Khóa luận Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α-Amylase và ứng dụng trong sản xuất dextri

hái cô đặc vì vậy dễ tinh sạch. Nuôi cấy bề mặt dễ sấy khô và ít bị tổn hao hoạt tính enzyme. Không cần trang thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ, độ ẩm thích hợp (Lƣơng Đức Phẩm, 1998). 2.3.1. Nuôi cấy bề mặt Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp tạo môi trƣờng cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trƣờng. Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng lỏng hoặc sử dụng môi trƣờng đặc (môi trƣờng bán rắn). Ở môi trƣờng lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trƣờng tạo thành váng khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dƣỡng từ dung dịch môi trƣờng, oxy không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). 2.3.2. Nuôi cấy chìm Phƣơng pháp này ngƣời ta sử dụng môi trƣờng lỏng và đƣợc thực hiện trong những thùng lên men có trang bị hệ thống sục khí, khuấy trộn, điều chỉnh pH. Phƣơng pháp nuôi cấy chìm có ƣu điểm chiếm ít diện tích nhƣng có nhƣợc điểm là dễ bị nhiễm toàn bộ và chi phí cho trang thiết bị khá cao. 13 2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME Phần lớn các enzyme thủy phân dễ hòa tan trong nƣớc nên có thể tách chiết enzyme từ canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn bằng cách lọc hay ly tâm. Để tinh sạch enzyme ngƣời ta thƣờng dùng phƣơng pháp kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ hay các dung dịch muối trung tính (K.Clarkson và cộng sự, 2000). Phƣơng pháp tinh sạch enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phƣơng pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol và aceton). Tỷ lệ dung môi và dịch enzyme là một chỉ tiêu quan trọng, nếu thiếu dung môi sẽ không thu hồi hết enzyme trong dung dịch (Ngô Xuân Mạnh và cộng sự, 2005). Thông thƣờng ngƣời ta thêm 3 – 4 thể tích dung môi vào 1 thể tích nƣớc chiết enzyme. Để tránh mất hoạt tính của enzyme, dung môi và enzyme phải đƣợc làm lạnh xuống 3 – 5oC. Phƣơng pháp này cho hiệu suất cao, ít ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme, dễ tách dung môi khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ. Có thể thu hồi dung môi bằng chƣng cất. Phƣơng pháp phổ biến thứ hai để tách enzyme là dùng muối trung tính để kết tủa. Muối trung tính thƣờng dùng là (NH4)2SO4 với tỷ lệ 50 – 60 % so với dịch chiết enzyme (Lƣơng Đức Phẩm, 1998). 2.5. DEXTRIN (theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Xuân Thủy, 2001) Dextrin là sản phẩm đƣợc tạo thành do sự thủy phân tinh bột mà giá trị tƣơng đƣơng dextrose (DE) đạt đƣợc nhỏ hơn 20. Dextrin có công thức tổng quát giống với cacbonhydrate nhƣng chiều dài chuỗi ngắn hơn và mức độ phức tạp cũng thấp hơn. 14 Hình 2.5. Dextrin ( 2.5.1. Phân loại Dextrin có thể ở dạng polymer mạch thẳng, phân nhánh hay polymer mạch vòng (cyclodextrin). Dựa vào phƣơng pháp xử lý ngƣời ta chia dextrin thành 4 nhóm chính: Dextrin thu nhận dƣới tác động của enzyme. Các dextrin vòng Sardinger thu nhận dƣới tác động của vi khuẩn Bacillus macerans lên tinh bột. Các dextrin thu đƣợc bằng cách dùng acid để thủy phân tinh bột trong môi trƣờng nƣớc. Các pirodextrin gồm các sản phẩm thu nhận đƣợc bằng xử lý nhiệt (có hay không có acid) lên tinh bột. Dựa vào tính tan, ngƣời ta phân loại dextrin nhƣ sau (Lê Hồng Phú, 2000): Amylosedextrin: tan trong rƣợu 25%, không tan trong rƣợu 40% Erythrodextrin: tan trong rƣợu 70%, không tan trong cồn tuyệt đối. Achrodextrin: tan trong cồn tuyệt đối. 2.5.2. Tính chất Đặc tính của dextrin tùy thuộc vào chỉ số DE đạt đƣợc, thƣờng có độ nhớt cao vì chứa một lƣợng lớn các polysaccharide trọng lƣợng lớn. Dextrin có bản chất keo, nhƣng mức phức tạp về phân tử thì lại thấp hơn. 15 Dextrin đƣợc xử lý enzyme tạo maltose, thủy giải bằng acid tạo glucose. Cho nhiều màu sắc khác nhau với dung dịch Iod. Dextrin có mức độ phức tạp cao cho màu xanh hoặc đỏ tía. Các dextrin có mức độ phân tử trung bình cho màu đỏ và các dextrin có mức độ phân tử thấp hơn sẽ không tạo màu với Iod. Dextrin tan trong nƣớc tạo dung dịch trong nhƣ nƣớc trái cây, nhƣng khi có glycogen dung dịch dextrin sẽ có màu trắng đục. Bảng 2.2. Một số tính chất của dextrin DE pH Tính chất 4 - 7 4,0 - 5,0 Độ nhớt cao, rất ít hút ẩm, ít ngọt, hòa tan tới 15% chất khô, bột mịn. Glucose 0,3% chất khô, maltose 0,9% chất khô 9 -12 4,0 - 4,7 Rất ít hút ẩm, ít ngọt, ít hóa màu nâu, hòa tan tới 30% chất khô Glucose 0,8% chất khô Maltose 2,9% chất khô 13 - 19,5 4,0 - 5,1 Ít hút ẩm, ít biến màu nâu, ngọt nhẹ, hòa tan tới 60 - 70% chất khô Glucose 1,3 - 1,6% chất khô, maltose 4,8 - 5,8% chất khô. 2.5.2.1. Độ nhớt Độ nhớt là một trong những yếu tố quan trọng trong ứng dụng của dextrin, lợi dụng độ nhớt này mà ngƣời ta sản xuất huyết tƣơng trong y học. Độ nhớt dextrin đƣợc đo bằng Sangtipuaz bởi các pipet chuyên dụng hoặc các công cụ chuẩn khác. Độ nhớt phụ thuộc vào nguồn tinh bột, nhiệt độ, nồng độ acid, độ pH và tuổi của dung dịch. 16 2.6.2.2. Độ pH pH ảnh hƣởng đến dextrin thành phẩm, độ keo tụ và kết dính. Trong quá trình thủy giải, độ acid làm biến đổi tinh bột hay dextrin phân tử lƣợng lớn tạo dung dịch loãng. Dù đƣợc trung hòa trở lại bằng Na2CO3 hoặc NH3 trƣớc khi đóng gói, nhƣng acid với một lƣợng dƣ vẫn ảnh hƣởng tính keo trong quá trình tích lũy. 2.6.