đa số trước thấp sau cao. So với thân hình thì đầu dài và không cân xứng. Mặt cong, lưng cong, bụng to và võng. Bề ngang hẹp và thấp. Khối lượng bò cái trung bình 180 - 200kg, bò đực 250 - 300kg. 2.1.2.4 Bò Sind Bò Sind là giống bò sữa ở nước Pakistan, thuộc vùng Karasi và Hiderabat. Từ năm 1920 - 1924 bò được nhập vào nước ta. Bò đã thích nghi với hoàn cảnh khí hậu nước ta, có khả năng chịu nóng tốt hơn trâu bò Việt Nam. Bò Sind sắc lông đỏ, có khi vá trắng. Phía u vai màu đỏ, có thể đỏ sẫm, cánh gián, vàng thẫm hoặc hung hung đỏ. Trán rộng và thường gồ lên. Mõm rộng, cổ ngắn và dày. Sừng to và ngắn. ức rộng, da mỏng, mông tròn. Đuôi dài và thẳng, có chòm lông đen ở cuối đuôi, chóp đuôi không có xương. Bầu vú đều đặn, núm vú thẳng, tai to và cụp xuống Bò cái hiền lành, vắt sữa dễ dàng. Khoảng cách 2 lứa đẻ là 13 tháng (Lai Sind 15 tháng). Sức tiết sữa trung bình 2000 kg trong một kỳ cho sữa. Có thể vắt sữa liên tục trong 10 tháng. Con tốt có thể vắt được 20 lít/ ngày. Bò cày dùng kéo xe rất tốt và chịu được điều kiện ăn uống kham khổ. 2.1.2.5 Bò Hà Lan Bò Hà Lan là giống bò chuyên sản xuất sữa được tạo ra ở vùng duyên hải nước Hà Lan. Bò được nhập nội vào nước ta từ Liên Xô và Trung Quốc. Sắc lông phần lớn màu loang đen trắng hoặc đen hẳn. Số ít có màu đỏ trắng. Đầu nhỏ, riêng bò đực đầu tương đối to, thô, ngắn. Hai mắt cách xa nhau, vành mắt có màu đen. Trán có đốm trắng. Sừng ngắn nhọn. Cổ dài, bò đực cổ to. Thân mình dài, phần sau thân rất nở nang. Mông dài, đùi to, bầu vú rất lớn. Con cái phần sau phát triển hơn phần trước, bò đực thì ngược lại. Bò đực cân nặng 750 - 1200kg, tỷ lệ thịt 55 - 58%. Bò cái nặng 450 - 750kg. Bê sơ sinh nặng 40 - 55kg. Sản lượng sữa trung bình đạt 5000kg trong 300 ngày, con kỷ lục trong 365 ngày vắt được 18875kg. Có con vắt đựợc tới 70 - 72kg/ngày. Bò cái hiền lành, bò đực dữ tợn. 2.2.Địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu Phòng Công Nghệ Phôi thuộc viện Công Nghệ Sinh Học - Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia 2.2.2 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 11 - 2001 đến tháng 06 - 2002 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Mẫu vật nghiên cứu Tế bào da bò Hà - ấn được nuôi trong điều kiện in vitro. Thí nghiệm được tiến hành trên các tế bào ở các lần chuyển khác nhau. 2.3.2 Vật liệu thí nghiệm _ Đá lạnh _ Máy ly tâm _ Kính hiển vi _ Cốc 100ml _ Bình tam giác 50ml _ Bình có màu 60ml _ Pipet paster _ ống ly tâm 15ml _ Bình nước cất _ Pipet man _ Lam(sấy, để ở -20 độC) _ Tủ nuôi _ Tủ sấy 2.3.3 Hoá chất _ Môi trường PBS(-) _ DMEM 10% FCS 5ml _ Hypotonic: KCl 0.075M 9ml Cách pha : Cân 5.59g KCl pha trong 1 lít nước cất, để trong tủ lạnh dùng dần _ Dung dịch cố định Công thức: etanol : axit acetic = tỉ lệ 3 : 1 _ Tripcin 400ml _ Đệm Photphat pH = 6.8 Cách pha : 0.453g KH2PO4 và 1.19g Na2HPO4 trong 100ml nước cất. _ Thuốc nhuộm Giemsa Cách pha : lấy 1g bột Giemsa hoà tan trong 54ml Glixerin ở 50o - 600C. Sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng rồi cho thêm 84ml metanol, khuấy đều, lọc qua bông. Thuốc nhuộm bảo quản trong tủ lạnh, dùng dần. 2.3.4 Nuôi và thu thập tế bào 2.3.4.1 Nuôi tế bào 2.3.4.1.1 Thu mẫu tế bào từ da tai của một con bò Hà - ấn cái: Vệ sinh vùng định thu mẫu, sát trùng bằng cồn 70%. Cắt bằng dụng cụ chuyên dụng. Mô da được thu vào môi trường PBS(-), đem về phòng thí nghiệm. Rửa sạch mẫu nhiều lần bằng PBS(-). Tách phần biểu bì, cắt nhỏ đến 0.1 x0.1 mm. Sắp xếp các miếng nhỏ vào đĩa, nuôi trong DMEM 10% FBS, nuôi ở 300C, 5% CO2, độ ẩm bão hoà. Sau 5 - 10 ngày các tế bào mọc ra từ miếng da. Dùng tripsin để cấy chuyển khi tế bào đã mọc đầy đĩa nuôi. 2.3.4.1.2 Nuôi tế bào sau các lần cấy chuyển: Sau khi cho tripsin các tế bào bong ra khỏi đĩa nuôi. Trung hoà tripsin còn thừa bằng DMEM 10% FBS. Ly tâm, loại bỏ môi trường, cho môi trường DMEM mới vào hoà tan cặn và gieo vào các đĩa nuôi trong 15 phút với mật độ 150.000 tế bào/ đĩa. Với mật độ này, thường sau ba ngày tế bào sẽ mọc đầy đĩa nuôi. Từ đó có thể cấy chuyển tiếp để duy trì hoặc làm nhiễm sắc thể để phân tích hoặc sử dụng cho các nghiên cứu khác. 2.3.4.2 Phương pháp tách tế bào khỏi giếng nuôi: _ Loại bỏ dung dịch nuôi _ Thêm 100ml trypsin cho mỗi giếng nuôi, trung hoà tripsin bằng DMEM 10%, để 10 phút. _ Đánh tan tế bào bằng pipet và cho vào ống nhựa 10ml. _ Thêm vào mỗi giếng nuôi 200ml dung dịch PBS(-), đánh kỹ và hút cho vào ống nhựa đó. Hình 2 : ảnh chụp tế bào bò Hà - ấn sau khi nuôi 2.3.5 Phương pháp làm tiêu bản nhiễm sắc thể. 2.3.5.1 Làm tiêu bản nhiễm sắc thể _ Sau khi tế bào được tách ra khỏi giếng nuôi, cho vào ống nhựa 10ml. Tiến hành ly tâm ngay với tốc độ 1000 vòng/phút trong 10 phút (tránh để lâu tế bào sẽ bị phân huỷ bởi tripsin). _ Hút bỏ phần nổi _ Thêm vào ống đã ly tâm 9ml dung dịch nhược trương _ Để 15 phút ở 370 C _ Sau 15 phút, thêm vào mỗi ống 1ml dung dịch cố định _ Để 5 phút _ Ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút _ Hút bỏ phần nổi _ Thêm vào 6ml dung dịch cố định mới _ Để 20 phút ở 40 C _ Sau 20 phút, ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút _ Hút bỏ phần nổi _ Thêm vào 2ml dung dịch cố định mới _ Ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút _ Hút bỏ phần nổi _ Thêm vào 600ml dung dịch cố định mới _ Dùng pipet hoà đều tế bào với môi trường cố định _ Chuẩn bị các lam kính sạch _ Dùng pipet hoà đều tế bào với môi trường cố định _ Lam kính rửa sạch, dể trong tủ lạnh ở nhiệt độ 00C trong khoảng 30 phút _ Nhỏ từng giọt dung dịch chứa tế bào bằng pipet xuống lam kính sao cho khoảng cách giữa pipet đến lam kính khoảng 1 mét. Động tác này có tác dụng làm giọt mẫu rơi từ trên cao xuống sẽ được dàn mỏng và đều, tế bào sẽ vỡ tung nhiễm sắc thể. _ Để khô từ 12 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng. 2.3.5.2 Nhuộm nhiễm sắc thể bằng thuốc nhuộm Giemsa _ Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Giemsa 6% trong đệm photphat trong 10 phút. _ Rửa tiêu bản bằng nước cất _ Để khô 2.3.6. Đọc tiêu bản Tiêu bản sau khi nhuộm đã để khô, chúng tôi quan sát dưới kính hiển vi Olympus Trước tiên quan sát chung ở vật kính 10, xác định vị trí của nhiễm sắc thể trên vi trường. Sau đó quan sát ở vật kính 40. Nhiễm