Mục Lục
Chương 1 MỞ ĐẦU . 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích 2
1.3 Yêu cầu 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
2.1 Sơ lược về thịt chế biến . 3
2.1.1 Giới thiệu về thịt . 3
2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến . 4
2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến 4
2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới 4
2.1.3.2 Tình hình xuất nhập khẩu động vật và sản phẩm chế biến từ động vật ở Việt Nam 5
2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật . 6
2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phương pháp multiplex PCR . 7
2.4 Các phương pháp phân biệt các loại thịt . 8
2.4.1 Phương pháp quan sát dưới kính hiển vi quang học . 8
2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA) 8
2.4.3 Protein array 9
2.4.4 Điện di 2 chiều 9
2.4.5. Giới thiệu chung về phương pháp PCR (polymerase chain reaction) . 10
2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR . 16
2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng phương pháp multiplex PCR 16
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 18
3.1 Nội dung thực hiện 18
3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành 18
3.3 Vật liệu 19
3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA . 19
3.3.2 Đoạn mồi . 19
3.3.3 Hóa chất 19
3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA . 19
3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di . 19
3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR . 20
3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ . 20
3.4 Phương pháp tiến hành 20
3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 20
3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt 20
3.4.3 Tách chiết DNA 21
3.4.4 Thực hiện phản ứng s-PCR . 22
3.4.5 Tối ưu hóa phản ứng m-PCR 24
3.4.5.1 Thực hiện phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) 24
3.4.5.2 Thí nghiệm điều chỉnh thành phần phản ứng . 24
3.4.5.3 Thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt . 24
3.4.5.4 Thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi trong 1 phản ứng 25
3.4.6 Thực hiện phản ứng m-PCR hai loài (heo, bò và heo, cừu) ở các nồng độ DNA khác nhau 26
3.4.7 Thực hiện phản ứng m-PCR cho hỗn hợp DNA heo, bò, cừu 27
3.4.8 S-PCR đối với DNA của thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút 27
3.4.9 M-PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau 28
3.4.10 M-PCR đối cới bột thịt . 28
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
4.1 Kết quả tách chiết 29
4.2 Kết quả s-PCR đối với thịt tươi thuần loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) 31
4.3 Kết quả phản ứng m-PCR 3 loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) 32
4.4 Kết quả quá trình thiết lập và tối ưu hóa phản ứng m- PCR . 33
4.4.1 Điều chỉnh thể tích phản ứng 33
4.4.2 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ Mg2+ 33
4.4.3 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt . 34
4.4.4 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi 36
4.4.5 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình . 38
4.5 Kết quả m-PCR đối với 2 loài . 39
4.6 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của DNA bò, cừu 40
4.7 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt 40
4.8 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 43
4.9 Kết quả m-PCR đối với bột thịt . 45
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 47
5.1 Kết luận . 47
5.2 Đề nghị 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 48
PHỤ LỤC 51
70 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 2345 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phương pháp multiplex PCR, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
g Tris – HCl ở pH = 8,3.
Những hoạt chất ổn định enzym (enzym stabilizers) cũng đƣợc chú ý nhƣ:
gelatin (0,01%), Triton X – 100 (0,1% (v/v)) trong những dung dịch đệm để tồn trữ
enzym. Có trƣờng hợp ngƣời ta sử dụng cả hai làm dung dịch điệm.
Ion Mg2+
Một trong những ảnh hƣởng có tính chất quyết định đến sự chuyên biệt và
hiệu quả của phản ứng PCR là nồng độ Mg2+. Môi trƣờng có tính chất ion cao sẽ
làm cho dung dịch đệm trở nên năng động rất nhiều. Do đó nồng độ Mg2+ cao hay
thấp đều tạo ra những ảnh hƣởng rất lớn. Nồng độ Mg2+ cao sẽ làm cho phân tử
DNA mạch đôi ổn định hơn nhƣng đồng thời ngăn cản sự biến tính hoàn toàn của
sản phẩm trong mỗi chu kì và do đó làm giảm sản phẩm PCR tạo ra. Ngoài ra lƣợng
Mg
2+
dƣ còn làm tăng hiện tƣợng bắt cặp giả tạo ra những sản phẩm không mong
muốn với số lƣợng khá lớn.
Ngƣợc lại nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 M), sẽ ảnh hƣởng xấu đến quá
trình kéo dài vì Mg2+ đóng vai trò là co-factor của Taq polymerase. Một vài ion
Mg
2+
sẽ đƣợc kẹp giữ bởi dNTP trong phản ứng. Vì vậy cần phải tỷ lệ thích hợp
giữa dNTP và Mg2+ .
Nucleotid
Cần phải có cả bốn loại nucleotid dạng triphophat: dATP, dTTP, dCTP,
dGTP. Ngƣời ta khuyến cáo rằng mỗi loại deoxynucleotid đƣợc sử dụng là 200 M.
15
Phải giữ cho nồng độ của tất cả các deoxynucleotid luôn bằng nhau, để tránh sự gắn
kết nhầm lẫn.
Thời gian và số chu kỳ
Phản ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn, giai đoạn đầu số lƣơng bản sao
tăng theo cấp số nhân nhƣng sau đó hiệu quả khuếch đại giảm dần vì một số nguyên
nhân sau:
Cạn kiệt các thành phần phản ứng, nhất là sự giảm nồng độ các
nucleotid.
Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
Các bản sao vừa mới đƣợc tổng hợp không bắt cặp với mồi mà bắt
cặp với nhau.
Ngoài ra, số lƣợng chu kì còn phụ thuộc vào số lƣợng bản sao ban
đầu, nếu số lƣợng ban đầu là 105 thì thực hiện 25 – 30 chu kì, còn số lƣợng mẫu
là 102 – 103 thì phải thực hiện 30 – 40 chu kì (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan,
1999).
Thiết bị và dụng cụ
Thực chất thiết bị và dụng cụ để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng
đƣợc nhu cầu thay đổi nhiệt độ nhanh và chính xác. Các thiết bị hiện nay đã đƣợc
cải thiện tối đa để tránh sự bốc hơi nƣớc trong quá trình phản ứng và cho phép tiến
hành phản ứng PCR ngay trên mô và tế bào... Tuy nhiên, mỗi kiểu thiết bị đều có
đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần đƣợc tiến
hành cùng một chủng loại thiết bị.
Hơn nữa ống nghiệm dùng cho các phản ứng của cùng một thí nghiệm phải
thuộc cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của của các ống này cũng nhƣ độ tiếp
xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hƣởng lớn đến quá trình
khuếch đại (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002).
Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng PCR
Ưu điểm của phản ứng PCR
Thời gian thực hiện nhanh, đơn giản, ít tốn kém.
16
Không đòi hỏi mẫu phải tinh sạch cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ).
Nhược điểm của phản ứng PCR
Đòi hỏi phải biết trình tự nucleotid của đoạn DNA cần khuếch đại,
hay ít nhất cũng phải biết trình tự hai đầu của phân tử DNA.
Chỉ khuếch đại những phân tử DNA có kích thƣớc nhỏ hơn 3 kb, tốt
nhất là 1 kb.
Rất dễ bị nhiễm, dẫn đến tạo sản phẩm phụ (dƣơng tính giả).
Ứng dụng của kỹ thuật PCR
Do có khả năng khuếch đại một lƣợng DNA cực nhanh và chuyên biệt nên kỹ
thuật PCR đƣợc áp dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực (Nguyễn Văn Uyển, 1995):
- Sản xuất các mẫu dò.
- Ứng dụng trong khuếch đại DNA, RNA.
- Ứng dụng để phân tích đa dạng di truyền.
- Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh.
2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR
Multiplex PCR là phản ứng PCR cho phép phát hiện cùng lúc nhiều gen của
một sinh vật hay nhiều sinh vật khác nhau bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác
nhau trong một phản ứng.
2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng
phƣơng pháp multiplex PCR
Hơn một thập kỉ qua, sau khi ra đời phƣơng pháp PCR nói chung và
multiplex PCR nói riêng đã đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện hay phân biệt DNA
các sinh vật khác nhau từ nhiều nguồn mẫu. Vì vậy phƣơng pháp multiplex PCR
cũng đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong việc phân biệt loài động vật trong
thịt chế biến.
