Khóa luận Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin

ằm xác định loài trong phức hệ này như dựa vào hình thái, khả năng giao phối (mating experiment), phân tích cây phát sinh loài dựa trên trình tự DNA từ những loci không liên kết như tiểu đơn vị nhỏ của ti thể (mtSSU) rDNA, nuclear 28S rDNA, -tubulin, calmodulin, EF-1 , và histon H3 gen. Những kĩ thuật phân tử khác như RAPDs, mitochondrial RFLPs và CHEF-gel karyotypes cũng được dùng để phân biệt những thành viên trong phức hệ loài Gibberella fujikuroi. Ngoài ra những thành viên trong quần thể giao phối có nhiều kí chủ khác nhau và khác nhau về khả năng tạo ra các hợp chất thứ cấp như fumonisins, axít 9 Sơ đồ 2.1 Con đƣờng sinh tổng hợp GA3 ở Gibberella fujikuroi. fusaric, fusaproliferin, moniliformin, fusarins và giberelin. Những dòng của những quần thể giao phối khác nhau sẽ tạo ra những chất thứ cấp khác nhau. Vì vậy những loài của MP-A, -C, -D và -G tạo ra fumonisins, MP-A, -C và F tạo ra moniliformin, beauvericin và fusaprolifern được MP-D và E tạo ra. Ngược lại, chỉ có loài F.fujikuroi (MP-C) có khả năng sản xuất giberelins (Stefan Malonek và ctv., 2005). 2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi Theo Hiroshi Kawaide (2006), quá trình nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp giberelin có thể chia thành 3 bước như sau: Bước 1: ent-kaurene được tổng hợp từ isopentenyl diphosphate và dimethylallyl diphosphate thông qua geranylgeranyl diphosphate (GGDP). Bước 2: chuyển ent-kaurene thành GA12-7-aldehyde dưới sự xúc tác của các enzyme cytochrome P450 monoxygenases. Bước 3: qua nhiều bước GA12-7-aldehyde sẽ tổng hợp thành GA3. (Nguồn www.aseanbiodiversity.info) 10 2.3 Giới thiệu về gen tef (translation elongation factor 1- ) Theo A.R.Pokalsky và ctv (1989), gen tef là gen mã hóa cho protein EF-1 . EF-1 là một chuỗi polypeptide có vai trò quan trọng trong sự kéo dài chuỗi polypeptide ở sinh vật nhân thật (eukaryotes). EF-1 xúc tác việc gắn nhóm aminoacyl tRNAs vào vị trí A của ribosome, phản ứng này đòi hỏi GTP. EF-1 có trọng lượng phân tử là 45.000 – 55.000. Nó cũng có chức năng tương đồng với EF-Tu (prokaryotic elongation factor), cả hai yếu tố này đều hình thành phức hợp aminoacyl tRNAs và GTP. Gen mã hóa EF-1 của nhiều loài đã được tạo dòng và được đọc trình tự. Đó là của các loài nấm men, tôm Artemia sanila, nấm Mucor racemosus và người. Tất cả những gen này mã hóa các protein có độ tương đồng cao so với những protein khác. Điều hòa sự biểu hiện EF-1 là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu do nó là một protein đa dạng và có vai trò quan trọng trong việc điều khiển sinh tổng hợp protein. Khi hoạt tính EF-1 tăng thì mô phát triển do có nhiều protein được tổng hợp. Tuy nhiên hoạt tính EF-1 được điều khiển ở mức mRNA hay protein vẫn chưa được biết rõ (A.R.Pokalsky và ctv., 1989). Dựa vào vùng gen tef có thể phân biệt được giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Vùng tef được nghiên cứu nhiều hơn vì chứa trình tự DNA đặc trưng cho từng nhóm loài (Lại Hà Tố Hoa, 2006). (David M.Geiser và ctv., 2004) Sơ đồ 2.2 Bảng đồ vùng gen tef ở Fusarium trong FUSARIUM-ID. 11 2.4 Tổng quát về giberelins 2.4.1 Đại cƣơng về các chất giberelins Giberelins (GAs) là nhóm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhóm auxin. Năm 1950 trong lúc nghiên cứu bệnh “foolish seedling” hay “bakanae disease” các nhà khoa học Nhật Bản thấy rằng bệnh gây ra bởi một chất hóa học do nấm tiết ra. Chất này được gọi là giberelin. Năm 1930, những nhà khoa học Nhật đã thành công trong việc thu tinh thể của hai hợp chất có hoạt tính tăng trưởng tiết ra từ nấm, chúng là giberelin A và B, nhưng do sự giới hạn về giao tiếp và chiến tranh thế thứ hai nên mãi đến giữa năm 1950 cấu trúc của chất này mới được xác định và được đặt là axít giberelic: (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Sau đó, năm 1956 ở Anh, J MacMillan lần đầu tiên đã tách thành công được giberelin từ hạt đậu Phaseolus vulgaris. Từ đó đến nay, người ta đã tách được những giberelin khác nhau trên nhiều loài cây. Ví dụ: Ở cây lúa chứa 14 loại giberelins, hạt ngô chứa 12 giberelins và lúa mì chứa 5 giberelins (Đào Văn Hoằng, 2005). Đặc điểm cấu trúc của tất cả giberelins có điểm chung là chúng được chuyển hóa từ ent-kaurene: Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic. Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 12 Sau khi axít giberelic đã được tìm hiểu khá rõ, các nhà thực vật học bắt đầu khảo nghiệm nó trên nhiều loài cây khác nhau. Có những phản ứng kì lạ được thấy ở sự tăng trưởng của những cây lùn và thực vật hoa thị (rosette plants), đặc biệt ở cây đậu Hà Lan lùn (Pisum sativum), cây ngô lùn (Zea mays) và nhiều cây hoa thị. Ngược lại, ở những cây đã có đặc tính di truyền cao thì sẽ không có đáp ứng cao hơn nữa khi dùng giberelins. Gần đây những thí nghiệm trên cây đậu Hà Lan lùn và cây ngô lùn chứng tỏ sự tăng trưởng tự nhiên của cây được điều hòa bởi giberelins. (Lincoln Taiz và ctv., 2002). Không lâu sau khi phát hiện hiệu quả kích thích tăng trưởng của axít giberelic, những hợp chất giống giberelin được tách từ nhiều loài cây khác nhau. Hợp chất này có hoạt tính sinh học giống giberelin nhưng cấu trúc hóa học thì chưa được xác định. Khi ngày càng nhiều GAs từ nấm và thực vật được xác định, chúng được đánh số thứ tự là giberelin Ax (hay GAx) với x là thứ tự phát hiện ra chúng. Tất cả GAs dựa trên cấu trúc của ent-gibbrellane skeleton nhưng đối với từng chất lại có những thay đổi tinh vi làm cho hoạt tính của từng chất trở nên khác nhau. Axít giberelic (GA3) được sản sinh từ nấm Gibberella fujikuroi là giberelin được xác định cấu trúc đầu tiên và là giberelin quan trọng nhất và được nghiên cứu nhiều nhất. Hiện nay có khoảng 136 loại giberelins được tách và xác định cấu trúc từ thực vật, nấm và vi khuẩn ( Mặc dù có nhiều Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 13 loại GAs trong cây nhưng chỉ có một vài GAs có hoạt tính như một hormon, tất cả những loại khác ở dạng tiền chất hay dạng bất hoạt. 2.4.2 Chức năng và vai trò sinh hóa (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Mặc dù GAs được phát hiện đầu tiên là nguyên nhân gây ra bệnh lúa von nhưng những GAs nội sinh cũng ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển của cây. Ngoài sự kéo dài của thân, GAs còn kích thích quá trình nảy mầm của hạt bao gồm phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt. Trong quá trình sinh sản của thực vật, giberelin có thể ảnh hưởng đến sự chuyển từ giai đoạn còn non sang giai đoạn trưởng thành cũng như bắt đầu ra hoa, xác định phái tính của hoa. 2.4.2.1 Giberelins kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị Giberelin được dùng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở nhiều loài cây. Tuy nhiên kích thích mạnh nhất được tìm thấy ở những cây lùn và cây hoa thị (rosette plant) cũng như những cây họ hòa thảo. GA3 ngoại sinh gây ra sự kéo dài thân ở những cây lùn bên cạnh đó chúng làm thân cây ốm yếu, giảm kích thước lá và lá có màu xanh nhạt. Dùng giberelin giúp thân cây hoa thị phát triển trong những ngày ngắn và sự phát triển thân bình thường được điều hòa bởi giberelin nội sinh. Ngoài ra nhiều cây hoa thị ngày dài đòi hỏi điều kiện lạnh cho sự phát triển của than, ra hoa và đòi hỏi này được khắc phục bởi việc dùng giberelin. GA cũng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở những cây hòa thảo (lúa nước là một ví dụ dễ thấy). Mặc dù GAs có tác động mạnh đến sự tăng trưởng của thân nhưng nó ít ảnh hưởng trực tiếp lên sự phát triển của rễ. Gần đây, người ta chưa biết rõ ảnh hưởng của Hình 2.7 GA3 kích thích cây bắp cải ra hoa và phát triển cao. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 14 giberelin lên sự tăng trưởng của rễ một cách gián tiếp hay trực tiếp. 2.4.2.2 Giberelins điều hòa sự chuyển hóa cây con sang giai đoạn trƣởng thành Các nhà nghiên cứu thấy rằng nhiều cây lâu năm không ra hoa cho đến khi chúng đạt đến giai đoạn trưởng thành. Giai đoạn non và trưởng thành thường khác nhau về hình dạng lá như cây Thường Xuân ở Anh (Hedera helix), do đó việc dùng GAs cả hai hướng này phụ thuộc vào loài. GA3 có thể gây chuyển hóa từ giai đọan trưởng thành sang giai đoạn còn non ở cây Thường Xuân và việc dùng những GAs không phân cực như GA4 + GA7 có thể làm cho nhiều cây Tùng Bách non chuyển sang giai đoạn sinh sản. 2.4.2.3 Giberelins ảnh hƣởng đến giai đoạn bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính Giberelins có thể thay thế nhu cầu dài ngày hay khí hậu lạnh để ra hoa ở nhiều cây, đặc biệt cây hoa thị do vậy giberelin được dùng để kích thích ra hoa ở một vài cây. Ở cây có hoa lưỡng tính thì sự xác định giới tính hoa được điều hòa bởi giberelin. Tuy nhiên, nó cũng bị ảnh hưởng bởi những nhân tố môi trường như quang chu kì, dinh dưỡng và các nhân tố này có thể được trung hòa bởi giberelin. 2.4.2.4 Giberelins đẩy mạnh “fruit set” Dùng GAs có thể gây ra “fruit set” (quả bắt đầu tăng trưởng sau khi thụ phấn) và sự tăng trưởng của một vài quả mà auxin không có tác dụng. Ví dụ: giberelin kích thích “fruit set” ở cây táo (Malus sylvestris). 2.4.2.5 Giberelins thúc đẩy sự nảy mầm của hạt GAs cần cho một hay nhiều bước trong quá trình nảy mầm của hạt. Giberelin đánh thức quá trình ngủ nghỉ của hạt để bắt đầu nảy mầm. Khi hạt được ngâm vào nước giberelin được giải phóng, đánh thức và kích thích hạt nảy mầm. Ngoài ra giberelin còn kích thích sự tạo nhiều hydrolases, đặc biệt -amylase, kích thích tổng hợp chất truyền tín hiệu RNA cho các men, qua đó nó tác động lên men di truyền. Như vậy tác dụng sinh học của giberelin rất đa dạng tùy thuộc vào từng loại giberelin cũng như loài cây. 15 2.4.3 Ứng dụng GAs trong thƣơng mại (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 2.4.3.1 Trong trồng trọt Sử dụng GAs chủ yếu để làm tăng chiều dài cuống của nho không hạt. Giberelin kích thích cuống phát triển dài hơn vì vậy làm cho quả phát triển lớn hơn và đẩy mạnh sự kéo dài của quả. Hỗn hợp benzyladenine (cytokinin) và