sắc thể bắt màu tím đậm. Quan sát hình thái, đếm số lượng nhiễm sắc thể, ghi lại toạ độ vi trường và chọn vi trường rõ nét nhất để chụp ảnh bộ nhiễm sắc thể. 2.3.7. Xử lý số liệu Các công thức toán học dùng trong tính toán và xử lý số liệu 2.3.7.1 Tính giá trị trung bình = i= 1,2,....n : số nhiễm sắc thể trung bình X: số nhiễm sắc thể của mỗi lần quan sát được n: số lần quan sát 2.3.7.2 Tỉ lệ % fi fi : tỉ lệ % Mi : số lượng phiến kỳ giữa có 60 nhiễm sắc thể lần chuyển thứ i Ni : số lượng phiến kỳ giữa của lần chuyển thứ i 2.3.7.3 Giá trị tính toán: Ti = Ti : gía trị tính toán A : tổng lượng phiến kỳ giữa có 60 nhiễm sắc thể ở các lần chuyển Ni : tổng lượng phiến kỳ giữa của lần chuyển thứ i C : tổng lượng phiến kỳ giữa của các lần chuyển 2.3.7.4 So sánh nhiều tỉ lệ bằng tiêu chuẩn X2 X2 = Oi : giá trị quan sát Ti : giá trị tính toán 2.3.8 Bố trí thí nghiệm Bò Hà ấn Thu tế bào da Tế Bào Nuôi tế bào Cấy chuyển 1 4 Lần chuyển 4 Phân tích Nhuộm Làm NST Cấy chuyển 4 6 Làm NST Nhuộm Phân tích Lần chuyển 6 Cấy chuyển 6 8 Phân tích Nhuộm Làm NST Lần chuyển 8 Cấy chuyển 8 10 Nhuộm Phân tích Làm NST Lần chuyển 10 Cấy chuyển 10 14 Phân tích Nhuộm Làm NST Lần chuyển 14 Cấy chuyển 14 18 Phân tích Nhuộm Làm NST Lần chuyển 18 Chương3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1 Số lượng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn cái trong nuôi in vitro Quá trình làm tiêu bản tế bào bò Hà - ấn trong nuôi invitro đạt kết quả tốt hay không tốt phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có những yếu tố quan trọng như thời gian lấy tế bào ở mỗi lần chuyển, thời gian xử lý hoá chất, nồng độ hoá chất, kỹ thuật làm tiêu bản nhiễm sắc thể .. Trong khuôn khổ khoá luận tốt nghiệp này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn qua các lần chuyển thứ 4, 6, 8, 10, 14, 18. Mới gần đây Chikara Kubota và cs (2000) đã tiến hành nghiên cứu nhiễm sắc thể tế bào fibroblast của bò trong nuôi in vitro ở lần chuyển thứ 5, 10, 15. Kết quả cho thấy 70- 80% có bộ nhiễm sắc thể hoàn chỉnh (2n = 60) và coi đó bộ nhiễm sắc thể không thay đổi. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi cũng thu được kết quả 70 - 77% có bộ nhiễm sắc thể hoàn chỉnh. Như vậy, chúng ta có thể sơ bộ kết luận rằng bộ nhiễm sắc thể của tế bào bò Hà - ấn trong quá trình nuôi in vitro là không thay đổi. Điều đó có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng tế bào nuôi. 3.1.1 Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 4 Bảng 1: Số lượng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 4 Số lượng nhiễm sắc thể Số lượng phiến kỳ giữa Tỉ lệ(%) > 60 3 3.26 60 68 73.91 60 - 55 4 4.35 55 - 50 6 6.52 50 - 45 6 6.52 45 - 40 5 5.43 40 - 35 0 0 35 - 30 0 0 < 30 0 0 Quá trình làm tiêu bản nhiễm sắc thể ở lần chuyển thứ 4 ta thu được 92 phiến trung kỳ, trong đó: _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được > 60 nhiễm sắc thể là 3, chiếm tỉ lệ 3.26% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 60 - 55 nhiễm sắc thể là 4, chiếm tỉ lệ 4.35% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 55 - 50 nhiễm sắc thể