Khóa luận Nuôi cấy mô cây dầu mè (Jatropha curcas L.)

ân giống bằng hạt. Rễ của cây giâm cành phát triển yếu dễ bị gẫy đổ (Heller, 1996). Hạt trƣớc khi đem gieo đƣợc lựa chọn là những hạt to, chắc, mẩy. Hạt đƣợc ngâm nƣớc qua đêm để làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Hôm sau, hạt đƣợc gieo vào trong các bầu đất. Hạt sẽ nẩy mầm sau khoảng 1 tuần và cây con có thể đem đi trồng sau 45 ngày. Rễ của cây con mọc từ hạt phát triển, thƣờng có 1 rễ cái và 4 rễ bên. Cây trồng ngoài thực địa sẽ sinh sản sau khoảng 3 – 4 năm (Heller, 1996). Nhƣợc điểm của phƣơng pháp nhân giống bằng hạt là chất lƣợng cây con không đồng nhất bởi cây dâu mè là cây thụ phấn chéo nên giữa các hạt có sự khác nhau về 23 mặt di truyền. Nhƣ xét tính trạng hàm lƣợng dầu trong hạt, các cây tạo ra bằng gieo hạt có hàm lƣợng dầu trong hạt không ổn định, giao động từ 4 đến 40 % (Timir baran Jha và ctv, 2007). Trong khi kiểm tra chất lƣợng hạt giống là một việc khó khăn thì tỉ lệ sống và nẩy mầm của hạt thấp do đó nhân giống bằng phƣơng pháp gieo hạt không thể đáp ứng đủ nhu cầy cây giống chất lƣợng tốt cho việc trồng cây trên qui mô công nghiệp. 2.2.4.2. Phƣơng pháp nhân giống hiện đại Các phƣơng pháp nhân giống hiện đại có ƣu điểm lớn là có khả năng tạo giống cây với số lƣợng lớn trong khoảng thời gian ngắn với chất lƣợng cao và đồng nhất. Tuy nhiên những nghiên cứu này còn ít hoặc ít đƣợc công bố. Năm 1995, M. Sujatha và N. Mukta đã phát triển kĩ thuật tái sinh cây dầu mè từ nhiều bộ phận khác nhau của cây nhƣ phần trụ dƣới lá mầm, cuống lá và lá. Sự tạo thành chồi non bất định đƣợc chứng minh là hiệu quả nhất ở môi trƣờng MS bổ sung 2,22 M BA và 4,9 M IBA. Sau đó mô sẹo đƣợc tái sinh gián tiếp trên môi trƣờng MS bổ sung 0,44 M BA và 0,49 M IBA. Chồi non hình thành đƣợc nuôi và tạo rễ trong môi trƣờng MS không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng cho đến khi phát triển thành cây hoàn chỉnh để đƣa ra vƣờn ƣơm. Năm 2005, M. Sujatha và các cộng sự đã thành công trong nhân giống in vitro cây dầu mè bằng phƣơng pháp tạo cụm chồi. Nghiên cứu đã tạo chồi non bằng cách nuôi nách lá cây dầu mè trên môi trƣờng MS bổ sung TDZ nồng đô 2,3 – 4,5 % sau đó chuyển sang môi trƣờng MS bổ sung IBA và BA. Hiệu quả tạo chồi cao 10 – 12,3 chồi/mẫu cấy. Việc tạo chồi bất định từ lá thu đƣợc bằng cách nuôi mẫu lá trên môi trƣờng bổ sung 8,9 – 44,4 M BA + 4,9 M indole-3-butyric acid (IBA) để tạo thành mô sẹo có màu trắng xanh, các chồi bất định sẽ đƣợc tạo thành sau khoảng 3 tuần sau đó chuyển sang môi trƣờng bổ sung 8,9 M BA + 2,5 M IBA. Phƣơng pháp phát sinh phôi từ tế bào soma (somatic embryogenesis) - một công cụ mạnh của nghành công nghệ sinh học để tạo giống cây trồng – đã đƣợc áp dụng thành công lần đầu tiên trên cây dầu mè bởi Timir baran Jha và các cộng sự 24 (Timir baran Jha và ctv, 2007). Sụ phát sinh phôi soma đƣợc tạo ra bằng nuôi mẫu lá trên môi trƣờng MS có các chất kích thích sinh trƣởng thực vật Kinetin và IBA, phôi đƣợc khích thích phát triển bằng cách bổ sung thêm adenine sulphate trong môi trƣờng. Các phôi soma chín sẽ tạo các cây non trên môi trƣờng ½ MS. Toàn bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 – 16 tuần. Đây là nghiên cứu tiền đề cho những nghiên cứu về chuyển gen trên cây dầu mè về sau. 25 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2007 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Công nghệ tế bào Thực Vật, Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại TP.HCM. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Đối tƣợng thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên cây dầu mè (Jatropha curcas L.) đƣợc trồng tại vƣờn giống Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, nhiệt kế, ẩm kế, kệ đặt bình, đèn neon,… Dụng cụ: pince, kéo, dao cấy, bình thuỷ tinh 500ml, đĩa, đèn cồn. 3.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy Các môi trƣờng đƣợc sử dụng gồm: Môi trƣờng MS, ½ MS, WPM, ½ WPM. Trong đó môi trƣờng ½ MS và ½ WPM là môi trƣờng MS và WPM mà thành phần đa lƣợng đƣợc giảm đi một nửa. - Môi trƣờng MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962) Thành phần Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 26 Khoáng vi lƣợng MnSO4.4H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Sắt EDTA Na2.EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Vitamin myo-Inositol 100 Thiamin (B1) 0,1 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glycine 2 - Môi trƣờng WPM ( Llooyd và McCown, 1981) Thành phần Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng NH4NO3 400 CaNO3 556 K2SO4 990 CaCl2 96 KH2PO4 170 MgSO4 370 Sắt EDTA FeNa2EDTA 65,1 Khoáng vi lƣợng MnSO4.4H2O 23,3 27 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Vitamin myo-Inositol 100 B1 1 B6 0,5 Nicotinic acid 0,5 Glycine 2 Các chất điều hoà sinh trƣởng thực vật đƣợc sử dụng là BA, IBA (mg/l). Các thành phần khác: Đƣờng sucrose 30 g/l Agar 7,5 /l Môi trƣờng đƣợc điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,05 (bằng KOH 1N và HCl 1N) trƣớc khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm (1210C) trong 20 phút. 3.