Năm 1997, Wayne và ctv đã có công trình nghiên cứu về trình tự mtDNA
dài2001 bp của 23 dòng chó. Kết quả nghiên cứu cho thấy trên mtDNA có trình tự
bảo toàn cho cả 23 dòng chó.
17
Tại Hoa Kỳ, Sawyer (1997) đã tìm ra một phƣơng pháp nhanh và nhạy để
xác định và ngăn chặn tình trạng nhập khẩu bò nhiễm BSE. Tác giả đã xây dựng
quy trình PCR phát hiện thịt bò trong thịt và bột thịt xƣơng dựa trên đoạn gen bảo
tồn của mtDNA bò (B – mtDNA).
Năm 1998, Matsugana đã công bố công trình nghiên cứu phát hiện 6 loại thịt
(bò, heo, gà, cừu, dê, ngựa) từ thịt chế biến. Tác giả sử dụng 7 đoạn mồi với tỉ lệ
thích hợp để phát hiện DNA chuyên biệt cho từng loài. Mồi xuôi đƣợc thiết kế dựa
trên trình tự DNA bảo toàn của gen mtDNA, còn mồi ngƣợc đƣợc thết kế dựa vào
trình tự chuyên biệt ở mỗi loài. Các cặp mồi này cho các sản phẩm PCR có kích
thƣớc khác nhau tƣơng ứng với 6 loại thịt. Các đoạn DNA của dê, gà, bò, cừu, heo,
ngựa lần lƣợt có khích thƣớc: 157, 227, 274, 331, 398, 439 bp. Kết quả PCR đƣợc
quan sát bằng điện di. DNA của dê, gà, bò, cừu, heo đƣợc phát hiện cả đối với DNA
tách chiết từ thịt xử lý nhiệt ở 1000C hay 1200C, riêng đối với thịt ngựa thì không
phát hiện đƣợc ở 1200C. Giới hạn nhỏ nhất của nồng độ DNA mà phản ứng PCR
còn phát hiện đƣợc là 0,25 ng.
Năm 2000, Montiel-Sosa và ctv đã thiết kế cặp mồi có tính chuyên biệt cao
trên đoạn bảo tồn của gen mtDNA. Cặp mồi này đƣợc dùng để khuếch đại đoạn
DNA dài 531bp của gia cầm bằng phƣơng pháp PCR. Phƣơng pháp này tỏ ra hữu
dụng đối với cả thịt tƣơi và hỗn hợp thịt chế biến bao gồm thịt phơi khô và thịt nấu
chín từ bò, cừu, gà.
Năm 2004, Myers và ctv cũng đã dựa vào đoạn mtDNA để thiết lập phản ứng
multiplex PCR nhằm phát hiện thịt các loài bò, heo, cừu, dê, ngựa trong thức ăn
chó. Giới hạn DNA để phát hiện là 1 g/kg. Kết quả cho thấy chỉ có 27 mẫu trong
tổng số 31 mẫu là chứa thịt bò và heo (các mẫu thức ăn chó đƣợc ghi trên nhãn là
chỉ gồm thịt bò và heo).
18
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nội dung thực hiện
(1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt ở: 800C/15’, 1200C/15’,
120
0C/30’, 1300C/15’.
(2) Thực hiện phản ứng single PCR (s-PCR) đối với DNA từ ba loại thịt tƣơi
(heo, bò, cừu) để làm cơ sở cho phản ứng multiplex PCR (m-PCR).
(3) Tối ƣu hóa quy trình m-PCR để xác định loại thịt trong hỗn hợp thịt tƣơi xay
nhuyễn.
(4)Thực hiện phản ứng s-PCR đối với DNA từ thịt xử lý ở nhiệt độ: 800C/15’,
120
0C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’.
(5) Thực hiện phản ứng m-PCR để xác định ba loại thịt heo, bò, cừu.
Thực hiện phản ứng m-PCR đối với hỗn hợp DNA heo, bò, cừu có nồng
độ của DNA bò, cừu giảm dần để xác định ở nồng độ nào phản ứng m-PCR vẫn còn
phát hiện đƣợc hai loài này.
Thực hiện phản ứng m-PCR với hỗn hợp thịt đã xử lý ở các nhiệt độ
80
0C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’.
(6) Thực hiện phản ứng m-PCR phát hiện thịt heo, bò, cừu trong bột thịt.
3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành
Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 01-02-2007 đến ngày 30-07-2007 tại Trung
Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh.
19
3.3 Vật liệu
3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA
Mẫu cơ vân đƣợc lấy từ thịt heo, bò, cừu mua ở siêu thị Metro TP. Hồ Chí
Minh.
Mẫu bột xƣơng thịt sử dụng trong thức chế biến thức ăn gia súc của các hãng
CE, A, VY.
3.3.2 Đoạn mồi
Matsugana và ctv (1998) đã xác định đƣợc trình tự bảo toàn trên gen
mtDNA, dựa vào trình tự này tác giả đã thiết kế đoạn mồi xuôi chung cho DNA thịt
heo, bò, cừu. Đoạn mồi này đƣợc kí hiệu là FSIM:
5’– GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA – 3’
Tuy nhiên ở mỗi loài thú khác nhau sẽ có những trình tự trên gen mtDNA
khác nhau, từ đó tác giả cũng đã thiết kế mồi xuôi cho từng loại gia súc heo, bò,
cừu, đƣợc kí hiệu lần lƣợt là: RP, RB, RS:
RP: 5’ – GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA – 3’.
RB: 5’ – CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG – 3’.
RS: 5’ – CTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA – 3’.
3.3.3 Hóa chất
3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA
Tris-HCl, NaCl, SDS, EDTA, proteinase K, sodium acetate, isoamyl alcohol,
phenol, chloroform, ethanol, TE 1 X.
3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di
Agarose, TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH = 8,3), loading dye 6 X, ladder
100bp, 200bp, ethidium bromide.
20
3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR
Taq DNA polymerase: 5UI/µl (Promega), dung dịch đệm 10X
(Promega), dNTP 25 mM (Promega), MgCl2 25 mM (Promega), 4 đoạn mồi
(khuếch đại gen mtDNA ở heo, bò, cừu), nƣớc cất 2 lần (khử ion, hấp vô trùng,
chiếu UV, pH 6,8 –7).
3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ
Tủ sấy (Jencons - PLS), water bath (Memmert), autoclave (Tommy), máy cất
nƣớc (khử ion) (Branstead), máy ly tâm (Mikro Z2K/Sigma 3K30C), tủ trữ mẫu và
hóa chất (Reetech, Brandt, Sanyo), máy chụp gel (Biorad), máy luân nhiệt
(Eppendorf, version 2.11.32), bộ điện di (Biorad), máy đo OD (Hewlett Packard),
micropipet, đầu tip, eppendorf, kéo, chày, kẹp…
3.4 Phƣơng pháp tiến hành
3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu
Mua 500 g mỗi loại thịt bỏ vào túi nilon sạch kích thƣớc 5 x 10 cm, dán nhãn
cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thí nghiệm, trữ ở –700C.
3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt
Mỗi loại thịt, lấy khoảng 150 g đem nghiền nhuyễn bằng máy nghiền mẫu.
Sau đó đem cân và trộn các loại thịt với tỉ lệ thịt heo, bò, cừu giảm dần (bảng 3.1).
Mỗi túi mẫu có khối lƣợng 20 g.
21
Bảng 3. 1 Tỷ lệ các loại thịt trong các hỗn hợp thịt
STT Đơn vị tính Thịt heo Thịt bò Thịt cừu
1
% 50 50 0
g 10 10 0
2
% 50 0 50
g 10 0 10
3
% 50 25 25
g 10 5 5
4
% 80 10 10
g 16 2 2
5
% 90 5 5
g 18 1 1
6
% 98 1 1
g 19,6 0,2 0,2
Sau đó chia mỗi hỗn hợp thành 4 phần, bỏ vào các túi nilon chịu nhiệt có dán
nhãn ghi rõ về thành phần, tỉ lệ, nồng độ và thời gian xử lí nhiệt. Hấp hỗn hợp thịt
bằng nồi hấp autoclave ở các nhiệt độ và thời gian: 800C/15 phút, 1200C/15 phút,
120
0C/30 phút, 1300C/15 phút. Làm nguội và trữ lạnh ở - 700C cho đến khi sử dụng.
