Khóa luận Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu khả năng sinh enzyme của vi khuẩn bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học

ết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.2.2.1. Thiết bị Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, … 3.2.2.2. Dụng cụ Lam, đèn cồn, que cấy, que trang, đũa thuỷ tinh, ống nghiệm, đĩa petri, micropipete, giá ống nghiệm, … Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong thí nghiệm đều phải được rửa sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C /15 phút. 19 3.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng. Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học. Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản. 3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài 3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở dưới. Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lí vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1. 3.4.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 đến 4. Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng. Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3 ,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa TSA này vào tủ ấm ủ ở 37 0C/24h. Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên môi trường TSA nghiêng. 20 Đồng nhất và pha loãng mẫu: 1 g mẫu + 9 ml dd NaCl 90/00 Lần lượt pha loãng được các nồng độ tiếp theo ủ ở 370C/ 24h Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi. Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần. Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử. Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis (như : là trực khuẩn, hai đầu tròn, G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hoá để khẳng định. Khảo sát các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn phân lập được. Mẫu đất Dd pha loãng mẫu 10-1 Hút từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA Chọn khuẩn lạc diển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hoá Giữ giống trên môi trường TSA nghiêng 21 Thử phản ứng sinh hóa Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006) 3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis 3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis  Mục đích: xác định thời gian và chế độ nào phù hợp nhất. Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1 Chế độ sục Thời khí gian Lô1: sục khí liên tục Lô 2: không sục khí Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease 24 giờ 48 giờ  Cách làm: Lấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp tiệt trùng (1210C/15phút), sau đó đo độ đục để cân bằng số lượng vi khuẩn cho vào các lô. Sau đó chuẩn bị 2 bình (cho một ống giống), mỗi bình chứa 150 ml môi trường TSB, cấy giống Bacillus subtilis với tỉ lệ 3%. Cho vòi sục khí vào bình với Chủng vi khuẩn thuần đã quan sát dưới kính hiển vi Hoạt tính catalase (+), Lecithinase (-), Nitrat (+), Voges-Proskauer (+), Citrat (+), Maltose (-). Khẳng định vi khuẩn Bacillus subtilis 22 thời gian và chế độ sục khí khác nhau: bình 1 sục khí liên tục, bình 2 không sục khí. Lấy mẫu vào các thời điểm 24h, 48h. Thí nghiệm được thực hiện trong 48 giờ và ở nhiệt độ phòng, sau đó đọc kết quả. Kiểm tra hoạt độ enzyme vào các thời điểm 24h, 48h ở 2 chế độ nuôi cấy khác nhau. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Từ đó chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, lựa chọn 4 chủng cho kết quả tốt để tiếp tục khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 3.4.2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis  Mục đích: xác định môi trường nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1.  Cách làm: Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục. Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào 4 loại môi trường thử nghiệm: Rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, TSB + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton với các điều kiện khảo sát: Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Tỉ lệ giống 3% pH = 6 Thời gian nuôi cấy và chế độ được chọn theo kết quả thí nghiệm 1. Sau đó tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme: Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth. Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fluld. 23 Sau khi kiểm tra hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường, tiến hành chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để làm thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2 Môi trƣờng Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 Rỉ đường + 2% tinh bột Rỉ đường + 1% tinh bột Rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton TSB + 1% tinh bột 24 3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis  Mục đích: xác định pH và thời gian nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1.  Cách làm: Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục. Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào môi trường đã chọn ở thí nghiệm 2 ở các pH và thời gian khác nhau với tỉ lệ 3% và nuôi cấy ở chế độ đã chọn ở thí nghiệm 1. Kiểm tra hoạt độ amylase và protease (thí nghiệm được lập lại 2 lần). Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3 pH 6,0 7,0 Hoạt độ enzyme Thời gian amylase protease amylase protease 24h 48h  Từ khảo sát trên, chọn mức pH, thời gian thích hợp mà các chủng Bacillus subtilis cho hoạt độ enzyme tốt nhất. 25 3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus subtilis 3.4.3.1. Quy trình thực hiện 3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản Chế phẩm được kiểm tra hoạt độ enzyme ở các khoảng thời gian: 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày theo hai chế độ bảo quản: 4 - 100C và nhiệt độ phòng. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic 7.0. Sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 40 – 500C Các giống vi khuẩn đã chọn ở thí nghiệm 1 Môi trường nhân giống: môi trường TSB với điều kiện nuôi cấy đã chọn Môi trường sản xuất: cám gạo Kiểm tra hoạt độ enzyme protease và amylase Thời gian 48h, nhiệt độ 370C Thu hoạch chế phẩm 26 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis Sau khi pha loãng mẫu và cấy trang trên môi trường TSA đĩa, ủ 24 giờ, quan sát và bắt giữ giống những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 4.1: khuẩn lạc có bề mặt khô, mọc lan trên mặt thạch, dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám. Tiếp tục làm tiêu bản nhuộm Gram từng chủng vi khuẩn phân lập và quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại x 1000 lần) để khảo sát đặc điểm hình thái. Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis Nhuộm Gram tiêu bản vi khuẩn và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy các chủng vi khuẩn được nghi ngờ có hình thái giống với Bacillus subtilis, là những trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 - 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có bào tử và bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng. 27 Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis (www.biol.pmf.hr/.../odg-slike/odg451.jpg) 4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với Bacillus subtilis được chọn làm một số phản ứng sinh hóa để khẳng định. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. Sau khi thử phản ứng sinh hóa của 21 chủng nghi ngờ, chúng tôi xác định được 10 chủng là vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiếp tục chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và protease trong những môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được. 28 Bảng 4. 1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập Ghi chú: (+) là phản ứng dương tính (-) là phản ứng âm tính Chủng phân lập Các phản ứng sinh hóa Catalase Lecithinase Nitrate Citrate MR - VP Maltose 1 + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 + + + + + 6 + + + + + 7 + + + + + 8 + + + + + 9 + + + + + 10 + + + + + 11 + + + + 12 + + + + 13 + + + + 14 + + + + 15 + + + + 16 + + + + 17 + + + + 18 + + + + 19 + + + 20 + + + 21 + + + 29 4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Các chủng vi khuẩn phân lập được nuôi cấy trong môi trường TSB ở hai chế độ sục khí và không sục khí với thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, nhiệt độ phòng, pH = 7, chúng tôi tiến hành theo dõi chỉ tiêu về khả năng sinh enzyme amylase và protease với kết quả như sau: Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2) Chế độ sục khí Thời gian Lô 1: sục khí liên tục (n = 18) Lô 2: không sục khí (n = 18) Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ml) Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ml) 24 giờ 39,11 32,89 14,44 5,44 48 giờ 47,11 40 25,78 8 Hoạt độ trung bình 43,11 36,45 20,11 6,72 Qua kết quả được trình bày ở bảng 4.2 cho thấy hoạt độ trung bình của hai loại enzyme trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ sục khí liên tục cao hơn hoạt độ trung bình của hai loại enzyme ở chế độ không sục khí. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở hai chế độ nuôi cấy và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê ở cả hai loại enzyme (với P < 0,05) (Phụ lục A). Như vậy cho thấy với chế độ sục khí do cung cấp oxy nhiều nên giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh và sản sinh ra nhiều enzyme hơn so với chế độ không sục khí (vì Bacillus sinh sản và phát triển tốt). 