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro Thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày Nhiệt độ 25 2oC Độ ẩm 50 – 60 % Cƣờng độ ánh sáng 2000-3000 lux 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp khử trùng mẫu - Ngoài tủ cấy: Chồi đƣợc cắt dài khoảng 3 cm từ đỉnh chồi. Hạt đƣợc lấy từ những quả chín. Hạt phải có màu đen, chắc, mẩy. 28 Chồi đƣợc cắt bỏ lá non, rửa sạch nhiều lần dƣới vòi nƣớc máy, sau đó rửa trong dung dịch nƣớc xà phòng 0,1 % trong 15 phút và đƣợc rửa lại bằng nƣớc máy bình thƣờng. Hạt đƣợc rủa sạch bằng nƣớc, dùng dao cạo bỏ lớp vở lụa mềm màu đen bên ngoài hạt, sau đó đƣợc rửa bằng xà phòng 0,1% trong 30 phút và đƣợc rủa lại bằng nƣớc máy nhiều lần. - Trong tủ cấy vô trùng: Rửa chồi và hạt bằng nƣớc cất vô trùng Lắc cồn 700 trong 30 giây Rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng Ngâm trong Natri hypochlorit (NaOCl) - nồng độ và thời gian theo thí nghiệm. Rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng. 3.3.2. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm đều đƣợc bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần và ở mỗi lần lập lại cấy 3 bình, trong mỗi bình cấy 3 mẫu. Mỗi bình chứa 50 ml môi trƣờng. 3.3.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ sống của mẫu cây dầu mè Mẫu cấy sau khi đƣợc khử trùng trong tủ cấy sẽ đƣợc cắt theo từng đốt đều nhau dài khoảng 0,5 – 1 cm, loại bỏ những phần bị ngấm chất khử trùng rồi cấy vào các bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng. Hạt đƣợc tách bỏ lớp vỏ cứng bằng kềm, pince và dao sau đó đƣợc cấy vào bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng. Thời gian thực hiện: 7 – 10 ngày Môi trƣờng thí nghiệm: MS Hóa chất đƣợc sử dụng là Natri hypochlorit (10 – 30 %) Vật liệu thí nghiêm: thí nghiệm đƣợc thực hiện với 2 đối tƣợng là chồi và hạt cây dầu mè. 29 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian xử lý vô trùng mẫu Nghiệm thức Nồng độ Natri hypochlorit (%) Thời gian (phút) 1 10 15 2 10 30 3 10 45 4 10 60 5 15 15 6 15 30 7 15 45 8 15 60 9 20 15 10 20 30 11 20 45 12 20 60 Chỉ tiêu theo dõi : 3.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro Do cây dầu mè là một cây còn khá mới mẻ ở Việt Nam, các đề tài nghiên cứu về nuôi cấy in vitro cây dầu mè chƣa nhiều. Việc tìm kiếm các tài liệu về nuôi cấy mô cây này là khá khó khăn và có rất ít. Do đó, chúng tôi muốn thực hiện một thí nghiệm cơ bản: khảo sát môi trƣờng khoáng thích hợp để có thể duy trì sự phát triển của mẫu cấy trong điều kiện in vitro. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 4 loại môi trƣờng: MS, ½ MS, WPM và ½ WPM. Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) = Số mẫu sống không bị nhiễm khuẩn, nấm X 100 Tổng số mẫu cấy 30 Đối tƣợng nghiên cứu: chồi non in vitro mọc lên từ hạt đã đƣợc khử trùng và nuôi cấy trong môi trƣờng MS trong thí nghiệm 1 sau sau khoảng thời gian 7 – 10 ngày. Sau khi hạt nẩy chồi, cắt mẫu dài khoảng 1 cm từ ngọn và cấy vào các môi trƣờng thí nghiệm. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức mỗi nghiệm thức cấy 10 mẫu. Bảng 3.2: Thí nghiệm xác định môi trƣờng khoáng cơ bản Nghiệm thức Môi trƣờng 1 MS 2 ½ MS 3 WPM 4 ½ WPM Chỉ tiêu theo dõi: o Tỉ lệ sống (%) o Tỉ lệ nảy chồi (%) o Phù gốc (+/-) 3.3.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè. Sau khi xác định môi trƣờng khoáng cơ bản trong thí nghiệm 2, chúng tôi bổ sung BA nồng độ thay đổi từ 0 – 0,5 mg/l. Thí nghiệm gồm có 4 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố, mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 3 bình tam giác có chứa 50 ml môi trƣờng nuôi cấy. Mỗi bình cấy 3 mẫu. Thời gian lấy số liệu 1 tháng. Mục tiêu của thí nghiệm này là xác định nồng độ BA nào thích hợp cho nuôi cấy tạo chồi cây dầu mè in vitro. Dựa vào tài liệu tham khảo và quá trình thí nghiệm thăm dò nồng độ BA đƣợc chia theo các mức sau: 31 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tạo cụm chồi in vitro cây dầu mè Nghiệm thức Môi trƣờng BA (mg/l) 1 Khoáng cơ bản TN2 0 2 Khoáng cơ bản TN2 0,1 3 Khoáng cơ bản TN2 0,3 4 Khoáng cơ bản TN2 0,5 Đối tƣợng nghiên cứu: chồi non in vitro mọc lên từ mẫu cấy chồi hoặc hạt đã đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS trong thí nghiệm 1 sau 7 – 10 ngày. Chỉ tiêu theo dõi: o Số chồi phát sinh/1 mẫu cấy o Chiều cao chồi (mm) o Số lá/1 mẫu cấy 3.3.2.