3.4.3 Tách chiết DNA
* Qui trình tách chiết
Sau khi rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng, tách chiết DNA theo dẫn liệu của
Lƣơng Quý Phƣơng (2006).
1. Cho khoảng 0,1 g mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Dùng chày nghiền nhuyễn
mẫu.
2. Cho vào 60 µl dung dịch đệm tách chiết (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl,
1 mM EDTA và 1% SDS, pH= 8) và 3 µl dung dịch protease K (20 mg/ml). Ủ hỗn
hợp ở 55oC trong 1h.
22
3. Cho vào 375 µl nƣớc cất khử ion vô trùng; vortex 14000 vòng/phút trong
30 giây. Cho thêm 200 µl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol
(25:24:1); vortex 14000 vòng/phút trong 1 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 2
phút ở 10oC.
4. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào eppendorf 1,5 ml mới đã có sẵn
1 ml dung dịch cồn tuyệt đối; trộn đều; ủ – 20oC trong 1 giờ.
5. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC; lấy cặn làm ráo.
6. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở
10
oC, lấy cặn.
7. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC.
8. Hòa tan cặn bằng 200 µl dung dịch TE; ủ 55oC trong 2 giờ.
Sản phẩm DNA sau khi tách chiết đƣợc trữ ở – 20oC hoặc sử dụng ngay. Kiểm
tra độ tinh sạch DNA bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bƣớc sóng
260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Hàm lƣợng DNA đƣợc ƣớc
lƣợng theo công thức DNA (ng/μl) = 62,9*OD260nm – 36*OD280nm. Các mẫu DNA
tách chiết có tỷ số OD260 nm/OD280 nm (tỷ số OD) trên 1,6 đƣợc sử dụng cho PCR.
Sau khi đo OD, chúng tôi pha loãng mẫu đến nồng độ 100 ng/ l.
Kết quả OD đƣợc xử ký bằng phần mền Statgraphics Version 7.0.
3.4.4 Thực hiện phản ứng s-PCR
Để tìm quy trình PCR phù hợp cho việc xác định 3 loại thịt heo, bò, cừu
trong hỗn hợp thịt, đầu tiên chúng tôi thử nghiệm phản ứng s-PCR theo quy trình
của Matsugana và ctv (1998).
Thành phần phản ứng đƣợc trình bày trong bảng 3.2 và bảng 3.3
23
Bảng 3. 2 Thành phần hóa chất PCR
Tên hóa chất Nồng độ cuối
Dung dịch đệm PCR 1X
MgCl2 1,5 mM
FSIM 0,4 M
reversal Tùy mỗi loại thịt (bảng 3.3)
dNTP 200 µM/mỗi loại
Taq 1,25 UI
DNA mỗi loại 100 ng /phản ứng
H2O cất vừa đủ 50 µl
Bảng 3. 3 Nồng độ mồi ngƣợc đối với mỗi loại thịt trong s-PCR
Tên mồi Nồng độ mồi ( M)
RP 0,24
RB 0,24
RS 1,2
Và có chu trình nhiệt nhƣ bảng 3.4.
Bảng 3. 4 Chu trình nhiệt của phản ứng
Giai
đoạn
Diễn giải Nhiệt độ
1 Tiền biến tính 940C trong 4 phút
2
Lặp
lại 35
chu kỳ
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài
94
0
C trong 30 giây.
60
0C trong 30 giây
72
0C trong 30 giây
3 Kéo dài cuối cùng 720C trong 5 phút
24
3.4.5 Tối ƣu hóa phản ứng m-PCR
3.4.5.1 Thực hiện m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998)
Đầu tiên, chúng tôi thực hiện phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana
và ctv (1998). Thành phần phản ứng đƣợc trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3. 5 Thành phần hóa chất PCR
Tên hóa chất Nồng độ cuối
Dung dịch đệm PCR 1X
MgCl2 1,5 mM
FSIM 0,4 M
RP 0,24 M
RB 0,24 M
RS 1,2 M
dNTP 200 µM/mỗi loại
Taq 1,25 UI
DNA tổng số (hỗn hợp heo, bò, cừu) 100 ng /phản ứng
H2O cất vừa đủ 50 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng tƣơng tự bảng 3.4
Chúng tôi thực hiện lặp lại 3 lần để khẳng định quy trình.
3.4.5.2 Thí nghiệm điều chỉnh thành phần phản ứng
Để tối ƣu hóa phản ứng PCR, trƣớc tiên chúng tôi thực hiện việc giảm thể
tích phản ứng xuống còn 30 l và giữ nguyên nồng độ cuối nhƣ bảng 3.5.
Sau đó, chúng tôi chỉnh lại nồng độ Mg2+ (lên 2 mM thay vì 1,5 mM) để tăng
độ hoạt động của Taq polymerase.
3.4.5.3 Thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt
Giảm nhiệt độ bắt cặp từ 600C xuống 560C và 540C đồng thời giữ nguyên thời
gian của chu trình nhiệt.
25
Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống còn 540C và tăng thời gian lúc biến tính, bắt cặp
và kéo dài (bảng 3.6)
Bảng 3. 6 Chu trình nhiệt của phản ứng trƣớc và sau khi điều chỉnh
Giai đoạn
Chu trình nhiệt chƣa điều chỉnh Chu trình nhiệt đã điều chỉnh
Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian
Biến tính 940C 30 giây 940C 1 phút
Bắt cặp 600C 30 giây 540C 45 giây
Kéo dài 720C 30 giây 720C 1 phút
3.4.5.4 Thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi trong 1 phản ứng
Giảm nồng độ mồi của loại thịt có sản phẩm PCR đậm và rõ để loại trừ việc
mồi tác dụng mạnh ức chế mồi tác dụng yếu - giảm RS (bảng 3.7).
Bảng 3. 7 Điều chỉnh nồng độ mồi RS (giảm)
Tên
mồi
Nồng độ
mồi gốc
( M)
Điều chỉnh
lần 1 ( M)
Điều chỉnh
lần 2 ( M)
Điều chỉnh
lần 3 ( M)
FSIM 0,4 0,4 0,4 0,4
RP 0,24 0,24 0,24 0,24
RB 0,24 0,24 0,24 0,24
RS 1,2 0,67 0,33 0,17
Tiếp tục giảm RS xuống còn 0,17 M đồng thời tăng RP (tăng nồng độ mồi
của đối tƣợng không xuất hiện rõ band sản phẩm PCR) cụ thể đƣợc trình bày ở
bảng 3.8.
26
Bảng 3. 8 Điều chỉnh nồng độ mồi RP (tăng)
Tên
mồi
Nồng độ
mồi gốc
( M)
Điều chỉnh
lần 4 ( M)
Điều chỉnh
lần 5 ( M)
Điều chỉnh
lần 6 ( M)
Điều chỉnh
lần 7 ( M)
FSIM 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
RP 0,24 0,33 0,5 0,67 0,83
RB 0,24 0,24 0,24 0,24 0,24
RS 1,2 0,17 0,17 0,17 0,17
Sau khi tìm ra quy trình m-PCR thích hợp để phát hiện ba loại thịt heo, bò,
cừu tƣơi, chúng tôi tiếp tục lặp lại phản ứng 3 lần để khẳng định tính ổn định của
quy trình này.
3.4.6 Thực hiện phản ứng m-PCR hai loài (heo, bò và heo, cừu) ở các nồng độ
DNA khác nhau
Sau khi tìm ra quy trình m-PCR thích hợp, trƣớc tiên chúng tôi thử nghiệm phản
ứng với hai đối tƣợng heo và bò, heo và cừu để xác định ở nồng độ nào DNA của bò,
cừu phản ứng m-PCR còn phát hiện đƣợc, làm cơ sở thực hiện phản ứng m-PCR của
DNA cả ba loài. Việc thực hiện thí nghiệm với các nồng độ DNA giảm dần của bò, cừu
nhằm tạo cơ sở xét nghiệm các sản phẩm chỉ gian lận một lƣợng rất nhỏ hai lọai thịt này.
Thực hiện phản ứng m-PCR đối với DNA thịt heo, bò, chúng tôi phối hợp
DNA theo các nồng độ ở bảng 3.9.