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin Sự gia tăng độ nhớt gây ra do sự đông lại hoặc do sự thoái biến của dung dịch dextrin, đặc biệt là những dextrin ít hòa tan. Khi thêm vào dung dịch dextrin chất làm đông đặc (Tetraborate Natri 5 - 20%) thì độ nhớt của dextrin gia tăng, thêm các chất nhƣ urea, dicyandiamide, salisilic acid, formaldehyde, các muối guanadin sẽ làm giảm độ nhớt. Thêm urea có thể thích hợp để dung dịch dextrin ở trạng thái lỏng. 2.6.2.4. Độ hòa tan Giai đoạn đầu của sự dextrin hóa, không có biến đổi lớn về độ tan của dextrin trong nƣớc lạnh. Ở nhiệt độ 130 - 140oC, khi có acid thì độ hòa tan nhanh chóng đạt 100% nhƣng hồ nóng từ sản phẩm này không bền và lúc làm lạnh thì không tạo nên các gel đặc. 2.6.2.5. Màu sắc Màu của dextrin phụ thuộc độ acid và nhiệt độ dextrin hóa. Các sản phẩm thu đƣợc ở nhiệt độ thấp thƣờng cho màu trắng, còn những sản phẩm thu đƣợc ở nhiệt độ cao có thể màu nâu. Độ acid cao ở một nhiệt độ nhất định thƣờng làm sẫm màu sản phẩm do quá trình caramel hóa. Có thể tẩy trắng dextrin với các peroxide hydrogen và bisulfite natri trong hệ thống acid hay peborat natri trong dung dịch kiềm. 17 2.5.3. Qui trình sản xuất dextrin (Nguyễn Xuân Thủy, 2001) Dung dịch tinh bột pH thích hợp Hồ hóa t o = 90 – 100oC t = 2 - 3 phút + enzyme Dịch hóa t o thích hợp t = 30 – 150 phút Bất hoạt enzyme Gia nhiệt Hạ pH Ly tâm Dung dịch dextrin có lẫn các loại đƣờng Tủa dextrin bằng cồn 96o Ly tâm loại nƣớc và đƣờng hòa tan Dextrin sấy khô Sơ đồ 2.1. Tóm tắt qui trình điều chế dextrin từ tinh bột 18 2.5.4. Ứng dụng Dextrin là sản phẩm trung gian giữa tinh bột và đƣờng đơn hay đƣờng đôi. Bản chất là đƣờng nên chúng tƣơng đối đƣợc cơ thể dễ hấp thu hơn tinh bột. Dextrin đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp vì chúng không có độc tố và giá thành thấp. Đƣợc sử dụng nhƣ dịch keo có thể hòa tan trong nƣớc nhƣ hồ dán, dùng làm tác nhân hóa dày trong chế biến thực phẩm và tác nhân kết dính trong dƣợc phẩm. Đƣờng malto-dextrin chủ yếu dùng làm thức ăn cho trẻ em, thực phẩm ăn kiêng với lƣợng nhỏ calo pha loãng (Janusz vaf Anna, 2004), làm chất thơm hay màu thực phẩm, dùng trong công nghiệp dƣợc phẩm. Một số dextrin đƣợc sử dụng thay thế cho chất béo trong các sản phẩm nhƣ bơ và mỡ gầy. Trong công nghiệp rƣợu bia, dextrin đƣợc đƣa vào để ổn định lƣợng dextrin trong sản phẩm, vừa là cơ chất cho quá trình lên men vừa tăng chất lƣợng, tạo cảm quan tốt cho sản phẩm. Trong y học, dextrin đƣợc pha chế với glucose 5%, NaCl 9‰ hay sorbitol 5% tạo dung dịch huyết tƣơng, dung dịch này dùng để chữa trị cho bệnh nhân mất máu nhiều (Lê Hồng Phú, 2000). 19 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Khóa luận đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian tiến hành: từ 19/03/2007 đến 19/07/2007. 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU  Nguồn gốc vi khuẩn Giống vi khuẩn Bacillus subtilis do công ty TNHH Gia Tƣờng cung cấp.  Nguyên liệu - Cám bắp, bã đậu nành, bột năng Vĩnh Thuận, bột nếp Vĩnh Thuận, bột gạo Vĩnh Thuận, bột bắp Tài Ký.  Thiết bị và dụng cụ - Cân điện tử - Pipet - Tủ lạnh - Micropipet - Bể điều nhiệt - Bercher - Nồi hấp - Erlen - Tủ sấy - Bình định mức - Máy ly tâm - Ống đong - Máy đo mật độ quang - Khay nhựa…  Hóa chất - Cồn 96% - Iod - NaCl - HCl - NaOH - Na2HPO4 - (NH4)2SO4 - NaH2PO4 … 20  Các loại môi trƣờng Môi trƣờng giữ giống (môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton agar). Môi trƣờng nhân giống (môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton). Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn. Thành phần và tỷ lệ các loại môi trƣờng đƣợc trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục. 3.3. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.3.1. Xác định mật độ tế bào Bacillus subtilis trong dịch tăng sinh Cách tiến hành: Dùng que cấy vòng cấy chuyển 1 vòng vi khuẩn B. subtilis từ ống giống vào erlen chứa 20 ml môi trƣờng tăng sinh đã khử trùng, lắc đều và đặt trên máy lắc (120 - 180 vòng/phút). Sau 24 giờ kiểm tra số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch tăng sinh bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc (đƣợc trình bày ở mục 2.1 và 2.2 của phần phụ lục). 3.3.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy tối ƣu Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn (35 g/erlen) đƣợc khử trùng ở 1atm trong 45 phút và để nguội khoảng 40 - 50oC. Cấy 5% dịch vi khuẩn đã tăng sinh 24 giờ vào môi trƣờng nuôi cấy. Ủ ở nhiệt độ phòng (30 – 32oC), trong thời gian 24, 36, 48, 60 và 72 giờ. Canh trƣờng sau khi nuôi cấy đƣợc sấy khô ở 50oC. Cân 1 g canh trƣờng đã sấy khô hòa trong 100 ml nƣớc cất, đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút ta có dịch enzyme pha loãng 100 lần. Từ dịch pha loãng này tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng thích hợp để xác định hoạt tính α- amylase theo phƣơng pháp Heinkel (xem mục 2.5 phần phụ lục). 3.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% Trong thí nghiệm này dùng phƣơng pháp tủa enzyme bằng cồn 96% lạnh (xem mục 2.3 phần phụ lục). Cân 5 g canh trƣờng đã sấy khô và nghiền nhỏ hòa trong 80 ml nƣớc cất, lắc đều trong 15 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch chiết enzyme. 21 Hoạt độ α-amylase sau tủa Lƣợng protein sau tủa Lấy 10 ml dịch chiết enzyme trên đem tủa với cồn 96% đã để lạnh khoảng 4 o C theo các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5, lắc đều, để lạnh trong 15 phút rồi lấy ra đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ cồn, thu cặn lắng và hòa trong 5 ml đệm acetate pH = 5,0. Định mức với nƣớc cất thành 100 ml. Hút 1 ml dịch enzyme này đem định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry (xem mục 2.6 phần phụ lục) và xác định hoạt tính theo phƣơng pháp Heinkel. Hiệu suất thu hồi hoạt độ amylase từ 10 ml DCE đƣợc tính theo công thức: H (%) = x 100 Hiệu suất thu hồi protein từ 10 ml DCE đƣợc tính theo công thức: H (%) = x 100 3.3.4. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 Tƣơng tự, chuẩn bị dịch chiết enzyme từ canh trƣờng giống nhƣ phần tủa bằng cồn 96%. Cân chính xác lƣợng muối (NH4)2SO4 (xem mục 2.6 phần phụ lục). Cho từ từ vào các erlen chứa 10 ml dịch enzyme đã để lạnh, lắc đều trong 10 phút. Sau đó đem để lạnh. Sau 10 phút, đem ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút. Các bƣớc kế tiếp tiến hành giống nhƣ phần tủa bằng cồn 96%. 3.3.5. Khảo sát thời gian tủa cồn 96% Các bƣớc tiến hành giống nhƣ phần khảo sát tỷ lệ cồn, nhƣng thể tích cồn ở thí nghiệm này không thay đổi. Tỷ lệ cồn 96% và enzyme là tỷ lệ thích hợp đã xác định đƣợc ở mục 3.3.3. Kiểm tra hoạt tính α-amylase và định lƣợng protein với thời gian tủa là 15, 30, 45, 60 và 75 phút. Hoạt độ α-amylase trƣớc tủa Lƣợng protein sau tủa 22 3.3.