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè trong điều kiện in vitro Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự tác động đồng thời của BA và IBA đến khả năng phát sinh chồi của cây dầu mè. Trong thí nghiệm IBA đƣợc bổ sung ở 1 mức thấp 0,01 mg/l, BA đƣợc bổ sung ở các mức khác nhau 0 mg/l; 0,1 mg/l; 0,3 mg/l; 0,5 mg/l. Thí nghiệm này có 6 nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Mỗi nghiệm thức lặp lại ba lần và mỗi nghiệm thức cấy vào ba bình tam giác. Trong mỗi bình tam giác cấy ba mẫu. Thời gian lấy số liệu 6 tuần. 32 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) 1 0 0 2 0,1 0,01 3 0,3 0,01 4 0,5 0,01 Chỉ tiêu theo dõi: 1. Số chồi/1 mẫu 2. Chiều cao chồi (mm) 3. Số lá/1 mẫu 4. Sự tạo mô sẹo (+/-) 3.3.2.5. Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ của cây dầu mè in vitro nhằm chuẩn bị cây con khoẻ mạnh để đƣa ra vƣờn ƣơm. Đối tƣợng nghiên cứu: Các chồi phát sinh sau khi thực hiện các thí nghiệm 3 và 4 có kích thƣớc 2 – 3 cm. Thí nghiệm này có 4 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, cấy trong các bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng khoáng cơ bản bổ sung IBA ở những nồng độ khác nhau. Thời gian lấy số liệu 6 tuần. Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của IBA đến tạo rễ cây dầu mè Nghiệm thức Nồng độ IBA (mg/l) 1 0 2 0,1 3 0.3 4 0,5 Các chỉ tiêu theo dõi: o Số rễ/1 mẫu o Chiều dài rễ (mm) 33 3.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình thống kê Statgraphic 7.0. Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng so sánh khác biệt giữa các nghiệm thức (Bằng phƣơng pháp LSD). 34 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây thực sinh Môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật có chứa đƣờng, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trƣờng nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trƣờng nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn. Thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công. Đây là bƣớc quan trọng trong nuôi cấy mô cây dầu mè. Mục tiêu đạt đƣợc của thí nghiệm này là xác định nồng độ của hóa chất diệt khuẩn (Natri hypochlorit) và thời gian vô trùng mẫu mô ban đầu để tạo ra nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm sau. 35 4.1.1. Vô trùng mẫu hạt Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu hạt vô trùng Nghiệm thức Nồng độ NaOCl (%) Thời gian (phút) Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) 1 10 15 5,00 a 2 10 30 18,33 b 3 10 45 16,67 b 4 10 60 20,83 bc 5 15 15 10,00 a 6 15 30 10,83 a 7 15 45 20,83 bc 8 15 60 26,79 d 9 20 15 10,00 a 10 20 30 19,55 bc 11 20 45 20,37 bc 12 20 60 25,00 cd CV (%) 18,6 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Theo kết quả trong bảng 4.2 cho thấy ở cả 3 nồng độ Natri hypochlorit 10 %, 15 % và 20 % tỉ lệ mẫu hạt vô trùng tăng tỉ lệ thuận với thời gian khử mẫu. Càng kéo dài thời gian khử mẫu tỉ lệ mẫu vô trùng càng cao do hạt cây có lớp vỏ cứng nên khi ngâm khử trùng chất khử không ngấm vào trong hạt gây chết mẫu. 3 nghiệm thức có tỉ lệ mẫu hạt vô sống cao nhất là nghiệm thứ 4, 8 và 12 trong đó nghiệm thức 8 đạt tỉ lệ cao nhất 26,79 %. Do đó kết luận điều kiện khử mẫu hạt tốt nhất là sử dụng Natri hypochlorit nồng độ 15 % và thời gian khử mẫu là 60 phút. 36 4.1.2. Vô trùng mẫu chồi Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu chồi vô trùng Nghiệm thức Nồng độ NaOCl (%) Thời gian (phút) Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) 1 10 15 0,00 a 2 10 30 1,28 ab 3 10 45 6,30 c 4 10 60 4,90 bc 5 15 15 1,33 ab 6 15 30 2,08 abc 7 15 45 4,91 bc 8 15 60 4,52 abc 9 20 15 1,52 abc 10 20 30 4,23 abc 11 20 45 3,13 abc 12 20 60 3,77 abc CV (%) 15,12 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Xét ở nồng độ 10 % tỉ lệ mẫu sống tăng tỉ lệ thuận với thời gian khử mẫu. Khi tăng thời gian khử mẫu từ 15 phút lên 60 phút tỉ lệ sống tăng từ 0 % (nghiệm thức 1) tăng lên 4,9 % (nghiệm thức 4) và nghiệm thức đạt cao nhất là nghiệm thức 3 với thời gian khử mẫu 45 phút và tỉ lệ mẫu sống 6,3 %. Nồng độ Natri hypochlorit 15%, tỉ lệ mẫu sống cũng tăng tỉ lệ thuận với thời gian khử mẫu. Tỉ lệ mẫu sống tăng từ 1,33 % (nghiệm thứ 5) tăng lên 4,52 % (nghiệm thứ 8). Tuy nhiên tỉ lệ mẫu sống cao nhất là nghiệm thức 7 chỉ đạt 4,91 % 37 thấp hơn so với nghiệm thứ 3. So với nống độ Natri hypochlorit 10% tỉ lệ nhiễm nấm, khuẩn có giảm nhƣng tỉ lệ mẫu chết do ngộ độc chất khử trùng tăng. Ở nồng độ Natri hypochlorit 20% việc kéo dài thời gian khử trùng mẫu cũng làm tăng tỉ lệ mẫu sống. Tuy nhiên, tỉ lệ mẫu sống ở nồng độ 20 % thấp hơn so với các nghiệm thức ở các nồng độ 10 % và 15 %. Nồng độ Natri hypochlorit cao tác dụng khử trùng nấm và khuẩn rõ ràng cao hơn, nhƣng tác dụng gây độc với mẫu khử cũng cao. Do đó tuy tỉ lệ nhiễm giảm nhƣng tỉ lệ mẫu chết do ngộ độc cao đặc biệt ở các nghiệm thức 11 và 12. Từ đó chúng tôi kết luận, cách thức khử mẫu thích hợp cho chồi cây dầu mè là ngâm mẫu trong Natri hypochlorit 