Khóa luận Nhân giống lan hồ điệp Phalaenopsis Sp. bằng kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS – temporary immersion system)

oại dịch chiết khác như dịch chiết gỗ bulô (Zimmer và Pieper, 1976), dịch chiết bò, dịch chiết lúa mì, lúa mạch, cà rốt, nấm men, khoai tây, nấm đảm, peptone và nhiều loại nước trái cây khác (Knudson, 1922; Lami, 1927; Curtis, 1947; Mariat, 1952; Withner, 1953). Nhưng đáng tiếc là hiệu quả tác dụng của các loại dịch chiết dinh dưỡng này lên sự tăng trưởng của phôi vẫm chưa được biết rõ, có thể trong thành phần các dịch chiết này chứa một số hợp chất kích thích tăng trưởng giúp cho sự phát triển bình thường của phôi. Vì phôi Lan có nhu cầu đặc biệt về nguồn đạm, do vậy có thể các thành phần đạm trong dịch chiết có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của phôi. 1.5.7.3. Yếu tố làm đặc môi trường Trong nuôi cấy mô thực vật người ta thường dùng một số vật liệu làm giá thể để nâng đỡ mô và chồi, giữ cho cây đứng vững trong môi trường. Nguyên liệu phổ biến nhất trong nuôi cấy mô là agar; người ta hòa agar vào trong môi trường, làm tan ở nhiệt độ cao (trên 60oC) và làm đặc lại ở nhiệt độ phòng. Ngoài ra tùy thuộc từng vật liệu nuôi cấy mà người ta sử dụng các vật liệu khác làm giá thể như: giấy lọc, vải, một số màng nhân tạo. Agar là một polyosid có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidum. Bởi vì agar là sản phẩm lấy từ tảo biển, nên nó có những tác động sinh lý trên mô thực vật. Loại agar sử dụng để làm đông môi trường có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm (Griffis et al., 1991; Debergh, 1983; Halquist et al, 1983). Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục môi trường do các chất cặn trong agar gây nên. Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60- 100oC, đặc lại khi nhiệt độ 35oC vì vậy agar ổng định trong tât cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật. Hơn nữa agar không phản ứng với các chất trong môi trường. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sủ dụng và pH của môi trường. 1.5.7.4. Ảnh hưởng của pH Arditti (1967) đã tóm tắt ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của một số phôi Lan. Đối với phần lớn các giống nghiên cứu thì pH khoảng 5- 6 là phù hợp. Nồng độ H+ trong môi trường dường như quyết định vào thời điểm nảy mầm của phôi, vì sau khi nảy mầm pH môi trường thấp hơn vẫn không gây độc cho sự tăng trưởng (Knudson, 1951). Tuy nhiên có qua nhiều môi trường khác nhau được sử dụng để nuôi cấy phôi, do vậy ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của phôi Lan vẫn chưa được khẳng định rõ ràng. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP. HCM, cây số 1900 Quốc lộ 1A, phường Trung Mỹ Tây, quận 12. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu Phát hoa của 5 giống Lan Hồ Điệp được thu khi hoa đã nở hết trên cành. Chọn những phát hoa to khỏe, cắt những đốt chứa mắt ngủ dài 4cm, tách bỏ vỏ bao quanh mắt ngủ (nhẹ nhàng, không làm tổn thương mắt ngủ). Tình trạng mắt ngủ phải còn trắng xanh hay hơi đỏ của màu phát hoa, loại bỏ những mắt ngủ bị hóa đen và bị trầy xước. Tiến hành khử trùng mẫu chọn thời gian và nồng độ chất khử trùng thích hợp cho tỉ lệ mẫu sống và vô trùng cao nhất. Có 5 giống Lan Hồ Điệp được dùng trong các thí nghiệm: Dtps. Taida Salu. Dtps. Taida Firebird. Dtps. Salu Spots. Dtps. Black Jack. Dtps. Metor pulcherrim Hình 2.1. Các giống Lan Hồ Điệp sử dụng trong các thí nghiệm 2.2.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường MS (Murashine và Skoog, 1962), với khoáng đa lượng được được giảm đi ½, các yếu tố khoáng vi lượng và vitamin được giữ nguyên. Các chất bổ sung gồm: Chất điều hòa sinh trưởng: NAA (Naphatalenacetic acid), BA (6- Benzy - aminopurine) Tryptone. Sucrose. PVP (Polyvinylpyrolidone). Nước dừa (CW). Peptone. Agar. Than hoạt tính (CA). 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm Để đảm bảo điều kiện vô trùng, các thí nghiệm trên hệ thống ngập chìm tạm thời được thực hiện trong một phòng nuôi riêng với điều kiện như sau: - Nhiệt độ : 25 ± 2oC. - Độ ẩm trung bình : 80 - 85%. - Thời gian chiếu sáng : 12 giờ/ngày. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Cách pha môi trường 2.3.1.1. Cách pha dung dịch mẹ Để tiết kiệm nguyên liệu và công lao động cho đề tài, ta cần pha dung dịch mẹ trước khi pha môi trường nuôi cấy. Pha dung dịch mẹ dựa vào môi trường khoáng MS (Murashine và Skoog, 1962). Các chất điều hòa sinh trưởng: cân 0,1 g BA pha và hòa tan trong 1 ml NaOH 1N rồi định mức 100 ml bằng nước cất vô trùng, lượng dùng lá hút 1 ml tương ứng cho 1 mg BA. Tương tự cho chất NAA. 2.3.1.2. Cách pha môi trường cấy Bước 1: Tùy theo thể tích cần pha ta hút dung dịch mẹ gồm các khoáng đa lượng, khoáng vi lượng và nhóm vitamin. Cân các chất: đường, tryptone, peptone và hút BA, NAA. Khuấy đều và hòa tan hoàn toàn các chất trong nước cất theo thể tích đã định sẵn. Bước 2: Định mức và đo pH 5,9 (điều chỉnh pH bằng NaOH 1N hay HCl 1N). Bước 3: Cân than hoạt tính và agar cho vào môi trường, nấu chín môi trường đến khi agar được tan hết. Bước 4: Cho vào mỗi chai thủy tinh khoảng 30 ml môi trường. Bước 5: Ghi rõ ngày tháng và tên (kí hiệu) môi trường để tránh nhầm lẫn. 2.3.2. Hấp khử trùng 2.3.2.1. Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy Môi trường sau khi được cho vào chai thủy tinh sẽ được cho vào nồi hấp vô trùng, chỉnh nhiệt độ ở 121oC, 1 atm; thời gian hấp khoảng 15 – 20 phút. Sau khi hấp xong chờ cho nhiệt độ nồi hấp giảm còn khoảng 45oC mới lấy môi trường ra. Chuyển môi trường đã hấp khử trùng sang phòng nuôi cấy. Giữ 2 ngày ở 25oC để kiểm tra. 2.3.2.2. Hấp khử trùng dụng cụ nuôi cấy Một số dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy mô như: kẹp lớn, nhỏ, dao, giá để dụng cụ, giấy cấy... được gói bằng giấy và nylon chịu nhiệt. Sau đó hấp khử trùng bằng nồi hấp vô trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. Dụng cụ sau khi hấp khử trùng được bảo quản trong phòng cấy để tránh nhiễm khi cấy. 2.3.3. Các thao tác trong phòng cấy Rửa sạch tay bằng xà bông trước khi thao tác, mặc áo blouse, khẩu trang và mang găng tay. Mở đèn cực tím UV, 5 phút sau mở quạt gió. Đèn UV mở trong 15 - 30 phút trước khi cấy rồi tắt. Sau 10 phút bắt đầu khử trùng tủ cấy. Lấy một miếng gòn tẩm alcool 70o hoặc 96o, lau