Bảng 3. 9 Phối hợp DNA của heo và bò ở các nồng độ khác nhau
Ký hiệu Nồng độ DNA heo (ng/ l) Nồng độ DNA bò (ng/ l) Tỷ lệ (%)
T1.1 50 50 50:50
T1.2 75 25 75:25
T1.3 80 20 80:20
T1.4 95 5 95:5
T1.5 99 1 99:1
27
Nồng độ mồi của phản ứng này đƣợc tối ƣu ở bảng 3.8
Thực hiện phản ứng m-PCR với hai đối tƣợng heo, cừu ở các nồng độ DNA
đƣợc trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3. 10 Phối hợp DNA của heo và cừu ở các nồng độ khác nhau
Ký hiệu Nồng độ DNA heo (ng/ l) Nồng độ DNA cừu (ng/ l) Tỷ lệ (%)
T2.1 50 50 50:50
T2.2 50 25 75:25
T2.3 80 20 80:20
T2.4 95 5 95:5
T2.5 99 1 99:1
3.4.7 Thực hiện phản ứng m-PCR cho hỗn hợp DNA heo, bò, cừu
Để tạo cơ sở cho việc thực hiện phản ứng m-PCR ở các nồng độ DNA heo,
bò, cừu khác nhau và để xác định ở nồng độ nào của DNA bò, cừu mà phản ứng
m-PCR còn phát hiện đƣợc, chúng tôi phối trộn DNA theo các tỷ lệ khác nhau nhƣ
bảng 3.11.
Bảng 3. 11 Thành phần các hỗn hợp DNA heo, bò, cừu
STT Kí hiệu hỗn hợp Tỷ lệ của hỗn hợp (heo, bò, cừu)
1 C1.1 50:50:0
2 C1.2 50:0:50
3 C1.3 50:25:25
4 C1.4 80:10:10
5 C1.5 90:5:5
6 C1.6 98:1:1
3.4.8 S-PCR đối với DNA của thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau:
80
0
C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút
Nhằm xác định mức độ biến tính và xác định sự phù hợp của quy trình đối
với DNA tách chiết từ thịt đã xử lý nhiệt, chúng tôi thực hiện phản ứng s-PCR cho
28
DNA của từng loại thịt xử lý nhiệt ở: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút,
130
0C/15 phút. Thực hiện phản ứng này theo chu trình nhiệt tối ƣu đã xác định ở
bảng 3.6 và nồng độ mồi tối ƣu (bảng 3.8).
3.4.9 M-PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở
các nhiệt độ khác nhau
Để khẳng định khả năng phát hiện cùng lúc ba loại thịt heo, bò, cừu xử lý
nhiệt đồng thời xác định ở nồng độ nào của thịt bò, cừu phản ứng m-PCR vẫn còn
phát hiện đƣợc hai loài này. Tiến hành thí nghiệm này với tỉ lệ các mồi tƣơng tự ở
bảng 3.8 và với các hỗn hợp thịt theo bảng 3.12.
Bảng 3. 12 Hỗn hợp thịt ở các nhiệt độ xử lý khác nhau
Tỷ lệ thịt
heo: bò:cừu
trong các hỗn
hợp
Kí hiệu hỗn
hợp thịt biến
tính ở
80
0C/15 phút
Kí hiệu hỗn
hợp thịt biến
tính ở
120
0C/15 phút
Kí hiệu hỗn
hợp thịt biến
tính ở
120
0C/30 phút
Kí hiệu hỗn
hợp thịt biến
tính ở
130
0C/15 phút
50:50:0 C2.1 C3.1 C4.1 C5.1
50:0:50 C2.2 C3.2 C4.2 C5.2
50:25:25 C2.3 C3.3 C4.3 C5.3
80:10:10 C2.4 C3.4 C4.4 C5.4
90:5:5 C2.5 C3.5 C4.5 C5.5
98:1:1 C2.6 C3.6 C4.6 C5.6
3.4.10 M-PCR đối cới bột thịt làm nguyên liệu thức ăn gia súc
Với mục đích đánh giá khả năng ứng dụng của quy trình m-PCR này chúng tôi
tiến hành xét nghiệm sản phẩm bột thịt trên thịt trƣờng. Chọn mẫu bột thịt của ba
hãng: CE, A, VY. Sau khi tách chiết DNA và tiến hành m-PCR, chúng tôi điện di
cùng với ba đối chứng s-PCR của heo, bò, cừu để xác định nguồn gốc của các loại
bột thịt trên.
29
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả tách chiết
DNA thịt heo, bò, cừu (thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt) đƣợc tách chiết theo quy
trình đƣợc trích dẫn bởi Lƣơng Quý Phƣơng (2006).
Kết quả đo OD thịt heo, bò, cừu (thịt tƣơi) đƣợc trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4. 1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA của thịt bò, heo, cừu
Chỉ tiêu
DNA thịt bò
(
X
± SD)
DNA thịt heo
(
X
± SD)
DNA thịt cừu
(
X
± SD)
Xác xuất
thống kê
Tỷ số OD 1,93 ± 0,3 2,09 ± 0,24 2,03 ± 0,26 P = 0,46
Hàm lƣợng
DNA (µg /µl)
0,15 ± 0,08 0,32 ± 0,1 0,43 ± 0,2 P = 0,0001
Tổng số mẫu 14 14 14
1.93
0.154
2.14
0.32
2.03
0.426
0
0.5
1
1.5
2
2.5
bò heo cừu
Loại thịt
tỷ số OD
nồng độ DNA
Biểu đồ 4. 1 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt heo, bò, cừu
30
Kết quả bảng 4.1 cho thấy độ tinh sạch của DNA tách chiết từ thịt heo, bò, cừu
khác nhau không ý nghĩa (p > 0,05). Hàm lƣợng DNA của ba loại thịt khác nhau có
ý nghĩa (p<0,001). Cả ba loại thịt trên đều đƣợc ly trích cùng một quy trình nên
DNA thu đƣợc có độ tinh sạch giống nhau. Tuy nhiên mỗi loài gia súc khác nhau thì
số tế bào cơ trên đơn vị diện tích hoặc đơn vị khối lƣợng cũng khác nhau do đó hàm
lƣợng DNA tách chiết từ ba loại thịt trên là khác nhau. Cụ thể là hàm lƣợng DNA
tách chiết từ thịt bò thì khác biệt so với thịt heo và thịt cừu còn hàm lƣợng DNA từ
thịt heo và thịt cừu khác nhau nhƣng không có ý nghĩa (phụ lục 4). Sự sai khác này
phụ thuộc vào: tỉ lệ nƣớc, hàm lƣợng mô liên kết, vị trí cơ thể học, mức độ luyện
tập của thú và nhiêṭ đô ̣xử lý.
Kết quả đo OD thịt tƣơi, thịt xử lý nhiệt của thịt thuần loài với số lƣợng mẫu
của mỗi loài đều bằng nhau ở hai loại này (bảng 4.2).
Bảng 4. 2 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA tách chiết từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt
Chỉ tiêu
DNA thịt tƣơi
(
X
± SD)
DNA xử lý nhiệt
(
X
± SD)
Xác xuất thống
kê
Tỷ số OD 2,02 ± 0,2 1,95 ± 0,2 P = 0,24
Hàm lƣợng DNA (µg /µl) 0,37 ± 0,02 0,16 ± 0,09 P = 0,0000
Tổng số mẫu 32 32
2.02
0.356
1.95
0.59
0
0.5
1
1.5
2
2.5
thịt tươi thịt xử lý nhiệt
Loại thịt
tỷ số OD
nồng độ DNA
Biểu đồ 4. 2 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt
31
Kết quả cho thấy độ tinh sạch của DNA tách chiết từ loại thịt tƣơi và thịt xử
lý nhiệt khác nhau có ý nghĩa (p>0,05) nhƣng hàm lƣợng DNA lại có sự khác biệt
rõ rệt (p<0,0001). Tƣơng tự nhƣ, trên độ tinh sạch của DNA các mẫu thịt đƣợc ly
trích cùng một quy trình nên không có sự khác biệt. Thịt đã xử lý nhiệt thì DNA đã
bị biến tính một phần do đó hàm lƣợng thấp hơn so với thịt tƣơi.