10% với thời gian 45 phút. So với các cây khác, thời gian khử của cây dầu mè lâu hơn do chồi non của cây dầu mè có kích thƣớc lớn, mọng nƣớc nên chịu đƣợc tác động của chất khử trùng tốt hơn. 38 Hình 4.2: Chồi cây dầu mè nẩy từ các hạt vô trùng Hình 4.1: Mẫu thực sinh cây dầu mè đƣợc vô trùng phát sinh chồi 39 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản cho cây dầu mè in vitro Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự phát sinh chồi của cây dầu mè trên các môi trƣờng khoáng cơ bản. Tuy nhiên, tài liệu công bố về nuôi cấy mô cây dầu mè không nhiều, ít công bố. Do đó thí nghiệm đƣợc thực hiện mang tính chất thăm dò. Do dầu mè là cây thân gỗ nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 4 loại môi trƣờng là MS, WPM, ½ MS và ½ WPM. Các môi trƣờng không bổ sung chất kích thích sinh trƣởng thực vật Bảng 4.3: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản cho cây dầu mè Nghiệm thức Môi trƣờng Tỉ lệ sống (%) Tỉ lệ nảy chồi (%) Phù gốc 1 MS 100 100 - 2 ½ MS 75 50 - 3 WPM 100 100 + 4 ½ WPM 50 67 + Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Mẫu khi cấy vào môi trƣờng MS và WPM sau khoảng 1 tuần đều nẩy chồi (100 %), trên các môi trƣờng ½ MS và ½ WPM thì chậm hơn 5 – 6 ngày và tỉ lệ nảy chồi cũng thấp hơn: ½ MS là 50% ; ½ WPM là 67%. Trong khoảng thời gian từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 4, trên môi trƣờng ½ MS và ½ WPM các chồi có biểu hiện bị úng ngọn. Ngọn dần chuyển sang màu vàng, lan đỉnh xuống gốc và mẫu chết. Hiện tƣợng này chỉ xuất hiện trên các môi trƣờng có khoáng đa lƣợng giảm một nửa chứng tỏ đòi hỏi về khoáng của cây cao và các môi trƣờng này không đáp ứng đƣợc. Khi xem xét gốc của mẫu cấy nhận thấy môi trƣờng WPM và ½ WPM gốc của mẫu cấy phù to. Trong khi đó trên môi trƣờng MS và ½ MS gốc mẫu hoàn toàn bình thƣờng không bị phù. 40 Từ những kết quả đạt đƣợc kết luận môi trƣờng khoáng thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè là môi trƣờng MS. 1 2 3 4 Hình 4.3: Sự phát triển của cây dầu mè trên các môi trƣờng khoáng cơ bản 1: Môi trƣờng MS 2: Môi trƣờng WPM 3: Môi trƣờng ½ MS 4: Môi trƣờng ½ WPM 41 4.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè Sử dụng kết quả của thí nghiệm 2, chúng tôi tiến hành nuôi cấy cây dầu mè trên môi trƣờng MS bổ sung BA nồng độ 0 – 0,5 mg/l. Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè Nghiệm thức Môi trƣờng BA (mg/l) Số chồi Chiều cao chồi (mm) 1 MS 0,1 1,00 a 1,86 b 2 MS 0,3 2,17 b 3,46 c 3 MS 0,5 2,38 c 3,54 c 4 MS 0 0,87 a 1,33 a CV (%) 12,5 4,8 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Kết quả thí nghiệm cho thấy số chồi sinh ra trên một mẫu cấy tăng tỉ lệ thuận với nồng độ BA trong môi trƣờng nuôi cấy. Ở nghiệm thức 1 (BA 0,1 mg/l) số chồi phát sinh là 1.0 chồi/ mẫu, sang nghiệm thức 2 số chồi tăng lên 2,17 chồi/mẫu và đạt cao nhất ở nghiệm thức thứ 3 2,38 chồi/mẫu. Chiều cao chồi sinh ra cũng tăng tỉ lệ thuận với việc tăng nồng độ BA trong môi trƣờng. Khi bổ sung BA ở mức 0,1 mg/l (NT1) thì chiều cao chồi là 1,86 mm so với nghiệm thức đối chứng (NT4) là 1,33 mm cho thấy mức BA 0,1 mg/l có tác động chƣa lớn đến chiều cao chồi.. Khi tăng nồng độ lên ở NT2 và NT3 chiều cao chồi có sự cải thiện rõ rệt - đạt cao nhất 3,54 mm ở NT3. Điều đó chứng tỏ từ nồng độ 0,3 – 0,5 mg/l, BA có sự tác động đáng kể đến chiều cao chồi tạo thành. Theo các thí nghiệm thăm dò trƣớc và theo một số tài liệu thì không nên tăng nồng độ BA cao hơn 0,5 mg/l vì cây rất nhạy, nồng độ BA cao mẫu cấy tạo khá nhiều mô sẹo. Hiện tƣợng này không tốt đối với, dễ làm cho mẫu chết và gây xáo trộn di truyền cây. 42 Nhƣ vậy, chúng tôi kết luận rằng nồng độ BA thích hợp để khích thích sự tạo chồi của cây dầu mè là 0,5 mg/l. Hình 4.4: Ảnh hƣởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè 1: BA 0,1 mg/l 2: BA 0,3 mg/l 3: BA 0,5 mg/l 1 2 3 43 4.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè Trong môi trƣờng khoáng cơ bản là MS chúng tôi bổ sung BA và IBA để xác định sự tác động của 2 chất khích thích sinh trƣởng này đến sự tạo thành chồi của cây dầu mè. Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè Nghiệm thức Môi trƣờng BA (mg/l) IBA (mg/l) Số chồi Chiều cao chồi (mm) Số lá Mô sẹo 1 MS 0,1 0,01 2,13 c 4.67 c 4,41 d + 2 MS 0,3 0,01 2,28 d 3.32 b 3.81 c ++ 3 MS 0,5 0,01 1,89 b 3.42 b 3.00 b +++ 4 MS 0 0 0,87 a 1.30 a 1.00 a - CV (%) 8,85 6,21 13,00 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Kết quả thí nghiệm cho thấy khi bổ sung đồng thời 2 loại kích thích sinh trƣởng thực vật (BA và IBA) số chồi trên 1 mẫu cấy gần nhƣ không tăng so với thí nghiệm chỉ bổ sung 1 chất khích thích sinh trƣởng BA (thí nghiệm 3). Nhƣng chiều cao chồi đƣợc cải thiện đáng kể. Điều này là phù hợp vì khi có sự hiện diện của auxin, cytokinin kích thích mạnh hơn sự phân chia tế bào (Dƣơng Công Kiên, 2002). Khi có sự hiện diện của IBA ở mức thấp 0,01 mg/l, việc tăng nồng độ BA từ 0,1 mg/l đến 0,5 mg/l không làm tăng số chồi, chiều cao chồi cũng nhƣ số lá trên 1 mẫu cấy. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở nghiệm thức thứ nhất - chỉ bổ sung BA ở nồng độ 0,1 mg/l và IBA 0,01 mg/l thì kết quả tạo chồi cầy dầu mè tỏ ra vƣợt trội hơn các nghiệm thúc khác về cả 3 chỉ tiêu: số chồi 2,13 chồi/mẫu cầy; chiều cao chồi cao nhất 4,67 mm, số lá 4,41 lá/mẫu cấy. Thí nghiệm cũng cho thấy khi tăng nồng độ BA mô sẹo tạo ra trên các mẫu càng nhiều. 44 Từ đó chúng tôi kết luận: môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy cây dầu mè invitro là môi trƣờng MS bổ sung BA (0,1 mg/l) và IBA (0,01 mg/l). Hình 4.5: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sụ tạo chồi của cây dầu mè 1: Môi trƣờng MS + IBA (0,01) + BA (0,1) 2: Môi trƣờng MS + IBA (0,01) + BA (0,3) 3: Môi trƣờng MS + IBA (0,01) + BA (0,5) 1 2 3 45 4.5. Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro Mục tiêu là xác định môi trƣờng thích hợp cho sự tạo rễ của cây dầu mè. Trong nuôi cấy mô, việc bổ sung các auxin vào môi trƣờng nuôi cấy cho hiệu quả kích thích cây khỏe mạnh, tạo nhiều rễ, phát triển tốt (Banerjee và Delanghe, 1985). Bảng 4.6: Tác động của IBA đến việc tạo rễ cây dầu mè in vitro Nghiệm thức Môi trƣờng IBA (mg/l) Số rễ Chiều dài rễ (mm) 1 MS 0,1 2,88 b 14,46 c 2 MS 0,3 5,50 c 15,07 c 3 MS 0,5 6,38 d 11,63 b 4 MS 0 0,00 a 0,00 a CV (%) 10,68 21,00 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Tác động của IBA đến việc tạo rễ của cây dầu mè in vitro là khá nhanh và mạnh. Các nghiệm thức 2 và 3 sau khi cấy mẫu khoảng 1 tuần cây bắt đầu mọc rễ , trong nghiệm thức 1 rễ mọc chậm hơn khoảng 2 – 3 ngày. Rễ cây mọc trên các môi trƣờng có màu trắng sau khoảng 2 tuần có màu nâu sậm. Từ kết quả thí nghiệm trên bảng 4.5 cho thấy nghiệm thức 3 là nghiệm thức cho kết quả tốt nhất. Số rễ tạo ra trên mỗi mẫu cấy là nhiều nhất và chiều dài rễ so với 2 nghiệm thức còn lại có sự khác biệt không nhiều. Nhƣ vậy, môi trƣờng thích hợp để tạo rễ cây dầu mè là MS + IBA (0,5 mg/l). 46 Hình 4.6: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro 1: Môi trƣờng MS + IBA 0,1 (mg/l) 2: Môi trƣờng MS + IBA 0,3 (mg/l) 3: Môi trƣờng MS + IBA 0,5 (mg/l) Hình 4.7: cây dầu mè in vitro 3 2 1 47 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi có một số kết luận sau:  Mẫu cây dầu mè thực sinh đƣợc vô trùng tốt nhất trong điều kiện Natri hypochlorit 10% trong khoảng thời gian 45 phút.  Môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro là môi trƣờng MS.  Môi trƣờng thích hợp để nhân chồi cây dầu mè là môi trƣờng MS bổ sung BA (0,1 mg/l) và IBA (0,01 mg/l).  Môi trƣờng thích hợp cho sự ra rễ là môi trƣờng MS bổ sung IBA nồng độ 0,3 mg/l. 5.2. Đề nghị  Cần nghiên cứu thêm môi trƣờng để nuôi cấy cây dầu mè từ sau khi ra rễ cho đến khi cây đủ lớn để đƣa ra vƣờn ƣơm, theo dõi sinh trƣởng cây trong giai đoạn vƣờn ƣơm đến khi đạt tiêu chuẩn đem trồng.  Xây dụng hoàn chỉnh qui trình nhân giống in vitro và trên vƣờn ƣơm cây dầu mè. 48 Chƣơng 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Bá Bổng, 1995. Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô. Sở khoa học công nghệ môi trƣờng An Giang. 2. Trần Thị Dung, 2003, Bài giảng nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. 3. Dƣơng Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. Nhà xuất bản Đại Học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh 5. Trần Văn Minh, 2004. Công nghệ sinh học – Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh. Trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 933 trang. 6. Khƣu Hoàng Minh, 2006. Nuôi cấy mô cây Trai Nam Bộ (Fagraea cochinchinensis A.Chev.). Luận văn kĩ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 7. Nguyễn Văn Uyển, 1996. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, tập 1, 2. 8. Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương. Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 333 trang 9. NIIR Board of Consultants and Engineers. 2006. The Complete Book on Jatropha (Bio-Diesel) with Ashwagandha, Stevia, Brahmi & Jatamansi Herbs (Cultivation, Processing & Uses) – Asia Pacific Business Press Inc. 10. Heller, J. (1996). Physic nut. Jatropha curcas L. Promoting the conservation and use of underutilized and neglected crops. 1. Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, Gatersleben, International Plant Genetic Resources Institute, Rome. 11. M. Sujatha & N. Mukta, 1995. Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Jatropha curca. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 44: 135 – 141, 1996 12. M. Sujatha, H.P.S. Makkar and K. Becker, 2005. Shoot bud proliferation from axillary nodes and leaf sections of non-toxic Jatropha curcas L. Plant Growth Regulation (2005) 47: 83 – 90. 