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng năng thủy phân tinh bột của chế phẩm α-amylase 3.3.6.1. Nhiệt độ phản ứng Cân 0,03 g chế phẩm α-amylase tinh sạch sơ bộ bằng cồn 96% đã sấy khô hòa trong 50 ml nƣớc cất, pha loãng thêm 100 lần. Đo hoạt tính α-amylase theo phƣơng pháp Heinkel ở các giá trị nhiệt độ: 30, 40, 45, 50, 55, 60 và 65oC. 3.3.6.2. pH Tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của các giá trị pH: 5,8; 6,0; 6,2; 6,4 và 6,6 lên hoạt độ α-amylase ở nhiệt độ thích hợp. Kiểm tra hoạt tính α-amylase ở mỗi giá trị pH theo phƣơng pháp Heinkel. 3.3.7. Khảo sát tỷ lệ cồn 96% thích hợp để thu dextrin Tinh bột sau khi hồ hóa đƣợc để nguội đến nhiệt độ thích hợp và cho chế phẩm enzyme (CPE) đã pha loãng vào (xem mục 2.7 phần phụ lục). Sau 30 phút đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ tinh bột thừa. Dịch ly tâm đƣợc cho vào các erlen có chứa cồn theo các tỷ lệ 1:2, 1:3 và 1:4, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch cồn và cân lƣợng dextrin thu đƣợc. 3.3.8. Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của chế phẩm α-amylase 3.3.8.1. Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột Thực hiện phản ứng thủy phân với các nguồn tinh bột khác nhau: bột gạo, bột năng, bột nếp, bột bắp ở nồng độ 10%. Tiến hành: 2 g tinh bột đƣợc hồ hóa trong 18 ml dung dịch đệm ở giá trị pH tối ƣu; làm nguội đến nhiệt độ thích hợp và cho vào 0,5 ml chế phẩm α-amylase đã pha loãng 200, 400, 600 lần, khuấy đều, liên tục. Sau 10 phút, cho 5 ml HCl 5% để dừng phản ứng. Ly tâm loại bỏ tinh bột thừa, dịch ly tâm đƣợc tủa cồn để thu dextrin. Cân lƣợng dextrin tạo thành và so sánh khối lƣợng dextrin có đƣợc giữa các nguồn tinh bột. 23 Dextrin thu đƣợc (g) Tinh bột ban đầu (g) Hiệu suất thu dextrin tính theo công thức: H (%) = x 100 3.3.8.2. Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp Sau khi chọn đƣợc nguồn tinh bột thích hợp, tiến hành khảo sát lƣợng dextrin tạo thành ở các nồng độ tinh bột là 10%, 15% và 20%. Cho thể tích và độ pha loãng CPE thích hợp vào 20 g hồ tinh bột với nồng độ tinh bột 10% và 15% và 20%. Thời gian khảo sát là 10, 20, 30 và 40 phút. 3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu đƣợc xử lý sai số và vẽ đồ thị, biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel 2003. 24 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY B. SUBTILIS Tiến hành thí nghiệm theo phần 3 mục 3.3.2, canh trƣờng nuôi cấy sau các thời điểm 24, 36, 48, 60, 72 giờ đƣợc kiểm tra hoạt tính bằng phƣơng pháp Heinkel. Thời gian nuôi cấy 48 giờ α-amylase có hoạt độ cao nhất là 468865 UI/g canh trƣờng (CT). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và đồ thị 4.1. Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase Thời gian (giờ) Độ pha loãng ∆OD Tinh bột bị thủy phân (mg/ml) Hoạt độ (UI/g CT) 24 10000 0,296 ± 0,0006 5,227 ± 0,011 52272 ± 105 36 80000 0,261 ± 0,0018 4,585 ± 0,032 366817 ± 3802 48 100000 0,267 ± 0,0012 4,689 ± 0,021 468865 ± 2108 60 100000 0,252 ± 0,0017 4,427 ± 0,030 442700 ± 3042 72 100000 0,231 ± 0,0009 4,044 ± 0,016 404365 ± 1610 Trong khoảng thời gian nuôi cấy từ 24 - 36 giờ hoạt độ của amylase tăng nhanh là do Bacillus subtilis trong giai đoạn phát triển và phân chia tối đa. Tại thời điểm 48 giờ, mật độ B. subtilis ổn định và lƣợng α-amylase sinh ra đạt cực đại nên hoạt độ α-amylase lúc này cao nhất. Từ 48 giờ trở đi, vi khuẩn chết dần do cạn dinh dƣỡng và hầu nhƣ không sinh α-amylase nữa; trong khi đó, lƣợng nƣớc có trong canh trƣờng trong thời gian dài làm hoạt độ α-amylase giảm dần. 25 52272 468865 404365 442700 366817 0 100000 200000 300000 400000 500000 24 36 48 60 72 Thời gian (giờ) H oạ t đ ộ ( UI /g C T) Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase 4.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH SƠ BỘ α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ (NH4)2SO4 4.2.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% Hoạt độ α-amylase trƣớc tủa là 50205,64 (UI/10ml dịch chiết enzyme), hàm lƣợng protein có trong 10 ml dịch chiết enzyme trƣớc tủa là 97,032 mg/10ml. Sau khi tủa, ly tâm loại bỏ cồn và đo hoạt tính bằmg phƣơng pháp Heinkel kết hợp định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Lowry theo phần 3 mục 3.3.3; chúng tôi ghi nhận ở tỷ lệ cồn 96% và enzyme là 3:1, α-amylase có hoạt độ cao nhất là 45607,75 Hình 4.2. Canh trƣờng nuôi cấy sau 48 giờ Hình 4.1. Môi trƣờng bán rắn trƣớc khi nuôi cấy 26 4367 43219 44284 45608 44056 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 1 2 3 4 5 Vcồn/Venzyme H oạ t đ ộ (U I/1 00 m l C P tƣ ơi ) UI/100ml chế phẩm α-amylase tƣơi). Kết quả khảo sát đƣợc trình bày ở bảng 4.2 và đồ thị 4.2. Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase Enzyme/cồn Protein (mg/100ml CP tƣơi) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt độ (UI/100ml CP tƣơi) Hiệu suất thu hồi hoạt độ (%) 1:1 10,462 ± 0,232 10,78 4366,90 ± 190,003 8,698 1:2 15,963 ± 0,568 16,45 44056,08 ± 80,497 87,751 1:3 21,756 ± 0,232 22,42 45607,75 ± 185,067 90,842 1:4 23,127 ± 0,154 23,83 44284,27 ± 109,698 88,206 1:5 23,696 ± 0,154 24,42 43219,40 ± 270,422 86,085 Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase Ở tỷ lệ 1:1, nồng độ cồn còn thấp chỉ kết tủa đƣợc một lƣợng nhỏ protein (α-amylase) nên hoạt độ α-amylase thấp. Nhƣng ở tỷ lệ 4:1 và 5:1, tuy lƣợng protein thu đƣợc cao hơn, song hoạt độ α-amylase lại thấp hơn tỷ lệ 3:1 là do ở hai tỷ lệ trên nồng độ cồn quá cao đã làm protein bị biến tính nên hoạt độ α-amylase giảm. 27 31835 36916 37575 37281 3693 10000 20000 30000 40000 50000 50 55 60 65 70 (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) H oạ t đ ộ (U I/1 00 m l C P tƣ ơi ) 4.2.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ tủa α-amylase bằng (NH4)2SO4 Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phần 3 mục 3.3.4. Kết quả ghi nhận ở bảng 4.3 và đồ thị 4.3. Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase Độ bão hòa (%) Hàm lƣợng protein (mg/100 ml CPtƣơi ) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt độ (UI/100 ml CP tƣơi ) Hiệu suất thu hồi hoạt độ (%) 50 14,805 ± 0,118 15,02 31835,132 ± 205,852 61,73 55 15,846 ± 0,101 16,08 36916,077 ± 73,132 71,58 60 16,293 ± 0,195 16,53 37575,282 ± 20,283 72,86 65 16,683 ± 0,108 16,92 37281,175 ± 123,378 72,29 70 19,037 ± 0,166 19,31 36926,219 ± 126,669 71,60 Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase Tủa bằng (NH4)2SO4 ở 60% độ bão hòa, α-amylase có hoạt độ cao nhất. Ở 70%, hoạt độ α-amylase giảm, do nồng độ muối quá cao làm biến tính protein. Theo bảng 4.2 và 4.3, tủa bằng cồn 96% hoạt độ của α-amylase và lƣợng protein thu hồi đƣợc cao hơn khi tủa bằng (NH4)2SO4. Vì vậy, chúng tôi chọn cồn 96% là tác nhân thích hợp dùng để tủa α-amylase. 28 50369 48742 45942 45729 44497 30000 40000 50000 60000 15 30 45 60 75 Thời gian (phút) H oạ t đ ộ (U I/1 00 m l C P tƣ ơi ) 4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA CỒN 96% Tiến hành thí nghiệm khảo sát thời gian tủa theo phần 3 mục 3.3.5. Theo kết quả ghi nhận ở bảng 4.4, thời gian tủa tốt nhất đối với α-amylase là 15 phút. Thời gian tủa càng dài lƣợng protein thu đƣợc càng nhiều nhƣng hoạt độ của α-amylase không tăng do lƣợng α-amylase bị biến tính tăng theo thời gian tiếp xúc với cồn 96%. Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase Thời gian tủa (phút) Hàm lƣợng protein (mg/100ml CP tƣơi) Hiệu suất thu hồi potein (%) Hoạt độ (UI/100ml CP tƣơi) Hiệu suất thu hồi hoạt độ (%) 15 21,493 ± 0,134 22,15 50369,23 ± 139,424 93,24 30 22,164 ± 0,127 22,84 48741,50 ± 30,425 90,23 45 23,069 ± 0,101 23,77 45942,42 ± 91,274 85,05 60 23,842 ± 0,228 24,57 45729,45 ± 121,699 84,65 75 24,324 ± 0,077 25,07 44497,24 ± 290,234 82,37 Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase 29 1229194 910748 1327061 1256069 963484943708 838742 500000 700000 900000 1100000 1300000 1500000 30 35 40 45 50 55 60 65 Nhiệt độ ( o C) H oạ t đ ộ (U I/g C PE ) 4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN TINH BỘT CỦA CHẾ PHẨM α-AMYLASE Thực hiện thí nghiệm theo phần 3 mục 3.3.6. Sau khi đo hoạt tính bằng phƣơng pháp Heinkel, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: 4.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase Nhiệt độ (oC) ∆OD Tinh bột bị thủy phân (mg) Hoạt độ (UI/g CPE) 30 0,285 ± 0,0041 5,032 ± 0,075 838742 ± 12462 40 0,320 ± 0,0018 5,662 ± 0,032 943708 ± 5366 45 0,326 ± 0,0015 5,781 ± 0,027 963484 ± 4421 50 0,423 ± 0,0010 7,536 ± 0, 18 1256 69 ± 3042 55 0,446 ± 0,0009 7,962 ± 0,016 1327060 ± 2683 60 0,414 ± 0,0018 7,375 ± 0,032 1229194 ± 5366 65 0,309 ± 0,0038 5,464 ± 0,069 910748 ± 11519 Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase 30 Theo số liệu bảng 4.5 cho thấy nhiệt độ tối ƣu của α-amylase là 55oC với hoạt độ cao nhất là 1327061 (UI/g chế phẩm enzyme). Ở 60oC, hoạt độ α-amylase bắt đầu giảm xuống. 4.4.2. Ảnh hƣởng của pH Cố định ở nhiệt độ tối thích là 55oC, thực hiện phản ứng thủy phân với giá trị pH thay đổi theo phần 3 mục 3.3.6.2. Kết quả đƣợc ghi nhận ở bảng 4.6 và đồ thị 4.6. pH 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 Hình 4.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase pH ∆OD Tinh bột bị thủy phân (mg/ml) Hoạt độ (UI/g CPE) 5,8 0,433 ± 0,0033 7,734 ± 0,060 1255562 ± 9988 6,0 0,438 ± 0,0035 7,810 ± 0,064 1301707 ± 10685 6,2 0,419 ± 0,0013 7,469 ± 0,024 1244914 ± 4057 6,4 0,421 ± 0,0009 7,515 ± 0,016 1238829 ± 2683 6,6 0,402 ± 0,0003 7,156 ± 0,006 1192684 ± 1014 Từ bảng 4.6, chúng tôi thấy ở 55oC, pH tối ƣu của α-amylase là 6,0 với hoạt độ là 1301707 (UI/g chế phẩm enzyme). 31 1192684 1238829 1244914 1301707 1255562 1000000 1100000 1200000 1300000 1400000 5,8 6 6,2 6,4 6,6 pH H oạ t đ ộ (U I/g C PE ) 0,31 1,29 1,18 1,17 0,0 0,5 1,0 1,5 1 2 3 4 Vcồn/Vdextrin D ex tr in (g ) Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase 4.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ CỒN 96% TỦA DEXTRIN Bảng 4.7. Lƣợng dextrin thu đƣợc ở các tỷ lệ cồn 96% Cồn 96% : dịch dextrin Khối lƣợng dextrin (g) 1:1 0,31 ± 0,021 2:1 1,29 ± 0,009 3:1 1,18 ± 0,019 4:1 1,17 ± 0,015 Biểu đồ 4.1. Lƣợng dextrin thu đƣợc từ các tỷ lệ cồn 96% 32 1,31 1,56 0,99 1,39 1,94 1,87 1,40 1,35 1,03 1,58 1,45 1,23 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 200 400 600 Độ pha loãng enzyme (lần) De xt ri n (g ) Bột gạo Bột nếp Bột bắp Bột năng Tỷ lệ cồn 96% để thu dextrin là 2:1, tỷ lệ cồn tăng thì khối lƣợng dextrin thu đƣợc giảm do lƣợng cồn càng nhiều làm cho lƣợng nƣớc trong dextrin tách ra càng nhiều. 4.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA α-AMYLASE VỚI CÁC NGUỒN TINH BỘT Thực hiện thí nghiệm theo phần 3 mục 3.3.8 với bột bắp, bột nếp, bột gạo, bột năng ở nồng độ 10%, 0,5 ml enzyme, thời gian thủy phân là 15 phút. Kết quả đƣợc ghi nhận ở bảng 4.8. Bảng 4.8. Lƣợng dextrin (g) tạo thành do α-amylase thủy phân tinh bột 10% Độ pha loãng CPE Khối lƣợng dextrin (g) Bột gạo Bột nếp Bột bắp Bột năng 200 1,03 ± 0,058 1,31 ± 0,032 0,99 ± 0,023 1,39 ± 0,018 400 1,40 ± 0,084 1,58 ± 0,061 1,23 ± 0,026 1,94 ± 0,044 600 1,35 ± 0,087 1,56 ± 0,04 1,45 ± 0,031 1,87 ± 0,053 Biểu đồ 4.2. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ tinh bột 10% 33 Bảng 4.9. Hiệu suất thu dextrin Độ pha loãng CPE (lần) Hiệu suất thu dextrin (%) Bột gạo Bột nếp Bột bắp Bột năng 200 51,67 ± 2,89 65,50 ± 1,61 49,33 ± 1,17 69,67 ± 0,08 400 69,83 ± 4,21 79,00± 3,04 61,33 ± 1,30 96,83 ± 2,19 600 67,67 ± 4,34 78,00 ± 2,02 72,50 ± 1,53 93,50 ± 2,65 Từ bảng 4.8 và bảng 4.9 cho thấy lƣợng dextrin thu đƣợc cao nhất khi sử dụng cơ chất là bột năng ở độ pha loãng CPE là 400 lần với lƣợng dextrin thu đƣợc là 1,94 gam, hiệu suất 96,83%. 4.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BỘT NĂNG VÀ THỜI GIAN THỦY PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE Theo bảng 4.8 và 4.9, chúng tôi thấy α-amylase thủy phân tốt ở độ pha loãng 400 lần. Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm này với chế phẩm α-amylase pha loãng 400 lần. Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát sơ bộ sự thủy phân tinh bột với các thể tích α-amylase pha loãng 400 lần, chúng tôi chọn ra những thể tích thích hợp để thực hiện thí nghiệm này: thể tích α-amylase cho vào 20 g hồ tinh bột năng 10% và 15% là 0,5 ml enzyme; 20 g hồ tinh bột năng 20% là 1,5 ml enzyme. Kết quả ghi nhận ở bảng 4.10, 4.11 và 4.12. Bảng 4.10. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 10% Thời gian thủy phân (phút) Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%) 10 1,93 ± 0,032 96,5 ± 1,61 20 1,86 ± 0,015 93,17 ± 2,73 30 1,72 ± 0,055 85,83 ± 0,77 40 1,62 ± 0,032 81,17 ± 1,59 34 1,93 1,86 1,72 1,62 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 10 20 30 40 Thời gian thủy phân (phút) D ex tr in (g ) 2,01 2,37 2,03 1,93 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 10 20 30 40 Thời gian thủy phân (phút) D ex tr in (g ) Biểu đồ 4.3. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 10% Sau khi thủy phân hết tinh bột, α-amylase sẽ chuyển sang thủy phân dextrin. Vì vậy, nếu kéo dài thời gian thủy phân lƣợng dextrin thu đƣợc sẽ thấp dần. Bảng 4.11. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 15% Thời gian thủy phân (phút) Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%) 10 2,01 ± 0,071 67 ± 2,36 20 2,37 ± 0,065 78,89 ± 2,16 30 2 ± 0,081 66,67 ± 2,69 40 1,93 ± 0,069 64,22 ± 2,31 Biểu đồ 4.4. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 15% 35 2,25 2,51 2,36 2,30 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 10 20 30 40 Thời gian thủy phân (phút) D ex tr in (g ) Bảng 4.12. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 20% Thời gian thủy phân (phút) Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%) 10 2,25 ± 0,072 56,25 ± 1,81 20 2,507 ± 0,086 62,67 ± 2,14 30 2,363 ± 0,102 59,08 ± 2,54 40 2,303 ± 0,064 57,58 ± 1,59 Biểu đồ 4.5. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 20% Đối với hồ bột năng 15% và 20%, do nồng độ tinh bột cao làm cho khả năng thủy phân tinh bột của α-amylase giảm nên hiệu suất thu dextrin không cao. Ở 30 và 40 phút mặc dù lƣợng tinh bột vẫn còn nhiều nhƣng lƣợng dextrin thu đƣợc vẫn không tăng. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc nhiều nhất khi thủy phân bột năng 10% là 1,93 g đạt hiệu suất là 96,5% và thời gian thủy phân là 10 phút (theo bảng 4.10). Đối với dung dịch bột năng 15%, lƣợng dextrin nhiều nhất là 2,37 g, hiệu suất 78,89% và thời gian thủy phân là 20 phút (theo bảng 4.11). 36 Dung dịch bột năng 20% có lƣợng dextrin cao nhất là 2,5 g, hiệu suất 62,67% và thời gian thủy phân là 20 phút (theo bảng 4.12). Hình 4.4. Chế phẩm α-amylase Hình 4.5. Chế phẩm dextrin 37 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN - Thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu α-amylase từ Bacillus subtilis là 48 giờ. - Tinh sạch sơ bộ dịch chiết α-amylase từ canh trƣờng nuôi cấy bằng cồn 96% tốt hơn (NH4)2SO4 với tỷ lệ cồn 96% thích hợp nhất là 1:3 với hiệu suất thu enzyme theo hoạt độ là 90,84% và gian tủa là 15 phút. - Nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động thủy phân của α-amylase tƣơng ứng là 55oC và 6,0. - Lƣợng dextrin thu đƣợc cao nhất (1,94 g) đạt hiệu suất 96,83% khi thủy phân bột năng (khoai mì) 10%. 5.2. ĐỀ NGHỊ - Tối ƣu các điều kiện nuôi trên khay để thu α-amylase có hoạt độ cao hơn. - Tủa enzyme ở nhiều nồng độ cồn khác nhau. - Xác định lƣợng tinh bột có trong các nguồn tinh bột khảo sát. - Định lƣợng dextrin thật trong chế phẩm dextrin. - Tách và khảo sát tính chất các phân đoạn dextrin từ sản phẩm dextrin thu đƣợc; nghiên cứu ứng dụng chế phẩm dextrin vào trong chế biến thực phẩm và y dƣợc. 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Nhƣ Nhứt, 2006. Phương pháp kiểm tra một số enzyme dùng trong chăn nuôi. Giáo trình khoa Sinh Học Bộ môn Sinh Hóa Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh, tr. 16 - 17. 2. Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngô Đại Nghiệp, 2004. Thực tập lớn sinh hóa. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia, TP. Hồ Chí Minh, tr. 36 – 46. 3. Lê Hồng Phú, 2000. Khảo sát qui trình điều chế dextrin từ một số loại tinh bột bằng sự thủy giải bởi acid HCl. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh Học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh. 4. Lƣơng Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội, tr. 249 – 257. 5. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus và thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 6. Nguyễn Đức Lƣợng, 2004. Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền. Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật. 7. Nguyễn Quỳnh Nam, 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với Echerichia coli gây bệnh tiêu chảy tr ên heo. Luận văn tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Tiến Thắng, 2002. Giáo trình Công nghệ enzyme. Viện Sinh Học Nhiệt Đới, TP. Hồ Chí Minh, tr. 42- 73. 9. Nguyễn Thị Nhƣ Thủy, 2005. Khảo sát các đặc tính của enzyme amylase thu nhận từ hai chủng nấm mốc Aspergillus niger và Aspergillus oryzae. Khóa luận cử nhân khoa học ngành Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. 10. Nguyễn Thị Thu Thủy, 2006. Khảo sát khả năng tổng hợp α-amylase và một số điều kiện kỹ thuật ảnh hưởng lên quá trình tăng sinh của Bacillus 39 sp. Báo cáo thực tập tốt nghiệp ngành Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. 11. Nguyễn Xuân Thủy, 2001. Khảo sát qui trình điều chế dextrin từ một số loại tinh bột bằng sự thủy giải bởi enzyme. Khóa luận cử nhân khoa học ngành Sinh Học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh. 12. Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ Thuật Sinh Hóa. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. 13. Trần Đỗ Quyên, 2004. Thu nhận và khảo sát hoạt tính của chế phẩm alpha amylase từ Bacillus subtilis. Báo cáo thực tập tốt nghiệp ngành Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM. 14. Trần Linh Thƣớc, 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo Dục, tr. 65 – 71. Tài liệu tiếng Anh 15. K. Clarkson, B. Jones, R. Bott, B. Bower, G. Chotani, T. Becker, Enzymes: Screening, Expression, Design and Production, Enzymes in Farm Animal Nutrition (Michael R. Bedford, Gary G. Partridge). CABI publishing, OCAB International, 2001, p. 337 – 346. Tài liệu từ internet 16. Ngô Xuân Mạnh, Võ Nhân Hậu, Nguyễn Thị Tú. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho việc thu nhận α-amylase chịu nhiệt từ vi khuẩn Bacillus licheniformis. 17. Steven J. McWethy, Paul A. Hartman. Purification and Some Propeerties of an Extracellular Alpha-amylase from Bactriodes amylophilus. Journal of Bacteriology, March. 1977, p. 1537 – 1544. (URL: 18. Janusz Kapusniak, Anna Tyflewska. The utilisation of dextrins from the thermolysis of starch with biogenic amino acids by Lactobacillus rhamnosus bacteria. Food, Agriculture & Enviroment Vol 2 (1): 153 – 159. 