Khóa luận Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC

đặt vấn đề Sốt rét là một bệnh nguy hiểm mang tính xã hội. Bệnh truyền từ người này sang người khác do muỗi anophen. Hàng năm trên thế giới có tới 300- 500 triệu trường hợp bị mắc sốt rét [25] trong đó có khoảng 2,7 triệu ca tử vong do sốt rét mỗi năm [24]. Những vùng có số người sốt rét cao là Châu Phi, Đông Nam á, . Việt Nam là một nước thuộc khu vực Đông Nam á, và nằm trong vùng sốt rét lưu hành. Hàng năm nước ta có tới 1 triệu ca sốt rét trong đó có 30.000 ca sốt rét ác tính [12]. Việc điều trị sốt rét ngày càng trở nên khó khăn do ký sinh trùng sốt rét càng ngày càng kháng mạnh với các loại thuốc điều trị sốt rét trước đây như: Cloroquin, Mefloquin, Primaquin, [17]. Trong khoảng mười năm trở lại đây Artemisinin (hoạt chất chiết từ cây Thanh Hao Hoa Vàng) và các dẫn chất của nó được đưa vào điều trị cho kết quả rất tốt, đặc biệt là dẫn chất Artesunat. Đây là một thuốc cắt cơn sốt nhanh, ít bị tái phát như Artemisinin, có tác dụng cả với chủng P.falciparum đã kháng Cloroquin. Thuốc qua được hàng rào máu não nên có tác dụng tốt trong điều trị sốt rét thể não [9]. Tuy vậy phương pháp kiểm tra chất lượng Artesunat đang áp dụng ở nước ta còn rất nhiều hạn chế [3], [4], [14], [16], [13]. Artesunat lại đắt nên rất dễ bị làm giả. Vì là thuốc điều trị sốt rét nên thuốc giả hay kém phẩm chất rất nguy hiểm cho bệnh nhân. Theo một bài báo ở Đông Nam á Artesunat bị làm giả rất nhiều. Mỗi năm thế giới có khoảng 1 triệu người chết vì sốt rét trong đo có tới 200.000 người có thể cứu được nếu dùng đúng thuốc. DHA là một tạp chất chính trong Artesunat, mặc dù DHA là một thuốc điều trị sốt rét mạnh gấp 2 lần Artemisinin nhưng tác dụng yếu hơn Artesunat 2, 3 lần, DHA lại rất ít tan trong nước nên DHA là một nguyên nhân quan trọng làm giảm hiệu quả điều trị của Artesunat [22]. Vì vậy xác định và khống chế hàm lượng DHA trong Artesunat là rất quan trọng. Trong điều kiện khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, kỹ thuật phân tích HPLC đang đươc triển khai áp dụng rộng rãi ở Việt Nam. Việc nghiên cứu và thực hành phương pháp HPLC đối với một Dược sỹ là rất cần thiết. Nằm trong mảng đề tài xây dựng phương pháp kiểm nghiệm Artesunat bằng phương pháp HPLC, trong khoá luận tốt nghiệp của mình tôi tham gia cải tiến điều kiện sắc ký đã xây dựng trong khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học của Nguyễn Thanh Tùng (2004) để rút ngắn thời gian phân tích và xây dựng phương pháp xác định giới hạn DHA trong Artesunat nguyên liệu với những mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu và sử dụng được máy HPLC để áp dụng phương pháp HPLC vào kiểm nghiệm trong thời gian làm khoá luận. 2. Học tập cách nghiên cứu, trình bày một vấn đề khoa học. 3. Xây dựng được phương pháp xác định tạp DHA trong nguyên liệu và đánh giá phương pháp vừa xây dựng. Phần I: tổng quan 1. Tổng quan về Artesunat 1.1. Công thức [1], [7]: Công thức phân tử: C19H28O8 Trọng lượng phân tử: 384.4 TKH: Acid Dihydro Artemisinin Succinat. 1.2. Nguồn gốc, cách điều chế [10]: + Nguồn gốc: Artemisinin phân lập từ cây Thanh Hao Hoa Vàng có tác dụng tốt trong điều trị sốt rét kể cả chủng đã kháng cloroquin tuy vậy Artemisinin khó tan và điều trị bằng Artemisinin tái phát sớm mặc dù bệnh nhân sạch ký sinh trùng trong máu. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bán tổng hợp ra các dẫn chất của Artemisinin có tác dụng tốt hơn là DHA, Artemether, Arteether, Artesunat, Artelinic. Trong đó Artesunat có tác dụng tốt, tan trong dung dịch kiềm dùng để pha tiêm, điều trị bằng Artesunat ít bị tái phát vì vậy được dùng phổ biến hơn cả. + Bán tổng hợp: Artesunat là sản phẩm bán tổng hợp của Artemisinin qua sản phẩm trung gian là DHA. Trường Đại học Dược Hà Nội bán tổng hợp Artesunat qua 2 giai đoạn như sau: Giai đoạn 1: Artemisinin khử hoá nhóm lacton thành DHA bởi NaBH4/ MeOH ở 0oC–5oC, phương trình: Giai đoạn 2: DHA được ester hoá thành Artesunat khi tác dụng với anhydrit Succinic hoặc acid Succinic xúc tác là Dimethylamino Pyridin (dmpa) hay hỗn hợp dmpa và Dicyclohexyl Carbodiimid. Phương trình: Từ phương pháp điều chế trên có thể thấy tạp chất chính có trong Artesunat nguyên liệu là: DHA và acid Succinic. 1.3. Tính chất [1], [23]: Tinh thể không mầu hay bột kết tinh trắng, không mùi, dễ tan trong ethanol, aceton, cloroform, benzen, khó tan trong nước, kém bền trong môi trường kiềm hay acid. [a]D25= +100 đ + 140 1.4. Tác dụng: Diệt thể phân liệt trong máu của mọi chủng ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt tốt với sốt rét thể não do P.falciprum, không diệt thể giao bào và không tác dụng trên giai đoạn ngoại hồng cầu, cắt cơn sốt nhanh. 1.5. Dược động học [2]: Sinh khả dụng đường uống: 24-64%, t1/2=41phút bị giảm hoạt tính do chuyển hoá qua gan; qua được hàng rào máu não và nhau thai; thải qua nước tiểu: dạng deoxy. 1.6. Tác dụng không mong muốn: Nhẹ và thoảng qua: rối loạn tiêu hoá, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt. 1.7. Chế phẩm [15]: Có ba dạng: viên nén 50 mg Artesunat, bột pha tiêm 60 mg Artesunat, thuốc đạn 50 mg Artesunat. 