49 13. Nannapat Thepsamran, Chockpisit Thepsithar and Aree Thongpukdee. In vitro multiple shoot induction of physic nut (Jatropha curcas). Nakhon Pathom 73000, Thailand. 14. Timir baran Jha, Priyanka Mukherjee and Mukul Manjari Datta, 2007. Somatic embryogenesis in Jatropha curcas Linn., an important biofuel plant. Springer Japan 1:135 -140, 2007. INTERNET 1. 2. s.2006-10-25.0403019214/view?searchterm=curcas 3. 4. PHỤ LỤC Thí nghiệm 1 - 1: Vô trùng mẫu hạt cây dầu mè One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN12._GT Level codes: TN12.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .1145915 11 .0104174 9.771 .0000 Within groups .0202576 19 .0010662 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .1348491 30 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN12._GT by TN12.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 2 .0500000 .0118000 .0230889 .0158204 .0841796 2 3 .1833333 .0057877 .0188520 .1554258 .2112409 3 3 .1666667 .0075922 .0188520 .1387591 .1945742 4 3 .2083333 .0389930 .0188520 .1804258 .2362409 5 2 .1000000 .0234500 .0230889 .0658204 .1341796 6 3 .1083333 .0136290 .0188520 .0804258 .1362409 7 3 .2083333 .0101583 .0188520 .1804258 .2362409 8 3 .2678571 .0255744 .0188520 .2399496 .2957647 9 2 .1000000 .0235640 .0230889 .0658204 .1341796 10 2 .1954545 .0098225 .0230889 .1612749 .2296342 11 3 .2037037 .0189627 .0188520 .1757962 .2316113 12 2 .2500000 .0067400 .0230889 .2158204 .2841796 -------------------------------------------------------------------------------- Total 31 .1751804 .0058646 .0058646 .1664987 .1838620  Multiple range analysis for TN12._GT by TN12.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 2 .0500000 X 5 2 .1000000 X 9 2 .1000000 X 6 3 .1083333 X 3 3 .1666667 X 2 3 .1833333 X 10 2 .1954545 XX 11 3 .2037037 XX 4 3 .2083333 XX 7 3 .2083333 XX 12 2 .2500000 XX 8 3 .2678571 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.13333 0.06240 * 1 - 3 -0.11667 0.06240 * 1 - 4 -0.15833 0.06240 * 1 - 5 -0.05000 0.06836 1 - 6 -0.05833 0.06240 1 - 7 -0.15833 0.06240 * 1 - 8 -0.21786 0.06240 * 1 - 9 -0.05000 0.06836 1 - 10 -0.14545 0.06836 * 1 - 11 -0.15370 0.06240 * 1 - 12 -0.20000 0.06836 * 2 - 3 0.01667 0.05582 2 - 4 -0.02500 0.05582 2 - 5 0.08333 0.06240 * 2 - 6 0.07500 0.05582 * 2 - 7 -0.02500 0.05582 2 - 8 -0.08452 0.05582 * 2 - 9 0.08333 0.06240 * 2 - 10 -0.01212 0.06240 2 - 11 -0.02037 0.05582 2 - 12 -0.06667 0.06240 * 3 - 4 -0.04167 0.05582 3 - 5 0.06667 0.06240 * 3 - 6 0.05833 0.05582 * 3 - 7 -0.04167 0.05582 3 - 8 -0.10119 0.05582 * 3 - 9 0.06667 0.06240 * 3 - 10 -0.02879 0.06240 3 - 11 -0.03704 0.05582 3 - 12 -0.08333 0.06240 * 4 - 5 0.10833 0.06240 * 4 - 6 0.10000 0.05582 * 4 - 7 0.00000 0.05582 4 - 8 -0.05952 0.05582 * 4 - 9 0.10833 0.06240 * 4 - 10 0.01288 0.06240 4 - 11 0.00463 0.05582 4 - 12 -0.04167 0.06240 * denotes a statistically significant difference. Thí nghiệm 1 – 2: Vô trùng mẫu chồi cây dầu mè One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN11._GT Level codes: TN11.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .0119997 11 .0010909 4.751 .0007 Within groups .0055110 24 .0000229 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0175108 35 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN11._GT by TN11.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 .0000000 .0000000 .0087488 -.0127711 .0127711 2 3 .0128205 .0015005 .0087488 .0000495 .0255916 3 3 .0629630 .0088441 .0087488 .0501919 .0757340 4 3 .0489766 .0193466 .0087488 .0362055 .0617477 5 3 .0133333 .0064959 .0087488 .0005623 .0261044 6 3 .0208333 .0074545 .0087488 .0080623 .0336044 7 3 .0490741 .0068402 .0087488 .0363030 .0618451 8 3 .0452279 .0064439 .0087488 .0324569 .0579990 9 3 .0151515 .0027933 .0087488 .0023805 .0279226 10 3 .0423077 .0066542 .0087488 .0295366 .0550788 11 3 .0313390 .0039580 .0087488 .0185680 .0441101 12 3 .0376984 .0144886 .0087488 .0249274 .0504695 -------------------------------------------------------------------------------- Total 36 .0316438 .0025256 .0025256 .0279571 .0353305  Multiple range analysis for TN11._GT by TN11.