30 Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy có sự khác biệt về hoạt độ của hai loại enzyme giữa hai khoảng thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ) (với P < 0,05) (Phụ lục A). Theo kết quả của chúng tôi khi nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis ở 48 giờ với chế độ sục khí liên tục sẽ cho hoạt độ enzyme cao hơn so với điều kiện nuôi cấy sục khí liên tục trong 24 giờ. Như vậy chứng tỏ khi vi khuẩn được cung cấp oxy càng nhiều thì chúng phát triển càng tốt và sinh càng nhiều enzyme. Cũng theo kết quả thống kê: có sự khác biệt về mặt thống kê giữa 9 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được nuôi cấy (cụ thể có sự khác biệt giữa các chủng: chủng 2 – 5, chủng 2 – 6, chủng 2 – 8, chủng 1 - 9, chủng 4 - 9,...). Tuy nhiên giữa hai chế độ sục khí và không sục khí thì hoạt độ enzyme trong cùng một chủng không đồng nhất, có thể ở điều kiện cung cấp oxy một số chủng này phát triển tốt hơn và ở chế độ không cung cấp oxy một số chủng khác lại phát triển tốt hơn. Điều này cho thấy có sự khác biệt về đặc điểm sinh học giữa các chủng. Từ các kết quả có được như trên, chúng tôi quyết định chọn chế độ sục khí liên tục trong thời gian 48 giờ và chọn 4 chủng: 2, 7, 9, 10 trong 9 chủng phân lập được để tiếp tục khảo sát hoạt độ của hai loại enzyme trong các môi trường nuôi cấy khác nhau ở thí nghiệm tiếp theo. 31 Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm Chủng vi khuẩn Hoạt độ enzyme amylase (W0/ml) Hoạt độ enzyme protease (Hdp/ml) Hoạt độ trung bình của 2 loại enzyme 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ amylase protease 1 40 48 16 32 44 24 2 64 56 24 32 60 28 4 40 48 20 32 44 26 5 32 48 20 32 40 26 6 32 40 24 40 36 32 7 32 48 56 48 40 52 8 32 40 32 32 36 32 9 48 48 64 56 48 60 10 32 48 40 56 40 48 4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis Chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis trên 4 loại môi trường: rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% peptone, TSB + 1% tinh bột với 4 chủng đã chọn và điều kiện nuôi cấy là: nhiệt độ phòng, tỉ lệ cấy giống là 3%, sục khí liên tục trong 48 giờ (mỗi chủng 4 loại môi trường) (thí nghiệm lặp lại 2 lần). Kết quả được trình bày qua bảng 4.4. 32 Bảng 4. 4. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn. Môi trường Hoạt độ enzyme amylase (W0/ml) Hoạt độ enzyme protease (Hdp/ml) Rỉ đường + 2% tinh bột (1) (n = 8) 26 30 Rỉ đường + 1% tinh bột (2) (n = 8) 18,5 22 Rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton (3) (n = 8) 20 32 TSB + 1% tinh bột (4) (n = 8) 14,5 20 Qua kết quả khảo sát hoạt độ hai loại enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, chúng tôi nhận thấy rằng môi trường rỉ đường + 2% tinh bột có hoạt độ enzyme trung bình cao hơn hoạt độ enzyme trung bình trên các môi trường rỉ đường + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% peptone, TSB + 1% tinh bột. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở 4 loại môi trường trên (cụ thể là có sự khác biệt giữa các môi trường: 1 - 2, 1 - 4, 2 - 3, 3 - 4) (Phụ lục B) và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (với P < 0,05) (Phụ lục B). Theo Nguyễn Đức Duy Anh, (2005): trong 5 loại môi trường nhân giống cấp 1 (Edward, Fragie, Nomura, pepton - gelatin, rỉ đường + 2% tinh bột) thì môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cũng cho kết quả tốt nhất nhưng hoạt độ của cả hai loại enzyme đều rất cao (amylase: 256 W0/ml, protease: 128 Hdp/ml) so với hoạt độ enzyme của môi trường rỉ đường + 2% tinh bột trong thí nghiệm này (amylase: 26 W0/ml, protease: 30 Hdp/ml). Sự chênh lệch hoạt độ enzyme trong cùng một loại môi trường này có thể là do sử dụng hai nguồn vi khuẩn khác nhau, lượng giống cho vào với tỉ lệ khác nhau. 33 Từ kết quả trên chúng tôi quyết định chọn môi trường rỉ đường + 2% tinh bột để tiến hành khảo sát ở thí nghiệm tiếp theo. 4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis Dựa trên các kết quả có được ở các thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đã chọn trên môi trường rỉ đường + 2% tinh bột ở hai điều kiện pH khác nhau: pH = 6 và pH = 7, thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, với tỉ lệ giống 3%, nhiệt độ phòng (mỗi chủng nuôi ở hai pH khác nhau). Kết quả được trình bày ở bảng 4.5. Bảng 4. 5. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. pH Thời gian 6,0 7,0 Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease 24 giờ (n = 8) 27 13 32 18 48 giờ (n = 8) 32 18 36 18 Qua kết quả khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ở bảng 4.5 chúng tôi thấy ở pH = 7 thì hoạt độ enzyme trung bình của vi khuẩn cao hơn so với pH = 6 và ở thời gian nuôi cấy là 48 giờ hoạt độ enzyme cũng cao hơn khi nuôi ở 24 giờ (kết quả này phù hợp với kết quả về thời gian nuôi cấy ở thí nghiệm 1). Tuy nhiên kết quả xử lý thống kê cho thấy không có sự khác biệt giữa hai điều kiện pH và thời gian ở cả hai loại enzyme (amylase, protease) và cũng không có ý nghĩa về mặt thống kê bởi vì mức ý nghĩa của hai loại enzyme đều lớn hơn mức ý nghĩa cho phép (Pamylase = 0,055 > 0,05 và Pprotease= 0,215 > 0,05) (Phụ lục C). 34 4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất Sau khi đã lựa chọn được 4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, chúng tôi tiến hành nuôi tăng sinh trong môi trường TSB, sau đó trộn với cám gạo để thử nghiệm thời gian bảo quản và nhiệt độ bảo quản sau khi thành chế phẩm của vi khuẩn Bacillus subtilis. Chế phẩm được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4 - 100C) và ở nhiệt độ phòng (30 - 37 0 C) trong thời gian là 10 ngày, 20 ngày và 30 ngày. Kết quả được trình bày ở bảng 4.6. Bảng 4.6. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm Nhiệt độ Thời gian 4 - 10 0 C 30 - 37 0 C Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease 0 ngày 56 38 56 38 10 ngày 5,25 0,0 4,75 0,0 20 ngày 5,25 0,0 4,25 0,0 30 ngày 5,0 0,0 4,5 0,0 Từ kết quả ở bảng trên cho thấy trong điều kiện bảo quản lạnh thì hoạt độ của hai loại enzyme cao hơn so với điều kiện bảo quản thường. Hoạt độ của hai loại enzyme này giảm rất nhanh (hơn 10 lần) chỉ sau 10 ngày bảo quản. Ở kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy kết quả cụ thể cho từng loại enzyme. Với enzyme amylase kết quả thống kê cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa hai nhiệt độ bảo quản (với P = 0,0026 < 0,05), còn với thời gian bảo quản có sự khác biệt có ý nghĩa giữa 0 ngày với các khoảng thời gian còn lại (với P = 0,000 < 0,05) (Phụ lục D). Riêng với enzyme protease kết quả thống kê cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai nhiệt độ bảo quản này (với P = 1,000 > 0,05) và ở thời gian bảo quản cũng có kết quả tương tự như đối với 35 enzyme amylase, đó là chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa khoảng thời gian là 0 ngày với 10, 20, 30 ngày (với P = 0,000 < 0,05) (Phụ lục D). Qua những kết quả ở trên, do có sự giảm đáng kể của cả hai loại enzyme chỉ trong khoảng thời gian 10 ngày bảo quản, trong khảo sát của chúng tôi cho thấy cám gạo không phải là chất nền thích hợp cho chế phẩm enzyme amylase, đặc biệt với enzyme protease lại càng không thích hợp. 36 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Sau một khoảng thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi có những kết luận sau: Phân lập được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất. Chế độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và cho enzyme tốt hơn Môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại. pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ thì hoạt độ enzyme của vi khuẩn là tốt nhất. Trong chất nền thử nghiệm cám gạo, kết quả cho thấy ở nhiệt độ 4 – 100C hoạt độ của enzyme amylase bảo toàn tốt hơn ở nhiệt độ 30 – 370C, riêng về thời gian bảo quản hoạt độ của hai loại enzyme có sự thay đổi lớn từ 0 ngày đến 10 ngày, còn từ 10, 20, 30 ngày thì không có sự thay đổi hoạt độ enzyme. 5.2. Đề nghị Cần phân lập thêm nhiều chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ nhiều nguồn khác nhau để có kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn cho hoạt độ enzyme tốt nhất. Cần khảo sát thêm các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh hai loại enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis. Thử nghiệm nhiều loại môi trường sản xuất khác nhau để có được môi trường sản xuất thích hợp nhất cho vi khuẩn. Tìm kiếm chất nền thích hợp cho việc bảo quản enzyme amylase và protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Vương Thị Việt Hoa, 2002, Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 74 trang. 2. Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic, tìm hiểu môi trường nuôi cấy thích hợp và sản xuất thử nghiệm. LVTN, Khoa Chăn nuôi thú y. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 3. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Phân lập và khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis. LVTN, Khoa Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 4. Nguyễn Ngọc Hải, Tô Minh Châu, 2001. Giáo trình thực tập vi sinh. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 5. Lý Kim Hữu, 2005. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic. LVTN, khoa Chăn nuôi thú y. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM 6. Vũ Thị Thứ, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của một số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis. Luận án phó tiến sĩ khoa học, sinh học, Viện sinh học nhiệt đới. 38 7. Tô Minh Châu, 2000. Giáo trình thực tập vi sinh vật học. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 8. Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất và khảo sát khả năng sử dụng các chủng phân lập được trong xử lý nhiễm aflatoxin trên nguyên liệu bắp. LVTN, Khoa Chăn nuôi thú y. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 9. Nguyễn Duy Khánh, 2006. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis. LVTN, khoa Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 10. Lê Đỗ Mai Phương, 2004. Phân lập và giám định vi khuẩn Bacillus subtilis trong tự nhiên, bước đầu khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và enzyme protease. LVTN, trường Đại học Mở Bán Công TP.HCM. 11. Nguyễn Vĩnh Phước, 1976. Vi sinh vật gây bệnh thú y tập 1, 2, 3. NXB Nông nghiệp Hà Nội. 12. Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Nhuận, 1976. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. 13. Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Đức Lượng, 2004. Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. 14. Lã Văn Kính, 1998. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong công nghệ sản xuất thức ăn gia súc và vai trò của probiotic đối với động vật. Viện Khoa học Nông Nghiệp và Kỹ Thuật Miền Nam. 39 15. Nguyễn Vĩnh Phước, 1977. Vi sinh vật thú y tập I. Nhà xuất bản đại học và trung học chuyên nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. 16. Trần Linh Thước, 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục. 17. Lương Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, Hà Nội. 18. Nguyễn Văn Đông, 1993. Khảo sát một số tính chất của vi khuẩn Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl phòng và trị bệnh tiêu chảy heo con. LVTN, khoa Chăn nuôi Thú y. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tài liệu tham khảo trên internet 19. www.sciencebuddies.org/.../MicroBio_img_004.jpg 20. www.fam.br/microrganismos/bacteriologia_bacil... 21. www.mbc.ntu.edu.tw/faculty/LeeKT/fig3.jpg 22. www.biol.pmf.hr/e-skola/odgovori/odgovor451.htm 23. www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba... PHỤ LỤC Phụ lục 1 Bảng phụ lục 1: Hoạt độ enzyme của 9 chủng vi khuẩn nuôi sục khí Chủng vi khuẩn Lần 1 Lần 2 Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ ml) Hoạt độ amylase (W0/ ml) Hoạt độ protease (Hdp/ ml) 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 1 32 64 16 32 48 32 16 32 2 64 64 24 32 64 48 24 32 4 32 64 16 32 48 32 24 32 5 32 64 16 32 32 32 24 32 6 32 48 32 32 32 32 16 48 7 32 48 48 64 32 48 64 32 8 32 32 32 32 32 48 32 32 9 32 48 64 64 64 48 64 48 10 32 48 48 64 32 48 32 48 Bảng phụ lục 2: Hoạt độ enzyme của 9 chủng vi khuẩn nuôi không sục khí Chủng vi khuẩn Lần 1 Lần 2 Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ ml) Hoạt độ amylase (W0/ ml) Hoạt độ protease (Hdp/ ml) 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 1 16 32 12 8 12 24 4 12 2 16 32 12 8 12 24 4 12 4 16 32 12 8 12 24 6 12 5 12 24 4 4 12 24 4 8 6 16 24 4 4 16 24 4 4 7 12 24 4 4 16 24 4 12 8 12 24 4 4 16 24 4 12 9 16 24 4 4 16 24 4 12 10 16 24 4 4 16 32 4 12 Bảng phụ lục 3: Hoạt độ enzyme của 4 chủng vi khuẩn trong 4 loại môi trƣờng Môi trƣờng Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn 2 7 9 10 2 7 9 10 Rỉ đường + 2% tinh bột 28 28 24 24 32 32 32 24 Rỉ đường + 1% tinh bột 18 18 18 20 24 16 24 24 Rỉ đường + 1% tinh bột +0,5%pepton 20 20 20 20 32 32 32 32 TSB + 1% tinh bột 14 14 16 14 20 20 20 20 Bảng phụ lục 4: Hoạt độ enzyme của 4 chủng vi khuẩn trong thí nghiệm 3 pH Thời gian 6,0 7,0 Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn 2 7 9 10 2 7 9 10 2 7 9 10 2 7 9 10 24 giờ (n = 8) 28 24 28 28 12 12 12 16 32 32 32 32 24 16 16 16 48 giờ (n = 8) 32 32 32 32 24 16 16 16 32 48 32 32 24 16 16 16  A. Điều kiện sục khí và thời gian nuôi cấy Analysis of Variance for PHI1.ketquaa - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI1.CON 1023.1111 8 127.8889 1.612 .1558 B:PHI1.dksuckhi 9522.0000 1 9522.0000 120.025 .0000 C:PHI1.thoigian 1682.0000 1 1682.0000 21.202 .0000 INTERACTIONS AB 792.00000 8 99.000000 1.248 .3007 AC 264.00000 8 33.000000 .416 .9038 BC 50.00000 1 50.000000 .630 .4409 ABC 296.00000 8 37.000000 .466 .8715 RESIDUAL 2856.0000 36 79.333333 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 16485.111 71 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Analysis of Variance for PHI1.ketquap - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI1.CON 2570.000 8 321.250 7.292 .0000 B:PHI1.dksuckhi 15901.389 1 15901.389 360.939 .0000 C:PHI1.thoigian 420.500 1 420.500 9.545 .0039 INTERACTIONS AB 3209.1111 8 401.13889 9.105 .0000 AC 326.0000 8 40.75000 .925 .5078 BC 93.3889 1 93.38889 2.120 .1541 ABC 485.1111 8 60.63889 1.376 .2398 RESIDUAL 1586.0000 36 44.055556 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 24591.500 71 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple range analysis for PHI1.ketquaa by PHI1.dksuckhi ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 0 36 20.111111 X 1 36 43.111111 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 0 - 1 -23.0000 4.25873 * ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for PHI1.ketquaa by PHI1.thoigian ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 24 36 26.777778 X 48 36 36.444444 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 24 - 48 -9.66667 4.25873 * ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for PHI1.ketquap by PHI1.dksuckhi ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 0 36 6.722222 X 1 36 36.444444 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 0 - 1 -29.7222 3.17361 * ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for PHI1.ketquap by PHI1.thoigian ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 24 36 19.166667 X 48 36 24.000000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 24 - 48 -4.83333 3.17361 * ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference.  