kỹ tất cả các thành đứng và ngang ở bên tủ cấy, lau cẩn thận bàn làm việc của tủ cấy. Lau cồn 70o tất cả các bình đựng môi trường, chai mẫu và các vật dụng trước khi đưa vào tủ cấy. Khi thao tác cấy, đặt dụng cụ vào ống nghiệm chứa cồn 960 sao cho 1/3 dụng cụ không bị ngập trong cồn. Ống nghiệm chứa cồn nên được để một miếng bông gòn ở đáy để hạn chế bể ống nghiệm. Đặt ống nghiệm chứa cồn này vào một erlen hoặc bercher, lót 1 miếng gòn ở đáy bình để hạn chế sự va chạm giữa 2 dụng cụ thủy tinh. Nhúng các dụng cụ cấy vào alcool 96o. Đốt các dụng cụ thao tác cùng một lúc, hơ qua lửa 2 - 3 lần cho thật nóng, để nguội dần trên một giá bằng kim loại. Sau khi dụng cụ cấy đã nguội dần, gắp giấy cấy từ trong gói giấy ra, mở nắp chai hoặc ống nghiệm có mẫu thì dùng ngón tay áp út và ngón tay út cầm lấy nút cao su, không đặt nút cao su xuống bàn cho đến khi gắn nó trở lại vào chai môi trường. Rút mẫu từ ống nghiệm đặt lên giấy cấy. Tiến hành cắt mẫu thành từng đốt và lát mỏng (ở giai đoạn nhân chồi), hay tách cụm chồi nhỏ để cấy vào môi trường vươn thân (ở giai đoạn vươn thân). Sau đó, đặt mô thực vật trên môi trường cấy thích hợp trong thời gian ngắn nhất. Tất cả các mô bị rơi trên mặt bàn hay tiếp xúc với các vật liệu khác ngoài dụng cụ cấy và giấy khử trùng đều được loại bỏ Hơ qua ngọn lửa cổ bình nuôi cấy sau khi đã cấy mẫu vào. Mẫu sau khi được cấy vào bình, dùng bút lông ghi lại tên giống và ngày cấy, tên môi trường. Ghi lại các thông tin này trong sổ thí nghiệm của phòng. Sau khi cấy xong, lau tủ cấy bằng cồn, dọn dẹp sạch sẽ nơi làm việc, giữ nguyên vị trí các dụng cụ có trong tủ cấy từ trước. Tắt đèn, quạt trong tủ cấy. Rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng cấy. 2.3.4. Cách bố trí thí nghiệm 2.3.4.1. Thí nghiệm 1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để vi nhân giống. + Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân nhanh PLB. Mục đích: - Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá của các chồi lan Hồ Điệp - Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu để nhân nhanh PLB. - Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB. Phương pháp thí nghiệm: Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá Tiến hành trên 5 giống, mỗi giống chọn lá cắt nhỏ khoảng 100 mảnh, mỗi mảnh có kích thước 5 x 5 mm. Tiến hành cấy trên môi trường MS ½ có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (NAA, Adenin, BA). Bảng 2.1. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLB từ lá Môi trường Nồng độ NAA (mg) Nồng độ adenine (mg/l) Nồng độ BA (mg/l) MSII1 1 10 0 MSII2 1 0 10 MSII3 1 10 10 Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự nhân nhanh PLB: Các mẫu PLB được cắt đôi và cấy vào môi trường MS ½ có bổ sung BA, NAA ở những nồng độ khác nhau; sucrose (30 g/l), CW 15%, CA 1g/l, Agar 8g/l. Thí nghiệm được lập lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mật độ mẫu cấy là 10 mẫu/bình. Bảng 2.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự nhân PLB Ký hiệu môi trường Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) NAA BA NB1 0,5 1 NB2 0,5 2 NB3 1 1 NB4 1 2 NB5 1 3 NB6 1 4 NB7 2 1 Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB Chọn ra tỉ lệ BA và NAA thích hợp nhất tiếp tục thí nghiệm trênnhững nồng độ đường khác nhau với vật liệu là PLB của giống số 1 và giống số 2 Bảng 2.3. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường sử dụng lên sự nhân PLB. Ký hiệu môi trường Sucrose (g/l) Glucose (g/l) SG1 30 0 SG2 25 5 SG3 20 10 SG4 15 15 SG5 10 20 SG6 5 25 SG7 0 30 Từ kết quả ở thí nghiệm này ta chọn môi trường thích hợp nhất để sử dụng cho tất cả thí nghiệm nhân PLB về sau. Chỉ tiêu theo dõi: - Tỉ lệ mẫu lá hình thành PLB của 5 giống Hồ Điệp lai sau 8 tuần nuôi cấy. - Số lượng PLB tạo thành của 2 giống Hồ điệp lai (Dtps. Taida Salu, giống số 1; Dtps. Taida Firebird, giống số 2) sau 8 tuần nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cũng như trên các môi trường có 2 loại đường ở các nồng độ khác nhau. + Thí nghiệm 1.2: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLB. Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB Vật liệu: Các PLB của 2 giống Hồ Điệp lai (Dtps. Taida Salu, giống số 1; Dtps. Taida Firebird, giống số 2) thu được trong thí nghiệm 1.1 Phương pháp thí nghiệm : Các PLB được nuôi cấy trên môi trường MS ½ có bổ sung: Peptone (2 g/l), CW (15%), PVP (500 mg/l). Sucrose (20 g/l), khoai tây (30 g/l). Agar (8 g/l), CA (1 g/l), pH 5,9. Tùy theo nghiệm thức thí nghiệm có bổ sung BA 0; 0,5 và 1 mg/l. Thí nghiệm được lập lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình chứa 10 PLB. Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ PLB phát triển thành chồi. + Thí nghiệm 1.3: Tìm môi trường thích hợp cho sự ra rễ Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của chồi Lan Hồ Điệp. Phương pháp thí nghiệm: Các chồi tái sinh từ PLB được đặt nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA ở nồng độ khác nhau (0; 0,5 và 1 mg/l). Chỉ tiêu theo dõi: - Số lượng rễ hình thành - Chiều dài rễ 2.2.3.2. Thí nghiệm 2: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan Mục đích: Bước đầu thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng, các bước tiến hành khử trùng dụng cụ và thiết bị nuôi cấy. Tiến hành nuôi cấy thử nghiệm Phương pháp thí nghiệm: Môi trường MS ½ có bổ sung pepton, dịch chiết khoai tây, nước dừa Lắp ráp thiết bị và cho máy vận hành không có mẫu chỉ có môi trường, theo dõi tỉ lệ nhiễm, tìm nguyên nhân và đưa ra các biện pháp khắc phục sự nhiễm của hệ thống. Sau đó tiến hành thử nghiệm nuôi cấy với mẫu cấy là các chồi lên từ PLB của Giống Hồ Điệp số 1 Dtps. Taida salu. Các bình Plantima chứa thể tích môi trường 200 ml được sử dụng. Cho vào mỗi bình 20 chồi, và đặt hệ thống bơm hoạt động theo chu kỳ và tần xuất định sẵn như bơm cho dung dịch ngập mẫu trong 2 phút, nghỉ 6 giờ. 2.2.3.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan Vật liệu: Các cụm PLB của Giống Hồ điệp Số 1 (Dtps. Taida Salu) được sử dụng cho thí nghiệm trong hệ thống Plantima Môi trường nuôi cấy: MS ½ có bổ sung BA 3mg/l, NAA 1mg/l, nước dừa 10%, pepton 1g/l và PVP 1g/l, sucrose 15g/l, glucose 15g/l. + Thí nghiệm 3.