2004, Science and Technology, WFL Publisher. 40 19. Hopek M., Ziobro R, Achremowicz B., 2006. Comparison of the effects of microbial a-amylase and scalded flour on bread quality. Acta Sci. Pol, Technol. Aliment .5(1), 97 – 106. 20. O. S. AZEEZ, 2005. Production of Dextrins from Cassava Starch. Chemical Engineering Department, Federal University of Technology, Minna, Nigeria, Lenardo Journal of Sciences ISSN 1583 – 0233. 21. Dextrin. The Colombia Encylopedia, Sixthedition. Copyright 2001 - 05 Colombia University Press. 22. Bacillus subtilis 41 PHỤ LỤC 1. THÀNH PHẦN MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƢỜNG 1.1. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton agar Giá đậu 100g D-glucose 50g Pepton 10g Agar 20g Nƣớc cất đủ 1000 ml pH = 7 Đun sôi 100g giá với 1000 ml nƣớc cất trong 30 phút, để nguội. Lọc nƣớc giá bằng vải lọc và định mức lại cho đủ 1000 ml. Cho glucose, pepton, agar vào và đun sôi, khuấy đều. Phân vào từng ống nghiệm, mỗi ống khoảng 10 ml môi trƣờng, hấp khử trùng ở 1atm trong 30 phút. Các ống nghiệm sau khi hấp đƣợc để nghiêng. 1.2. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton Giá đậu 100g D-glucose 50g Pepton 10g Nƣớc cất đủ 1000 ml pH = 7 Cho Glucose, pepton vào nƣớc chiết giá, khuấy đều và cho vào các erlen. Hấp khử trùng ở 1atm trong 30 phút. 42 1.3. Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn Bã đậu nành 50g Cám bắp 50g NaCl 0.36g CaCl2 0.6g DAP 0.2g MgSO4 0.5g Nƣớc cất đủ 135 ml pH = 7 2. CÁC PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 2.1. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Khác với phƣơng pháp đếm trực tiếp dƣới kính hiển vi, phƣơng pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là độ nhạy cao, cho phép định lƣợng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu. Cách thực hiện - Pha loãng mẫu theo dãy thập phân: Mẫu đƣợc pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân: hút 1 ml mẫu (hoặc dung dịch có độ pha loãng trƣớc đó) vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc cất đã khử trùng, lắc đều. - Sau khi đã pha loãng thành các nồng độ 10-3,10-4, 10-5, 10-6,… hút 1 ml dịch pha loãng ở mỗi nồng độ cho vào đĩa petri. Đổ khoảng 15 – 20 ml môi trƣờng đã khử trùng và để nguội đến 45 - 50oC vào đĩa petri có mẫu. - Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngƣợc chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống đƣợc trộn đều trong môi trƣờng cấy. - Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên, lật ngƣợc đĩa. - Sau 24 giờ tiến hành đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc trên đĩa. 43 Tính kết quả Mật độ tế bào vi khuẩn trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di đƣợc tính theo công thức: Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình /đĩa Di là độ pha loãng V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml). Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau. 2.2. Phƣơng pháp đo độ đục  Nguyên tắc Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trƣờng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật cũng là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trƣờng cũng làm môi trƣờng trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào.  Tiến hành - Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào: Các huyền phù của vi sinh vật cần kiểm nghiệm đƣợc pha loãng và đo OD610nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5. Dùng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này. Tính giá trị log(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tƣơng ứng với mỗi độ đục. Vẽ đƣờng biểu diễn của log(N/ml) (trục tung) theo OD610nm (trục hoành). Xác định khoảng tuyến tính giữa log(N/ml) và OD610nm. - Xác định mật độ tế bào theo độ đục: Đo độ đục của huyền phù tế bào cần xác định mật độ Từ trị số OD610nm đo đƣợc, dựa vào đƣờng tƣơng quan giữa log(N/ml) và độ đục OD610nm suy ra trị số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml (N/ml = 10 a với a = log(N/ml). 44 2.3. Phƣơng pháp tinh sạch enzyme bằng cồn  Nguyên tắc Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử có hằng số điện môi lớn (nhƣ nƣớc, dimethylsulphoxid) có thể ổn định các tƣơng tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngƣợc lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trƣờng. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trƣờng.  Cách tiến hành Sau khi cho cồn vào, enzyme sẽ bị kết tủa. Ly tâm loại cồn, thu tủa enzyme. Tủa enzyme đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm acetate (pH=5) và đo hoạt tính enzyme bằng phƣơng pháp Heinkel kết hợp với định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Lowry. 2.4. Phƣơng pháp tủa enzyme bằng (NH4)2SO4  Nguyên tắc Ở nồng độ muối cao thì khả năng hòa tan của enzyme giảm mạnh và có xu hƣớng kết lắng vì nồng độ muối cao làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm protein bị mất nƣớc.  Cách tiến hành Cân chính xác lƣợng muối (NH4)2SO4 ứng với các nồng độ bão hòa trong 10 ml dịch chiết enzyme (xem bảng 2.1). Bảng 2.1. Khối lƣợng tƣơng ứng các độ bão hoà Độ bão hoà (%) 50 55 60 65 70 (NH4)2SO4 (gram) 3,1 3,51 3,9 4,3 4,72 45 Cho 10 ml dịch chiết enzyme vào erlen và đƣa vào máy khuấy từ, cho từ từ muối vào. Sau 30 phút lấy ra ly tâm. 2.5. Phƣơng pháp Heinkel Thực hiện Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch tinh bột 1%, 1 ml dung dịch NaCl 0,1%, 2 ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0. Lắc đều, để ống nghiệm trong tủ ấm ở 30 o C, 15 - 20 phút để dung dịch đạt đến 30oC. Thêm 1 ml dung dịch enzyme đã pha loãng và đạt đến 30oC vào ống nghiệm. Lắc đều và tiếp tục giữ ở 30oC trong 30 phút. Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ ấm cho ngay vào 5 ml dung dịch HCl 1N để dừng phản ứng. Song song với mẫu thí nghiệm, làm mẫu kiểm tra đối chứng tƣơng tự nhƣ trên nhƣng cho dung dịch HCl vào trƣớc rồi cho enzyme vào. Lấy 1 ml mẫu thí nghiệm và đối chứng cho vào ống nghiệm mới, thêm vào 9 ml dung dịch Iod pha loãng 450 lần. Lắc đều, so màu ở bƣớc sóng 560 nm. Lấy hiệu số đọc đƣợc trên máy giữa mẫu đối chứng và thí nghiệm đối chiếu với đƣờng cong tiêu chuẩn, tính số mg tinh bột đã bị thủy phân. Cách tính Đơn vị hoạt động của enzyme là lƣợng enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh bột thành các sản phẩm không tạo màu với Iod sau 30 phút ở điều nhiệt độ thí nghiệm. Hoạt độ A = Số mg tinh bột bị phân giải * Độ pha loãng (UI). 