GA4 + GA7 làm cho quả táo phát triển dài ra và được dùng để cải thiện hình dáng của quả táo loại ngon trong một vài điều kiện. Mặc dù việc xử lý này không làm tăng năng suất hay mùi vị, nó cũng được mong đợi để thương mại. Ở cây có múi, GAs làm chậm sự già yếu. 2.4.3.2 Sản xuất bia Một trong những ứng dụng quan trọng là dùng để tăng sản lượng mạch nha từ lúa mạch dùng làm rượu bia. GAs được sử dụng để làm nẩy mầm hạt lúa mạch gia tăng tạo ra enzym thủy giải những chất dự trữ trong hạt thành acid amin và đường để thành mạch nha. 2.4.3.3 Tăng sản lƣợng mía Mía (Saccharum officinarum) là một trong số ít cây dự trữ đường thay vì tinh bột (cây dự trữ đường quan trọng khác là củ cải đường). Có nguồn gốc từ New Hình 2.8 Ảnh hƣởng của GA3 đến giống nho không hạt của Thompson. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Có xử lý GA3 Không xử lý GA3 16 Guinea, mía có thể cao từ 4 – 6 m. Đường được dự trữ ở trung tâm không bào của tế bào mô đốt. Phun giberelin có thể tăng sản lượng mía lên 20 tấn trên mẫu và sản lượng đường 2 tấn trên mẫu. Kết quả này là do kích thích sự kéo dài của đốt trong suốt mùa đông. 2.4.3.4 Sử dụng trong chọn giống thực vật Phun GA4 + GA7 làm giảm mạnh thời gian tạo hạt. Ngoài ra đẩy mạnh hoa đực ở cây họ bầu bí và kích thích kéo dài thân cây củ cải đường (Beta vulgaris) và bắp cải (Brassica oleracea). Do tác dụng đa dạng của giberelin, người ta có thể căn cứ vào mục đích của từng trường hợp để sử dụng cho hiệu quả. Bản thân các chất giberelin không gây dị ứng cho da khi tiếp xúc, không nằm trong danh mục các chất gây ung thư hay chất độc do các tổ chức thế giới qui định. Vì vậy chúng được khuyến cáo sử dụng trong nông nghiệp. Ngày nay trên thế giới có rất nhiều chế phẩm thương mại của giberelin đang sử dụng như Activol, Berelex, Giberelin, Gibrel, Pro-gibb, Pro-gibb plus, regulex. Ở Việt Nam các giberelin cũng đã được sử dụng rộng rãi trên nhiều đối tượng cây trồng: lúa, các loại rau quả, kích thích mủ cao su (Đào Văn Hoằng, 2005). 2.5 Sắc ký lớp mỏng 2.5.1Tổng quát về sắc ký lớp mỏng Sắc lý lớp mỏng là kỹ thuật phân bố rắn lỏng, trong đó pha động là chất lỏng được cho đi qua một chất hấp thu trơ (ví dụ silicagel hay oxít nhôm), chất hấp thu này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một lớp phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng. Theo Nguyễn Xuân Dũng và ctv (1985) quá trình thực hiện sắc ký gồm các bước sau: Chuẩn bị bản mỏng Bản mỏng có thể là tấm kính, tấm nhôm hay tấm plastic có tráng một chất hấp thu trơ (silicagel hoặc oxít nhôm). Thông thường bản có kích thước 5 x 20 cm, 10 x 20 cm, 20 x 20 cm. Đôi khi dùng vật kính cỡ 2,5 x 7,5 cm để phân tích nhanh. 17 Theo tiêu chuẩn Stahl bản có kích thước 10 x 20 cm và 20 x 20 cm. Bề dày của kính từ 2 – 4 mm. Nếu đế bản kim loại thì mỏng hơn nhiều. Dùng kính tốt nhất vì có thể rửa dễ dàng, sử dụng lại và đặc biệt có thể dùng các thuốc hiện ăn mòn mạnh hoặc tác dụng phá hủy mạnh. Nếu cần hiện sắc ký đồ ở nhiệt độ lớn hơn 150oC cần dùng để làm bằng loại thủy tinh bosilic. Đưa mẫu lên bản sắc ký Trước khi chấm mẫu lên bản phải vạch sẵn đường “mức xuất phát‟ cách đáy bản 1 cm và đường “mức tiền tuyến dung môi” cách đầu trên của bản 0,5 cm. Với bản bán sẵn, dùng viết chì vót nhọn vạch nhẹ; với bản tự tráng trong phòng thí nghiệm rất dễ tróc nên vạch cẩn thận và nhẹ nhàng bằng đầu nhọn của vi quản. Lượng chất và hỗn hợp chất đưa lên bản có ý nghĩa quan trọng đối với kết quả tách sắc ký, đặc biệt ảnh hưởng tới giá trị Rf. Lượng chất lớn làm cho vệt sắc ký lớn và thường kéo dài, các vệt của các chất có giá trị Rf gần nhau bị chồng chập. Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạt của thuốc thử không cho phép. Nếu mẫu là chất lỏng thì sử dụng trực tiếp còn nếu mẫu là chất rắn hòa tan mẫu bằng loại dung môi phù hợp (ví dụ như ete, cloroform, nước) để mẫu phải tan hoàn toàn. Dung môi dùng hòa tan mẫu để chấm lên bản là loại dung môi càng dễ bay hơi; càng ít phân cực càng tốt. Nếu dung môi dùng để hòa tan mẫu được hấp thu mạnh lên lớp mỏng thì khi dung môi giải ly đi ngang qua vết chấm tại mức xuất phát, dung môi giải ly sẽ gây nên những vết bất thường dẫn đến các vết tách được sẽ bị biến dạng nghiêm trọng. Nhúng nhẹ phần đầu nhọn vi quản vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch mẫu vào vi quản. Chấm nhẹ phần đầu nhọn có chứa mẫu lên bản mỏng, tại một điểm, ở mức xuất phát (đối với các dung dịch nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trước khi đưa lên bản hoặc có thể làm giàu trực tiếp lên bản bằng cách chấm nhiều lần ở đúng một vị trí, chờ chấm trước khô mới chấm chấm sau). Nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm vào bề mặt của lớp mỏng, tránh không làm thủng lỗ trên bề mặt này. Chạm vào và lấy vi quản ra thật nhanh để dung 18 dịch mẫu thấm vào bản tạo thành một điểm tròn nhỏ. Thổi hoặc dùng máy sấy tóc để sấy nhẹ giúp dung môi bay hơi mau, không lan thành vết to. Nếu cần chấm nhiều dung dịch khác nhau lên cùng một tấm bản, các vết cách