1.8. Chỉ định [2]: Điều trị sốt rét do p. falciparum, p. malaria, p. vivax, kể cả p.falciparum đã kháng thuốc khác. 2. tổng quan về tạp DHA trong Artesunat nguyên liệu. 2.1. Tạp DHA và nguyên nhân gây tạp DHA trong Artesunat nguyên liệu [28], [27]. Bản thân DHA là thuốc điều trị sốt rét mạnh hơn cả Artemisinin tuy nhiên trong Artesunat thì DHA lại được coi như là tạp chất vì DHA rất ít tan, sinh khả dụng thấp, tác dụng kém hơn Artesunat vì vậy nếu lẫn nhiều DHA trong Artesunat sẽ làm giảm hiệu lực điều trị của thuốc, đồng thời DHA còn là chỉ thị cho mức độ tinh chế Artesunat và cũng là yếu tố đánh giá bảo quản thuốc. Nguyên nhân chính gây tạp DHA trong nguyên liệu artersunat: Tinh chế chưa tốt. Sản phẩm phân huỷ của Artesunat trong bảo quản. 2.2. Tổng quan về một số phương pháp xác định giới hạn tạp chất liên quan trong thuốc, ưu nhược điểm, các phương pháp xác định DHA. 2.2.1. Một số phương pháp xác định tạp chất liên quan trong thuốc và ưu nhược điểm. a. Làm phản ứng bán định lượng (hay áp dụng đối với tạp vô cơ) [5]: Lấy 2 ống nghiệm giống nhau để thực hiện phản ứng. ống 1 lấy chính xác1thể tích dung dịch thuốc đem thử. ống 2 lấy chính xác 1 thể tích dung dịch chuẩn. Sau đó tiến hành song song phản ứng thử tạp với cùng một thuốc thử rồi so sánh kết quả phản ứng ở 2 bình từ đó xác định giới hạn tạp có trong mẫu thuốc đem thử. Kết quả thường so sánh về mầu sắc, độ đục. Phương pháp đơn giản nhưng độ chính xác không cao, chỉ cho kết quả bán định lượng. b. Đo quang [1], [18]. Nguyên tắc là làm phản ứng mầu đặc trưng của tạp rồi đo độ hấp thụ của dung dịch mẫu so với độ hấp thụ của dung dịch có chứa tạp đó ở mức tiêu chuẩn trong cùng điều kiện. Phương pháp chỉ xác định mức giới hạn, việc áp dụng hạn chế do phải có phản ứng đặc hiệu. c. Sắc ký lớp mỏng [1], [18], [21]: Pha dung dịch thử của chế phẩm. Pha dung dịch chuẩn tạp có nồng độ bằng mức giới hạn quy định. Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng một lượng thể tích bằng nhau của hai dung dịch. Triển khai sắc ký, lấy ra sấy khô và so sánh vết tạp của dung dịch chuẩn tạp và vết tạp tương ứng của dung dịch thử. Yêu cầu vết tạp của dung dịch thử có diện tích và đậm độ không lớn hơn vết tạp của dung dịch chuẩn tạp. Nếu không có chuẩn tạp thì người ta thay dung dịch chuẩn tạp bằng chính dung dịch thử có nồng độ bằng mức giới hạn quy định của tạp và cũng tiến hành tương tự như trên, rồi so sánh vết tạp của dung dịch thử và vết chính trên sắc ký đồ của chuẩn của chất thử. Nhận xét: khi không có chuẩn tạp ngưới ta đã xem đáp ứng của tạp và chất thử là như nhau. d. Sắc ký lỏng hiệu năng cao [1, 18, 19]: Chuẩn hoá diện tích pic: Pha dung dịch thử và tiến hành sắc ký, ghi diện tích của tất cả các píc trừ píc dung môi và những píc có đáp ứng rất nhỏ (thường là những pic có đáp ứng nhỏ hơn 0.1 % so với tổng diện tích các pic). Phần trăm diện tích của mỗi pic được tính là phần trăm khối lượng mỗi chất có trong mẫu thử. Phương pháp này cho kết quả khá chính xác nhưng đã xem đáp ứng của các pic là như nhau khi nồng độ bằng nhau và tất cả các píc có trong mẫu thử đều cho đáp ứng trên sắc ký đồ. Để xác định đúng hàm lượng phần trăm mỗi chất (tạp chất) trong mẫu thử, cần xác định sự liên quan giữa tỉ lệ phần trăm diện tích pic với phần trăm hàm lượng giữa các chất, để đơn giản, thường xem hoạt chất có tỉ lệ này bằng: 1. Vì vậy cần xác định hệ số biến đổi phần trăm diện tích pic ra phần trăm hàm lượng (hệ số F). Khi đó phần trăm tạp được tính như sau: % Tạp = So sánh với chuẩn tạp (khi chỉ cần xác định giới hạn cho phép của tạp). Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn tạp có hàm lượng bằng giới hạn quy định và ghi đáp ứng các pic. Diện tích pic tạp của dung dịch thử tương ứng píc chuẩn tạp không được lớn hơn diện tích của pic chuẩn tạp. So sánh với chuẩn của thử. Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn, dung dịch này được pha từ dung dich thử có nồng độ so với dung dịch thử bằng giới hạn cho phép của tạp. Diện tích của bất kỳ pic tạp nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử không được lớn hơn diện tích pic chính của dung dịch chuẩn. Nhận xét: Các phương pháp trên khi không có hệ số đáp ứng đã coi hệ số đáp ứng bằng 1, trường hợp này rất khó xẩy ra. 2.2.2 Các phương pháp xác định tạp DHA trong Artesunat nguyên liệu. a. Phương pháp Dược Điển Việt Nam [1], [20]: Bằng sắc ký lớp mỏng. Pha tĩnh: Bản mỏng silicagel GF254. Dung môi: Ethylacetat : Toluen(1:1) Dung dịch thử: 10 mg chế phẩm trong 1ml Cloroform. Dung dịch đối chiếu1: 0,1 mg DHA/1ml Cloroform. Dung dịch đối chiếu 2: 0,05 mg DHA/1ml Cloroform. Dung dịch đối chiếu 3: 10 mg Artesunat chuẩn/1ml Cloroform. Chấm riêng biệt các dung dịch lên một bản mỏng, mỗi dung dịch 10ml.Triển khai sắc ký, hiện mầu bằng Vanilin 2%/H2SO4, sấy ở 100oC trong thời gian 10 phút. Bất kỳ vết nào ngoài vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử tương ứng với vết DHA không đậm hơn vết DHA của dung dịch đối chiếu 1 (Ê 1%). Ngoài vết chính và vết phụ tương ứng với DHA không được quá 1 vết đậm hơn vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu 2 (Ê 0,5%). Nhận xét: Phương pháp tiến hành khá phức tạp, kết quả còn phụ thuộc chủ quan và chưa cho kết quả xác định chính xác hàm lượng tạp. b. Phương pháp của Dược Điển Quốc Tế (volume 5) [19]: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột: (12,5´3mm; 5mm). Pha động: Acetonitril R: Đệm pH3 (50:50) Tốc độ dòng: 0,6ml/phút. Nhiệt độ: 30oC Thể tích tiêm: 20ml. Dung dịch A: 4mg/ml Artesunat nguyên liệu. Dung dịch C: 0,04mg/ml Artesunat nguyên liệu. Tiêm 20 ml dung dịch A ghi kết quả. Tiêm 20 ml dung dịch C ghi kết quả. Diện tích của bất kỳ pic nào trên sắc ký đồ của dung dịch A trừ pic chính không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của C (Ê 1%). Không được có hơn một pic có diện tích lớn hơn 1/2 diện tích pic chính của C (> 0,5%). Tổng diện tích các pic tạp (bỏ qua pic có diện tích nhỏ hơn hoăc bằng 0,1% diện tích pic chính của C) không lớn hơn 2 lần diện tích của pic chính của C (< 2 %). Nhận xét: Phương pháp đã thừa nhận đáp ứng pic của DHA và Artesunat là như nhau khi hàm lượng bằng nhau. 3. Tổng quan về phương pháp HPLC. 3.1. Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao [6]. a. Khái niệm về sắc ký: Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách các thành phần trong mẫu dựa vào sự phân bố khác nhau vào hai pha, là pha động và pha tĩnh. Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ trên nền chất rắn. Pha rắn được nhồi trong cột hay tráng trên bản mỏng hay dàn thành film. Pha động là khí hay chất lỏng. Sự tách là do hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ. b. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao: HPLC là một phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha không trộn lẫn với nhau. Trong đó, pha động là chất lỏng được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực cao của một bơm cao áp. Sắc ký lỏng dựa trên cơ sở là cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hoá học ở bề mặt. 3.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký [11]. Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất lỏng có tính chất phân bố thì ta có sắc ký phân bố. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. Để kéo chất phân tích ra khỏi cột tách chúng ta sử dụng một pha động. Ví dụ: Nếu ta nạp một mẫu gồm 3 chất là A, B, C vào cột tách thì khi bơm pha động qua cột tách các quá trình sắc ký xẩy ra, khi đó A, B, C tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột tách. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng của các tương tác: Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1). Tương tác giữa chất phân tích và pha động (F2). Tương tác giữa pha tĩnh và pha động (F3). Theo sơ đồ sau: Chất phân tích A, B, C F2 F1 Pha động Pha tĩnh F3 Trong đó tương tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định. 3.3. Cơ sở lý thuyết sắc ký. Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tuỳ theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải tách được các chất ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát hiện và ghi dưới dạng pic. Tín hiệu của cả quá trình sắc ký cho ta sắc ký đồ. Một sắc ký đồ sẽ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào thành phần mẫu. 3.4. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống săc ký. a. Hệ thống bơm: Bơm được xem là một trong những thành phần quan trọng nhất của hệ thống sắc ký. Bơm đẩy dung môi qua hệ thống với một tốc độ hằng định. * Có hai loại bơm: + Một là bơm áp suất hằng định, ít được áp dụng. + Hai là bơm tốc độ dòng hằng định, loại bơm này được áp dụng cho phân tích HPLC thông thường. b. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi. Bình chứa dung môi thường bằng thuỷ tinh đôi khi bằng thép không gỉ. Cần lọc loại các hạt trong dung môi (0,45mm) và đuổi khí hoà tan trong dung môi. Trong phương pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi. Trong phương pháp gradien cần tới 2, 3, 4 bình chứa các dung môi. c.Hệ tiêm mẫu: Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động. d. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký. Vì ở cột sẩy ra quá trình tách các chất. Cột đóng vai trò rất quan trọng tới khả năng tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký. Một cách đại cương có thể chia ra 3 loại cột: - Cột tách phân tích: dài 10-25 cm, đường kính 2-5mm. - Cột bán điều chế: dài 50 – 100 cm, đường kính 5 – 10cm - Cột tách điều chế: dài 100 – 150 cm, đường kính 10 - 50cm e. Detector trong HPLC. Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động từ cột sắc ký đi ra liên tục. Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các chất hay hợp chất của chúng dựa theo một tính chất hoá lý nào đó của chất phân tích. Thường có các loại Detector sau: - Detector UV- VIS. - Detector huỳnh quang. - Detector phổ phát xạ nguyên tử. - Detector điện hoá, cực phổ. - Detector đo thế. - Detector đo độ dẫn điện - Detector khúc xạ kế. f. Bộ phận ghi tín hiệu: gồm có Recorder, Computer. 3.5. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng [1], [18], [21]. a. Thời gian lưu và thể tích lưu (Retention time). - tR và VR = tR´Fc (Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian). tR là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ. vR là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ. tR và VR là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chât tan vì vậy hai đại lượng này phụ thuộc vào: Tính chất pha tĩnh, bản chất pha động, tốc độ dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ,.. b. Hệ số phân bố K. K = k.Cs/Cm Cs và Cm là nồng độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột. K chỉ phụ thuộc vào: Bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ. K lớn thì tRlớn (ra muộn). K nhỏ thì tR nhỏ (ra sớm). c. Thừa số dung lượng K’. K’ = + tR là thời gian lưu. + td là thời gian chết. K’phụ thuộc: Bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột: Vs / Vm. K’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp. Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tich sao cho: 1Ê K’ Ê 8. Nếu K’ < 1 thì pic ra sớm dễ lẫn với pic tạp. Nếu K’ > 8 thì thời gian phân tích sẽ quá dài. d. Tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất. Được đánh giá qua thừa số chọn lọc (selectivity-factor). a = Để tách riêng hai chất thường chọn a = 1,05 - 2,0. Nếu a càng lớn 2 chất tách nhau càng tốt, a nhỏ 2 chất khó tách nhau, nhưng a quá lớn thì thời gian phân tích sẽ quá dài. Giá trị a phụ thuộc yếu tố quyết định t’RA và t’RB. e. Độ phân giải (Resolution). Là đại lượng đo mức độ tách 2 chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B). RS = Như vậy Rs phụ thuộc vào: + Hiệu lực cột. + Thừa số chon lọc a. + Thừa số dung lượng K’B. Rs tối ưu ³ 1,5. Có thể làm tăng Rs bằng cách: Tăng N: Tăng chiều dài cột, giảm tốc độ dòng, cách này ít hiệu quả. Tăng K’B: Thay đổi pha động làm Rs thay đổi lớn. Tăng a: Thay đổi pha động hay pha tĩnh sẽ làm Rs thay đổi lớn. f. Hệ số bất đối AF. AF = b= một nửa w ở phía sau pic. a= một nửa w ở phía trước pic. W là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao pic. Yêu cầu AF = 0,9 - 2. Vai trò: AF càng gần 1 thì pic càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết quả tính diện tích pic càng chính xác. - Yếu tố ảnh hưởng: Cột: Cột tốt AF sẽ tốt. pH: quyết định dạng tồn tại của chất tan từ đó có ảnh hưởng nên AF. Thể tích tiêm - Cách cải thiện AF: Chọn cột thích hợp. Điều chỉnh pH để chất tan tồn tại ở một dạng thích hợp. Thể tích tiêm thích hợp. g. Số đĩa lý thuyết N. N= Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột. Khi phân tích yêu cầu N ³ 3000. Từ công thức ta thấy N phụ thuộc vào tR và W (độ rộng đáy pic). tR càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài. W hay W1/2 (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càng bé thì N càng lớn nhưng WB và W1/2 sẽ bé hơn nếu tR bé. Khi tR cố định thì bản chất cột, pha động, tốc độ, pH là yếu tố quyết định trong đó cột đóng một vai trò rất quan trọng. Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị chiều dài cột. N= Khi các điều kiện khác là cố định thì cột nào có N lớn hơn cột đó có hiệu lực cao hơn. 3.6. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký. a. Lựa chọn cột (pha tĩnh). Vì phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu này là sắc ký hấp phụ nên các phân tích dưới đây chỉ tập trung vào lựa chọn pha tĩnh cho sắc ký hấp phụ. Sắc ký hấp phụ có hai loại là: Sắc ký hấp phụ pha thuận (normal phase - HPLC). Sắc ký hấp phụ pha đảo (Reverse phase- HPLC). Bản chất chính của sự tách sắc ký loại này là dựa trên tính chất hấp phụ bề mặt của pha tĩnh. Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ. Trong sắc ký pha thuận thì pha tĩnh sẽ phân cực còn pha động không phân cưc, chất phân tích thường là các chất ít phân cực. Pha tĩnh có thể ở hai trạng thái: trạng thái lỏng (LLC), trạng thái rắn (LSC). Nếu pha tĩnh ở trạng thái lỏng thì nó phải được mang bởi các hạt chất mang kích thước nhỏ từ 5–10 mm. Nền các hạt thường có bản chất là Silica, Oxid Nhôm, Cellulose, nền mạch Cacbon. Trong đó Silicagel là có ưu việt hơn và được sử dụng rãi hơn cả. Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC. Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký. Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định. Tính chất bề mặt ổn định. Cân bằng động học của sự tách phải xẩy ra nhanh và lặp lại tốt. Cỡ hạt phải đồng nhất. Vì Silica là loại pha tĩnh hay dùng và ưu việt nên ở đây giới thiệu về một số loại Silica: Silica trung tính, trên bề mặt còn có các nhóm OH phân cực (ưa nước). Loại này sử dụng làm pha tĩnh cho sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực. Silica đã Alkyl hoá, được điều chế bằng cách Alkyl hoá các nhón OH trên bề mặt Silica bằng các gốc Alkyl – R của mạch Cacbon (C2, C8, C18) hay các gốc Cacbon vòng. Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica đã alkyl hoá được sử dụng cho sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion. Silica Sulfon hoá hay Nitro hoá để làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi cation. Silica amin hoá dùng làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi anion. b. Lựa chọn pha động cho HPLC. Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của 2, 3 dung môi theo tỉ lệ nhất định. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tR và hiệu quả tách. Pha động có thể ảnh hưởng tới: Độ chọn lọc của hệ pha động. Thời gian lưu giữ của chất tan. Hiệu lực tách của cột. Độ phân giải của chất tan trong một pha tĩnh. Độ rộng của pic sắc ký. Vì những lý do đó nên khi các điều kiện khác đã cố định thì việc chọn pha động thích hợp là rất quan trọng. Yêu cầu của một pha động: Phải trơ đối với pha tĩnh. Phải hoà tan được chất mẫu. Phải bền vững theo thời gian. Phải có độ tinh khiết cao. Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký. Phù hợp với loại detector. Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường. Trong sắc ký pha thuận thì pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực (kỵ nước) như: n_Hecxan, n_Heptan, Benzen, Cloroform, . Các pha động này thường được bão hoà nước. Trong sắc ký pha đảo thì pha động là hệ dung môi phân cực như: Nước, Methanol, Acetonitril, hay hỗn hợp của chúng. Các dung môi đó có thể hoà tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ. c. Chọn đệm pH [29]. Trong nhiều trường hợp của sắc ký hấp phụ pha đảo thường phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. pH thường phải ổn định trong trường hợp sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hay base. Nếu pH thích hợp sẽ góp phần làm cho kết quả tách tốt hơn. Thông thường với chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid nhưng cũng có trường hợp đặc biệt, còn sắc ký tạo cặp ion thì pH tuỳ từng trường hợp. d. Tốc độ pha động. Sau khi có pha động, pha tĩnh, pH thích hợp thì một yếu tố cần lựa chọn để quá trình tách tốt hơn là tốc độ pha động. 3.7. ứng dụng của HPLC [6], [7], [21]. Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính. a. Định tính: Vị trí của pic thử trên sắc đồ phải tương ứng với vị trí trên sắc đồ của chất chuẩn đối chiếu. Tuy nhiên việc định tính đơn thuần bằng HPLC không đảm bảo tính chắc chắn. b. Sắc ký điều chế: Qua quá trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa giải được hứng riêng rồi bốc hơi dung môi thu lấy chất. c. Định lượng: Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp. Khi sắc ký chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và được định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích của pic đáp ứng. Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong kỹ thuật HPLC là: Phương pháp chuẩn ngoại: Cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó diện tích pic thu được từ mẫu thử được so sánh với diện tích pic thu được từ mẫu chuẩn. Kết quả có thể được tính theo một trong các cách sau đây: Chuẩn hoá một điểm: Cx = Xây dựng đường chuẩn tuyến tính: Thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính rồi tính kết quả định lượng dựa vào phương trình hay đồ thị: Y = ax + b Phương pháp chuẩn nội. Thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là chuẩn nội. Khi đó nồng độ chất thử được tính theo công thức: Cx = Trong đó: Cx và Cis là nồng độ chất thử và chất chuẩn. Ax và Ais diện tích pic của thử và chuẩn. Fx là hệ số hiệu chỉnh: Fx = Cũng có thể tính kết quả thông qua xây dựng đường chuẩn quan hệ giữa Cx và Ax/Ais. Phương pháp thêm chuẩn. Phương pháp náy kết hợp cả hai phương pháp chuẩn nội và chuẩn ngoại. Kết quả tính theo công thức: Cx = DC là nồng độ chuẩn thêm vào. DS là chênh lệch diện tích sau khi thêm chuẩn. Sx và Cx là diện tích và nồng độ thử khi chưa thêm chuẩn. Kết quả có thể tính toán dựa vào một pic không muốn định lượng của mẵu thử như là chất chuẩn: Yx = (ythêm) Ra/Rthêm. Với Ra = Sx/Skđl (chưa thêm). Rb = Sxt/Skđlt (đã thêm chuẩn x). Rthêm = Rb - Ra Hay cũng có thể tính kết quả từ việc thiết lập đường chuẩn giữa hiệu số diện tích (DS) cuả pic tổng (thử+ chuẩn) và diện tích của pic thử với nông độ của chất chuẩn (C chuẩn). Phương pháp chuẩn hoá diện tích pic. Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều cấu tử được tính bằng tỉ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần. Yêu cầu: Tất cả các thành phần đều được rửa giải và phát hiện. Tất cả các thành phần có đáp ứng như nhau với detector. Khi đó hàm lượng chất thử được tính như sau: %X= Tuy vậy trong sắc ký lỏng thì điều kiện tất cả các thành phần đều có đáp ứng như nhau với detector là rất khó. Khắc phục nhược điểm này, trong sắc ký lỏng người ta xây dựng hệ số đáp ứng cho từng thành phần. Để xây dựng hệ số đáp ứng ta chọn một thành phần làm chuẩn có hệ số đáp bằng 1. Các thành phần khác có hệ số đáp ứng tính theo công thức sau: Fx = Sc và Sx là diện tích pic của thành phần chọn làm chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ số đáp ứng. Cc và Cx là nồng độ của thành phần chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ số đáp. fc là hệ số hiệu chỉnh của chuẩn, khi đó hàm lượng của thành phần X tính theo công thức : %X = Đây là phương pháp hay áp dụng để định lượng tạp chất trong thuốc. Phương pháp này được chúng tôi chọn áp dụng để áp dụng để xác định tạp DHA. Cách xác định hệ số đáp ứng. Cách 1: Dựa vào phương trình tuyến tính ở nồng độ khảo sát của mỗi chất và tính ra hệ số đáp ứng theo biến đổi toán học. Nếu chất A có phương trình tuyến tính là yA =k1xA + b1, B có phương trình tuyến tính y = k2xB + b2 thì khi yA = yB ị FB = xA/xB = k1/k2 + (b2- b1)/k1xB với xB nằm trong khoảng khảo sát ta tính được giá trị gần đúng của F là F. Cách 2: Xác định giá trị của độ hấp thụ riêng của từng chất và tính hệ số đáp ứng dựa vào độ hấp thụ riêng. Ví dụ: có hai chất A và B, A được chon làm chất chuẩn có hệ số đáp ứng là 1, khi đó hệ số đáp ứng của B sẽ là: F = E11A/E11B. Cách 3: Tính hệ số đáp ứng dựa vào kết quả đo tại từng điểm rồi tính hệ số hiệu chỉnh trung bình của các điểm. Ví dụ có 2 chất A và B trong đó A là chất làm chuẩn ta phải tính hệ số hiệu chỉnh cho B. Kết quả xác định ở nồng độ 100 % của A là SA, kết quả xác định của B ở 5 mức nồng trong khoảng khảo sát tuyến tính là S1B, S2B, S3B, S4B, S5B ta lần lượt sẽ có F1B = SA/S1B, F2B = SA/S2B, F3B =SA/S3B, F4B = SA/S4B, F5B = SA/S5B và Ftb = (F1B + F2B + F3B + F4B + F5B)/5 (Ftb là hệ số đáp ứng trung bình). d. Xác định giới hạn định lương bằng HPLC. Cách 1 [24]: Pha một số dung dịch có nồng độ thấp dần rồi tiến hành sắc ký định lượng. Giới hạn định lượng sẽ là nồng độ thấp nhất mà ở đó kết quả định lượng đảm bảo tính đúng và tính chính xác. Cách 2 [24]: xác định độ nhiễu đường nền bằng cách tiêm 20 mẫu trắng ghi đáp ứng pic tại vị chí của pic đang nghiên cứu (yblank) và tính độ lêch chuẩn của các kết qủa (Sblank). Từ đó tính được độ nhiễu tín hiệu đường nền là sblank và giới hạn tín hiệu đinh lương là yblank + 10sblank. Nồng độ giới hạn định lượng đươc suy ra từ kết quả so sánh tín hiệu đáp ứng của các dung dịch có nồng độ thấp với tín hiệu giới hạn định lượng. Cách 3 [26]: phương pháp phương trình hồi quy ở nồng độ gần nồng độ giới hạn theo dự tính. Pha 5 mức dung dịch ở 5 nồng độ liền kề với nồng độ giới hạn định lương ước tính, tiến hành sắc ký ghi kết quả, thành lập phương trình tuyến tính từ các kết quả trên dạng y = ax + b (y là đáp ứng pic, x là nồng độ dung dịch). ở mức nồng độ thấp nhất làm 5 lần và tính độ lệch chuẩn của các kết quả(s), giới hạn tín hiệu phát hiện sẽ là:y = 3s + b. Từ phương trình hồi quy và phương trinh tính giới hạn tín hiệu phát hiện tính ra nồng độ giới hạn phát hiện: xlod = 3s/a và nồng độ giới hạn định lượng: xloq = 10xloq/3 Cách 4 [24]: Tiến hành sắc ký, ghi sắc ký đồ. Xác định độ nhiễu đường nền ở vùng thời gian lưu của chất nghiên cứu từ sắc ký đồ của mẫu trắng. Giới hạn tín hiệu định lượng bằng 10 lần độ nhiễu đường nền. Từ đó suy ra giới hạn định lượng bằng cách so sánh giới hạn đinh lượng với đáp ứng của dung dịch có nồng độ rất thấp. Phần ii: Thực nghiệm và kết quả 1. Đối tượng, hoá chất, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu. 1.1. Đối tượng: Artesunat nguyên liệu do trường ĐH Dược sản xuất DHA đã tinh chế lại do trường ĐH Dược sản xuất Acid Succinic chuẩn 1.2. Phương tiện, dụng cụ, hoá chất: a. Phương tiện dụng cụ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao : Dionex_ Detector UV diode array Máy siêu âm : Sonorex Máy đo pH Meter 3305-Jenway Màng lọc chân không: Satorius Cân phân tích Mettler AB204 độ chính xác 0.1mg. Bình định mức 25 ml, 50ml, 100ml, 1000 ml. Cốc đong 100ml, 1000ml. Pipet chính xác, Pipet thường các loại đũa thuỷ tinh. Màng lọc Milipore 0.45ml, màng lọc 0.45ml. Tủ sấy, bơm tiêm, lọ đựng mẫu b. Hoá chất: Artesunat nguyên liệu do bộ môn công nghiệp dược trường Đh Dược sản xuất. Artesunat chuẩn của viện kiểm nghiệm hàm lượng 98,6% (sks 019261) của viện kiểm nghiệm bộ y tế. DHA do bộ môn công nghiệp sản xuất đã tinh chế lại. Acid Succinic chuẩn. KH2PO4: PA KOH : PA MeOH, Acetonitril dùng cho HPLC. Chuẩn pH 6,88; pH 9,22 1.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu. a. Nghiên cứu phương pháp và cải tiến phương pháp định lượng Artesunat nguyên liệu để xây dựng phương pháp xác định tạp DHA trong nguyên liệu. Tham khảo các phương pháp kiểm nghiệm Artesunat nguyên liệu đang áp dụng, chú ý phương pháp xác định tạp DHA. Nghiên cứu phương pháp HPLC và ảnh hưởng của các yếu tố pha động, pha tĩnh, nhiệt độ, tốc độ, pH, bản chất của chất phân tích trong quá trình sắc ký. Phân tích các đặc tính của Artesunat, DHA, acid Succinic và phương pháp HPLC định lượng Artesunat nguyên liệu của sinh viên Lê Thanh Tùng (2004) để tìm cách cải tiến các điêu kiện sắc ký Tiến hành thực nghiệm để lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp và xây dựng phương pháp xác định DHA trong Artesunat nguyên liệu bằng HPLC. b. Đánh giá phương pháp vừa xây dựng: Đánh giá tính tuyến tính. Đánh giá tính chính xác. Đánh giá tính đúng. Xác định giới hạn định lượng. Xác định hệ số biến đổi khi không có DHA chuẩn để định lượng DHA trong Artesunat nguyên liệu. 1.4. Một số công thức sử dụng tính toán thống kê [8]. giá trị trung bình: = độ lệch chuẩn Sd: Sd= độ lệch chuẩn tương đối Rsd: Rsd (%) = .100 Sai số chuẩn Sx: Khoảng tin cậy: 2. thực nghiệm và kết quả 2.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện sắc ký: Dựa trên kết quả nghiên cứu của khoá luận tốt nghiệp duợc sỹ đại học 2004 của sinh viên Lê Thanh Tùng về nghiên cứu định lượng Artesunat nguyên liệu bằng HPLC: Điều kiện sắc ký: Pha động: MeOH: Đệm pH3 (60:40) Cột: Nucleosil C18 (250´4,6mm; 5ml). Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút. Nhiệt độ: nhiệt độ phòng. Detector: UV = 216 nm. Thể tích tiêm: 20ml(dung dịch 4mg/ml) Kết quả tách và định lượng được Artesunat với thời gian lưu của 3 pic như sau: Pic acid Succinic tR= 2.673 phút Pic Artesunat tR= 7,220 phút Pic DHA tR= 27,540 phút Từ kết quả trên ta thấy DHA lưu giữ quá lâu vì vậy khi xác định DHA sẽ rất tốn kém thời gian, tiền bạc, mặt khác 3 pic trên tách nhau khá xa nên chúng tôi tìm cách thay đổi điều kiện pha động để thời gian lưu của DHA ngắn lại và vẫn đảm bảo tách được 3 pic. Từ phân tích lý thuyết và thực nghiệm chúng tôi nhận thấy: A.Succinic rất phân cực nên bị lưu giữ ngắn và ít phụ thuộc vào tỉ lệ pha động. DHA không phụ thuộc pH nhưng rất khó tan trong nước và dễ tan trong MeOH vì vậy thời gian lưu của DHA sẽ phụ thuộc rất nhiều vào tỉ lệ MeOH, MeOH càng nhiều thì thời gian lưu của DHA càng ngắn lại. Artesunat phụ thuộc pH, tuy nhiên dưới dạng muối kim loại kiềm Artesunat tan trong nước nhiều hơn DHA (nhất là ở pH = 7,1). Qua khảo sát chúng tôi thấy rằng ở pH = 7.1 thì 3 pic trên tách tốt nhất Từ phân tích trên chúng tôi đã tiến hành khảo sát với hệ pha động gồm: MeOH: Đệm pH7,1 với tỉ lệ MeOH tăng dần như sau: 1. MeOH: Đệm pH7,1 (62:38) 2. MeOH: Đệm pH7,1 (65:35) 3. MeOH: Đệm pH7,1 (68:32) 4. MeOH: Đệm pH7,1 (70:30) Kết quả thấy rằng hệ 4: MeOH: Đệm pH7,1 (70:30) đảm bảo vừa đủ việc tách a.Succinic , Artesunat , DHA và rút ngắn thời gian lưu của DHA nhất. Vì vậy chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký để nghiên cứu xác định DHA trong nguyên liệu Artesunat như sau: Cột: Nucleosil C18 (250´4.6 mm; 5mm). Pha động: MeOH: Đệm pH7,1 (70:30) Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút Nhiệt độ: nhiệt độ phòng. Thể tích tiêm: 20 ml (dung dịch 4mg/ml) Trên cơ sở quy định của Dược Điển VN: giới hạn DHA< 1% vì vậy chúng tôi sẽ khảo sát DHA ở mức 1% so với nguyên liệu (nồng độ làm việc ở100% của DHA là 0,04 mg/ml). 