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 .0000000 X 2 3 .0128205 XX 5 3 .0133333 XX 9 3 .0151515 XX 6 3 .0208333 XXX 11 3 .0313390 XXX 12 3 .0376984 XXXX 10 3 .0423077 XXX 8 3 .0452279 XXX 4 3 .0489766 XX 7 3 .0490741 XX 3 3 .0629630 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.01282 0.02554 1 - 3 -0.06296 0.02554 * 1 - 4 -0.04898 0.02554 * 1 - 5 -0.01333 0.02554 1 - 6 -0.02083 0.02554 1 - 7 -0.04907 0.02554 * 1 - 8 -0.04523 0.02554 * 1 - 9 -0.01515 0.02554 1 - 10 -0.04231 0.02554 * 1 - 11 -0.03134 0.02554 * 1 - 12 -0.03770 0.02554 * 2 - 3 -0.05014 0.02554 * 2 - 4 -0.03616 0.02554 * 2 - 5 -0.00051 0.02554 2 - 6 -0.00801 0.02554 2 - 7 -0.03625 0.02554 * 2 - 8 -0.03241 0.02554 * 2 - 9 -0.00233 0.02554 2 - 10 -0.02949 0.02554 * 2 - 11 -0.01852 0.02554 2 - 12 -0.02488 0.02554 3 - 4 0.01399 0.02554 3 - 5 0.04963 0.02554 * 3 - 6 0.04213 0.02554 * 3 - 7 0.01389 0.02554 3 - 8 0.01774 0.02554 3 - 9 0.04781 0.02554 * 3 - 10 0.02066 0.02554 3 - 11 0.03162 0.02554 * 3 - 12 0.02526 0.02554 4 - 5 0.03564 0.02554 * 4 - 6 0.02814 0.02554 * 4 - 7 -0.00010 0.02554 4 - 8 0.00375 0.02554 4 - 9 0.03383 0.02554 * 4 - 10 0.00667 0.02554 4 - 11 0.01764 0.02554 4 - 12 0.01128 0.02554 5 - 6 -0.00750 0.02554 5 - 7 -0.03574 0.02554 * 5 - 8 -0.03189 0.02554 * 5 - 9 -0.00182 0.02554 5 - 10 -0.02897 0.02554 * 5 - 11 -0.01801 0.02554 5 - 12 -0.02437 0.02554 6 - 7 -0.02824 0.02554 * 6 - 8 -0.02439 0.02554 6 - 9 0.00568 0.02554 6 - 10 -0.02147 0.02554 6 - 11 -0.01051 0.02554 6 - 12 -0.01687 0.02554 7 - 8 0.00385 0.02554 7 - 9 0.03392 0.02554 * 7 - 10 0.00677 0.02554 7 - 11 0.01774 0.02554 7 - 12 0.01138 0.02554 8 - 9 0.03008 0.02554 * 8 - 10 0.00292 0.02554 8 - 11 0.01389 0.02554 8 - 12 0.00753 0.02554 9 - 10 -0.02716 0.02554 * 9 - 11 -0.01619 0.02554 9 - 12 -0.02255 0.02554 10 - 11 0.01097 0.02554 10 - 12 0.00461 0.02554 11 - 12 -0.00636 0.02554 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA đến tạo chồi cây dầu mè 1 – Số chồi One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN3CHOI._GT Level codes: TN3CHOI.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 16.028922 3 5.3429739 158.549 .0000 Within groups 1.010975 30 .0336992 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 17.039897 33 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN3CHOI._GT by TN3CHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.0000000 .0671296 .0820965 .8814163 1.1185837 2 6 2.1666667 .1666667 .0749435 2.0584150 2.2749183 3 8 2.3750000 .0301137 .0649030 2.2812513 2.4687487 4 15 .8666667 .0132254 .0473984 .7982023 .9351310 -------------------------------------------------------------------------------- Total 34 1.4705882 .0314826 .0314826 1.4251135 1.5160630  Multiple range analysis for TN3CHOI._GT by TN3CHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 15 .8666667 X 1 5 1.0000000 X 2 6 2.1666667 X 3 8 2.3750000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -1.16667 0.22707 * 1 - 3 -1.37500 0.21378 * 1 - 4 0.13333 0.19365 2 - 3 -0.20833 0.20252 * 2 - 4 1.30000 0.18114 * 3 - 4 1.50833 0.16417 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 2 – Chiều cao chồi One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN3CAO1._GT Level codes: TN3CAO1.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 47.418907 3 15.806302 1008.869 .0000 Within groups .673696 43 .015667 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 48.092603 46 1 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN3CAO1._GT by TN3CAO1.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 7 1.8571429 .0474769 .0473095 1.7896631 1.9246226 2 13 3.4615385 .0362717 .0347157 3.4120219 3.5110550 3 13 3.5384615 .0322259 .0347157 3.4889450 3.5879781 4 14 1.3333333 .0341119 .0334529 1.2856180 1.3810487 -------------------------------------------------------------------------------- Total 47 2.6099291 .0182578 .0182578 2.5838871 2.6359710 Multiple range analysis for TN3CAO1._GT by TN3CAO1.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 14 1.3333333 X 1 7 1.8571429 X 2 13 3.4615385 X 3 13 3.5384615 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -1.60440 0.11837 * 1 - 3 -1.68132 0.11837 * 1 - 4 0.52381 0.11688 * 2 - 3 -0.07692 0.09903 2 - 4 2.12821 0.09725 * 3 - 4 2.20513 0.09725 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của BA và IBA đến tạo chồi cây dầu mè 1 – Số chồi One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN4CHOI._GT Level codes: TN4CHOI.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 20.301868 3 6.7672894 246.960 .0000 Within groups 2.000376 73 .0274024 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 22.302245 76 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN4CHOI._GT by TN4CHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 22 2.1363636 .0310786 .0352926 2.0866160 2.1861113 2 21 2.2857143 .0488223 .0361231 2.2347959 2.3366327 3 19 1.8947368 .0332663 .0379767 1.8412056 1.9482681 4 15 .8666667 .0288300 .0427414 .8064192 .9269141 -------------------------------------------------------------------------------- Total 77 1.8701299 .0188647 .0188647 1.8435386 1.8967211  Multiple range analysis for TN4CHOI._GT by TN4CHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 15 .8666667 X 3 19 1.8947368 X 1 22 2.1363636 X 2 21 2.2857143 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.14935 0.10067 * 1 - 3 0.24163 0.10335 * 1 - 4 1.26970 0.11050 * 2 - 3 0.39098 0.10448 * 2 - 4 1.41905 0.11156 * 3 - 4 1.02807 0.11398 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  2 – Chiều cao chồi One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN4CCHOI._GT Level codes: TN4CCHOI.