đáy bản 1 cm; vết này cách vết kia 1 cm; các vết nên cách bờ cạnh của bản 1 – 1,5 cm (để tránh hiệu ứng bờ). Vi quản được sử dụng trở lại sau khi rửa bằng aceton. Sau khi chấm xong nên dùng máy sấy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm rồi mới nhúng bản vào dung dịch ly giải. Khai triển sắc ký đồ là quá trình tách các cấu tử trên lớp mỏng. Trước khi đặt bản vào trong bình, bình cần được bảo hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất bằng cách khi ta rót dung môi vào bình cần để một tờ giấy lọc áp sát thành bình và sát đáy bình được tẩm dung môi. Kích thước của bình và thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể. Nếu bình không được bão hòa dung môi thì khi dung môi giải ly là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm do dung môi đi ở bên cạnh nhanh hơn ở giữa bản. Sau khi mẫu đã được chấm lên bản ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai có kích thước phù hợp (bản phải thẳng đứng hoặc hơi nghiêng một góc nhỏ hơn 15 độ so với đường thẳng đứng), dung môi trong bình phải ngập bản 0,5 cm, tối đa 0,7 cm, nghĩa là cách điểm xuất phát 0,8 – 1 cm. Một hệ dung môi dung ly phù hợp là hệ sau khi giải ly sẽ cho vết chính có giá trị Rf từ 0,3 đến 0,7. Tùy theo hướng chuyển động, cách chuyển động, thành phần dung môi có thể có các cách khai triển sắc ký đồ sau: + Khai triển theo kiểu dung môi giải ly di chuyển lên. + Khai triển theo kiểu dung môi giải ly di chuyển xuống. + Khai triển hai chiều. Hiện sắc đồ: đối với những chất được sắc ký không màu hoặc màu rất nhạt, thì sau khai triển ta phải hiện sắc đồ bằng phương pháp hóa học hoặc quang học, phóng xạ đối với các đồng vị phóng xạ. 19 Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC Dụng cụ chuẩn bị TLC Chấm mẫu lên bảnTLC Chuẩn bị quá trình ly giải Quá trình ly giải Phát hiện vết trên đèn UV Phun thuốc thử thích hợp lên bản, rồi sấy 120o/5’ Hình 2.9 Sơ đồ các bƣớc thực hiện TLC. 20 2.5.2 Ƣu điểm của sắc ký lớp mỏng Cần ít mẫu. Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích. Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích sẽ có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng; trong khi so với HPLC những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký đồ ở dạng một mũi hấp thu rộng và lài nên khó phân biệt được đó là một mũi để chỉ sự hiện diện của một chất hay chỉ là tạp bẩn. Sau quá trình giải ly dung môi sẽ được loại bỏ khỏi tấm bản mỏng trước khi dùng kỹ thuật vật lý hay hóa học để phát hiện sự hiện diện chất nên không phải nghĩ đến vấn đề hậu sắc ký như ở HPLC. 2.5.3 Một số ứng dụng thông thƣờng của TLC Xác định thành phần các chất trong hỗn hợp. Xác định tính đồng nhất của hai chất. Theo dõi quá trình phản ứng. Xác định hiệu quả của một qui trình tinh sạch của một chất. Xác định điều kiện thích hợp cho sự phân phân tách của sắc ký cột. Theo dõi quá trình sắc ký cột. 2.6 Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài nấm Kỹ thuật PCR là kỹ thuật sử dụng những cặp mồi “oligonucleotide” để khuếch đại một đoạn DNA đặc biệt nào đó trong một qui trình có tính chất tự động hóa. Có rất nhiều ứng dụng của kỹ thuật PCR trong nghiên cứu khoa học cũng như trong thương mại. Trong đó kỹ thuật PCR đặc biệt có ý nghĩa quan trọng đối với các nhà Bảo vệ Thực vật vì kỹ thuật này giúp họ định danh đúng tên loài sinh vật gây bệnh một cách chính xác mà điều này khó thực hiện được nếu dựa vào hình thái và khả năng tạo độc tố của nấm. Bên cạnh đó phản ứng PCR thì nhanh và nhạy hơn các kỹ thuật vi sinh khác. Phản ứng vẫn tiến hành tốt với một lượng mẫu rất ít và không cần đến sự có mặt của vi sinh vật. Điều đó được 21 Kamel A. Abd-Elsalam và ctv (2003) chứng minh khi thực hiện phản ứng PCR bằng cặp mồi ITS-Fu-f và ITS-Fu-r và phản ứng này vẫn nhạy khi nồng độ DNA của F. oxysporum trong khoảng 10 ng – 100 fg. Ví dụ: Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng gen tef của các loài nấm thuộc giống Fusarium bằng cặp mồi ef1-ef2 để tạo nền tảng cho việc định danh đúng các loài thuộc giống này đặc biệt là các loài thuộc phức hệ Gibberella fujikuroi, phức hệ F.solani, F.oxysporum và những loài tạo trichothecene loại A và B (David M. Geiser và ctv., 2004). 22 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2007 đến 08/2007. 