B. Loại môi trƣờng nuôi cấy Analysis of Variance for PHI2.kqa - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI2.con 2.00000 3 .66667 .023 .9951 B:PHI2.moitruong 546.00000 3 182.00000 6.276 .0051 INTERACTIONS AB 42.000000 9 4.6666667 .161 .9956 RESIDUAL 464.00000 16 29.000000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1054.0000 31 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Analysis of Variance for PHI2.kqp - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI2.con 32.00000 3 10.66667 .267 .8484 B:PHI2.moitruong 832.00000 3 277.33333 6.933 .0033 INTERACTIONS AB 160.00000 9 17.777778 .444 .8906 RESIDUAL 640.00000 16 40.000000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1664.0000 31 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple range analysis for PHI2.kqa by PHI2.moitruong ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 4 8 14.500000 X 2 8 18.500000 X 3 8 20.000000 X 1 8 26.000000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 1 - 2 7.50000 5.70944 * 1 - 3 6.00000 5.70944 * 1 - 4 11.5000 5.70944 * 2 - 3 -1.50000 5.70944 2 - 4 4.00000 5.70944 3 - 4 5.50000 5.70944 ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference Multiple range analysis for PHI2.kqp by PHI2.moitruong -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 8 20.000000 X 2 8 22.000000 X 1 8 30.000000 X 3 8 32.000000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 8.00000 6.70539 * 1 - 3 -2.00000 6.70539 1 - 4 10.0000 6.70539 * 2 - 3 -10.0000 6.70539 * 2 - 4 2.00000 6.70539 3 - 4 12.0000 6.70539 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference  C. Điều kiện pH và thời gian nuôi cấy Analysis of Variance for PHI3.kqa - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI3.con 54.00000 3 18.00000 .474 .7049 B:PHI3.ph 162.00000 1 162.00000 4.263 .0555 C:PHI3.thigian 162.00000 1 162.00000 4.263 .0555 INTERACTIONS AB 150.00000 3 50.000000 1.316 .3038 AC 150.00000 3 50.000000 1.316 .3038 BC 2.00000 1 2.000000 .053 .8239 ABC 54.00000 3 18.000000 .474 .7049 RESIDUAL 608.00000 16 38.000000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1342.0000 31 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Analysis of Variance for PHI3.kqp - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI3.con 198.00000 3 66.000000 2.200 .1278 B:PHI3.ph 50.00000 1 50.000000 1.667 .2150 C:PHI3.thigian 50.00000 1 50.000000 1.667 .2150 INTERACTIONS AB 38.000000 3 12.666667 .422 .7396 AC 38.000000 3 12.666667 .422 .7396 BC 50.000000 1 50.000000 1.667 .2150 ABC 38.000000 3 12.666667 .422 .7396 RESIDUAL 480.00000 16 30.000000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 942.00000 31 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple range analysis for PHI3.kqa by PHI3.ph ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 6 16 29.500000 X 7 16 34.000000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 6 - 7 -4.50000 4.62137 ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for PHI3.kqa by PHI3.thigian ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 24 16 29.500000 X 48 16 34.000000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 24 - 48 -4.50000 4.62137 ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference.  D. Thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm Analysis of Variance for PHI5.kqa - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI5.con 279.500 3 93.167 248.444 .0000 B:PHI5.nhietdobq 4.000 1 4.000 10.667 .0026 C:PHI5.thoigianbq 31417.000 3 10472.333 27926.222 .0000 INTERACTIONS AB 3.50000 3 1.166667 3.111 .0400 AC 772.50000 9 85.833333 228.889 .0000 BC 2.00000 3 .666667 1.778 .1712 ABC 4.50000 9 .500000 1.333 .2592 RESIDUAL 12.000000 32 .3750000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 32495.000 63 -------------------------------------------------------------------------------- 1 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Analysis of Variance for PHI5.kqp - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI5.con 432.000 3 144.0000 2.250 .1015 B:PHI5.nhietdobq .000 1 .0000 .000 1.0000 C:PHI5.thoigianbq 17328.000 3 5776.0000 90.250 .0000 INTERACTIONS AB .0000 3 .00000 .000 1.0000 AC 1296.0000 9 144.00000 2.250 .0443 BC .0000 3 .00000 .000 1.0000 ABC .0000 9 .00000 .000 1.0000 RESIDUAL 2048.0000 32 64.000000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 21104.000 63 -------------------------------------------------------------------------------- 1 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple range analysis for PHI5.kqa by PHI5.thoigianbq ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 20 16 4.750000 X 30 16 4.750000 X 10 16 5.000000 X 0 16 56.000000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 0 - 10 51.0000 0.44111 * 0 - 20 51.2500 0.44111 * 0 - 30 51.2500 0.44111 * 10 - 20 0.25000 0.44111 10 - 30 0.25000 0.44111 20 - 30 0.00000 0.44111 ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for PHI5.kqa by PHI5.nhietdobq ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 30 32 17.375000 X 4 32 17.875000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 4 - 30 0.50000 0.31191 * ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 2:  Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA) Thành phần g/l Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5 g NaCl 5 g Agar 18 g Nước cất 1000 ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30 g bột môi trường TSB + 18 g agar cho vào 1000 ml nước cất, đun sôi cho hòa tan. Đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C/ 15 phút.  