2.6. Phƣơng pháp Lowry định lƣợng protein hòa tan trong nƣớc  Nguyên tắc Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lƣợng của những amino acid này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau có hàm lƣợng các amino acid này giống nhau. Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu. Cƣờng độ màu của phức này tỷ lệ với hàm lƣợng Tyrosin và Tryptophan 46 (cũng là lƣợng protein). Vì thế ta có thể dùng phƣơng pháp so màu để xác định hàm lƣợng protein.  Hóa chất Dung dịch albumin 0,1%: cân chính xác 0,1 g albumin pha với nƣớc cất thành 100 ml. Dung dịch A: cân 2 g Na2CO3 hòa trong NaOH 0,1N thành 100 ml Dung dịch B: 0,5 g CuSO4.5H2O hòa trong natri citrate 1% thành 100 ml Dung dịch C: hỗn hợp A và B theo tỉ lệ 49:1. dung dịch C pha trƣớc khi dùng 30 phút. Thuốc thử Folin: pha loãng 3 lần từ Folin đậm đặc.  Cách tiến hành + Lập đồ thị chuẩn: Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn có các nồng độ: 0, 50, 100, 150, 200, 250 μg/ml từ dung dịch albumin chuẩn 0,1% pha loãng với nƣớc cất theo các tỷ lệ khác nhau (xem bảng 2.1) Bảng 2.2. Cách pha các nồng độ albumin Số ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Albumin 1% (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Nƣớc cất (ml) 10 9,5 9 8,5 8 7,5 Protein (µg/ml) 0 50 100 150 200 250 Hút 0,4 ml dung dịch albumin đã pha loãng theo bảng 3 từ các ống 1 – 6 cho vào 6 ống nghiệm mới theo thứ tự. Thêm vào 2 ml dung dịch C, lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Thêm 0,2 ml Folin, lắc đều, để yên 5-10 phút, thêm nƣớc cất đủ 5 ml. So màu ở bƣớc sóng 750 nm. Xác định trị số mật độ quang của các ống, từ đó xây dựng đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml). 47 + Xác định hàm lƣợng protein trong mẫu: Hút vào ống nghiệm 0,4 ml dung dịch mẫu thí nghiệm. Thêm vào 2 ml dung dịch C, lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 5 – 10 phút, thêm nƣớc cất cho đủ 5 ml. Đem đo mật độ quang ở bƣớc sóng 750 nm.  Cách tính Từ đƣờng chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein, từ đó suy ra hàm lƣợng protein của nguyên liệu là a (μg/ml) Lƣợng protein (M) có trong 1 g nguyên liệu đƣợc tính theo công thức: M= mg protein/g Với a: hàm lƣợng protein (μg/ml dung dịch) n: hệ số pha loãng mẫu m: khối lƣợng nguyên liệu lấy phân tích (g) 2.7. Phƣơng pháp thu nhận dextrin Các bƣớc tiến hành: - Dịch hóa: trong thời gian hồ hóa tinh bột, ta để dung dịch enzyme ở nhiệt độ thích hợp để enzyme đƣợc hoạt hóa. Tinh bột đƣợc hồ hóa và làm nguội khoảng 50 o C, sau đó bổ sung enzyme vào dung dịch hồ tinh bột. Từ lúc cho enzyme vào, khuấy liên tục, khuấy kỹ để tạo sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất đồng đều. Thời gian từ lúc hồ hóa tinh bột đến lúc làm nguội và cho enzyme vào khoảng 5 phút. - Khi hồ tinh bột bắt đầu lỏng ra, tính thời gian. - Bất hoạt enzyme: sau mỗi thời gian khảo sát ta bất hoạt enzyme nhằm đảm bảo chính xác các thông số đo tại thời điểm khảo sát bằng cách làm lạnh và thêm 5 ml dung dịch HCl 5%. - Sau đó ly tâm loại bỏ tinh bột thừa, tủa cồn thu dextrin, đem sấy khô ở 70 - 80 o C. a x 10 -3 x n m 48 y = 2,3588x + 6,9686 R2 = 0,9725 6,8 7,2 7,6 8,0 8,4 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 OD610nm Lo g (N /m l) 2.8. Đồ thị chuẩn xác định mật độ tế bào Bảng 2.3. Giá trị OD610nm tƣơng ứng mật độ tế bào OD610nm 0,12 0,221 0,306 0,41 0,53 Mật độ trung bình (N/ml) 15,333x10 6 34x10 6 52,333x10 6 100,333x10 6 141x10 6 Log (N/ml) 7,186 7,531 7,719 8,001 8,149 Đồ thị 2.1. Sự tƣơng quan giữa giá trị OD61onm và mật độ tế bào 2.9. Đồ thị chuẩn xác định lƣợng tinh bột bị thủy phân theo phƣơng pháp Heinkel Bảng 2.4. Giá trị OD650nm tƣơng ứng hàm lƣợng tinh bột Tinh bột (mg/ml) 0 2 4 6 8 10 OD trung bình 0,016667 0,139 0,2497 0,3673 0,467 0,56167 dOD560nm 0 0,1223 0,233 0,3507 0,450333 0,545 49 y = 0,0561x R 2 = 0,997 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 2 4 6 8 10 tinh bột (mg/ml) dO D y = 0,0012x R 2 = 0,9961 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0 50 100 150 200 250 albumin (μg/ml) dO D Đồ thị 2.2. Sự tƣơng quan giữa giá trị OD560nm và hàm lƣợng tinh bột (mg/ml) 2.10. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp LOWRY Bảng 2.5. Giá trị OD750nm tƣơng ứng với các nồg độ albumin Albumin (μg/ml) 0 50 100 150 200 250 OD750nm trung bình 0,043 0,1117 0,1683 0,2253 0,277 0,33133 dOD 0 0,0687 0,1253 0,1823 0,234 0,28833 Đồ thị 2.3. Sự tƣơng quan giữa giá trị OD750nm và hàm lƣợng protein 50 2.11. Thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis Bảng 2.6. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase 2.12. Kết quả tủa enzyme bằng cồn 96% và (NH4)2SO4 Bảng 2.7. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase Trƣớc tủa Hoạt độ (UI/ml dịch chiết enzyme) Hoạt độ (UI/10ml DCE) 5020,56 50205,64 Enzyme/cồn Hoạt độ (UI/100ml CPE tƣơi) Phƣơng sai Sai số Hiệu suất (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 1:1 4001,80 4640,72 4458,17 4366,90 108303,38 190,003 8,698 1:2 44025,66 43934,38 44208,21 44056,08 19439,07 80,497 87,751 1:3 45303,50 45577,32 45942,42 45607,75 102749,4 185,067 90,842 1:4 44345,12 44071,29 44436,39 44284,27 36101,13 109,698 88,206 1:5 43341,10 43614,92 42702,18 43219,40 219383,77 270,422 86,085 Thời gian (giờ) Số lần Trung bình Phƣơng sai Sai số 1 2 3 24 ∆OD 0,297 0,295 0,296 0,296 1E-06 0,0006 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 5,245 5,209 5,227 5,227 0,0003332 0,0105 Hoạt độ (UI/g CT) 52454,27 52089,17 52271,72 52272,38 33324,117 105,395 36 ∆OD 0,264 0.262 0,258 0,261 9,33E-06 0,0018 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 4,634 4,597 4,524 4,585 0,0031103 0,0322 Hoạt độ (UI/g CT) 367790,03 361948,7 375092,2 366817,31 43365784 3802,008 48 ∆OD 0,267 0,265 0,269 0,267 4E-06 0,0012 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 4,689 4,652 4,725 4,689 0,001333 0,0211 Hoạt độ (UI/g CT) 468865,3 