3.1.2 Địa điểm thực hiện Phân lập và tách đơn bào tử tại phòng bệnh cây, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Nhân sinh khối nấm Fusarium moniliforme tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Ly trích DNA tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Tiến hành PCR tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Tiến Hành Sắc Ký Lớp Mỏng tại Phòng Hóa Lý – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 23 3.2 Vật liệu nghiên cứu Bảng 3.1 Các dòng nấm Fusarium moniliforme đƣợc thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long trong tháng 02/2007 và tháng 05/2007. STT Kí hiệu các dòng nấm F.moniliforme Giống Lúa Địa điểm lấy mẫu 1 FM1 Jasmine 85 Thốt Nốt – Cần Thơ 2 FM2 Jasmine 85 Ô Môn – Cần Thơ 3 FM3 OM 2517 Cờ Đỏ - Cần Thơ 4 FM4 OM 2518 Ô Môn – Cần Thơ 5 FM5 OM 2518 Châu Thành – An Giang 6 FM6 Jasmine 85 Châu Phú – An Giang 7 FM7 OM 2517 Chợ Mới – An Giang 8 FM8 OM 2514 Thoại Sơn – An Giang 9 FM9 OM 2517 Càng Long – Trà Vinh 10 FM10 Jasmine 85 Châu Thành – Trà Vinh 11 FM11 OM 504 dòng 2 Tiểu Cần – Trà Vinh 12 FM12 OM 4698 Càng Long – Trà Vinh 13 FM13 Jasmine 85 Mỹ An – Đồng Tháp 14 FM14 OM 2518 Tháp Mười – Đồng Tháp 15 FM15 OM 4655 Châu Thành – Đồng Tháp 16 FM16 OM 2517 Mỹ An – Đồng Tháp 17 FM17 OM 4698 Châu Thành – Kiên Giang 18 FM18 Jasmine 85 An Biên – Kiên Giang 19 FM19 OM 1490 Tân Hiệp – Kiên Giang 20 FM20 OM 2517 Châu Thành – Kiên Giang 24 3.3 Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm 3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, que cấy các loại, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, nồi hấp, tủ sấy, máy lắc, bông gòn không thấm, bút lông, giấy thấm, máy khuấy từ, cá từ. Môi trường agar nước (Water agar), PDA (Potato dextrose agar), môi trường nhân sinh khối. Nước cất. *Cách pha môi trường nhân sinh khối Thành phần môi trường nhân sinh khối chứa trong một lít nước gồm: Glucose 20g KH2PO4 0,5g K2HPO4 0,5g MgSO4 0,5g Yeast extract 5g CaCl2 1 ít Cho hỗn hợp trên vào trong becher 1 lít khuấy cho tan hết bằng máy khuấy từ. Rót vào mỗi bình tam giác 100 ml. Đậy bình bằng nút bông và giấy bạc. Rồi đem hấp ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. *Cách pha môi trường agar nước (WA – water agar) Cho 20 g agar vào 1 lít nước cất đun sôi khuấy đều rồi đem hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 15 phút sau đó cho vào đĩa petri, mỗi đĩa khoảng 15 ml. *Cách pha môi trường PDA Môi trường PDA là môi trường giàu cacbo hydrate chứa: Dextrose 20g Agar 15g Khoai tây 200g Nước 1 lít 25 Khoai tây bào vỏ, rửa sạch, thái nhỏ nấu khoảng 1 giờ. Lọc lấy nước trong. Cho vừa đủ lượng agar, nước và đường khuấy đều trong lúc nấu. Đem hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. 3.3.1.2 Phƣơng pháp phân lập nấm Nấm được phân lập từ mẫu lúa bệnh theo các bước sau: Mẫu đưa về phòng thí nghiệm khử trùng bằng cồn 70oC. Cắt mẫu bệnh thành những đoạn nhỏ có kích thước 3 – 5 mm sau đó ủ trên môi trường agar nước để hạn chế nhiễm khuẩn. Ủ 2 – 3 ngày lấy sợi nấm mọc trên mẫu bệnh sang môi trường WA. Ủ 2 ngày dùng dao cấy cắt miếng thạch có sợi nấm sang PDA. Thấy khuẩn lạc đặc trưng của nấm Fusarium moniliforme sau 5 – 7 ngày ủ. Tiến hành tách đơn bào tử của nấm. 3.3.1.3 Phƣơng pháp cắt đơn bào tử Sau khi phân lập được dòng nấm mong muốn thuần chủng, ta tiến hành tách đơn bào tử. Qui trình tách đơn bào tử được thực hiện như sau: Lấy khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA cho vào cốc nước cất đã khử trùng. Quan sát dưới kính hiển vi để xem lượng bào tử đã thích hợp chưa nếu quá nhiều bào tử ta tiến hành pha loãng tiếp đến khi nồng độ thích hợp. Dùng pipet hút 10 µl dung dịch bào tử lên lam có trải một lớp mỏng agar rồi trang đều sau đó ủ 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành quan sát trên kính hiển vi tìm những bào tử nào nảy mầm riêng rẽ và mọc tách riêng rẽ rồi dùng dao cấy cắt vùng thạch chứa bào tử đó, cấy vào đĩa petri chứa môi trường WA. Đem ủ ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày rồi cấy sang PDA. Đem ủ ở nhiệt độ phòng 3 – 5 ngày bào tử sẽ mọc thành khuẩn lạc có màu đặc trưng của nấm. 26 3.3.1.4 Phƣơng pháp nhân sinh khối Chuẩn bị môi trường nhân sinh khối (Mục 3.3.1.1). Sau khi thu được khuẩn lạc tiến hành nhân sinh khối trong môi trường đã chuẩn bị. Nhân sinh khối nấm bằng cách lắc trên máy lắc từ 150 – 200 vòng/phút ở 26 – 30oC. Nên kiểm tra trong 2 ngày đầu vì rất dễ nhiễm khuẩn. Sau 3 – 5 ngày tiến hành thu sinh khối bằng cách lọc trên vải lọc đã hấp khử trùng. Đặt sinh khối nấm vào giấy bạc rồi cất vào tủ -70 C. 3.3.2 Phƣơng pháp ly trích DNA của nấm 3.3.2.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm Nitơ lỏng Lysis buffer: 50 mM Tris HCl + 50 mM EDTA + 3% SDS + 1% -mecaptoethanol. Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1). Chloroform/isoamylalcohol (24:1). Isopropanol. Ethanol 70%. TE 1X: 10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA, pH = 8,0. Dụng cụ thí nghiệm gồm có: cối và chày để nghiền mẫu nấm, máy vortex, bồn ủ nhiệt Memmert, máy ly tâm, eppendorf, micropipette và đầu típ các loại. 3.3.2.2 Phƣơng pháp ly trích DNA Qui trình 1: DNA của nấm được ly trích theo qui trình Lee và Taylor cải tiến (Kurt Weising và ctv., 1995). Qui trình có thay đổi một số bước cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Các bước ly trích DNA như sau: Bước 1: Mẫu nấm được nghiền trong nitơ lỏng cho đến mịn (trong lúc nghiền cho liên tục nitơ lỏng vào để mẫu nấm không bị tan). Cho mẫu nấm đã được nghiền mịn vào eppendorf. Bước 2: Thêm 400 l lysis buffer, vortex cho đến khi hỗn hợp đồng nhất. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer. Ủ ấm ở 65oC trong vòng 1 giờ. 27 Bước 3: Thêm vào 400 l phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1). Lắc đều, nhẹ. Ly tâm 14000 vòng/15phút ở nhiệt độ phòng. Hút lấy phần dịch nổi ở trên vào eppendorf mới. Bước 4: Thêm vào eppendorf mới 400 l chloroform/isoamylalcohol (24:1). Trộn đều, ly tâm 14000 vòng/10 phút/28oC. Hút lấy phần dịch nổi ở trên cho eppendorf khác. Bước 5: Thêm vào isopropanol lượng chất bằng 0,6 tổng thể tích của ống nghiệm để tủa DNA. Lắc nhẹ, ủ ít nhất 30 phút ở 4oC. Ly tâm 14000vòng/15phút/ 28oC. Bước 6: Dùng que thu DNA tủa ở đáy ống. Rửa DNA tủa nhiều lần bằng ethanol 70%. Bước 7: Phơi DNA đến khô rồi hòa tan DNA mẫu trong dung dịch TE 1X và giữ ở 4oC hay -20oC. Qui trình 2: Ở bước 3 chỉ thay phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) bằng chloroform/isoamylalcohol (24:1). 3.3.2.3 Định tính DNA Định tính DNA của nấm sau khi ly trích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8% - 1% theo các bước sau: Chuẩn bị gel agarose bằng cách: Cân 0,15 g agarose cho vào 15 ml TAE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong lò viba ở 650W trong 2 phút. Để nhiệt độ trong chai giảm xuống dần, đổ vào khuôn có gắn lược với số giếng mong muốn. Chờ gel đông, lấy lược ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu. Nạp mẫu, điện di và đọc kết quả: dùng micropipette hút lấy 4 l mẫu, trộn đều với 2 l loading buffer 6X, hút tổng lượng thể tích là 6 l bơm vào giếng tương ứng đã bố trí sẵn. Lần lượt bơm các mẫu khác đã được trộn đều với thuốc nhuộm vào tất cả các giếng còn lại. Tiến hành điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế là 100V, cường độ dòng điện 400mA trong 20 phút. Kết thúc quá trình điện di, bảng gel được chuyển vào thuốc nhuộm ethidium 28 bromide (1%) trong khoảng 15 – 20 phút, rửa sạch gel bằng nước máy và đọc kết quả bằng phần mềm Quality One của máy Gel doc 2000 (Biorad). 3.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm ly trích DNA tổng số sau khi ly trích thường có nhiều tạp có thể do các nguyên nhân sau chưa loại bỏ hết protein, DNA bị gãy, tạp nhiễm RNA. Do đó trước khi tiến hành PCR, DNA tổng số nên được tinh sạch theo qui trình dưới đây: Bước 1: Pha loãng mẫu ly trích với TE 1X hay nước cất vô trùng theo tỷ lệ 3 mẫu : 1 TE 1X (hay nước). Bước 2: Hút 200 l hỗn hợp chloroform/isoamylalcohol (24:1) vào eppendorf mẫu, lắc nhẹ. Bước 3: Đem ly tâm hỗn hợp ở 9800 vòng ở 10oC trong thời gian 10 phút. Tiến hành hút dịch nổi cho vào eppendorf khác. Bước 4: Lập lại bước 2 và 3. Bước 5: Thêm vào isopropanol lượng chất bằng 0,6 tổng thể tích của eppendorf. Ủ -20oC trong 30 phút. Bước 6: Ly tâm 9800 vòng trong 20 phút. Loại bỏ dịch nổi. Bước 7: Rửa DNA 2 lần bằng ethanol 70%. Bước 8: Phơi mẫu ở 37oC cho đến khô rồi cho TE 1X vào. 3.3.3 Khuếch đại vùng tef của nấm Gibberella fujikuroi bằng kỹ thuật PCR 3.3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm Trình tự 2 mồi được dùng trong phản ứng PCR để khuếch đại vùng tef. Mồi xuôi: 5‟-ATG GGT AAG GA(A/G) GAC AAG AC- 3‟ Mồi ngược: 5‟-GGA (G/A)GT ACC AGT (G/C)AT CAT GTT-3‟ Dụng cụ thí nghiệm: Máy PCR. Micropippette, đầu típ, eppendorf các loại. Lò vi sóng. Cân kỹ thuật 4 số. 29 Bồn điện di . 3.3.3.2 Thực hiện phản ứng Bảng 3.2 Thành phần một phản ứng PCR Thành phần Nồng độ đầu Liều lƣợng phản ứng Nồng độ cuối 5X Buffer 5X 10 1X MgCl2 25 mM 3 1.5 mM dNTP 25 mM 0,4 0.2 mM EF1 10 pmol/ l 1 10 pmol/ l EF2 10 pmol/ l 1 10 pmol/ l Taq polymerase 5 u/ l 0,2 1.25 u DNA mẫu 1 Nước Vừa đủ phản ứng 50 l Chu kì nhiệt của phản ứng PCR Giai đoạn 1: 95oC trong 3 phút Giai đoạn 2: Bước 1: 95oC trong 30 giây Bước 2: 53oC trong 45 giây 30 chu kỳ Bước 3: 72oC trong 45 giây Giai đoạn 3: 72oC trong 7 phút 3.3.3.3 Đánh giá sản phẩm PCR Thực hiện tương tự Mục 3.3.2.3. 3.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phát hiện GA3 3.4.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm Các dụng cụ dùng trong sắc ký như sau: máy khuấy từ, cá từ, máy đo pH, máy lắc, nồi hấp, giấy lọc, phễu, máy cô quay, bình cầu, bình lắng, ống đong thể 30 tích 50 ml, pipet các loại, kẹp, kéo, bình ly giải, becher các loại, ống mao quản, bản mỏng, bình tam giác các loại, tủ sấy, đèn UV. Các hóa chất: chloroform, methanol, acid acetic, acid sulfuric, ethanol, acetone, ethyl acetate, acid chlohydride 0,5N, natri bicarbonate. Thành phần môi trường ICI: Glucose 80g MgSO4 5g KH2PO4 1g NH4NO3 5g Nước 1 lít 3.4.2 Phƣơng pháp sản xuất GA3 Chuẩn bị môi trường 20% ICI như Mục 3.4.1. Cho 100 ml môi trường vào mỗi bình tam giác 250 ml. Đem hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. Lấy 0,1 ml dịch nấm cho vào bình chứa môi trường. Lắc 200 vòng/phút ở 28oC trong vòng 7 ngày. 3.4.3 Phƣơng pháp trích GA3 Lọc dịch nấm bằng giấy lọc để loại bỏ sinh khối. Sau đó tiến hành trích mẫu theo qui trình phân tích GA3 của phòng Hóa Lý, Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. Dịch nuôi cấy Chỉnh pH=2,5 bằng HCl 0,5N Trích 3 lần bằng ethyl acetate (50 ml) Trích 3 lần với NaHCO3 8% Sắc ký lớp mỏng Pha nước (lớp dưới) Bỏ Pha ethyl acetate (lớp trên) 31 3.4.4 Định tính GA3 bằng TLC Qui trình định tính GA3 được xây dựng theo phương pháp của MacMillan (1963) trong đó chúng tôi đã thay đổi hệ dung môi giải ly cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm: Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA3. Chấm mẫu lên bản sắc ký có chất hấp thụ Silicagel Ly giải trong hệ dung môi CHCl3:EtOAc:AcOH [60:40:5] Phun bản bằng EtOH:H2SO4[95:5] Sấy bản 120oC trong 5 phút Phát hiện GA3 bằng đèn UV (365nm) Sơ đồ 3.2 Qui trình TLC phát hiện GA3. 