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 134.35998 3 44.786659 927.509 .0000 Within groups 6.47047 134 .048287 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 140.83044 137 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN4CCHOI._GT by TN4CCHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 41 4.7125000 .0198652 .0343181 4.6644942 4.7605058 2 45 3.3222222 .0334361 .0327574 3.2763997 3.3680447 3 37 3.4130022 .0473763 .0361256 3.3624681 3.4635363 4 15 1.3000000 .0543358 .0567374 1.2206331 1.3793669 -------------------------------------------------------------------------------- Total 138 3.5398086 .0187058 .0187058 3.5136421 3.5659751  Multiple range analysis for TN4CCHOI._GT by TN4CCHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 15 1.3000000 X 2 45 3.3222222 X 3 37 3.4130022 X 1 41 4.7125000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 1.39028 0.09385 * 1 - 3 1.29950 0.09857 * 1 - 4 3.41250 0.13118 * 2 - 3 -0.09078 0.09647 2 - 4 2.02222 0.12961 * 3 - 4 2.11300 0.13306 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  3 – Số lá One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN4LA._GT Level codes: TN4LA.T Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 113.23593 3 37.745310 213.449 .0000 Within groups 12.90900 73 .176836 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 126.14493 76 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN4LA._GT by TN4LA.T -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 22 4.4090909 .0403457 .0896548 4.2827153 4.5354665 2 21 3.8095238 .0722893 .0917646 3.6801742 3.9388734 3 19 3.0000000 .1637446 .0964735 2.8640129 3.1359871 4 15 1.0000000 .0614260 .1085774 .8469515 1.1530485 -------------------------------------------------------------------------------- Total 77 3.2337662 .0479225 .0479225 3.1662156 3.3013168  Multiple range analysis for TN4LA._GT by TN4LA.T -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 15 1.0000000 X 3 19 3.0000000 X 2 21 3.8095238 X 1 22 4.4090909 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 0.59957 0.25574 * 1 - 3 1.40909 0.26254 * 1 - 4 3.40909 0.28069 * 2 - 3 0.80952 0.26542 * 2 - 4 2.80952 0.28339 * 3 - 4 2.00000 0.28954 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  Thí nghiệm 5: Tạo rễ in vitro cây dầu mè 1 – Số rễ One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN5RE._GT Level codes: TN5RE.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 223.72059 3 74.573529 541.958 .0000 Within groups 4.12801 30 .137600 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 227.84860 33 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for TN5RE._GT by TN5RE.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 8 2.8750000 .1023560 .1311489 2.6855628 3.0644372 2 8 5.5000000 .2126994 .1311489 5.3105628 5.6894372 3 8 6.3750000 .1341517 .1311489 6.1855628 6.5644372 4 10 .0000000 .0000000 .1173032 -.1694378 .1694378 -------------------------------------------------------------------------------- Total 34 3.4705882 .0636166 .0636166 3.3786977 3.5624788 Multiple range analysis for TN5RE._GT by TN5RE.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 10 .0000000 X 1 8 2.8750000 X 2 8 5.5000000 X 3 8 6.3750000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -2.62500 0.37887 * 1 - 3 -3.50000 0.37887 * 1 - 4 2.87500 0.35943 * 2 - 3 -0.87500 0.37887 * 2 - 4 5.50000 0.35943 * 3 - 4 6.37500 0.35943 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 2 – Chiều dài rễ One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN5DRE._GT Level codes: TN5DRE.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1976.2044 3 658.73480 96.248 .0000 Within groups 848.6706 124 6.84412 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 2824.8750 127 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for TN5DRE._GT by TN5DRE.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 24 14.458333 .4339704 .5340146 13.710780 15.205887 2 43 15.069767 .3711575 .3989555 14.511280 15.628255 3 51 11.627451 .4409978 .3663310 11.114633 12.140269 4 10 .000000 .0000000 .8272918 -1.158105 1.158105 -------------------------------------------------------------------------------- Total 128 12.406250 .2312351 .2312351 12.082550 12.729950 Multiple range analysis for TN5DRE._GT by TN5DRE.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 10 .000000 X 3 51 11.627451 X 1 24 14.458333 X 2 43 15.069767 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.61143 1.31966 1 - 3 2.83088 1.28204 * 1 - 4 14.4583 1.94938 * 2 - 3 3.44232 1.07228 * 2 - 4 15.0698 1.81830 * 3 - 4 11.6275 1.79119 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.