465214,3 472516,2 468865,26 13329647 2107,894 60 ∆OD 0,256 0,251 0,251 0,252 8,33E-06 0,0017 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 4,488 4,397 4,397 4,427 0,002777 0,0304 Hoạt độ (UI/g CT) 448784,9 439657,4 439657,4 442699,56 27770097 3042,482 72 ∆OD 0,233 0,233 0,230 0,231 2,33E-06 0,0009 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 4,068 4,050 4,013 4,044 0,0007776 0,0161 Hoạt độ (UI/g CT) 406798,6 404973,1 401322,2 404364,3 7775627,2 1609,93 51 Bảng 2.8. Hàm lƣợng protein tƣơng ứng các tỷ lệ cồn 96% và α-amylase Trƣớc tủa Protein (mg/ml DCE) Protein (mg/10ml DCE) 9,703 97,032 Enzyme/cồn Protein (mg/100ml CP tƣơi ) Phƣơng sai Sai số Hiệu suất (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 1:1 10,900 10,112 10,375 10,462 0,1609487 0,232 10,78 1:2 14,883 16,809 16,196 15,963 0,9682472 0,568 16,45 1:3 22,193 21,405 21,668 21,756 0,1609487 0,232 22,42 1:4 22,894 23,069 23,419 23,127 0,0715328 0,154 23,83 1:5 23,638 23,463 23,988 23,696 0,0715328 0,154 24,42 Bảng 2.9. Hoạt độ α-amylase sau khi tủa bằng (NH4)2SO4 Trƣớc tủa Hoạt độ (UI/ml DCE) Hoạt độ (UI/10ml DCE) 5157,47 51574,76 Độ bão hòa (%) Hoạt độ (UI/100ml CP tƣơi) Phƣơng sai Sai số Hiệu suất (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 50 31571,450 31693,149 32240,796 31835,132 127125,3 205,852 61,73 55 37017,493 36774,095 36956,644 36916,077 16044,95 73,132 71,58 60 37595,565 37595,565 37534,715 37575,282 1234,227 20,283 72,86 65 37078,343 37504,290 37260,892 37281,175 45666,38 123,378 72,29 70 36743,670 36865,369 37169,617 36926,219 48134,84 126,669 71,60 Bảng 2.10. Hàm lƣợng protein tƣơng ứng các độ bão hoà (NH4)2SO4 dùng tủa α-amylase Trƣớc tủa Protein (mg/ml DCE) Protein (mg/10ml DCE) 9,85 98,57 Độ bão hòa (%) Protein (mg/100ml CP tƣơi) Phƣơng sai Sai số Hiệu suất (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 50 14,825 14,591 15,000 14,805 0,0420113 0,118 15,02 55 16,021 15,846 15,671 15,846 0,0306569 0,101 16,08 60 15,904 16,488 16,488 16,293 0,1135441 0,195 16,53 65 16,605 16,546 16,897 16,683 0,0351987 0,108 16,92 70 19,173 19,231 18,706 19,037 0,0828872 0,166 19,31 52 2.13. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% Bảng 2.11. Hoạt độ α-amylase sau các thời gian tủa cồn 96% Trƣớc tủa Hoạt độ (UI/ml DCE) Hoạt độ (UI/10ml DCE) 5020,56 50205,64 Phút Hoạt độ (UI/100ml CP tƣơi) Phƣơng sai Sai số Hiệu suất (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 15 50277,96 50186,68 50643,06 50369,23 58317,204 139,424 93,24 30 48680,65 48771,93 48771,93 48741,50 2777,010 30,425 90,23 45 45759,87 46033,69 46033,69 45942,42 24993,087 91,274 85,05 60 45486,05 45851,15 45851,15 45729,45 44432,155 121,699 84,65 75 44253,84 44162,57 45075,31 44497,24 252707,884 290,234 82,37 Bảng 2.12. Hàm lƣợng protein tƣơng ứng các thời gian tủa cồn 96% Trƣớc tủa Protein (mg/ml DCE) Protein (mg/10ml DCE) 9,703 97,032 Phút Protein (mg/100ml CP tƣơi) Phƣơng sai Sai số Hiệu suất (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 15 21,230 21,580 21,668 21,493 0,0536496 0,134 22,15 30 22,193 22,368 21,931 22,164 0,0485401 0,127 22,84 45 23,244 23,069 22,894 23,069 0,0306569 0,101 23,77 60 23,463 23,813 24,251 23,842 0,1558393 0,228 24,57 75 24,294 24,469 24,207 24,324 0,0178832 0,077 25,07 53 2.14. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của CPE Bảng 2.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của chế phẩm α-amylase Nhiệt độ (oC) Số lần Trung bình Phƣơng sai Sai số 1 2 3 30 ∆OD 0,279 0,284 0,293 0,285 5,03333E-05 0,0041 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 4,917 5,008 5,172 5,032 0,0167731 0,075 Hoạt độ(UI/g CP) 819473 834686 862068 838742 4,66E+08 12462 40 ∆OD 0,317 0,323 0,320 0,320 9,33333E-06 0,0018 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 5,601 5,711 5,674 5,662 0,0031103 0,032 Hoạt độ (UI/g CP) 933566 951821 945736 943708 86395857,8 5366 45 ∆OD 0,326 0,324 0,329 0,326 6,33333E-06 0,0015 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 5,775 5,738 5,830 5,781 0,0021105 0,027 Hoạt độ(UI/g CP) 962469,8 956385 971597 963484 58625760,65 4420 50 ∆OD 0,425 0,422 0,422 0,423 3E-06 0,0010 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 7,573 7,518 7,518 7,536 0,0009997 0,018 Hoạt độ(UI/g CP) 1262154 1253027 1253027 1256069 27770097,15 3042 55 ∆OD 0,445 0,446 0,448 0,446 2,33333E-06 0,0009 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 7,938 7,956 7,992 7,962 0,0007776 0,016 Hoạt độ(UI/g CP) 1323004 1326046 1332131 1327060 21598964,45 2683 60 ∆OD 0,411 0,417 0,413 0,414 9,33333E-06 0,0018 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 7,327 7,436 7,363 7,375 0,0031103 0,032 Hoạt độ(UI/g CP) 1221081 1239336 1227166 1229194 86395857,8 5366 65 ∆OD 0,310 0,302 0,315 0,309 4,3E-05 0,0038 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 5,483 5,337 5,574 5,464 0,0143294 0,069 Hoạt độ(UI/g CP) 913790 889450 929003 910748 398038059 11519 54 2.15. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của CPE Bảng 2.14. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của chế phẩm α-amylase pH Số lần Trung bình Phƣơng sai Sai số 1 2 3 5,8 ∆OD 0,427 0,424 0,416 0,422 3,23333E-05 0,0033 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 7,619 7,564 7,418 7,533 0,010774798 0,060 Hoạt độ(UI/g CT) 1269760, 5 1260633 1236293 1255562 299299936 9988 6,0 ∆OD 0,4345 0,4445 0,4335 0,438 3,7E-05 0,0035 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 7,755 7,938 7,737 7,810 0,012329923 0,064 Hoạt độ (UI/g CT) 1292579 1323004 1289537 1301707 342497865 10685 6,2 ∆OD 0,4215 0,4175 0,4175 0,419 5,33333E-06 0,0013 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 7,518 7,445 7,445 7,469 0,001777286 0,024 Hoạt độ(UI/g CT) 1253027 1240857 1240857 1244914 49369062 4057 6,4 ∆OD 0,4185 0,4165 0,4155 0,417 2,33333E-06 0,0009 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 7,463 7,427 7,409 7,433 0,000777563 0,016 Hoạt độ(UI/g CT) 1243899 1237814 1234772 1238829 21598964 2683 6,6 ∆OD 0,402 0,402 0,401 0,402 3,33333E-07 0,0003 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 7,162 7,162 7,144 7,156 0,00011108 0,006 Hoạt độ(UI/g CT) 1193698 1193698 1190656 1192684 3085566 1014