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima. Cho PLB với các mật độ: 2 g, 4 g, 6 g, 8 g vào các bình Plantima có thể tích môi trường 200 ml và cho hệ thống bơm hoạt động theo tần suất định sẵn như bơm cho dung dịch ngập mẫu trong 5 phút, nghỉ 2 giờ. Từ thí nghiệm về mật độ PLB nuôi cấy chọn mật độ thích hợp nhất cho kết quả nhân PLB tốt và và phát triển đủ không gian bình Plantima để làm thí nghiệm về thể tích môi trường ở các mức : 150 ml, 200 ml và 250 ml. Tần suất ngập chìm là ngập 5 phút trong chu kỳ 2 giờ. Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 bình Plantima và được lập lại ít nhất 2 lần. Đối chứng: 1,5 g PLB được nuôi trên môi trường thạch trong các bình tam giác 250 ml có thể tích môi trường là 50 ml. + Thí nghiệm 3.2: Khảo sát tần suất ngập chìm của mẫu cấy cấy lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima Sử dụng mật độ và thể tích tối ưu trong thí nghiệm 4.1 để khảo sát ảnh hưởng của các tần suất ngập chìm lên sự nhân PLB: Ngập 10 phút trong chu kỳ 1 giờ; ngập 5 phút trong chu kỳ 2 giờ, ngập 10 phút trong chu kỳ 2 giờ. 2.4. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu Số liệu trong các bảng được thống kê bằng chương trình Statistical Program Scientific System (SPSS) phiên bản 11.5 cho Windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0.05 của các giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau kèm theo sau số trung bình và sai số chuẩn. 2.5. Chuyển cây con ra vườn ươm Mục đích: Theo dõi tỉ lệ sống sót và phát triển của các cây con có nguồn gốc nuôi cấy trong bình Plantima và bình tam giác khi mang ra ngoài vườn ươm. Phương pháp: Các cây con có bộ rễ khỏe mạnh thu được từ thí nghiệm ra rễ trên hệ thống Plantima và bình tam giác được lấy ra và rửa sạch, sau đó được trồng trong các vỉ nhựa với giá thể là dớn. Trong tuần lễ đầu, phun sương nước cho cây con nhiều lần trong ngày để giữ ẩm cho cây, kết hợp phun B1 2 lần /tuần. Sau đó phun phân bón NPK 30 - 10 - 10 2 lần/ tuần. Theo dõi tỉ lệ sống và sự phát triển của cây con trong vườn ươm. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để vi nhân giống. 3.1.1. Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân nhanh PLB. 3.1.1.1. Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá Thí nghiệm này được tiến hành trên cả 5 giống, mỗi giống chọn lá cắt nhỏ có kích thước 5 x 5 mm, mỗi nghiệm thức 30 mảnh lá, thí nghiệm được lập lại 3 lần Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLB từ lá Môi trường Auxin Loại cytokinin Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) Giống 1 Giống 2 Giống 3 Giống 4 Giống 5 MSII1 NAA (1 mg/l) Adenine (10mg/l) 0 0 0 0 0 MSII2 NAA (1 mg/l) BA (10mg/l) 9,67 ± 0,58 5,67 ± 2,08 0,33 ± 0,05 0,67 ± 0,05 0 MSII3 NAA (1 mg/l) Adenine (10 mg/l) + BA (10mg/l) 30,0 ± 1,0 15,7 ± 3,06 2,33 ± 0,58 2,67 ± 0,58 0 Theo Tanaka và Sakanishi (1980), việc nuôi cấy những mảnh lá chỉ thực hiện thành công với những mẫu lá non, còn các lá trưởng thành không có khả năng tạo PLB. Theo phương pháp này, PLB có thể tạo ra khi nuôi cấy các mẫu lá in vitro được hình thành từ các chồi của phát hoa trên môi trường MS, mỗi mẫu tạo ra trung bình khoảng 3,8 PLB tại mặt cắt của mẫu lá. Sự tạo PLB còn phụ thuộc đoạn cắt của lá, thường những đoạn cuối lá có khả năng tạo PLB cao hơn. Môi trường thích hợp cho việc nuôi cấy là môi trường MS cải tiến, Hyponex Japan (6,5 - 6 - 19), những giống thích hợp là Phalaenopsis hybrid. So-young Park và cộng sự (2002) đã nghiên cứu vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật, nồng độ đường và ảnh hưởng của ánh sáng đến việc cảm ứng tạo PLB từ các mẫu lá và thấy rằng khi sử dụng môi trường MS ½ bổ sung BA (88,8 mM) và NAA (5,4mM), sucrose 30 g/l cho số mẫu lá tạo PLB rất cao (85%) và trung bình tạo được khoảng 12 PLB trên một mẫu lá. Trong thí nghiệm này chỉ khảo sát ảnh hưởng của BA ở nồng độ 10 mg/l kết hợp với NAA 1 mg/l và Adenine 10 mg/l (Tanaka và Sakanishi, 1980) so sánh với việc sử dụng chỉ Adenine hoặc chỉ BA kết hợp với NAA (bảng 3.1). Sau 10 tuần nuôi cấy chỉ thu được kết quả từ giống số 1(Dtps. Taida Salu) và giống số 2 (Dtps. Taida Firebird) là 2 giống có số lượng mẫu lá tạo PLB nhiều nhất, giống số 3 và 4 thì tạo PLB ít hơn hay những mảnh lá chỉ có phản ứng với môi trường (lá vênh lên, có những đốm trắng ở rìa mép mà không tạo được PLB), còn ở giống thứ 5 (Mãn Thiên Hồng) lá hoá đen và chết sau 2 tuần nuôi cấy. Các PLB được hình thành chủ yếu từ các mảnh lá ở phần gốc và ít ở các mảnh lá phần đỉnh. Lá và thân mặc dù có những nét giống nhau về hình thái giải phẫu nhưng khác nhau về cách sinh trưởng và cách sắp xếp các mô. Lá có sinh trưởng tận cùng hữu hạn. Do đó, để có sự phát sinh hình thái mới, đỉnh lá cũng cần phải có sự phân hoá của các tế bào nhu mô để trở về trạng thái mô phân sinh. Sau một thời gian, các chồi xuất hiện xung quanh mép lá (nơi có vết thương) tiếp tục phát triển trong khi phần mô lá ban đầu bị hoại đi. Phiến lá ban đầu được sử dụng như nguồn dinh dưỡng khởi đầu cho PLB và cho chồi sau này nhưng hệ thống mạch của chồi được hình thành thì hoàn toàn độc lập với hệ thống mạch của mô mẹ. Môi trường có bổ sung 10 mg/l BA thì có PLB hình thành. Tuy nhiên tỉ lệ hình thành PLB trên mỗi mẫu ở môi trường này rất ít. Trong môi trường nếu chỉ có adenine thì hoàn toàn không có PLB hình thành. Nhưng trong môi trường có sự hiện diện của cả hai 2 loại cytokinin thì sự tạo PLB là nhiều nhất. Ðiều này có thể giải thích là: do adenine là tiền chất của hormone thực vật do đó không đủ khả năng để kích thích mô lá biệt hoá thành PLB, khi có sự hiện diện của BA trong môi trường thì PLB được hình thành và khi đã có sự hình thành PLB thì Adenine có tác dụng để tăng sinh PLB . Hình 3.1. PLBs hình thành từ mẫu lá nuôi cấy trên các môi trường khác nhau PLBs trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 10 mg/l BA. PLBs từ mảnh lá trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 10 mg/l Adenine + 10 mg/l BA. PLBs từ cuống lá trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 10 mg/l Adenine + 10 mg/l BA. PLBs từ cuống lá cầy chuyền sang cùng loại môi trường sau 4 tuần. PLBs không cấy chuyền phát triển thành cây sau 14 tuần. 3.1.1.2. Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu để nhân nhanh PLB Ở 2 giống (Dtps. Taida Salu, giống 1; Dtps. Taida Firebird, giống 2) số lượng PLB tạo ra nhiều nhất nên chúng tôi sử dụng PLB của 2 giống này để thực hiện thí nghiệm. Mỗi nghiệm thức được nuôi cấy với 3 bình, mỗi bình chứa 10 PLB. PLB được lựa chọn đồng cỡ đều nhau và chưa hình thành chồi, được cắt ngang làm đôi và nuôi cấy trong môi trường MS ½ có bổ sung BA và NAA ở những nồng độ khác nhau, 30 g/l đường sucrose, 15% CW, 1g/l than hoạt tính, 8 g/l agar, pH = 5,9. Các PLB bị cắt làm đôi tiết rất nhiều phenol nên dễ làm đen mẫu và gây chết mẫu, do đó khi cắt phải chọn lựa những PLB đủ lớn, dùng dao bén để không làm dập mẫu. Dùng acid citric vô trùng để rửa mẫu cắt, làm giảm lượng phenol trên mẫu do vết thương tiết ra. Sau 8 tuần nuôi cấy ghi nhận kết quả số lượng PLB tạo thành Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự nhân nhanh PLB từ một PLB ban đầu Môi trường NAA -BA (mg/l) PLB tạo thành Giống 1 Tình trạng PLB Giống 1 PLB tạo thành Giống 2 Tình trạng PLB Giống 2 NB1 0,5 - 1 0,77 ± 0,19f Rất ít 1,11 ± 0,38e Ít NB2 0,5 - 2 4,22 ± 0,51d Nhỏ, vàng 3,33 ± 0,58d Vàng xanh NB3 1 - 1 6,77 ± 0,51c Nhỏ, vàng 5,44 ± 0,38c xanh NB4 1 - 2 8,56 ± 0,19b Lớn, vàng xanh 7,21 ± 0,19b xanh NB5 1 - 3 13,9 ± 0,96a Lớn, vàng xanh 11,5 ± 0,38a xanh NB6 1 - 4 8,33 ± 0,67b Nhiều chồi, xanh 3,88 ± 0,84d Chồi hình thành NB7 2 - 1 1,77 ± 0,19e Nhiều chồi 1,11 ± 0,51e Chồi hình thành, có rễ * Ghi chú: Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05. Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự nhân nhanh PLB từ một PLB ban đầu Qua đồ thị 3.1 ta thấy ở nghiệm thức NB1 (MS ½ + 0,5mg/l NAA + 1mg/l BA ) PLB hình thành rất ít do lượng chất ĐHSTTV chưa đủ để kích thích hình thành PLB ở mẫu bị cắt. Khi tăng lượng chất ĐHSTTV ở nghiệm thức NB2, NB3 và NB4 thì ta thấy lượng PLB tạo thành từ 2 giống tăng dần. Ở nghiệm thức NB5 (MS ½ + 1mg/l NAA + 3mg/l BA) cho thấy PLB phát triển tốt ở cả 2 giống (kích thước to có màu xanh nhạt hơi vàng). Ở nghiệm thức NB7 (MS ½ + 2mg/l NAA + 1mg/l BA) khi tăng lượng NAA lên thì thấy ở PLB có sự hình thành rễ và lượng PLB giảm hẳn, và chồi xuất hiện. Điều này là do Auxin ở nồng độ thấp (phối hợp với cytokinin) giúp tăng trưởng chồi non và khởi tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô, Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ và cả sự tăng trưởng của rễ này (Bùi Trang Việt, 2000). Hình 3.2. PLBs và chồi của giống 1 (Dtps. Taida Salu) trên các môi trường MS có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng khác nhau PLBs trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BA. PLBs trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA. PLBs trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 3 mg/l BA. Chồi trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 4 mg/l BA. Chồi trên môi trường MS + 2 mg/l NAA + 1 mg/l BA. Hình 3.3. PLBs và chồi của giống 2 (Dtps. Taida Firebird) trên các môi trường MS có nồng độ chất ĐHSTTV khác nhau PLBs trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BA. PLBs trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA. PLBs trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 3 mg/l BA. Chồi trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 4 mg/l BA. Chồi trên môi trường MS + 2 mg/l NAA + 1 mg/l BA. 3.1.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB Để xác định loại đường thích hợp cho sự nhân nhanh PLB của 2 giống số 1 và số 2, cần khảo sát ảnh hưởng của 2 loại đường glucose và sucrose lên sự nhân nhanh PLB trên môi trường MS ½ bổ sung BA 3 mg/l và NAA 1 mg/l, 2 loại đường sucrose và glucose ở các nồng độ khác nhau tùy theo nghiệm thức. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2 loại đường lên sự nhân PLB Môi trường Sucrose - Glucose (g/l) Số lượng PLB tạo thành của giống 1 Tình trạng PLB giống 1 Số lượng PLB tạo thành của giống 2 Tình trạng PLB giống 2 SG1 30 – 0 13,11 ± 0,38c Chồi 12,00 ± 0,58c Xanh SG2 25 – 5 13,66 ± 0,33c Chồi 12,56 ± 0,38c Xanh SG3 20 – 10 15,44 ± 0,19b Ít chồi 13,88 ± 0,51b Xanh SG4 15 – 15 16,88 ± 0,51a Có nhiều lông hút 15,44 ± 1,02a Xanh SG5 10 – 20 13,44 ± 0,19c Vàng 11,56 ± 2,91c Xanh SG6 5 – 25 5,88 ± 0,84d Vàng 6,80 ± 2,2d Xanh SG7 0 – 30 5,77 ± 0,96d Vàng 2,33 ± 0,58d Xanh * Ghi chú: Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05. Nghiên cứu của Tokuhara và Masahiro (2003) đã chứng minh ảnh hưởng rất đáng kể của các nguồn carbohydrate khác nhau lên sự hình thành PLB từ huyền phù tế bào của cây Lan Hồ Điệp Doritaenopsis New Toyohashi. Trong nghiên cứu này cho thấy nồng độ đường glucose 58,4 mM cho sự hình thành PLB nhiều nhất sau 8 tuần nuôi cấy. Trong khi đó, trong môi trường chứa maltose có xuất hiện PLB sau 1 tháng nuôi cấy, tuy nhiên lượng PLB rất ít chỉ bằng 8% lượng PLB thu được trên môi trường chứa Glucose. Trường hợp môi trường chứa sorbitol cũng tạo được một ít PLB và callus sau 8 tuần nuôi cấy. Khi nuôi cấy lượng huyền phù tế bào của cây Doritaenopsis New Toyohashi trên môi trường chứa đường sucrose, callus hình thành rất nhiều và không có sự xuất hiện của PLB. Dựa vào nghiên cứu trên, thí nghiệm ảnh hưởng của hai loại đường và sự kết hợp của chúng lên sự nhân nhanh PLB được thiết kế, kết quả được nêu trong bảng 3.3. Khác với kết quả của Tokuhara và Masahiro (2003), ở đây khi sử dụng chỉ dùng một loại đường glucose trong môi trường nuôi cấy, PLB tạo thành rất ít. Điều này có thể giải thích là do mẫu cấy sử dụng trong thí nghiệm này là PLB chứ không phải là dịch huyền phù tế bào, thêm vào đó yếu tố khác nhau về giống khiến cho kết quả giữa hai nghiên cứu khác nhau như ở trên. Theo George( 1993), khi sucrose được bổ sung vào môi trường nuôi cấy, nó sẽ bị phân hủy thành 2 loại đường đơn (glucose và fructose) do sự phóng thích của enzyme ngoại bào trong quá trình nuôi cấy in vitro và điều này làm gia tăng áp suất thẩm thấu trong môi trường. Vì vậy cần phải ghi nhận rằng sự khác nhau trong ảnh hưởng của glucose và sucrose lên sự hình thành PLB trong thí nghiệm này có thể không chỉ bởi sự khác nhau về thành phần đường trong quá trình nuôi cấy mà còn là do sự thay đổi áp suất thẩm thấu do sự phân hủy sucrose thành 2 loại đường đơn. Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của 2 loại đường lên sự nhân PLB Mặc dù vậy, khi thay đổi nồng độ đường và sự kết hợp của hai loại đường cho thấy chúng có ảnh hưởng đáng kể lên sự nhân nhanh PLB từ nguồn PLB ban đầu. Qua đồ thị 3.2 ta thấy sự kết hợp giữa 15 g/l sucrose và 15 g/l glucose cho lượng PLB hình thành là cao nhất. Ở đây dễ dàng nhận thấy sự tương quan giữa nồng độ đường sucrose và glucose đến sự nhân nhanh PLB, khi nồng độ đường sucrose cao nhất và không có glucose, lượng PLB tạo thành khoảng 13,11 PLB. Tiến hành giảm nhẹ lượng sucrose xuống còn 25 g/l và thêm vào 5 g/l glucose cho thấy có sự tăng nhẹ lượng PLB hình thành. Tiếp tục giảm lượng sucrose và tăng glucose, PLB hình thành tiếp tục gia tăng và đạt mức cao nhất ở nồng độ sucrose 15 g/l và glucose 15 g/l. Tiếp tục giảm sucrose và tăng lượng glucose, sự hình thành PLB giảm dần và thấp nhất ở nồng độ 30 g/l glucose và không có sucrose. Tóm lại, trong thí nghiệm này sự kết hợp giữa hai loại đường sucrose và glucose cho sự nhân nhanh PLB tốt nhất là ở nồng độ 15 g/l sucrose và 15 g/l glucose. A B Hình 3.4. Ảnh hưởng cúa các loại và nồng độ đường khác nhau lên sự nhân nhanh PLBs của giống số 1 và 2 trên môi trường MS ½. A. Giống số 1 – Dtps. Taida Salu B. Giống số 2 – Dtps. Taida Firebird a1. 30 g/l sucrose + 0 g/l glucose. b1. 30 g/l sucrose + 0 g/l glucose. a2. 15 g/l sucrose + 15 g/l glucose. b2. 15 g/l sucrose + 15 g/l glucose. a3. 0 g/l sucrose + 30 g/l glucose. b3. 0 g/l sucrose + 30 g/l glucose. 3.1.2. Thí nghiệm 1.2: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLB. Theo nhiều tác giả khi tái sinh thành cây con từ PLB chỉ cần sử dụng các môi trường khoáng có bổ sung nước dừa, peptone, khoai tây…mà không sử dụng bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào. Tanaka và Sakanishi (1985) và Tanaka (1987) đã sử dụng môi trường Knudson C cải tiến, môi trường Hyponex cải tiến, còn Haas-von Schmude (1983,1985) sử dụng môi trường MS trong việc tái sinh cây con từ PLB. Griesbach (1983) sử dụng môi trường Murashige và Skoog cho việc tái sinh cây con từ PLB, trong khi Lin (1986) sử dụng môi trường Knudson C cải tiến có bổ sung BA (1 mg/l) để chuyển PLB thành cây con. Trong thí nghiệm này sử dụng môi trường MS ½ có bổ sung Peptone (2 g/l), khoai tây (30 g/l), CW (15%), PVP (500 mg/l), sucrose (20 g/l), than hoạt tính (CA) (1 g/l), BA (0; 0.5; 1 mg/l), agar (8 g/l) để khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh PLB sau 6 tuần nuôi cấy và ghi nhận kết quả trong bảng sau. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB của giống 1 (Dtps. Taida Salu) Môi trường BA (mg/l) Trọng lượng tươi (g) Số mẫu tái sinh chồi (%) Tỷ lệ tạo chồi từ 1 PLB Chiều rộng lá (mm) Nhận xét B11 0 2,84 ± 0,24 100 2,73 ± 0,2 5,0 ± 0,2 Chồi xanh, lá to dài B12 0,5 2,44 ± 0,09 100 4,13 ± 0,2 2,1 ± 0,06 Tỷ lệ đẻ chồi cao nhưng kích thước chồi nhỏ B13 1 1,84 ± 0,11 100 - - Chồi nhú lên ở nhiều điểm trên mẫu cấy * Ghi chú: (-) Không xuất hiện Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB của giống 2 (Dtps. Taida FireBird) Môi trường BA (mg/l) Trọng lượng tươi (g) Số mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ tạo chồi từ 1 PLB Chiều rộng lá (mm) Nhận xét B21 0 1,3 ± 0,06 100 1 4,1 ± 0,1 Chồi xanh mướt, không có đẻ chồi nách B22 0,5 1,1 ± 0,03 36 - - Phần lớn mẫu đưa vào tạo PLB B23 1 0,8 ± 0,02 27 - - Phần lớn mẫu đưa vào tạo PLB * Ghi chú: (-) Không xuất hiện Qua kết quả thí nghiệm cho thấy, ở giống số 1, tất cả PLB được nuôi trên môi trường tái sinh chồi đều sống và tái sinh được chồi, tuy nhiên sự phát triển của chồi qua các nghiệm thức là khác nhau, chứng tỏ hormone Benzyl Adenin đã can thiệp vào quá trình tái sinh chồi từ PLB. Ở bình nuôi cấy có BA 0mg/l, chồi phát triển mạnh, thân chồi cao khoảng 1,2cm có từ 3-4 lá, các lá trên ngọn chồi có kích thước rộng lá khoảng 5 mm. Ở nghiệm thức này, tỷ lệ tạo chồi 2,73 tức là từ 1 PLB ban đầu tái sinh thành chồi và chồi phát triển và tạo thêm chồi nách, các chồi trong cụm to và dễ tách rời. Trên môi trường có bổ sung BA 0,5mg/l, mẫu cấy phù to và nhú lên nhiều chồi với tỷ lệ 4,13 từ 1 PLB ban đầu nhưng các chồi trong cụm cho lá nhỏ có kích thước rộng lá khoảng 2mm, thân chồi cao khoảng 5mm. Còn môi trường có 1mg BA, mẫu cấy phù to có màu xanh đậm và tạo chồi từ nhiều điểm trên mẫu cấy và những chồi này rất nhỏ. Điều này chứng tỏ nồng độ BA càng cao kích thích mẫu cấy càng mạnh làm mô cấy biệt hoá nhiều điểm tạo chồi nhưng các chồi nhú lên chi chít mà không thể phát triển hơn nữa. Đối với giống số 2, không có hiện tượng tạo chồi nách như giống số 1, ở môi trường không có bổ sung BA, mỗi PLB tái sinh chồi bình thường, chồi xanh mướt có 2 lá, chiều rộng lá khoảng 4mm, mỗi chồi có từ 1- 2 rễ, trong khi đó môi trường nuôi cấy có bổ sung từ 0,5 - 1mg BA, tỉ lệ PLB tái sinh thấp (36% ở BA 0,5 mg/l và 27% ở BA 1 mg/l), ở phần gốc và thân PLB phình to và xuất hiện sự phân chia tạo PLB mới, có lông hút mọc xung quanh, trung bình mỗi PLB đưa vào tạo ra thêm 4-5 PLB. Như vậy ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi ở 2 giống này hoàn toàn khác nhau. Giống số 1 không có hiện tượng tạo PLB, nhưng lại có hiện tượng tạo thêm chồi nách từ chồi tái sinh từ PLB, còn giống số 2 BA không cho tái sinh chồi mà lại kích thích tạo thêm PLB từ PLB ban đầu, điều này có thể do sự tương tác giữa các chất điều hòa sinh trưởng nội sinh và ngoại sinh ở các giống khác nhau là khác nhau. Tóm lại, giống số 1 và giống số 2 có biểu hiện khác nhau trên môi trường có BA nhưng cả 2 giống đều cho kết quả tốt trên môi trường không bổ sung BA, kết quả này phù hợp với các kết quả cho tái sinh PLB thành cây của Griesbach (1983) và Haas-von Schmude (1983,1985). Hình 3.5. Ảnh hưởng cúa BA lên sự tái sinh chồi từ PLB Giống số 1 – Dtps. Taida Salu Giống số 2 – Dtps. Taida Firebird a. BA 0 mg a’. BA 0 mg b. BA 0,5 mg b’. BA 0,5 mg c. BA 1 mg c’. BA 1 mg Bar: 0,5 cm 3.1.3. Thí nghiệm 1.3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của chồi Lan Hồ Điệp. Các chồi hình thành trong thí nghiệm 3 được sử dụng để khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ và kết quả ghi nhận trong bảng sau: Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của hai giống Lan Hồ Điệp Môi trường NAA (mg/l) Số lượng rễ giống 1 Chiều dài rễ giống 1(cm) Tình trạng mẫu N11 0 2,73 ± 0,44 3,66 ± 0,22 lá to, rễ to dài N12 0,5 3,15 ± 0,17 3,13 ± 0,24 lá to, rễ to dài N13 1 4,62 ± 0,38 5,58 ± 0,12 lá nhỏ, rễ to rất dài Số lượng rễ giống 2 Chiều dài rễ giống 2(cm) Tình trạng mẫu N21 0 2,51 ± 0,34 3,84 ± 0,30 lá to, rễ to dài N22 0,5 4,67 ± 