Môi trƣờng Tryticase Soya Broth (TSB) Thành phần g/l Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5 g NaCl 5 g Nước cất 1000 ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30 g bột môi trường TSB cho vào 1000 ml nước cất, đun sôi cho hòa tan. Đem hấp khử trùng ở 1210C/15 phút.  Môi trƣờng Clark lubs Thành phần g/l Pepton bột 7 g Glucose 5 g KH2PO4 5 g Nước cất 1000 ml pH 6,7 – 7,1  Môi trƣờng lên men các loại đƣờng Thành phần g/l Cao thịt 5 g Pepton bột 10 g Đường 10 g Phenol red 0,01 g Nước cất 1000 ml pH 7,4 Hấp khử trùng ở 1210C/15 phút.  Môi trƣờng Simons Citrate Agar Thành phần g/l Sodium citrate 2 g K2HPO4 1 g MgSO4 0,2 g Brothymol blue 0,08 g NaCl 5 g NH4H2PO4 1 g Agar 18 g pH 6,9 ± 0,2  Môi trƣờng khử Nitrate Thành phần g/l Cao thịt 3 g Pepton bột 5 g NaNO3 1 g Agar 7 g Nước cất 1000 ml pH 7,0 ± 0,2  Môi trƣờng Lòng đỏ trứng Thành phần g/l Cao thịt 1 g Pepton bột 10 g Mannitol 10 g NaCl 10 g Phenol red 0,0025 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml pH 7,2 ± 0,2 Chia 225 ml môi trường vào bình tam giác. Khử trùng ở 1210C/15 phút. Khi môi trường nguội đến 500C thêm 12,5 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà. Trộn đều rồi đổ vào các đĩa petri vô trùng. Cách pha dung dịch lòng đỏ trứng: rửa sạch trứng, sát trùng trứng bên ngoài bằng cồn. Dùng kẹp đập trứng, bỏ phần lòng trắng, chuyển phần lòng đỏ vào bucher có chứa 25 - 30 ml nước muối sinh lí vô trùng. Bảo quản dung dịch này ở 4 0C để dùng.  Môi trƣờng Rỉ đƣờng + 2% Tinh bột Thành phần g/l KH2PO4 20 g K2HPO4 20 g MgSO4 0,5 g (NH)4SO4 40 g Nước cất 1000 ml Tinh bột 20 g pH 5 – 6  Môi trường rỉ đường + 1% Tinh bột, môi trường rỉ đường 1% tinh bột + 0,5% peptone tương tự như môi trường rỉ đường + 2% tinh bột, chỉ thay đổi tỉ lệ tinh bột cho vào.  Môi trƣờng TSB + 1% Tinh bột Thành phần g/l Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5 g NaCl 5 g Nước cất 1000 ml Tinh bột 10 g pH 7,3 ± 0,2  Hóa chất Nước muối sinh lí 9%o NaCl 9 g Nước cất 1000 ml Dung dịch Iod 0,02N Cân 2 g KI hòa tan trong 3 ml nước cất, lắc đều cho tan, them nước cất vào cho đến 100 ml Dung dịch tinh bột 0,1% Tinh bột 0,1 g Nước cất thêm đến 100 ml Trộn tinh bột với khoảng 10 ml nước cất, thêm tiếp 80 ml nước cất đang sôi, khuấy đều, để nguội, thêm nước cất đến 100 ml. Dung dịch casein 0,1% Casein 0,1 g NaOH 0,1N 5 ml Nước cất 25 ml Đun cách thủy cho đến khi tan hoàn toàn. Làm lạnh dùng HCl 0,1N chỉnh pH = 8. Thêm nước cất để đủ 100 ml. Nước muối 0,1% Cân 0,1 g muối NaCl hòa tan trong 100 ml nước cất. Dung dịch acid acetic 1% trong ethanol Acid acetic đặc 1 ml Nước cất 49 ml Ethanol 96% 50 ml Hòa tan acid acetic đặc trong nước cất và ethanol.  Phƣơng pháp nhuộm Gram Các bước tiến hành : Phết canh khuẩn lên miếng lam Cố định mẫu bằng cách hơ qua ngọn đèn cồn Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm bằng crystal violet trong 2 phút Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Cố định màu bằng lugol trong 1 phút Rửa nước, thấm khô Tẩy cồn 960 khoảng 15 giây Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm màu bằng dung dịch Fuchsine kiềm loãng Rửa nước, thấm khô Xem kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần (vật kính dầu)  Thử các phản ứng sinh hóa  Khả năng lên men đường Chuẩn bị: Môi trường đường: maltose, glucose, saccharose Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Ống nghiệm, ống Durham Cách làm: cho vào ống nghiệm đã có sẵn môi trường đường một ống Durham hấp khử trùng ở 1210C/15 phút. Sau đó cấy vi khuẩn vào môi trường ủ ở 37 0C/24 giờ. Quan sát sự đổi màu sinh hơi. Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường, chuyển đường thành rượu, rượu lên men thành acid làm pH môi trường giảm, sẽ chuyển màu môi trường. Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu hồng đỏ Phản ứng (+): môi trường có màu vàng  Thử phản ứng Catalase Chuẩn bị: Dung dịch H2O2 30% Lame Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: dung piptte lấy một ít vi khuẩn, phết lên giữa lame kính sạch và khô. Sau đó nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn. Đọc kết quả su khoảng 15 giây. Kết quả: Phản ứng (-): không có hiệ tượng sủi bọt Phản ứng (+): có hiện tượng sủi bọt  Thử phản ứng VP (Voges Proskauer) Chuẩn bị: Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Môi trường Clark lubs α – naphtol 10%, NaOH 40% Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Clark lubs, nuôi ở nhiệt độ 37 0C/24 giờ. Sau đó nhỏ 3 – 5 giọt NaOH 40% và 3 – 5 giọt α – naphtol 10%. Sau 15 phút đọc kết quả. Kết quả: Phản ứng VP (-): môi trường có màu vàng Phản ứng VP (+): môi trường có màu đỏ.  