4.2 Kết quả s-PCR đối với thịt tƣơi thuần loài theo quy trình của Matsugana
và ctv (1998)
Tiến hành phản ứng s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) với
một loại DNA tách chiết từ loại thịt tƣơi đã biết trƣớc, kết quả thu đƣợc là mỗi
giếng có một band sản phẩm PCR chuyên biệt cho từng loài (heo, cừu, bò) có kích
thƣớc tƣơng ứng: 398, 331, 274 (hình 4.1).
Vậy các cặp mồi trong quy trình Matsugana và ctv (1998) gồm: FSIM, RP,
RB, RS (mục 3.2.2) có tính chuyên biệt cao và thích hợp cho việc phát hiện các loại
thịt heo, bò, cừu.
t. heo t. bò t.cừu lad
Hình 4.1 Sản phẩm s-PCR
theo quy trình của Matsugana
và ctv (1998)
274 bp
331 bp
398 bp
32
4.3 Kết quả phản ứng m-PCR 3 loài theo quy trình của Matsugana và ctv
(1998)
Thực hiện quá trình phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv với
nồng độ hóa chất và DNA giữ nguyên nhƣ bảng 3.5, kết quả điện di cho thấy ở các
mẫu thí nghiệm chỉ có 1 band 398 bp chuyên biệt cho thịt heo mà thôi (hình 4.2).
Matsugana và ctv (1998) đã xác định các loại thịt trong thịt xử lý nhiệt chính
xác 100% khi tiến hành với quy trình m-PCR này. Nhƣng khi m-PCR với cùng quy
trình của Matsugana và ctv (1998), chúng tôi không thu đƣợc kết quả mong muốn
(chỉ có một band DNA chuyên biệt cho thịt heo). Chúng tôi tiến hành thí nghiệm
này với hóa chất của hãng Promega và điều kiện phòng thí nghiệm Đại học Nông
lâm còn Matsugana và ctv (1998) thì tiến hành trong điều kiện ở Nhật Bản. Có thể
điều này đã tạo ra sự khác biệt về kết quả.
Chúng tôi cho rằng quy trình này chƣa phù hợp với việc phát hiện hỗn hợp
DNA ba loài heo, bò, cừu với điều kiện thí nghiệm trong nƣớc hiện nay.
t.heo H14
Hình 4.2 Sản phẩm m-
PCR theo quy trình của
Matsugana và ctv (1998)
ĐC
Quy trình của
Matsugana
Band heo
(389 bp)
Tạp
33
4.4 Kết quả quá trình thiết lập và tối ƣu hóa phản ứng m- PCR
4.4.1 Điều chỉnh thể tích phản ứng
Bƣớc đầu tiên để tối ƣu hóa quy trình phản ứng m-PCR, chúng tôi tiến hành giảm
chi phí thí nghiệm (giảm lƣợng hóa chất) bằng cách giảm thể tích xuống còn 30 l.
Khi thực hiện m-PCR của hỗn hợp DNA thịt heo, bò, cừu (tỉ lệ 1:1:1) với thể
tích phản ứng là 30 l, điện di mẫu cùng với hai đối chứng s-PCR của DNA heo, bò
(thí nghiệm 4.2), kết quả chỉ thu đƣợc hai band DNA của thịt bò và cừu (274 bp và
331 bp), không thu đƣợc band DNA của thịt heo (hình 4.3).
Có thể khi giảm thể tích phản ứng xuống còn 30 l đã tăng độ đồng đều về
nhiệt độ trong phản ứng m-PCR do đó kết quả đạt đƣợc tốt hơn.
4.4.2 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ Mg2+
Sau khi tiến hành tăng nồng độ Mg2+ lên 2 mM, điện di mẫu m-PCR (của hỗn
hợp DNA heo, bò, cừu tỉ lệ 1:1:1) với đối chứng là sản phẩm s-PCR của DNA cừu
(mục 4.2), kết quả thu đƣợc lần này vẫn chỉ có hai band bò và cừu (274 bp và 331
bp) nhƣng đậm và rõ nét hơn (hình 4.4).
Hình 4.3 Sản phẩm m-PCR
khi điều chỉnh thể tích phản
ứng
Heo bò
ĐC ĐC hỗn hợp
Band bò
(274 bp)
Tạp
Band cừu
(331bp)
Band heo
(398 bp)
34
Theo Yale (1997), phản ứng m-PCR khi các sản phẩm kích thƣớc ngắn không
xuất hiện thì một trong các biện pháp giải quyết để có đƣợc các sản phẩm mong
muốn là tăng nồng độ Mg2+ và vẫn giữ nguyên nồng độ dNTP. Việc tăng nồng độ
Mg
2+
sẽ làm cho phản ứng trở nên linh hoạt hơn, tăng hoạt tính của Taq polymerase,
tăng lƣợng sản phẩm. Do đó chúng tôi đã thu đƣợc kết quả các band rõ hơn.
4.4.3 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt
Giảm nhiệt độ bắt cặp từ 600C xuống 560C, 540C (hình 4.5):
56
0
C 54
0
C
56
0
C 54
0
C
56
0
C 54
0
C
ĐC: tăng Mg2+
t.cừu
Hình 4.4 Sản phẩm m-PCR
sau khi tăng nồng độ Mg2+
Tạp
Band bò
(274bp)
Band cừu
(331bp)
Band cừu
(331 bp)
ĐC Hỗn hợp
(cừu)
Hình 4.5 Sản phẩm m-PCR
khi điều chỉnh nhiệt độ bắt
cặp: 560C và 540C
Band cừu (331pb)
Band heo (mờ) (398bp)
Tạp
Band bò (mờ) (274bp)
56
0
C 54
0
C
35
Nhiệt độ bắt cặp có vai trò quan trọng trong phản ứng PCR, nó quyết định khả
năng gắn mồi vào khuôn để khởi đầu tổng hợp nên sợi mới, do đó ảnh hƣởng lớn
đến khả năng tạo sản phẩm PCR. Nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào Tm của mồi.
Nhƣng trong phản ứng m-PCR có nhiều cặp mồi do đó phải lựa chọn nhiệt độ bắt
cặp sao sao phù hợp nhất đối với tất cả các mồi, thông thƣờng nhiệt độ này đƣợc
lệch so với Tm là 5-100C. Theo Yale (1997), trong phản ứng PCR khi đã sử dụng
cặp mồi chuyên biệt mà vẫn không xuất hiện sản phẩm mong muốn thì ta nên tăng
khả năng bắt cặp của mồi vào khuôn bằng cách giảm nhiệt độ bắt cặp. Tuy nhiệt độ
bắt cặp 600C là phù hợp đối với các đoạn mồi đã đƣợc thiết kế nhƣng trong điều
kiện thí nghiệm của chúng tôi ở nhiệt độ bắt cặp này không thu đƣợc sản phẩm PCR
của thịt bò. Cho nên chúng tôi đã tiến hành lần lƣợt giảm nhiệt độ bắt cặp xuống
còn 560C và 540C. Khi nhiệt độ bắt cặp là 540C, kết quả thu đƣợc cả ba band sản
phẩm PCR của ba loài. Tuy nhiên các band này chƣa đƣợc rõ.
Vậy nhiệt độ 540C là nhiêt độ bắt cặp tƣơng đối thích hợp cho việc khuếch đại
đồng thời DNA của ba loài thịt heo, bò, cừu.
Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống còn 540C và tăng thời gian biến tính, bắt cặp,
kéo dài (lặp lại hai phản ứng). Kết quả thu đƣợc ba band sản phẩm DNA rõ nét hơn
nhƣng vẫn chƣa hoàn toàn tối ƣu (band heo, bò còn vẫn mờ) (hình4.6).