là 6, chiếm tỉ lệ 6.52% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 50 - 45 nhiễm sắc thể là 6, chiếm tỉ lệ 6.52% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 45 - 40 nhiễm sắc thể là 5, chiếm tỉ lệ 5.43% _ Số lượng phiến trung kỳ đếm được < 40 nhiễm sắc thể là 0, chiếm tỉ lệ 0% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 60 nhiễm sắc thể là 68, chiếm tỉ lệ 73.91%. Tỉ lệ này cho thấy số lượng phiến kỳ giữa có 60 nhiễm sắc thể là lớn nhất. Ta có thể kết luận rằng bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trong quá trình nuôi in vitro ở lần chuyển 4 là không thay đổi (2n = 60). Hình 3: ảnh bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn ở lần chuyển thứ 4 3.1.2. Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 6 Bảng 2: Số lượng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 6 Số lượng nhiễm sắc thể Số lượng phiến kỳ giữa Tỉ lệ(%) > 60 1 0.69 60 109 75.17 60 - 55 1 0.69 55 - 50 19 13.10 50 - 45 10 6.69 45 - 40 4 2.76 40 - 35 0 0 35 - 30 1 0.69 < 30 0 0 Quá trình làm tiêu bản nhiễm sắc thể ở lần chuyển thứ 6 ta thu được 145 phiến trung kỳ, trong đó: _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được > 60 nhiễm sắc thể là 1, chiếm tỉ lệ 0.69% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 60 - 55 nhiễm sắc thể là 1, chiếm tỉ lệ 0.69% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 55 - 50 nhiễm sắc thể là 19, chiếm tỉ lệ 13.10% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 50 - 45 nhiễm sắc thể là 10, chiếm tỉ lệ 6.69% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 45 - 40 nhiễm sắc thể là 4, chiếm tỉ lệ 2.76% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được < 40 nhiễm sắc thể là 1, chiếm tỉ lệ 0.69% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 60 nhiễm sắc thể là 109, chiếm tỉ lệ 75.17%. Tỉ lệ này cho thấy số lượng phiến kỳ giữa có 60 nhiễm sắc thể là lớn nhất. Ta có thể kết luận rằng bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trong quá trình nuôi in vitro ở lần chuyển thứ 6 là không thay đổi (2n = 60). Hình 4: ảnh bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 6 3.1.3. Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 8 Bảng 3: Số lượng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 8 Số lượng nhiễm sắc thể Số lượng phiến kỳ giữa Tỉ lệ(%) > 60 4 2.86 60 105 75.00 60 - 55 6 4.29 55 - 50 4 2.86 50 - 45 13 9.29 45 - 40 5 3.57 40 - 35 1 0.71 35 - 30 0 0 < 30 2 1.43 Quá trình làm tiêu bản nhiễm sắc thể ở lần chuyển thứ 8 ta thu được 140 phiến trung kỳ, trong đó: _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được > 60 nhiễm sắc thể là 4, chiếm tỉ lệ 2.86% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 60 - 55 nhiễm sắc thể là 6, chiếm tỉ lệ 4.29% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 55 - 50 nhiễm sắc thể là 4, chiếm tỉ lệ 2.86% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 50 - 45 nhiễm sắc thể là 13, chiếm tỉ lệ 9.28% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 45 - 40 nhiễm sắc thể là 5, chiếm tỉ lệ 3.57% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được < 40 nhiễm sắc thể là 3, chiếm tỉ lệ 2.13% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 60 nhiễm sắc thể là 105, chiếm tỉ lệ 75%. Tỉ lệ này cho thấy số lượng phiến kỳ giữa có 60 nhiễm sắc thể là lớn nhất. Ta có thể kết luận rằng bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trong quá trình nuôi in vitro ở lần chuyển thứ 8 là không thay đổi (2n = 60). Hình 5: ảnh bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 8 3.1.4. Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 10 Bảng 4: Số lượng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 10 Số lượng nhiễm sắc thể Số lượng phiến kỳ giữa Tỉ lệ(%) > 60 5 6.94 60 54 75.00 60 - 55 2 2.77 55 - 50 3 4.16 50 - 45 1 1.38 45 - 40 0 0 40 - 35 2 2.77 35 - 30 1 1.38 < 30 4 5.55 Quá trình làm tiêu bản nhiễm sắc thể ở lần chuyển thứ 10 ta thu được 72 phiến kỳ giữa, trong đó: _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được > 60 nhiễm sắc thể là 5, chiếm tỉ lệ 6.94% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 60 - 55 nhiễm sắc thể là 2, chiếm tỉ lệ 2.77 % _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 55 - 50 nhiễm sắc thể là 3, chiếm tỉ lệ 4.16% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 50 - 45 nhiễm sắc thể là 1, chiếm tỉ lệ 1.38% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 45 - 40 nhiễm sắc thể là 0, chiếm tỉ lệ 0% _ Số lượng phiến trung kỳ đếm được < 40 nhiễm sắc thể là 7, chiếm tỉ lệ 9.71% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 60 nhiễm sắc thể là 54, chiếm tỉ lệ 75%. Tỉ lệ này cho thấy số lượng phiến kỳ giữa có 60 nhiễm sắc thể là lớn nhất. Ta có thể kết luận rằng bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trong quá trình nuôi in vitro ở lần chuyển thứ 10 là không thay đổi (2n = 60). Hình 6: ảnh bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 10 3.1.5. Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 14 Bảng 5: Số lượng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 14 Số lượng nhiễm sắc thể Số lượng phiến kỳ giữa Tỉ lệ(%) > 60 3 2.97 60 75 73.27 60 - 55 8 7.92 55 - 50 8 7.92 50 - 45 5 4.95 45 - 40 1 0.99 40 - 35 1 0.99 35 - 30 0 0 < 30 0 0 Quá trình làm tiêu bản nhiễm sắc thể ở lần chuyển thứ 14 ta thu được 101 phiến kỳ giữa, trong đó: _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được > 60 nhiễm sắc thể là 3, chiếm tỉ lệ 2.97% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 60 - 55 nhiễm sắc thể là 8, chiếm tỉ lệ 7.92% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 55 - 50 nhiễm sắc thể là 8, chiếm tỉ lệ 7.92% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 50 - 45 nhiễm sắc thể là 5, chiếm tỉ lệ 4.95% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 45 - 40 nhiễm sắc thể là 1, chiếm tỉ lệ 0.99% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được < 40 nhiễm sắc thể là 1, chiếm tỉ lệ 0.99% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 60 nhiễm sắc thể là 75, chiếm tỉ lệ 73.27%. Tỉ lệ này cho thấy số lượng phiến kỳ giữa có 60 nhiễm sắc thể là lớn nhất. Ta có thể kết luận rằng bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trong quá trình nuôi in vitro ở lần chuyển thứ 14 là không thay đổi (2n = 60). Hình 7: ảnh bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 14 3.1.6. Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 18 Bảng 6: Số lượng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 18 Số lượng nhiễm sắc thể Số lượng phiến kỳ giữa Tỉ lệ(%) > 60 2 1.61 60 89 71.77 60 - 55 8 6.45 55 - 50 9 7.25 50 - 45 8 6.45 45 - 40 4 3.22 40 - 35 0 0 35 - 30 4 3.22 < 30 0 0 Quá trình làm tiêu bản nhiễm sắc thể ở lần chuyển thứ 18 ta thu được 124 mẫu, trong đó: _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được > 60 nhiễm sắc thể là 2, chiếm tỉ lệ 1.61% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 60 - 55 nhiễm sắc thể là 8, chiếm tỉ lệ 6.45% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 55 - 50 nhiễm sắc thể là 9, chiếm tỉ lệ 7.26% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 50-45 nhiễm sắc thể là 8, chiếm tỉ lệ 6.45% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được 45 - 40 nhiễm sắc thể là 4, chiếm tỉ lệ 3.23% _ Số lượng phiến kỳ giữa đếm được < 40 nhiễm sắc thể là 4, chiếm tỉ lệ 3.23% _ Số lượng phiến trung kỳ giữa được 60 nhiễm sắc thể là 89, chiếm tỉ lệ 71.77%. Tỉ lệ này cho thấy số lượng phiến kỳ giữa có 60 nhiễm sắc thể là lớn nhất. Ta có thể kết luận rằng bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trong quá trình nuôi in vitro ở lần chuyển thứ 18 là không thay đổi (2n = 60). Hình 7: ảnh bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 18 Từ kết quả thu được ở các lần chuyển trên, ta có bảng tổng kết các lần chuyển ta đã làm thí nghiệm Bảng 7: Bảng tổng kết các lần chuyển có số nhiễm sắc thể 2n = 60 Lần chuyển Số phiến kỳ giữa thu được Số phiến kỳ giữa có 2n = 60 Tỉ lệ (%) 4 92 68 73.91 6 145 109 75.17 8 140 105 75.00 10 72 54 75.00 14 101 74 73.26 18 124 89 71.77 Dùng tiêu chuẩn X2 để đánh giá tỉ lệ % giữa các lần chuyển là độc lập nhau hay phụ thuộc lẫn nhau. Từ công thức ở mục 2.3.7.3 và 2.3.3.4 ta có được bảng giá trị tính toán và tiêu chuẩn X2 ở các lần chuyển. Bảng 8: Bảng giá trị tính toán và tiêu chuẩn X2 ở các lần chuyển. Lần chuyển Giá trị thực tế Số phiến trung kỳ ở mỗi lần chuyển Giá trị lý thuyết X2 thành phần 4 68 92 68.11 1.77.10-4 6 109 145 107.35 0.025 8 105 140 103.65 0.017 10 54 72 53.31 8.93.10-3 14 74 101 74.78 8.14.10-3 18 89 124 91.80 0.085 Tổng 499 674 499 0.144 Với độ tin cậy 95%, tra bảng phân phối X2 ta có X2 = 11.07 Ta nhận thấy rằng X2 tổng mà ta tính được nhỏ hơn X2 tra bảng. Từ đó ta có thể kêt luận rằng tỉ lệ % số lượng phiến kỳ giữa có 2n = 60 nhiễm sắc thể tính được ở các lần chuyển là độc lập nhau. Kết quả thu được ở các lần chuyển khác nhau một cách ngẫu nhiên. Các lần chuyển có tỉ lệ trung bình khoảng 74.5% số lượng phiến kỳ giữa có bộ nhiễm sắc thể hoàn chỉnh. Theo bài báo “Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture” trên trang web (1999), tác giả Chikara Kubota và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nhiễm sắc thể tế bào fibroblas của bò trong nuôi invitro ở lần chuyển thứ 5, 10, 15. Kết quả ông thu được 70 - 80% số lượng phiến