Thử phản ứng MR (Methyl – Red) Chuẩn bị: Môi trường Clark lubs Thuốc thử Methyl Red Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy vào môi trường Clark lubs, nuôi ở nhiệt độ 370C/24 giờ. Sau đó nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn và đọc kết quả. Kết quả: Phản ứng MR (-): môi trường có màu vàng Phản ứng MR (+): môi trường có màu đỏ.  Thử phản ứng khử Nitrate (NO3) Chuẩn bị: Môi trường Nitrate Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy sâu vào môi trường thạch nitrate, nuôi ở nhiệt độ 370C/24 giờ. Sau 24 giờ nhỏ vào môi trường 2 – 3 giọt Giess A, sau đó nhỏ tiếp 2 – 3 giọt Giess B. Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu vàng Phản ứng (+): môi trường có màu đỏ  Thử khả năng sử dụng Citrate Chuẩn bị: Môi trường Citrate Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Citrate. Nuôi ở nhiệt độ 370C/24 giờ. Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu xanh lá mạ non Phản ứng (+): môi trường có màu xanh dương  Các phƣơng pháp thực hiện  Phương pháp kiểm tra hoạt tính amylase (Phương pháp Wolhgemuth) Phương pháp này xác định lượng enzyme ít nhất có thể phân giải hoàn toàn lượng tinh bột với chất chỉ thị màu Iodine. Một đơn vị Wolhgemuth là lượng enzyme ít nhất mà sau 30 phút ở 300C, khi có ion clorine có thể phân giải 1 mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu với Iodine. Hoạt tính của enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị Wolhgemuth trên 1 ml dịch môi trường hoặc 1 ml dung dịch chiết enzyme. Thiết bị, vất liệu và hóa chất: Bình tam giác hay bình cầu Ống nghiệm Máy ly tâm hay máy lọc Pipette Dung dịch enzyme: Nghiền cẩn thận môi trường thạch có chưa vi sinh vật, cân 20 – 100 g cho vào bình tam giác hay bình cầu, thêm 500 – 1000 ml dung dịch NaCl 1%, lắc liên tục từ 1 – 2 giờ trên mấy lắc ở nhiệt độ phòng. Lọc hoặc ly tâm để thu được dịch chiết trong suốt. Nếu môi trường nuôi cấy là dịch thể chỉ cần ly tâm tách sinh khối rồi sử dụng phần chất lỏng trong suốt thu được để phân tích. Dung dịch tinh bột 0,1% Dung dịch NaCl 0,1% Dung dịch iod 0,02%  Cách tiến hành: Chuẩn bị 10 ống nghiệm, cho vào mỗi óng 1 ml dung dịch NaCl 0,1%. Thêm vòa ống thứ nhất 1 ml enzyme ròi lắc đều, lấy 1 ml chuyển sang ống thứ hai lại lắc đều và lấy 1 ml chuyển sang ống thứ ba… Cứ thế cho đến ống thứ 10, sau cùng lấy 1 ml ở ống thứ 10 bỏ đi. Cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch tinh bột 0,1%, lắc đều, giữ ở 300C trong 30 phút. Làm lạnh, cho vào mooyj giọt dung dịch Iodine 0,02 N. Ghi nhận ống có độ pha loãng lớn nhất mà không cho tạo màu với Iodine. Ví dụ: Các ống từ 1 đến 4 không tạo màu, nhưng ống thứ 5 trở đi có màu thì hoạt tính của enzyme trong 1 ml dung dịch enzyme là 16 x 2 = 32 đơn vị. Trong đó 16 là độ pha loãng của dung dịch enzyme trong ống thứ tư, 2 là số mg tinh bột trong mỗi ống nghiệm.  Phương pháp kiểm tra hoạt tính protease (Phương pháp Gross và Fluld) Trong môi trường kiềm yếu, casein bị hòa tan nhưng khi thêm acid acetic trong ethanol, casein bị kết tủa. Trái lại, các sản phẩm thủy phân của casein lại không bị kết tủa trong điều kiện này. Phương pháp Gross và Fluld dựa trên cơ sở xác định lượng enzyme ít nhất cần thiết để phân giải 2 mg casein đến mức không bị kết tủa bởi acid acetic trong ethanol. Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme 1ml dung dịch nghiên cứu có khả năng phân giải 1 mg casein ở 380C trong thời gian 30 phút.  Thiết bị, vật liệu và hóa chất Bể điều nhiệt hay tủ ấm (380C) Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer) Ống nghiệm Dung dịch casein 0,1% Dung dịch acid acetic 1% trong ethanol  Cách tiến hành: Chuẩn bị 12 ống nghiệm sạch, khô Cho vào mỗi ống 1ml nước cất, trừ ống thứ nhất. Cho vào ống thứ nhất và ống thứ hai mỗi ống 1 ml dịch chứa enzyme, lắc đều. Chuyển 1 ml dung dịch của ống thứ hai vào ống thứ ba, lắc đều. Chuyển 1 ml dung dịch của ống thứ ba vào ống thứ tư, lắc đều. Cứ như vậy cho đến ống thứ 12. Kaays 1 ml từ ống thứ 12 bỏ đi. Như thế thể tích chất lỏng trong tất cả các ống đều là 1 ml. Tăng nhiệt độ của các ống đến nhiệt độ 380C bằng cách đặt chúng vào bể điều nhiệt cài ở 380C từ 10 – 15 phút. Thêm vào mỗi ống 2 ml dung dịch casein 0,1% có nhiệt độ 380C, lắc đều. Giữ ở 380C trong 30 phút. Đúng 30 phút làm lạnh ngay trong nước đá để ngừng phản ứng. Nhỏ theo vách mỗi ống vài giọt dung dịch acid acetic trong dung dịch ethanol. Nếu thấy tất cả các ống đều có kết tủa trắng, chứng tỏ lượng enzyme không đủ để phân giải hết casein. Cần phải chuẩn bị lại dụng dịch enzyme có nồng độ cao hơn. Còn nếu ở tất cả các ống đều không xuất hiện kết tủa cần phải pha loãng dung dịch enzyme đem phân tích. Trong trường hợp có một số ống xuất hiện kết tủa, số còn lại không kết tủa thì chọn lấy ống không kết tủa cuối cùng (đứng trước ống bắt đầu cho kết tủa) là ống có lượng enzyme bé nhất có khả năng phân giải hoàn toàn 2 mg casein. Ví dụ: ở ống thứ 7 là ống cuối cùng không cho kết tủa, lượng enzyme ban đầu pha loãng 64 lần trong ống này, tương đương với 0,0156 ml dung dịch enzyme ban đầu, và như vậy 1 ml dung dịch enzyme ban đầu có hoạt độ là 2/0,0156 = 128 đơn vị. Từ đó tính ra hoạt độ của enzyme trong 1 g chế phẩm.