Lặp lai lần:
1 2 Lặp lại lần:
1 2
Band bò (274bp)
Band cừu (331bp)
Hình 4.6 Sản phẩm m-PCR
khi điều chỉnh chu trình nhiệt
Band heo (mờ)(398bp)
Lặp lại lần:
Lần 1 lần 2
Tạp
36
Theo Sambrook và Russell (2001), thời gian của mỗi bƣớc trong giai đoạn lặp
lại của các chu kỳ ảnh hƣởng quyết định đến năng suất sản phẩm PCR. Nếu thời
gian biến tính không đủ lâu để cắt đứt hoàn toàn các liên kết hidro trong mạch đôi
thì giai đoạn bắt cặp sẽ không đạt hiệu quả cao. Thời gian kéo dài chuỗi ngắn quá
cũng hình thành sản phẩm không chuyên biệt. Theo lý thuyết, tốc độ kéo dài chuỗi
của Taq polymerase là 2000 nucleotide/phút. Tuy nhiên, trong thực tế, ngƣời ta
thƣờng thấy loại Taq này kéo dài 1000 nucleotid trong vòng 1 phút. Theo quy trình
của Matsugana và ctv (1998), thời gian trong mỗi bƣớc của giai đoạn lặp lại đều là
30 giây. Nhóm tác giả này đã xác định các loại thịt trong hỗn hợp thịt chế biến
chính xác đến 100% khi tiến hành với chu trình nhiệt ấy. Nhƣng khi thí nghiệm với
cùng chu trình của tác giả, chúng tôi hoàn toàn không thu đƣợc kết quả mong muốn
(chỉ đƣợc một band DNA chuyên biệt cho thịt heo). Vì vậy chúng tôi đã tiến hành
giảm nhiệt độ bắt cặp đã đƣợc xác định ở phần trên đồng thời tăng thời gian của các
bƣớc: biến tính, bắt cặp và kéo dài, kết quả thu đƣợc sản phẩm PCR gồm ba band
có thể nhận diện đƣợc ba loài heo, bò, cừu.
Vậy chu trình nhiêt (giai đoạn 2) thích hợp cho phản ứng m-PCR phân biệt ba
loài heo, bò, cừu là: biến tính ở 940C/1phút, bắt cặp ở 540C/45 giây, kéo dài ở
72
0C/1 phút.
4.4.4 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi
Giảm nồng độ RS.
Kết quả mỗi giếng đều có 3 band nhƣng band DNA của thịt heo và thịt bò mờ
hơn band DNA của thịt cừu. Tuy vậy ở giếng thứ 3 (với RS là 0,17 M) thì thu
đƣợc kết quả rõ ràng nhất (hình 4.7).
37
Tăng nồng độ RP.
Kết quả là ở mỗi lần điều chỉnh đều thu đƣợc 3 band heo bò cừu. Trong đó ở nồng
độ RS (0,17 M) và RP (0,83 M) xuất hiện ba band tốt nhất (hình 4.8).
Hình 4.7 Kết quả m-PCR
khi giảm RS
Điều chỉnh nồng độ RS ( M)
Band cừu (331bp)
0,67 0,33 0,17
Tạp
Band heo (398bp)
Band bò (274bp)
Hình 4.8 Kết quả m-PCR
khi tăng RP
Điều chỉnh nồng độ RP ( M)
Band cừu (331bp)
Tạp
Band bò (274 bp)
Band heo (389bp)
0,33 0,5 0,67 0,83
38
Ở mục 4.4.3, kết quả m-PCR thu đƣợc sau khi điều chỉnh chu trình nhiệt chỉ
có band DNA của thịt cừu đậm và rõ còn band DNA của thịt bò và heo nhạt hơn
nhiều. Theo Yale (1997), trong phản ứng m-PCR, nếu có một số sản phẩm PCR
mạnh (band DNA đậm và rõ) và một số sản phẩm PCR khác yếu (band DNA không
rõ) thì nên tăng nồng độ mồi của sản phẩm yếu và giảm nồng độ mồi của sản phẩm
mạnh. Vì vậy sau khi điều chỉnh mồi nhƣ bảng 3.7, thu đƣợc RS (0,17 M) là tốt
nhất, sau đó tiếp tục giữ nguyên lƣợng RS và tăng RP nhƣ bảng 3.8, chúng tôi đã
thu đƣợc kết quả mong muốn (hình 4.8).
Vậy nồng độ mồi FSIM: RP: RB: RS thích hợp cho phản ứng m-PCR phát
hiện ba loại thịt heo, bò, cừu lần lƣợt là: 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M.
4.4.5 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình
Sau ba lần lặp lại phản ứng m-PCR với quy trình tối ƣu (nồng độ mồi theo
bảng 3.8), chúng tôi thấy cả ba lần đều có kết quả tốt – có ba band chuyên biệt cho
ba loài heo, bò, cừu đậm và rõ (hình 4.9).
Lặp lại 3 lần:
1 2 3 Lad
Hình 4.9 Kết quả kiểm tra tính ổn
định của quy trình
398 bp
(heo) 331 bp
(cƣ̀u) 274bp
(bò)
Tạp
39
Nhƣ vậy quy trình này là quy trình tối ƣu cho việc xác định ba loại thịt heo,
bò, cừu.
4.5 Kết quả m-PCR đối với 2 loài
Sau khi đã pha loãng DNA đến nồng độ 100ng/ l, chúng tôi tiến hành phối
trộn các DNA theo bảng 3.9 và bảng 3.10 và tiến hành m-PCR, kết quả thu đƣợc
nhƣ sau:
Phản ứng m-PCR đối với heo, bò (hình 4.10).
Phản ứng m-PCR đối với heo, cừu (hình 4.11).
Hình 4.11 Sản phẩm m-PCR
đối với DNA heo, cừu
T2.1 T2.2 T2.3 T2.4 T2.5
Band heo
(398bp) Band cừu
(331bp)
Tạp
Band heo
(398bp)
Tạp
Band bò
(274bp)
Hình 4.10 Sản phẩm m-PCR
đối với heo, bò
T1.1 T1.2 T1.3 T1.4 T1.5
40
Kết quả trên cho thấy ở nồng độ DNA tách chiết từ thịt bò, cừu 1ng/ l (trong hỗn
hợp T5.1 và T5.2) vẫn còn có thể phát hiện bằng m-PCR. Theo Matsugana và ctv
(1998), nồng độ DNA nhỏ nhất còn có thể phát hiện đƣợc bằng PCR là 0,25 ng/ l.
4.6 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của DNA
bò, cừu
Sau khi phối trộn DNA của heo, bò, cừu nhƣ bảng 3.11 và thực hiện phản
ứng m-PCR, kết quả thu đƣợc là ở nồng độ 1ng/ l của DNA tách chiết từ thịt bò,
cừu vẫn còn phát hiện đƣợc bằng PCR (hình 4.12).
4.7 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt
Mức nhiệt độ để xử lý sản phẩm thịt chế biến rất đa dạng tùy thuộc quy trình chế
biến của nhà sản xuất và mục đích sử dụng sản phẩm. Các sản phẩm nhƣ xúc xích, lạp
xƣởng... đƣợc xử lý ở 800C. Xúc xích tiệt trùng, thịt hộp các loại... thƣờng đƣợc xử lý ở
120
0C trở lên. Riêng đối với bột thịt sử dụng trong chế biến thức ăn gia súc đƣợc xử lý
ở 1300C. Do đó chúng tôi tiến hành các thí nghiệm s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở các
nhiệt độ: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút. Mục đích của
thí nghiệm là xác định hiệu quả của phƣơng pháp PCR đối với thịt xử lý ở vài mức
Hình 4.12 Kết quả m-PCR của
các hỗn hợp DNA
C1.1 C1.2 C1.3 C1.4 C1.5 C1.6
Band heo
(398bp)
Band bò
(274)
Band cừu
(331bp)
41
nhiệt độ và thời gian xử lý trên để làm cơ sở xác định các loại thịt chế biến lƣu hành
trên thị trƣờng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 800C/15 phút (hình 4.13).
Phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 1200C/15 phút (hình 4.14).
Band bò (274bp)
Hình 4.13 Kết quả s – PCR
đối với thịt xử lý nhiệt ở
80
0C/15 phút
t.heo t.bò t.cừu
Band cừu (331pb)
Band heo (398bp)
Hình 4.14 Kết quả s-PCR đối
với thịt xử lý nhiệt ở
120
0C/15 phút
Tạp
Band cừu
(331bp)
t.heo t.bò t.cừu
Band heo
(398bp) Band bò
(274bp)
42
Phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 1200C/30 phút (hình 4.15).
Phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút (hình 4.16).
t.heo t.bò t.cừu
Hình 4.15 Kết quả s-PCR của thịt
xử lý nhiệt ở 1200C/30 phút
Band cừu
(331bp) Band bò
(274bp)
Band heo
(398bp)
Tạp
t.heo t.bò t.cừu
Hình 4.16 Kết quả
s-PCR của thịt xử lý
nhiệt ở 1300C/15 phút
Band heo
( (398bp)
Band bò
(274bp)
Band cừu
(331bp)
t.heo t.bò t.cừu
Tạp
43
Kết quả thí nghiệm cho thấy khi xử lý thịt ở: 800C/15phút, 1200C/15phút,
120
0C/30 phút, 1300C/15 phút thịt chƣa bị biến tính nhiều. Theo Ali (2005), thịt bò
(mô cơ) xử lý ở 970C/200 phút và 1200C/90 phút vẫn phát hiện đƣợc bằng phƣơng
pháp PCR. Năm 2003, Cheng và ctv cũng đã xác định bột xƣơng thịt xử lý ở
133
0
C/20 phút vẫn có thể cho sản phẩm PCR. Cho nên ở các nhiệt độ trong thí
nghiệm của chúng tôi các loại thịt vẫn chƣa bị biến tính nhiều và cho kết quả
s-PCR tốt.
Vậy quy trình PCR tối ƣu hóa với tỷ lệ các mồi nhƣ bảng 3.8 thích hợp cho
việc xác định DNA của thịt xử lý nhiệt từ 800C đến 1300C/15 phút.
4.8 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt
Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 800C/15 phút (hình 4.17).
Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1200C/15 phút (hình 4.18).
Hình 4.17 Kết quả m-PCR đối
với hỗn hợp thịt xử lý ở nhiệt độ
80
0C/15 phút
C2.1 C2.2 C2.3 C2.4 C2.5 C2.6
Band bò
(274bp)
Band cừu
(331bp)
Band heo
(398 bp)
44
Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1200C/30 phút (hình 4.19)
Tạp
Hình 4.18 Kết quả m – PCR
đối với hỗn hợp thịt xử lý
nhiệt ở1200C/15 phút
Band bò
(274bp)
Band cừu
(274bp)
Band heo
(398bp)
C3.1 C3.2 C3.3 C3.4 C3.5 C3.6
Hình 4.19 Kết quả m-PCR đối
với hỗn hỗn hợp xử lý nhiệt
120
0C/30 phút.
C4.1 C4.2 C4.3 C4.4 C4.5 C4.6
Band bò
(274 bp)
Band cừu
(331 bp)
Band heo
(398 bp)
Tạp
45
Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút – điện
di với ladder để đối chứng (hình 4.20).
Các kết quả này cho thấy, quy trình m-PCR của chúng tôi hoàn toàn có khả
năng ứng dụng để phát hiện ba loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt đã xử lý
nhiệt. Với quy trình này, ở tỷ lệ 1% của thịt bò, cừu trong hỗn hợp thịt (C2.6, C3.6,
C4.6, C5.6) đã xử lý từ 800C đến 1300C/15 phút vẫn còn phát hiện đƣợc.
4.9 Kết quả m-PCR đối với bột thịt
Khi đã xác định đƣợc quy trình này hoàn toàn phù hợp để xác định thịt đã xử
lý nhiệt, chúng tôi tiến hành m-PCR trên đối tƣợng bột thịt của 3 cơ sở: CE, A, VY.
Qua điện di ba mẫu PCR bột thịt cùng với ba đối chứng là sản phẩm s-PCR của
DNA thịt heo, bò, cừu (mục 4.2), kết quả thu đƣợc: bột thịt CE có nguồn gốc từ thịt
heo, còn bột thịt A và VY có nguồn gốc từ thịt bò (hình 4.21).
Tạp
Lad C5.1 C5.2 C5.3 C5.4 C5.5 C5.6
Hình 4.20 Kết quả m-PCR của các
hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15
phút
Band cừu
(274 bp)
Band heo
(398 bp)
Band bò
(331 bp)
46
Hình 4.21 Sản phẩm m-PCR của
bột thịt
3 đối chứng
T.heo T.bò T.cừu CE A VY
Band bò (274 bp)
Band heo (398 bp)
Tạp
47
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
1. Tách chiết DNA thành công đối với cả thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt ở
80
0C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút với độ tinh sạch cao.
2. Thiết lập đƣợc quy trình m-PCR tối ƣu để phát hiện ba loài heo, bò, cừu
trong hỗn hợp thịt chế biến. Quy trình này có thể áp dụng cho cả thịt tƣơi và thịt xử
lý nhiệt ở nhiệt độ: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút.
3. Quy trình vẫn phát hiện đƣợc khi nồng độ DNA của thịt cừu và thịt bò ở
mức 1 ng/ l và tỉ lệ trong hỗn hợp thịt là 1%.
4. Quy trình áp dụng đƣợc đối với việc phân tích bột thịt làm nguyên liệu
cho thức ăn gia súc.
5.2 Đề nghị
1. Thử nghiệm quy trình m-PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý ở các nhiệt độ
cao hơn.
2. Tối ƣu hóa quy trình để thử nghiệm với các nồng độ DNA nhỏ hơn.
3. Thử nghiệm với nhiều loại thịt gia súc gia cầm khác để tiến tới một quy
trình kiểm nghiệm và kiểm soát loài trong bột thịt nhập khẩu vào nƣớc ta.
4. Xây dựng quy trình định lƣợng DNA loài trong hỗn hợp thịt chế biến bằng
phƣơng pháp real time PCR (RT- PCR).
48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bùi Thị Cúc, 2006. Tình hình xuất nhập khẩu động vật và các sản phẩm
động vật. Cục Thú y /Department of animal heath of Việt Nam.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002. Sinh Học Phân Tử (Khái Niệm - Phương
Pháp - ứng Dụng). Tái bản lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí
Minh.
3. Hồ Thị Nguyệt Thu, 2003. Giáo trình môn học chế biến thịt. Giáo trình
môn học, khoa công nghệ thực phẩm trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành
Phố Hồ Chí Minh.
4. Lƣơng Quý Phƣơng, 2006. Sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR
phát hiện gen halothan trên heo. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ công ngệ
sinh học, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt
Nam.
5. Nguyễn Đình Trung, Nguyễn Minh Tâm, 2005. Giáo trình Giải phẩu
sinh ký vật nuôi. NXB Hà Nội. Tr. 38-39.
6. Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004. Chế biến bảo quản thịt và
sữa. NXB Nông nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr 11- 16.
7. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 1999. Sinh học phân tử. Giới thiệu và
ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Văn Uyển, 1995. Những phương pháp công nghệ sinh học thực
vật, Tập 1. Nhà xuất bản nông nghiệp
9. Phạm Văn Ty, 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà
Nội
10. Trần Nhật Phƣơng, 2004. Protein array. Tài liệu giảng dạy, bộ môn công
nghệ sinh học, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr.
6-10.
11. Trần Thị Xô, Nguyễn Thị Lan, 1999. Cơ sở di truyền và công nghệ gen.
NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. Tr. 163-169.
49
12. Xmolxki N.T., 1997. Hóa sinh học thịt gia súc. NXB KHKT, Hà Nội.
(Đặng Đức Dũng dịch). 165 trang.
Tài liệu tiếng nƣớc ngoài
13. Ali A., Irfan O., Calicioglu M. , 2005. Effect of method of cooking on
identification of heat processed beef using polymerase chain reaction
(PCR) technique. Meat science 72: 326-330.
14. Garfin E. David, 2000. Electrophoretic Methods. Academic Press, A
Harcourt Science and Technology Company. 109 p.
15. Rybicki E.D., Purves M., 2003. SDS polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS-page). Deft Microbiology, University of Cape Town. 51 pg.
16. Romans R. John, Costello J. William, Carson C. Wendell, Greaser L.
Mairon, Kevin W. Jones, 1999. The meat we eat. Interstate publishers,
INC. 593p.
17. Myers J. Michael, Farrell E. Dorothy; Heller N. David, Yancy F. Haile,
2004. Development of a polymerase chain reaction-based method to
identify species-specific components in dog food. Food and drug
Administration.
18. Davidson W. Michael, 2005. Molecular expressions cell biology and
Microscopy structure and fuction of cell and viruses: animal cell
structure. The Florida State University.
19. Montiel-Sosa JF, Ruiz-Pesini E, Montoya J, Roncalés P, López-Pérez
MJ, Pérez-Martos A, 2000. Direct and highly species-specific detection
of pork meat and fat in meat products by PCR amplification of
mitochondrial DNA. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
y Celular, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza, E-50013
Zaragoza, Spain.