trung kỳ có bộ nhiễm sắc thể hoàn chỉnh (2n = 60). Với kết quả này, các tác giả đã kết luận rằng số lượng bộ nhiễm sắc thể bò trong quá trình nuôi in vitro là không thay đổi. Tại phòng Công Nghệ Phôi - Viện Công Nghệ Sinh Học, Bùi Xuân Nguyên và cộng sự (2000) đã nhân bản phôi bò Hà - ấn bằng cấy nhân tế bào sinh dưỡng, các phôi này đã phát triển đến giai đoạn phôi nang (morula). Theo các tác giả này thì các phôi này đã phát triển trong cơ thể bò mẹ một thời gian (2002). Kết quả này được củng cố với các công trình nhân bản đã thành công trước đây (Well, 2001). Trên những cơ sở đó chúng ta khẳng định rằng tỉ lệ thu được ở mỗi lần chuyển khoảng 74,5% số lượng phiến trung kỳ chứa bộ nhiễm sắc thể hoàn chỉnh từ trong công trình nghiên cứu này. Điều đó đã chứng tỏ số lượng nhiễm sắc thể trong quá trình nuôi in vitro là không thay đổi. 3.2 Sơ bộ về hình thái nhiễm sắc thể Bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trong qua trình nuôi invitro cũng giống như bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trong invivo về hình thái. Bộ nhiễm sắc thể gồm 30 cặp trong đó có một cặp nhiễm sắc thể giới tính, sự sắp xếp kiểu nhân như sau: _ Từ cặp số 1 đến cặp số 29 là nhiễm sắc thể thường, có dạng chữ V tâm mút (acrocentric) _ Cặp nhiễm sắc thể cuối cùng chính là cặp nhiễm sắc thể giới tính XX ở con cái (Phan Cự Nhân, 1987). Cặp nhiễm sắc thể này có dạng chữ X, nhiễm sắc thể có hai, tâm gần giữa (submetacentric). Các đôi nhiễm sắc thể sắp xếp theo thứ tự giảm dần về chiều dài của các nhiễm sắc thể phù hợp với qui ước quốc tế quy định về xây dựng kiểu nhân. Hình 8: Kiểu nhân của bò Hà - ấn cái Mục lục Trang Đặt vấn đề 1 Chương 1: Tổng quan tài liệu 3 1.1 Sự hình thành nhiễm sắc thể trong điều kiện in vivo 3 1.2 Những nghiên cứu nhiễm sắc thể trong điều kiện in vitro 9 1.2.1 Lược sử nghiên cứu chung về nhiễm sắc thể 9 1.2.2 Nghiên cứu tế bào in vitro và nhiễm sắc thể ở Việt Nam 12 Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu của đề tài 14 2.1.1 Nguồn gốc tiến hoá của các giống bò 14 2.1.2 Đặc điểm một số giống bò 15 2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 17 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 17 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Mẫu vật nghiên cứu 17 2.3.2 Vật liệu thí nghiệm 17 2.3.3 Hoá chất 18 2.3.4 Nuôi và thu thập tế bào 18 2.3.5 Phương pháp làm tiêu bản nhiễm sắc thể 20 2.3.6 Đọc tiêu bản 21 2.3.7 Xử lý số liệu 21 2.3.8 Bố trí thí nghiệm 23 Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 24 3.1 Số lượng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn cái trong nuôi in vitro 24 3.1.1 Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 4 24 3.1.2 Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 6 26 3.1.3 Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 8 28 3.1.4 Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 10 29 3.1.5 Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 14 31 3.1.6 Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 18 33 3.2 Sơ bộ về hình thái nhiễm sắc thể 37 Kết luận và đề nghị 40 Tài liệu tham khảo 41