2.2. Thử tính thích hợp của hệ thống Các pic dùng trong định lượng phải đảm bảo được một số yêu cầu thì mới sử dụng trong phân tích để đảm bảo chính xác cho kết quả, vì vậy cần phải đánh giá tính thích hợp của hệ thống. Tiến hành: Tiến hành sắc ký 5 mẫu Artesunat (nồng độ 4 mg/ml) có thêm 1% DHA để đánh giá các thông số. Kết quả ở bảng dưới đây: Stt Pic Artesunat Pic DHA Hệ số bất đối Diện tích Hệ số bất đối Diện tích 1 1.10 85.620 1.06 0.684 2 1.09 85.630 1.07 0.682 3 1.12 85.650 1.08 0.680 4 1.10 85.600 1.07 0.681 5 1.08 85.630 1.06 0.681 độ lệch chuẩn tương đối RSd = 0.0182 % RSd = 0.0152 % sd = 0.0152 Như vậy các giá trị của hệ số bất đối (As) đều nằm trong khoảng: 0.9- 2.0, RSd < 2% Có nghĩa là hệ thống thích hợp để định lượng Artesunat và DHA 2.3. Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp xác định DHA trong Artesunat nguyên liệu. Khảo sát từ khoảng nồng độ DHA từ 0.2% đến 2% so với nồng độ nguyên liệu 4 mg/ml nghĩa là (0.008mg/ml- 0.08mg/ml). Tiến hành: Pha 5 mức nồng độ như sau: 0.02% (0.008mg/ml), 0.05% (0.02mg/ml), 1% (0.04mg/ml), 1.5% (0.06mg/ml), 2% (0.08mg/ml). Mỗi nồng độ tiến hành sắc ký 3 lần theo quy trình rồi lấy kết quả trung bình. Ta được kết quả như bảng dưới đây: Nồng độ (mg/ml) 0.008 0.02 0.04 0.06 0.08 Diện tích (mAu.min) 0.141 0.344 0.682 0.999 1.377 Từ kết quả ta có đồ thị phương trình hồi quy tuyến tính của DHA: Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 17.003x+ 0.001 Hệ số tương quan: r = 0.9996 (r > 0.99) Y_intercep = 0.001 (= 0.006% so với giá trị ở 100%) Độ lệch chuẩn của y_intercep: sb = 0.0135 Khoảng tin cậy của y_intercep: 0.001 +/- 0.0192 (chứa 0) Vì vậy có sự phụ thuộc tuyến tính cao giữa nồng độ và đáp ứng ở khoảng khảo sát: 0.2% - 2% DHA so với nguyên liệu. 2.4. Tính chính xác của phương pháp xác định DHA trong Artesunat nguyên liệu. Xác định ở nồng độ làm việc của DHA 100% là 0.04mg/ml (1% so với nguyên liệu). Tiến hành: Pha 6 mẫu thử DHA ở nồng độ 1% so với nguyên liệu, đồng thời làm mẫu chuẩn DHA tương đương, rồi sắc ký theo quy trình, lấy kết quả. Cách pha: Cân lượng DHA chính xác khoảng 10.0 (mg) rồi pha trong bình định mức 50 (ml) được dung dịch 0.2 mg/ml, lấy chính xác 10 ml dung dịch trên pha loãng trong bình định mức 50 ml được dung dịch 0.04 mg/ml (1%) Kết quả ở bảng dưới: Tt Khối lượng chuẩn(mg) Diện tích (mAu.min) Khối lượng Thử (mg) Diện tích (mAu.min) Hàm lượng(%) 1 10.0 0.681 9.9 0.678 100.56 2 10.0 0.681 10.0 0.680 99.85 3 10.0 0.681 10.1 0.684 99.45 4 10.0 0.681 10.1 0.681 99.01 5 10.0 0.681 10.1 0.681 99.01 6 10.0 0.681 10.2 0.684 98.47 Hàm lượng trung bình C = 99.39% Độ lệch chuẩn Sd = 0.737 Độ lệch chuẩn tương đối Rsd = 0.742 % (< 2%) Khoảng tin cậy của hàm lượng: 99.39 +/- 0.774 Vậy phương pháp xác định DHA là chính xác. Sắc ký đồ của DHA thử : No. Ret.Time Peak Name Heigh Area Rel.Area Amou Type Min mAU mAU*min % 1 13.32 na 0.411 0.684 100.00 na BMB* Total: 0.938 1.118 100.00 0.000 2.5. Tính đúng của phương pháp xác định DHA trong nguyên liệu Artesunat Nguyên tắc: Vì nguyên liệu Artesunat chưa xác định rõ hàm lượng DHA nên xác định tính đúng phải theo phương pháp thêm ở 3 mức nồng độ theo dãy nồng độ khảo sát là: 0.2% (0.008mg/ml), 1% (0.04mg/ml), 1.5 % (0.06mg/ml) (từ kết quả khảo sát nguyên liêu có hàm lượng DHA khoảng 0.3 %) -Tiến hành: ã Pha dung dịch chuẩn DHA: Cân chính xác khoảng 25,0 (mg) DHA chuẩn cho vào bình định mức 50 (ml) hoà tan và thêm dung môi đến vạch được dung dịch (1) (0.5mg/ml) lấy chính xác 5ml dung dịch (1) pha loãng thành 25 ml trong bình định mức 25 ml được dung dịch (2) ( 0.1mg/ml) Pha dung dịch nguyên liệu Artesunat 4mg/ml : cân chính xác khoảng 0.1000(g) nguyên liệu Artesunat pha trong bình định mức 25 ml, làm 5 mẫu, tiến hành sắc ký xác định DHA trong nguyên liệu ã Dung dịch Artesunat nguyên liệu thêm 0.2% chuẩn DHA so với nguyên liệu. tiến hành như trên nhưng thêm chính xác 2.00 ml dung dịch (2), làm 3 mẫu tiến hành sắc ký lấy kết quả trung bình. ã Dung dịch Artesunat nguyên liệu thêm 1% chuẩn DHA so với nguyên liệu. Làm như trên nhưng thêm 10.00 ml dung dịch (2), làm3 mẫu, tiến hành sắc ký lấy kết quả trung bình. ã Dung dịch Artesunat nguyên liệu thêm 1.5 % chuẩn DHA so với nguyên liệu. Làm như trên nhưng thêm 15.00 ml dung dịch (2), làm 3 mẫu lấy kết quả trung bình. Các kết qủa trình bày ở bảng sau: Nồng độ thêm Lượng thêm (mg) Lượng thu hồi (mg) % tìm lại Khoảng tin cậy (%) 0.2% 0.200 0.198 99.0 99.0 +/- 0.4 1 % 1.00 0.996 99.6 99.6 +/- 0.2 1.5 % 1.50 1.50 100.0 100.0 +/- 0.4 Vậy % thu hồi luôn nằm trong khoảng: 98% - 102% Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất thêm vào và lượng thu hồi của hoạt chất: y = 1,001x - 0,003 Độ lệch chuẩn “residual”: S = 0.00262 Độ lệch chuẩn của a: Sa = 0.00283 Độ lệch chuẩn của y_ intercep: Sb = 0.00296 Khoảng tin cậy của độ dốc: 1.001+/-0.031(chứa 1) Khoảng tin cậy của y_ intercep: - 0.003 +/- 0.038 (chứa 0) Vậy không có sai số hệ thống Không có sai số hằng định Phương pháp là đúng. 2.6. Tính đặc hiệu của phương pháp xác định DHA trong Artesunat nguyên liệu. Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn DHA và ghi sắc ký đồ. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn DHA: Từ sắc ký đồ trên ta thấy chỉ có 1 pic của DHA tại thời gian lưu là: tR = 13.32 phút Sắc ký mẫu trắng (MeOH: H2O (70:30)), ghi sắc ký đồ. Sắc ký đồ của của mẫu trắng: từ sắc ký đồ của mẫu trắng ta thấy không có pic lạ nào ở thời gian lưu của DHA Tiến hành sắc ký dung dịch Artesunat nguyên liệu 4mg/ml có thêm DHA và acid Succinic. Ta có sắc ký đồ: No. Peakname Ret.Time Area Amount Type Height Rel.Area Resolution min mAU*min mAU % 1 n.a. 2.847 1.5812 n.a. BMB 3.371 6.54 2.03 2 n.a. 4.42 21.4772 n.a. BMB 40.483 88.83 6.5 3 n.a. 13.327 1.1208 n.a. BMB* 0.924 4.64 n.a. Total: 24.1791 0 44.777 100 (Sắc ký đồ đánh giá độ phân giải) Kết quả ở bảng: Chất Thời gian lưu tR(min) Độ phân giải Rs Acid Succinic 2.847 Artesunat 4.420 2.03 DHA 13.327 6.5 Như vậy acid Succinic và Artesunat có độ phân giải Rs = 2,03 hai pic coi như tách nhau hoàn toàn Artesunat và DHA có độ phân giải Rs = 6,50 hai pic tách hoàn toàn Vậy phương pháp định lượng Artesunat và xác định DHA trong nguyên liệu xây dựng ở đây có tính đặc hiệu cao 2.7. xác định giới hạn định lượng DHA theo phương pháp xây dựng. Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất của DHA mà ta có thể định lượng đảm bảo tính đúng và tính chính xác theo phương pháp ta xây dựng. Cách xác định: - Theo ước tính giới hạn định lượng DHA ở khoảng 0,05% so với nguyên liệu nồng độ 4mg/ml. - Vì vậy tiến hành xác định đáp ứng của DHA ở 5 khoảng nồng độ liền kề đó là: 0.05% (0.002mg/ml), 0.1% (0.004mg/ml), 0.2% (0.008mg/ml), 0.3% (0.012mg/ml), 0.4% (0.016mg/ml) Kết quả ở bảng sau: Nồng độ (%) 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 Diện tích (mAu.min) 0.060 0.102 0.135 0.206 0.272 Phương trình đường chuẩn: Y = 0.586x + 0.032 (1) (r = 0.992) x là nồng độ chuẩn DHA ở nồng độ thấp nhất 0.05%: xác định 5 kết quả và tính độ lệch chuẩn(Sd). Kết quả ở bảng sau: Tt Diện tích s (mAu.mim) Thống kê 1 0.0589 Stb = 0.0606 Stb =Sd 0s.0606S 2 0.0601 3 0.0610 4 0.0650 5 0.0580 Ta có phương trình tín hiệu của giới hạn phát hiện là: Y = 3Sd + b =3Sd + 0.032 (2) Từ (1) và (2) ta có cách tính nồng độ giới hạn phát hiện: 3Sd+0.032 = 0.586xlod + 0.032 => xlod = 3Sd/0.586 Vậy giới hạn định lượng là: xloq= 10.xlod/3 = 0.0463 % hay 1.85 mg/ml 2.8. xây dựng cách xác định DHA trong nguyên liệu artessunat khi không có DHA chuẩn: Trong kiểm nghiêm thuốc để thuận tiện cho việc xác định tạp chất thường người ta không sử dụng chất chuẩn tạp mà lấy đáp ứng pic tạp nhân với hệ số biến đổi để tính ra hàm lượng phần trăm của tạp. Do hàm lượng Artesunat và DHA trong mẫu thử ổn định vì vậy chúng tôi tiến hành xác định hệ số biến đổi F dựa vào khoảng thay đổi nồng độ của các chất này. Xác định khoảng tuyến tính của Artesunat nguyên liệu. Tiến hành xác định khoảng tuyến tính của Artesunat nguyên liệu trong khoảng 80 % - 120 % nồng độ làm việc 4 mg/ml (3.2 mg/ml - 4.8 mg/ml) theo phương pháp xây dựng. Kết quả ở bảng dưới đây: Nồng độ (mg/ml) 3.2 3.6 4.0 4.4 4.8 Diện tích (mAu.min) 68.36 77.03 85.63 94.81 102.69 Sắc ký đồ của Artesunat chuẩn ở nồng độ 110 %. No. Peakname Ret.Time Area Amount Type Height Rel.Area Resolution min mAU*min mAU % 1 n.a. 3.207 0.2393 n.a. BMB* 0.374 0.25 1.15 2 n.a. 4.473 94.0914 n.a. BMB* 146.73 99.6 5.17 3 n.a. 12.653 0.1432 n.a. BMB* 0.111 0.15 n.a. Total: 94.4739 0 147.215 100 đồ thị: Phương trình hồi quy: y = 21.60x –0.74 Hệ số tương quan: r = 0.9995 Y_intercep: - 0.74 Độ lệch chuẩn y_intercep: Sb = 1.049 Khoảng tin cậy y_intercep - 0.74 +/- 1.049 (chứa 0) Vậy phương pháp là tuyến tính trong khoảng 3,2 mg/ml – 4,8 mg/ml Artesunat nguyên liệu. Tính tuyến tính của DHA đã xác định ở mục 2.3 Nếu F là hệ số đáp ứng của DHA ta có: F = Khi Sart = SDHA thì: F = và Vì Cart nằm trong khoảng khảo sát là: 3.2 – 4.8 => F = 1,27 - = 1,27 – () Có thể lấy kết quả gần đúng của hệ số đáp là: F = 1.26 Từ tính toán trên ta có công thức tính hàm lượng DHA như sau: CDHA = 2.9. Tổng kết. Phương pháp xác định DHA trong định lượng Artesunat nguyên liệu như sau: Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao: Cột: nucleosil C18(250.4mm.5mm) Pha động: MeOH: Đệm ph7.1 (70:30) (pha đệm: 1.36g KH2PO4Trong 1000ml nước rồi chỉnh về pH 7.1 bằng KOH 10 %) Detector : UV = 216 nm Thể tích tiêm : 20 (ml) Nhiệt độ t :nhiệt độ phòng Dung dịch thử pha ở nồng độ 4mg/ ml nguyên liệu Dung dịch chuẩn pha ở nồng độ 4mg/ml Artesunat chuẩn(vkn) và 0.04mg/ml DHA chuẩn (nếu có) Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử ghi kết quả, các kết quả chỉ được lấy khi hệ thống đảm bảo tính thích hợp (N> = 3000, Rs >1.5, 0.9 < As < 2). Làm 5 mẫu lấy kết quả trung bình với điều kiện độ lệch chuẩn < 2% Công thức tính hàm lượng Artesunat: %ARTESUNAT = Trong đó : SArtthu là diện tích pic thử SArtch là diện tích pic chuẩn mc là khối lượng chuẩn m là khối lượng nguyên liệu cân P là hàm lượng chuẩn (98.6%) Tính hàm lượng DHA trong nguyên liệu: Trường hợp có chuẩn: %DHA/nguyên liệu = Trong đó: SDHAnl và SDHAch là diện tích pic của DHA trong nguyên liệu và Pic chuẩn. m là khối lượng nguyên liệu cân. Trường hợp không có chuẩn DHA: %DHA/Nguyên liệu = Với F = 1.26 SDHA và S Artesunatthu là diện tích của pic DHA và pic Artesunat của mẫu thử. P là hàm lượng của Artesunat trong nguyên liệu đã xác định. Phần III: Kết luận và đề xuất 3.1 Kết luận: khi thực hiện đề tài tôi đã thu được một số kết quả sau: Học được cách tìm tài liệu, làm thực nghiệm và trình bầy văn bản khoa học về một vấn đề nghiên cứu Tìm hiểu phưong pháp HPLC và sử dụng được máy HPLC để định lượng Xây dựng được một phương pháp xác định DHA khi định lương Artesunat trong nguyên liệu đảm bảo tính đúng, tính chính xác, tính đặc hiệu và tính tuyến tính ở nồng độ nghiên cứu Cách đánh giá một phương pháp định lượng Học được cách xác định giới hạn định lương của một chất trên máy HPLC 3.2 Đề xuất: Tiếp tục nghiên cứu áp dụng phương pháp trên để xác định DHA trong thuốc tiêm và viên nén. Vì điều kiện thời gian chúng tôi chưa nghiên cứu xác định tạp acid Succinic, chúng ta có thể tiếp tục nghiên cứu xác định tạp acid Succinic. Có thể áp dụng cách tiến hành trong khoà luận để xác định đúng hàm lượng DHA trong nguyên liệu Artesunat trong trường hợp không có DHA chuẩn.