20. Murray BW, McClymont RA, Strobeck C, 1995. Forensic identification
of ungulate species using restriction digests of PCR-amplified
mitochondrial DNA. Department of Biology, McMaster University,
Hamilton, Ontario, Canada.
21. Sambrook Joseph and Russell W. David, 2001. Molecular cloning (A
laboratory manual). 3
rd
edition, Cold Spring Harbor laboratory press,
New York, USA. Vol.2: p. 8.23, Vol.3: p. A8.13.
50
22. Sawyer M, Rensen G, Smith W, Yee M, Wong A, Osburn B, Cullor J,
1997. Overcoming RNA inhibition in the fluorescent polymerase chain
reaction assay to enhance detection of bovine DNA in cattle feeds.
Department of Population Health and Reproduction, School of
Veterinary Medicine, University of California, Sawyer, California
95616, USA.
23. Matsugana T., Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Shibata K, Yamada J.,
Shinmura Y.,1998. A quick and simple method for the identification of
meat species and meat products by PCR assay. Meat science 51: p. 143-
148.
24. Yale T., 1997. Troubleshooting for PCR and multiplex PCR.
25. Wayne RK., Geffen E., Girman DJ., Koepfli KP., Lau LM., Marshall
CR., 1997. Molecular systematics of the Canidae. Department of
Biology, University of California, Los Angeles, California 90095, USA.
26. Cheng Y.H., Wen C.M., Ding S.T., Kao C.C., Kuo T.Y., 2003. Detecting
meat – bone meal in ruminant’s feeds by species – specific PCR. Journal
of Animal and Sciences, 12, 2003, 851-860.
Tài liệu internet:
27. http:// www.cucthuy.gov.vn>.
28. >.
29. >
30. - 37k>
31.
4573.2006.00046.x
32.
meat.htm.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1:
30/08/07 03:05:53 PM
Page 1
Analysis of Variance for TTTBT.tsod - Type III Sums of Squares
-------------------------------------------------------------------------
-------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio
Sig. level
-------------------------------------------------------------------------
-------
MAIN EFFECTS
A:TTTBT.mau .0819391 1 .0819391 1.374
.2457
RESIDUAL 3.6984594 62 .0596526
-------------------------------------------------------------------------
-------
TOTAL (CORRECTED) 3.7803984 63
-------------------------------------------------------------------------
-------
0 missing values have been excluded.
All F-ratios are based on the residual mean square error.
30/08/07 03:06:52 PM
Page 1
Table of Least Squares Means for TTTBT.tsod
-------------------------------------------------------------------------
-------
95%
Confidence
Level Count Average Stnd. Error for mean
-------------------------------------------------------------------------
-------
GRAND MEAN 64 1.9848438 .0305298 1.9238016
2.0458859
A:TTTBT.mau
t 32 2.0206250 .0431757 1.9342984
2.1069516
c 32 1.9490625 .0431757 1.8627359
2.0353891
-------------------------------------------------------------------------
-------
30/08/07 03:07:39 PM
Page 1
Multiple range analysis for TTTBT.tsod by TTTBT.mau
-------------------------------------------------------------------------
-------
Method: 95 Percent LSD
Level Count LS Mean Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------
-------
c 32 1.9490625 X
t 32 2.0206250 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
contrast difference +/- limits
t - c 0.07156 0.12208
-------------------------------------------------------------------------
-------
* denotes a statistically significant difference.
Phụ lục 2:
30/08/07 03:08:40 PM
Page 1
Analysis of Variance for TTTBT.NDDND - Type III Sums of Squares
-------------------------------------------------------------------------
-------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio
Sig. level
-------------------------------------------------------------------------
-------
MAIN EFFECTS
A:TTTBT.mau .7331641 1 .7331641 26.615
.0000
RESIDUAL 1.7078977 62 .0275467
-------------------------------------------------------------------------
-------
TOTAL (CORRECTED) 2.4410618 63
-------------------------------------------------------------------------
-------
0 missing values have been excluded.
All F-ratios are based on the residual mean square error.
30/08/07 03:09:12 PM
Page 1
Table of Least Squares Means for TTTBT.NDDND
-------------------------------------------------------------------------
-------
95%
Confidence
Level Count Average Stnd. Error for mean
-------------------------------------------------------------------------
-------
GRAND MEAN 64 .2660625 .0207465 .2245814
.3075436
A:TTTBT.mau
t 32 .3730938 .0293400 .3144306
.4317569
c 32 .1590312 .0293400 .1003681
.2176944
-------------------------------------------------------------------------
-------
30/08/07 03:09:52 PM
Page 1
Multiple range analysis for TTTBT.NDDND by TTTBT.mau
-------------------------------------------------------------------------
-------
Method: 95 Percent LSD
Level Count LS Mean Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------
-------
c 32 .1590312 X
t 32 .3730938 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
contrast difference +/- limits
t - c 0.21406 0.08296 *
-------------------------------------------------------------------------
-------
* denotes a statistically significant difference.
Phụ lục 3:
30/08/07 03:36:41 PM
Page 1
Analysis of Variance for BPS.tisood - Type III Sums of Squares
-------------------------------------------------------------------------
-------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio
Sig. level
-------------------------------------------------------------------------
-------
MAIN EFFECTS
A:BPS.mau .1804513 2 .0902256 .785
.4637
RESIDUAL 4.1364154 36 .1149004
-------------------------------------------------------------------------
-------
TOTAL (CORRECTED) 4.3168667 38
-------------------------------------------------------------------------
-------
0 missing values have been excluded.
All F-ratios are based on the residual mean square error.
30/08/07 03:37:08 PM
Page 1
Table of Least Squares Means for BPS.tisood
-------------------------------------------------------------------------
-------
95%
Confidence
Level Count Average Stnd. Error for mean
-------------------------------------------------------------------------
-------
GRAND MEAN 39 2.0166667 .0542786 1.9065591
2.1267743
A:BPS.mau
b 13 1.9269231 .0940133 1.7362111
2.1176350
p 13 2.0915385 .0940133 1.9008265
2.2822504
s 13 2.0315385 .0940133 1.8408265
2.2222504
30/08/07 03:37:42 PM
Page 1
Multiple range analysis for BPS.tisood by BPS.mau
-------------------------------------------------------------------------
-------
Method: 95 Percent LSD
Level Count LS Mean Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------
-------
b 13 1.9269231 X
s 13 2.0315385 X
p 13 2.0915385 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
contrast difference +/- limits
b - p -0.16462 0.26971
b - s -0.10462 0.26971
p - s 0.06000 0.26971
-------------------------------------------------------------------------
-------
* denotes a statistically significant difference.
Phụ lục 4:
30/08/07 03:14:08 PM
Page 1
Analysis of Variance for BPS.dna - Type III Sums of Squares
-------------------------------------------------------------------------
-------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio
Sig. level
-------------------------------------------------------------------------
-------
MAIN EFFECTS
A:BPS.mau .4887762 2 .2443881 12.075
.0001
RESIDUAL .7286095 36 .0202392
-------------------------------------------------------------------------
-------
TOTAL (CORRECTED) 1.2173857 38
-------------------------------------------------------------------------
-------
0 missing values have been excluded.
All F-ratios are based on the residual mean square error.
30/08/07 03:14:37 PM
Page 1
Table of Least Squares Means for BPS.dna
-------------------------------------------------------------------------
-------
95%
Confidence
Level Count Average Stnd. Error for mean
-------------------------------------------------------------------------
-------
GRAND MEAN 39 .3005128 .0227805 .2543010
.3467246
A:BPS.mau
b 13 .1544615 .0394570 .0744204
.2345027
p 13 .3206154 .0394570 .2405742
.4006565
s 13 .4264615 .0394570 .3464204
.5065027
-------------------------------------------------------------------------
-------
30/08/07 03:15:05 PM
Page 1
Multiple range analysis for BPS.dna by BPS.mau
-------------------------------------------------------------------------
-------
Method: 95 Percent LSD
Level Count LS Mean Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------
-------
b 13 .1544615 X
p 13 .3206154 X
s 13 .4264615 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
contrast difference +/- limits
b - p -0.16615 0.11320 *
b - s -0.27200 0.11320 *
p - s -0.10585 0.11320
-------------------------------------------------------------------------
-------
* denotes a statistically significant difference.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- TRINH THI THANH HUYEN.pdf