0,2 2,33 ± 0,74 lá to, rễ to nhiều N23 1 7,42 ± 0,39 0,58 ± 0,12 Lá nhỏ, rễ quá nhiều Trên môi trường có bổ sung NAA cho thấy sự hình thành rễ được đẩy mạnh trên cả hai giống. Tuy nhiên khi số rễ gia tăng, cây phát triển không cân đối, lá nhỏ, thân ốm. Trong môi trường không không bổ sung NAA, rễ phát triển tốt, cây sinh trưởng khoẻ, lá to, do đó ở giai đoạn ra rễ, không cần bổ sung NAA trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên đối với giống số 1 cây con cho phát sinh chồi nách vì vậy cần phải sử dụng một chất điều hòa sinh trưởng khác để hạn chế việc ra chồi và thúc đẩy ra rễ mà cây vẫn phát triển tốt. Hình 3.6. Ảnh hưởng của các nồng độ NAA khác nhau lên sự ra rễ và sinh trưởng chồi của hai giống Lan Hồ Điệp 1 và 2 A. Giống số 1 – Dtps. Taida Salu B. Giống số 2 – Dtps. Taida Firebird a1. MS + 0 mg/l NAA b1. MS + 0 mg/l NAA a2. MS + 0,5 mg/l NAA b2. MS + 0,5 mg/l NAA a3. MS + 1 mg/l NAA b3. MS + 1 mg/l NAA 3.2. Thí nghiệm 2: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan Trước khi tiến hành khảo sát sự nhân PLB trên hệ thống Plantima, việc vận hành hệ thống này thành thạo hạn chế sự nhiễm là một bước vô cùng quan trọng. Do đó, sau khi được nhập về từ Đài Loan, đọc kỹ các hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và tiến hành lắp ráp hệ thống như hình 1.12. Sau khi đã lắp các hệ thống như hướng dẫn, tiến hành cài đặt chu kỳ ngập chìm cho hệ thống. Có 3 thông số cần được cài đặt lần lượt là thời gian T1,T2 và T3: - T1: Thời gian máy bơm được kích hoạt, khí được nén vào ngăn chứa môi trường tạo ra áp suất đẩy môi trường lỏng theo ống dẫn của Funnel lên ngăn chứa mẫu cấy, - T2: Thời gian máy bơm ngừng hoạt động, van xả khí vẫn đóng giúp áp suất được duy trì để mẫu ngập trong môi trường mà không có sự sục khí, - T3: Thời gian bơm ngừng hoạt động, van khí mở ra giúp khí ở ngăn chứa môi trường thoát ra ngoài, môi trường từ ngăn trên theo trọng lực chảy xuống ngăn dưới như ban đầu. Khi thời gian T3 kết thúc, hệ thống lặp lại chu kỳ như đã cài đặt. Khi đã cài đặt các thông số theo ý muốn với T1 = 2 phút, T2 = 30 giây, T3 = 2 giờ, tiến hành cho hệ thống chạy thử với môi trường lỏng được thay bằng nước máy, hệ thống không cần phải khử trùng. Sau một thời gian theo dõi, hệ thống đã vận hành đúng như được lập trình. Việc vận hành hệ thống bước đầu đã thành công. Tiếp theo sau quá trình vận hành thử hệ thống với môi trường lỏng thay bằng nước máy trong điều kiện không vô trùng, lần này tiến hành pha môi trường MS bổ sung 30 g/l đường Sucrose, pH 5,8 và cho vào mỗi bình Plantima với thể tích 250 ml theo hướng dẫn của nhà sản xuất, đậy nắp vừa phải, không được chặt quá trước khi hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, trong 25 phút. Sau khi hấp, đợi hệ thống nguội, siết nắp vừa chặt, dùng film nylon dán kín xung quanh nắp bình Plantima, ráp vào hệ thống và vận hành thử với chế độ ngập chìm là T1 = 2 phút, T2 = 30 giây, T3 = 2 giờ. Hệ thống vận hành bình thường sau 2 – 3 tuần, hiện tượng nhiễm vi sinh vật được quan sát thấy lần lượt trong tất cả các hệ thống bình Plantima. Các nguyên nhân gây nhiễm trong hệ thống TIS : - Khi đổ môi trường vào bình trước khi hấp khử trùng theo hướng dẫn, trong quá trình hấp môi trường bị đun sôi văng lên qua chỗ nối với filter làm filter bị ướt, đây có thể là một trong những nguyên nhân gây nhiễm. - Kiểm tra hệ thống nắp và filter có bị rò rỉ trong quá trình bơm hay không bằng cách nhúng bình vào xô nước, nhận thấy dù đã siết nắp thật chặt nhưng vẫn có sự sủi bọt khí ở vị trí nắp và ở filter, điều này chứng tỏ áp suất bơm khí của máy quá mạnh (nguyên nhân là do thử nghiệm chỉ với 8 bình, còn hệ thống bơm được thiết kế cho khoảng 40 bình hoạt động cùng lúc). Các biện pháp khắc phục hiện tượng nhiễm được thử nghiệm dựa trên việc khắc phục các nguyên nhân dẫn tới nhiễm vi sinh vật: - Gắn thêm hệ thống điều áp giảm áp suất bơm của máy, cho hệ thống chạy với 20 bình. Thay các ron cao su bị giãn gây hở nắp khi bơm. - Tiến hành thay ống silicone dài khoảng 10 cm nối hai filter với bình bằng ống silicone dài 25 cm. Môi trường được đổ vào bình trước khi hấp khử trùng, buộc các filter hướng lên trên để tránh hiện tượng môi trường khi hấp bị văng lên filter. - Giữ phòng sáng luôn sạch và hạn chế ra vào thường xuyên. Tiến hành rà soát lại các bước thực hiện, sau hơn 4 tháng tìm hiểu và lặp lại các thí nghiệm khảo sát nguyên nhân gây nhiễm. Hiện tượng nhiễm vi sinh vật trong bình Plantima từng bước đã được khắc phục. Sau khi khắc phục sự nhiễm của hệ thống, chúng tôi thử nghiệm nuôi cấy với mẫu cấy là các chồi lên từ PLB của Giống Hồ Điệp số 1. Sử dụng 5 bình TIS mỗi bình chứa 200 ml môi trường MS ½ có bổ sung pepton, dịch chiết khoai tây, nước dừa. Cho vào mỗi bình 30 chồi, và đặt hệ thống bơm hoạt động theo tần xuất cho dung dịch ngập mẫu trong 2 phút, nghỉ 6 giờ. Sau 2 tháng nuôi cấy các chồi trong bình Plantima chúng tôi ghi nhận kết quả như sau: Các chồi được nuôi cấy trong hệ thống này phát triển nhanh và tốt hơn so với các chồi được nuôi trên môi trường đặc (đối chứng). Đặc biệt là các chồi trong bình TIS có hiện tượng nhân chồi tiếp tục, các chồi phát triển với bộ lá lớn hơn và ra rễ sớm hơn, không thấy có hiện tương thủy tinh thể hay dạng bất thường nào. Hình 3.7. Sự sinh trưởng và phát triển của Lan Hồ Điệp trong bình Plantima a, b,c: Chồi Lan được nuôi cấy trên hệ thống Plantima d: Chồi Lan sau 8 tuần nuôi cấy trên hệ thống Plantima e: Chồi ban đầu, làm nguyên liệu nuôi cấy f, g, h: Chồi Lan sau 10 tuần nuôi cấy trên hệ thống Plantima 3.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan 3.3.1. Thí nghiệm 3.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima Để khảo sát mật độ PLB thích hợp cho quá trình nhân PLB trên hệ thống Plantima sử dụng thể tích dung dịch nuôi cấy là 200 ml và hệ thống được thiết kế cho hoạt động theo chu kỳ 2 giờ ngập một lần và thời gian ngập mẫu trong 5 phút. Kết quả được ghi nhận trong bảng sau Bảng 3.7. Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy đến sự nhân nhanh PLB trên hệ thống Plantima Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Số lượng PLB/1g PLB ban đầu Số chồi Nhận xét 2g 11,25 ± 1,87 973,27 ± 30,68 ab 19,58 ± 4,79 Cụm PLB xanh tốt, tròn, một số PLB phát triển thành chồi Không gian TIS còn trống 4g 23,05 ± 4,65 1020,11 ± 110,36 a 36,31 ± 6,91 PLB xanh tốt, tròn, một số PLB phát triển thành chồi Không gian TIS còn trống 6g 40,15 ± 5,08 984,6 ± 116,54 ab 73,21 ± 6,99 PLB xanh tốt, tròn, một số PLB phát triển thành chồiVừa đủ không gian TIS 8g 53,3 ± 6,80 753,26 ± 151,81 b 113,25 ± 8,91 PLB không được tròn, hơi vàng chồi nhiều, lá chồi bị vàng Chật kín không gian TIS Ghi chú: Kết quả số lượng PLB tạo thành được tính trên 1 g PLB ban đầu để dễ so sánh và nhận xét. Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy đến sự nhân nhanh PLB trên hệ thống Plantima Sau 6 tuần nuôi cấy, ở nghiệm thức sử dụng 2g và 4g PLB cho kết quả nhân PLB tốt, số PLB tạo thành tính trên 1g PLB ban đầu lần lượt là 973,27 PLB và 1020,11 PLB, cụm PLB có màu xanh mướt, PLB dạng tròn và một số PLB trong cụm phát triển thành chồi. Ở 2 mật độ này số lượng PLB tạo thành tuy có nhiều hơn các mật độ khác nhưng không gian bình Plantima vẫn còn trống. Còn ở nghiệm thức sử dụng 6g PLB cho kết quả tạo 984,6 PLB tính trên 1g PLB ban đầu và sau 6 tuần nuôi cấy lượng PLB tạo thành vừa đủ lấp kín không gian bình Plantima, PLB có màu xanh tốt, dạng tròn. Ở nghiệm thức sử dụng 8g PLB, trong thời gian 2-3 tuần đầu lượng PLB gia tăng khá rõ, có màu xanh tốt nhưng sang tuần 5 và 6 cụm PLB có hiện tượng vàng do mật độ PLB ban đầu đưa vào cao và thể tích môi trường nuôi cấy cùng là 200 ml nên trong những tuần đầu chất dinh dưỡng cung cấp đủ cho việc phân chia và tăng trưởng tế bào sau đó nguồn dinh dưỡng cạn dần dẫn đến mẫu bị vàng. Mật độ này dẫn đến sự phát triển của PLB chiếm hết khoảng không gian bình Plantima. Như vậy, trong thí nghiệm về mật độ PLB sử dụng trong giai đoạn nhân PLB chúng ta nhận thấy để sử dụng có hiệu quả không gian bình Plantima thì mật độ 6g PLB với thể tích môi trường 200 ml cung cấp đủ nguồn dinh dưỡng cần thiết cho việc nhân PLB trong thời gian 6 tuần. Hình 3.8. Ảnh hưởng mật độ mẫu cấy lên sự nhân nhanh PLBs. a, a’: Mật độ nuôi cấy 2g PLBs b, b’: Mật độ nuôi cấy 4g PLBs c, c’: Mật độ nuôi cấy 6g PLBs d, d’: Mật độ nuôi cấy 8g PLBs Để khảo sát thể tích môi trường tối ưu cho việc nhân PLB trong bình Plantima với mật độ PLB ban đầu đưa vào là 6g, chúng tôi khảo sát ở 3 mức thể tích là 150, 200 và 250 ml và ghi nhận kết quả trong bảng sau Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên việc nhân nhanh PLB Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Số PLB Số chồi Nhận xét 150ml 35,91 ± 5,63 4169,0 ± 369,8b 71,52 ± 8,86 Xuất hiện cụm PLB hoá nâu 200ml 42,24 ± 7,11 6051,8 ± 454,7a 83,49 ± 9,31 PLB tròn, xanh tốt 250ml 46,67 ± 6,15 6446,9 ± 477,4a 121,34 ± 11,89 PLB tròn, xanh tốt Đối chứng trên thạch 27,81 ± 3,99 2202,4 ± 207,4c 88,32 ± 5,91 PLB có màu xanh đậm Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên việc nhân nhanh PLB Trong thí nghiệm này, chúng ta nhận thấy số PLB tạo thành ở thể tích 200 ml và 250 ml lần lượt là 6051,8 và 6446,9 PLB, kết quả này cho thấy không có sự khác biệt nhiều về hệ số nhân PLB cũng như tình trạng PLB. Chất lượng PLB đều tốt, PLB có dạng tròn, xanh. Trong khi đó nuôi cấy ở thể tích 150 ml cho số lượng PLB thấp hơn (4169 PLB) và có một số cụm PLB bị hóa nâu ở tuần thứ 5 – 6. Điều này có thể giải thích là: trong giai đoạn đầu môi trường cung cấp đủ dinh dưỡng cho sự tăng sinh PLB nhưng khi số lượng PLB tăng lên rồi thì chất dinh dưỡng trong bình cũng cạn dần theo thời gian không đủ cung cấp cho sự tăng sinh tiếp theo. Vì vậy lượng PLB hình thành thấp hơn so với thể tích 200ml và 250 ml. Theo dõi thay đổi pH trong quá trình nuôi cấy cho thấy trước khi hấp khử trùng pH của môi trường được điều chỉnh đến 5,9. Sau 6 tuần nuôi cấy pH giảm còn 4,4- 4,6 cho thấy quá trình acid hóa đã diễn ra liên tục trong quá trình nuôi cấy. Quá trình acid hóa môi trường xảy ra có thể do sự hấp thu khoáng một cách có chọn lọc dẫn đến thay đổi tính chất của môi trường, cũng có thể do quá trình biến dưỡng thứ cấp tạo ra những chất có tính acid như các hợp chất phenolic. Vì vậy ở thời điểm này cần phải thay môi trường để tiếp tục cung cấp dinh dưỡng cho sự phát triển của mẫu cấy. Trên nghiệm thức đối chứng cho lượng PLB thu được ít nhất (2202,4 PLB). Cụm PLB có màu xanh đậm, một số PLB có dạng dẹp, không tròn như các PLB nuôi trong hệ thống Plantima. Như vậy, với thời gian thí nghiệm 6 tuần thì thể tích môi trường 200ml là đủ để cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho việc nhân PLB với lượng mẫu ban đầu đưa vào là 6g. Hình 3.9. Ảnh hưởng của thế tích lên sự nhân nhanh PLBs. 3.3.2. Thí nghiệm 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập lên sự nhân PLB trong hệ thống Plantima. Sử dụng 6 g PLB nuôi cấy trong bình Plantima có thể tích môi trường là 200 ml, các nghiệm thức về tần suất ngập mẫu ( thời gian ngập mẫu và chu kỳ ngập) được thiết kế và ghi nhận kết quả trong bảng sau Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân PLB Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Số PLB hình thành Số chồi Nhận xét 2giờ/10phút 50,85 ± 5,31 6276,98 ± 413,26b 125,28 ± 11,65 PLB rất to, xanh tốt 2giờ/5 phút 42,27 ± 6,27 6112,3 ± 326,41b 82,96 ± 6,57 PLB xanh tốt 1giờ/10phút 68,18 ± 6,96 8545,68 ± 612,45a 187,89 ± 9,60 PLB rất to, một số có dạng trong, mọng nước. Thời gian ngập và chu kỳ ngập của mẫu cấy trong môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa rất quan trọng do nó ảnh hưởng đến sự hấp thu chất dinh dưỡng của mẫu cấy cũng như sự xảy ra hiện tượng thủy tinh thể. Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân PLB Trong thí nghiệm này, thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ 1 giờ cho hệ số nhân PLB cao hơn (8545,68 PLB so với 6112,3 và 6276,98 PLB), nhưng PLB chủ yếu ở dạng trong, mọng nước rất khó chuyển sang dạng chồi để phát triển thành cây hoàn chỉnh. Như vậy tần suất ngập chìm cao (1 giờ ngập 1 lần) đã gây ra hiện tượng thủy tinh thể ở PLB. Tian-Su Zhou (1995) khi khảo sát các yếu tố gây ra hiện tượng thủy tinh thể ở Lan Hồ Điệp ông thấy rằng các PLB bình thường có nhiều khoảng không chứa khí hơn các PLB thủy tinh thể và ông cũng nhận thấy rằng PLB bị thủy tinh thể cho hiệu suất nhân PLB cao hơn bình thường gấp 2 lần và vấn đề này đến nay vẫn chưa được giải thích rõ ràng. Zhou cho rằng việc mất lignin, cellulose trong PLB bị thủy tinh thể làm yếu mối liên hệ giữa các tế bào trong mô, các tế bào có thể dễ dàng thoát khỏi tương tác ức chế và hình thành nhiều phác thể PLB mới. Thời gian ngập 5 và 10 phút sau mỗi 2 giờ cho tốc độ nhân PLB là như nhau, số lượng PLB khoảng từ 6100 - 6300 PLB. Cụm PLB thu được xanh mướt và có xuất hiện sự tái sinh chồi. Điều này cho thấy thời gian ngập từ 5-10 phút không ảnh hưởng đến tốc độ nhân PLB mà chủ yếu là số lần bơm môi trường nuôi cấy trong ngày. Thời gian ngập 5 phút với chu kỳ 2 giờ cho chất lượng PLB tốt nhất, chồi xanh tốt phát triển bình thường. Krueger và cộng sự (1991) đã chứng minh được tầm quan trọng của tần suất ngập chìm lên hiệu quả nhân chồi ở cây Serviceberry. Khi cho ngập chìm 5 phút với chu kỳ 30 phút cây bị mọng nước, nhưng khi cho ngập 5 phút với chu kỳ 60 phút thì không xảy ra hiện tượng này. Vì vậy trong thí nghiệm về tần suất ngập chìm chúng tôi thấy tần suất ngập 5 phút với chu kỳ 2 giờ thích hợp cho việc nhân nhanh PLB của giống Hồ Điệp này. Bảng 3.10. So sánh hệ số nhân PLB của các hệ thống nuôi cấy khác nhau Hệ thống nuôi cấy Lượng PLB sử dụng ban đầu (g) Tổng số PLB tạo thành Số PLB tạo ra/ 1PLB ban đầu Lỏng lắc (40 ml) 6,0 5022 8,3 Lỏng tĩnh (20 ml) 6,0 3032 5,05 Plantima 6,0 6112 10,2 Thạch 6,0 2200 3,6 Khi so sánh giữa nhân PLB trên hệ thống Plantima với phương pháp nhân PLB trên môi trường thạch kết quả cho thấy với cùng một lượng PLB ban đầu là 6 g sau thời gian 6 tuần lượng PLB tạo thành trên hệ thống Plantima gấp 2.77 lần lượng PLB tạo thành trên môi trường thạch (6112 PLB trên hệ thống Plantima so với 2200 trên môi trường thạch).Và nuôi cấy trên hệ thống Plantima cho tỉ lệ nhân PLB gấp 1.2 lần so với nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc và gấp 2 lần trên môi trường lỏng tĩnh. Sự phát triển và tăng trưởng của mô cấy không chỉ phụ thuộc vào thành phần chất dinh dưỡng mà còn phụ thuộc vào thành phần không khí bên trong các bình nuôi cấy (Ziv, 1991). Điều này được thấy rõ trong hệ thống Plantima với việc ngập chìm theo thời gian và tần xuất tối ưu cho từng đối tượng có tác dụng cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng và sự trao đổi khí nên mẫu cấy phát triển tăng sinh nhanh và tốt hơn mẫu đối chứng trên môi trường thạch. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Park và cộng sự (2000) khi sử dụng các hệ thống bioreactor khác nhau trong nuôi cấy PLB của Hồ Điệp tác giả ghi nhận rằng với hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời có gắn màng lọc than hoạt tính (charcoal filter) và được lập chương trình cho ngập 5 phút cứ sau mỗi chu kỳ 125 phút nhờ 1 máy hẹn giờ (timer) cho kết quả nhân PLB tốt nhất, từ 20 g PLB ban đầu sau thời gian nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời này cho tạo được 18.000 PLB. Hình 3.10. Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân nhanh PLBs a, a’: PLBs được nuôi cấy ở tần suất 1 giờ/ 10 phút b, b’: PLBs được nuôi cấy ở tần suất 2 giờ/ 5 phút c, c’: PLBs được nuôi cấy ở tần suất 2 giờ/ 10 phút 3.4. Sự sinh trưởng và phát triển của cây Hồ Điệp ngoài vườn ươm Nhận xét ban đầu cho thấy, trong cùng điều kiện chăm sóc như nhau, tỉ lệ sống sót của các cây nuôi trong bình Plantima hầu như trên 95%, trong khi các cây từ bình tam giác có tỉ lệ sống thấp hơn, khoảng 80%. Sự sinh trưởng và phát triển bước đầu của những cây được nuôi trong bình Plantima là rất khả quan, cây con phát triển nhanh và tốt hơn so với những cây trong hệ thống thông thường. Trong điều kiện nuôi cấy trong hệ thống Plantima cây con có khả năng trao đổi không khí với môi trường bên ngoài, được cung cấp CO2 và O2 nên cây tăng cường được khả năng quang hợp và hô hấp dẫn đến việc gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong môi trường. Ngoài ra cây con sinh trưởng và phát triển trong điều kiện không bị bão hòa hơi nước, cây không bị mọng nước nên ít xảy ra hiện tượng mất nước khi ra ngoài vườn, dễ dàng thích nghi với điều kiện tương đối khô hơn của môi trường in vitro. Hình 3.11. Cây con Lan Hồ Điệp giai đoạn vườn ươm Cây con Lan Hồ Điệp 1 tháng tuổi. Cây con Lan Hồ Điệp 3 tháng tuổi. Hình 3.12. Tóm tắt qui trình nhân giống Lan Hồ Điệp Phalaenopsis có sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận 4.1.1. Thiết lập môi trường vi nhân giống Môi trường MS bổ sung BA 10 mg/l, Adenin 10 mg/l và NAA 1 mg/l thích hợp nhất cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá. Môi trường MS bổ sung BA 3 mg/l, NAA 1mg/l, Sucrose 15 g/l, Glucose 15g/l thích hợp nhất cho việc nhân nhanh PLBs của giống Dtps. Taida salu. Môi trường MS 1/2 bổ sung pepton 2 g/l, khoai tây 30g/l, nước dừa (15%) tốt cho sự tái sinh chồi và phát triển cây con. 4.1.2. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây lan Hồ Điệp lai Dtps. Taida Salu cho phép đưa ra các kết luận sau Nhân nhanh PLBs trong bình Plantima tối ưu ở mật độ 6g PLBs, thể tích 200 ml, tần suất ngập 5 phút trong chu kỳ 2 giờ. Hệ số nhân PLBs trên thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời gấp 2,77 lần so với nhân trên môi trường thạch và gấp 1,2 lần so với nuôi cấy lỏng lắc. Trong giai đoạn tái sinh chồi và nhân nhanh chồi, ở mật độ 50 PLBs, thể tích 200 ml, tần suất ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ hệ thống này cho tỉ lệ nhân chồi gấp 3,7 lần so với nuôi cấy trên môi trường thạch. Trong giai đoạn phát triển cây con, sử dụng 30 chồi nuôi trong bình Plantima có thể tích môi trường 250 ml và tần suất ngập là 3 phút trong chu kỳ 6 giờ cho thấy thời gian tạo cây con để có thể đưa ra vườn ươm trên hệ thống này là 8 tuần so với 10 tuần trên môi trường thạch. Ngoài ra tỉ lệ sống của cây con từ hệ thống TIS sau 1 tháng ở giai đoạn vườn ươm là 95%, trong khi tỉ lệ sống của các cây trên môi trường thạch là 79%). Kết luận chung: Tính tất cả các giai đoạn từ nhân PLB đến ra cây con trên hệ thống ngập chìm tạm thời cho hệ số nhân giống gấp 10.3 lần so với nuôi cấy trên môi trường thạch, tạo cây con sớm hơn 2 tuần và tỉ lệ sống cao hơn. 4.2. Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu khả năng nhân PLB, nhân chồi của một số giống lan khác: Mokara, Renanthera, Ngọc Điểm…và một số giống cây kiểng khác trên hệ thống ngập chìm tạm thời. Ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời (cụ thể trên hệ thống Plantima có cải tiến) để nhân nhanh số lượng lớn cây con Hồ Điệp cung cấp cho sản xuất.