32 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thu mẫu bệnh lúa von ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Bệnh lúa von do nấm gây ra, có giai đoạn vô tính là Fusarium moniliforme và giai đoạn hữu tính là Gibberella fujikuroi (B.Tudzynski, 1999). Trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm tạo ra GAs làm cho cây lúa phát triển chiều cao vì thế gây ra các triệu chứng đặc trưng của bệnh lúa von. Dựa vào triệu chứng đặc trưng này là cây mạ bị nhiễm bệnh vươn dài ra cao hơn hẳn cây lúa bình thường, có bộ lá mỏng màu xanh vàng, thối rễ và bị chết. Ở giai đoạn đẻ nhánh, cây bị bệnh ít nở bụi, gầy và cao, lá đòng có màu xanh vàng dễ nhận biết cao hơn lên hẳn phía trên tầng lá bình thường của ruộng, lóng phát triển dài ra, thường mọc nhiều rễ phụ ở đốt (rễ gió) và có thể thấy lớp phấn trắng phớt hồng bao quanh đốt thân và vị trí xung quanh đốt thân. Chúng tôi đã thu thập được 20 mẫu bệnh thuộc các giống Jasmine 85, OM 2517, OM 2514, OM 4655, OM 2518, OM 4698, OM 504 dòng 2 tại các tỉnh được biểu thị ở Bảng 3.1. Trong nhiều vụ lúa vừa qua, bệnh lúa von đã phát triển nặng trên một số giống lúa như Jasmine 85, OM 2517, IR42 ở An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Sóc Trăng, Trà Vinh ( Thực tế thu mẫu cho thấy giống lúa Jasmine 85 và OM 2517 bị nhiễm bệnh lúa von nhiều hơn các giống khác (Hình 4.1a và Hình 4.1b). Cả hai ruộng lúa này đều ở Huyện Càng Long Tỉnh Trà Vinh tại thời điểm 01/05/2007 và đều bị nhiễm bệnh lúa von nhưng ở Hình 4.1a là ruộng được trồng với giống OM 4698 (nhiễm ít) còn ruộng ở Hình 4.1b thì được trồng bằng giống OM 2517 (nhiễm nhiều). Vậy để hạn chế lúa bị nhiễm bệnh nên tiến hành các biện pháp phòng trừ sau: gieo cấy các giống lúa ít mẫn cảm với bệnh; không dùng hạt giống từ những hạt bị bệnh; xử lý hạt giống bằng nước nóng 54oC hoặc thuốc hóa học trừ nấm có hiệu quả trong việc phòng trừ 33 bệnh lúa von (Phạm Văn Biên và ctv., 2003). Ngoài ra, theo S.H.Ou (1985) bào tử nấm Fusarium moniliforme có thể tồn tại trong đất 4 tháng do đó nên xử lý đất sau khi thu hoạch và trồng cách vụ để hạn chế tối đa sự phát sinh của mầm bệnh. Ghi chú: các mũi tên chỉ cây lúa nhiễm bệnh lúa von. 4.2 Kết quả phân lập và tách đơn bào tử Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh (3 mm x 3 mm) trên môi trường WA (môi trường nghèo dinh dưỡng nên loại sự tạp nhiễm trên mẫu bệnh), từ mẫu bệnh xuất hiện sợi nấm mọc lên trên mẫu và lan ra môi trường (Hình 4.2). Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von ở Càng Long – Trà Vinh ngày 01/05/2007. (a) giống OM 4698 bị nhiễm nấm F.moniliforme; (b) giống OM 2517 bị nhiễm nấm F.moniliforme. (a) (b) Mẫu bệnh Sợi nấm mọc trên mẫu bệnh Hình 4.2 Mẫu bệnh sau 3 ngày ủ trên môi trƣờng WA. 34 Hình 4.4 Màu khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme trên môi trƣờng PDA sau 7 ngày cấy. Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm trên mẫu bệnh sang môi trường WA, sau 2 – 3 ngày sợi nấm mọc lan ra môi trường. Tiến hành tách một phần môi trường có sợi nấm sang đĩa môi trường PDA (môi trường để tạo dòng thuần các dòng nấm và dùng để định danh nấm dựa vào hình thái), tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 5 – 7 ngày thu được khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme có những đặc điểm (Hình 4.3) như : màu trắng nhạt, mọc tỏa ra theo cấu trúc hình tròn, bề mặt khuẩn lạc xốp kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Trần Tùng (2005). Theo Lester W. Burgess và ctv (1994), khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme khi được nuôi cấy trên môi trường PDA có màu sắc rất đa dạng như không màu, cam nhạt (bright organe hay pale organe), xám tím (violet grey), tím đậm (dark violet) hoặc đỏ đậm (dark magenta). Trong 20 dòng nấm được phân lập thu được 18 dòng có khuẩn lạc màu cam nhạt và 2 dòng có màu đỏ đậm. Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm F.moniliforme sau 7 ngày cấy. 35 Để khẳng định mẫu nấm thu được là Fusarium moniliforme tiếp tục xem bào tử dưới kính hiển vi. Kết quả nhận thấy đại bào tử (Hình 4.5) và tiểu bào tử (Hình 4.6). Quan sát đại bào tử và tiểu bào tử của các dòng nấm được phân lập dưới kính hiển vi ở vật kính 40X chúng tôi ghi nhận được các đặc điểm giống như mô tả của (Vũ Triệu Mân và ctv., 1998): đại bào tử của nấm Fusarium moniliforme thanh mảnh, dài, hai đầu nhọn, hơi cong hình lưỡi liềm hay gần thẳng có một cái móc ở đỉnh và có 3 – 5 vách ngăn và tiểu bào tử có hình trứng dẹt, không có hoặc có một vách ngăn. Sau khi thu được các dòng nấm có khuẩn lạc thuần, tiến hành tách đơn bào tử với mục đích tạo ra khuẩn lạc đồng nhất về mặt di truyền (Trích Ngô Quang Hưởng, 2006) và hạn chế đột biến trong quá trình nuôi cấy (Paul E. Nelson, 1992). Dựa vào các đặc điểm trên chúng tôi tiến hành tách đơn bào tử theo Mục 3.3.1.3. Và tách thành công đơn bào tử của 20 dòng nấm được phân lập. 4.3 Kết quả nhân sinh khối Bào tử thu được sau khi tách đơn bào tử sẽ phát triển thành khuẩn lạc. Dùng dao cấy cắt 3 mẫu thạch chứa sinh khối nấm (mỗi mẫu kích thước khoảng 9 mm2) đĩa petri sang bình tam giác để tăng nhanh sinh khối. Các bình tam giác này chứa môi trường nhân sinh khối và được lắc ở 160 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 C. Nấm Hình 4.5 Đại bào tử F.moniliforme (xem ở vật kính 40X). Hình 4.6 Tiểu bào tử F.moniliforme (xem ở vật kính 40X). 36 được nhân sinh khối trong môi trường lỏng nhằm tạo điều kiện cho khuẩn lạc nấm tiếp xúc với môi trường nhiều hơn từ đó tăng nhanh sinh khối. Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi sinh khối đã đạt được lượng cần thiết ta tiến hành thu sinh khối. Vấn đề thường gặp trong giai đoạn này là rất dễ bị nhiễm khuẩn, đặc biệt là trong ngày thứ nhất và thứ hai. Tuy theo dõi từng ngày trong quá trình lắc nhưng do lắc liên tục nên rất khó phát hiện bị nhiễm khuẩn trong khi lắc. Để đảm bảo không bị nhiễm khuẩn, trước khi thu sinh khối ta tiến hành quan sát kỹ dịch lỏng, thông thường mẫu bị nhiễm khuẩn sẽ bị đục trong khi lắc. 4.4 Kết quả ly trích DNA của nấm Sợi nấm được thu nhận sau khi nhân sinh khối các dòng nấm và được tiến hành ly trích DNA tổng số theo qui trình 1 nêu ở Mục 3.3.2.2. Kết quả ly trích được thể hiện ở Hình 4.7. Sản phẩm điện di DNA tổng số ly trích theo qui trình 1 có quá nhiều tạp, do đó chúng tôi đã tiến hành ly trích DNA theo qui trình 2 là thay thế bước xử lý phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) bằng chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) thì hạn chế được lượng DNA đứt gãy (Hình 4.8). Tạp Hình 4.7 Kết quả ly trích DNA theo qui trình 1. 37 Ghi chú: (1) FM1; (2) FM2; (3) FM3; (4) FM4; (5) FM5; (6) FM6; (7) FM7; (8) FM8; (9) FM9; (10) FM10; (11) FM11; (12) FM12; (13) FM13; (14) FM14; (15) FM15; (16) FM16; (17) FM 17; (18) FM18; (19) FM19; (20) FM20. Thời gian ở các lần ly tâm của qui trình Lee và Taylor cải tiến 10 – 15 phút do đó đã tăng thời gian để phá hủy lớp vỏ tế bào, lớp màng nhân, loại bỏ protein và cũng giúp cho sự phân lớp giữa phần dịch tế bào chứa DNA, lớp xác tế bào và protein tốt hơn vì vậy loại bỏ được nhiều tạp trong quá trình ly trích mặc dù qui trình này không dùng proteinase K để loại bỏ các protein và RNase để loại bỏ RNA. Bên cạnh đó, phenol có thể làm đứt gãy DNA. Do đó khi tiến hành ly trích với qui trình 2 chúng tôi thu được kết quả tối ưu hơn qui trình 1. Theo Hình 4.8, DNA của các dòng FM12, FM13, FM14, FM17, FM19 có lượng tạp rất ít nên có thể tiến hành 15 12 13 14 16 17 18 19 20 DNA tổng số Phần tạp 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 9 Hình 4.8 Kết quả ly trích DNA của 20 dòng nấm Fusarium moniliforme theo qui trình 2. 38 chạy PCR sau khi pha loãng 10 lần bằng TE 1X hoặc nước khử ion. DNA của các dòng nấm còn lại do lượng tạp tương đối nhiều nên phải tiến hành tinh sạch lại. 4.5 Kết quả PCR Theo David và ctv (2004) một trong những trở ngại lớn khi nghiên cứu Fusarium là việc định danh loài dựa vào hình thái, độc tố hoặc khả năng gây bệnh vì những đặc điểm phân chia loài dựa vào hình thái chưa rõ ràng đồng thời cũng có nhiều biến đổi và đột biến trong quá trình nuôi cấy. Để giải quyết vấn đề này các tác giả trên đã tạo ra Fusarium ID.v.1.0 – dữ liệu trình tự DNA của vùng tef để xác định nhanh và chính xác các nấm tạo độc tố trichothecene loại B và phức hệ loài Gibberella fujikuroi; Fusarium oxysporum; Fusarium solani. Vùng gen tef có thể phân biệt được giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Vùng tef được nghiên cứu nhiều hơn do chứa trình tự DNA đặc trưng cho từng nhóm loài (Trích Lại Hà Tố Hoa, 2006). Đặc biệt đối với Fusarium vùng gen tef mã hóa những protein thiết yếu trong quá trình dịch mã và rất hữu ích để xác định nguồn gốc phát sinh loài. Ngoài ra gen này là bản sao đơn bền vững ở Fusarium và nó cho mức độ đa hình cao ở các loài có quan hệ gần gũi từ đó tef trở thành công cụ định danh Fusarium dựa trên locus đơn. Trên cơ sở đó chúng tôi sử dụng cặp mồi ef1 và ef2 được thiết kế bởi O‟Donnell và ctv (1998) để khuếch đại vùng gen tef của 20 dòng nấm Fusarium spp. gây bệnh lúa von ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Kết quả thu được sản phẩm khuếch đại của 14 dòng nấm có kích thước gần bằng 700 bp rõ và ít tạp. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của David và ctv (2004). Bên cạnh đó kết quả PCR (Hình 4.9) cũng cho thấy sản phẩm PCR của các dòng nấm Fusarium moniliforme được thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh ĐBSCL đều có kích thước của vùng tef bằng nhau. Hạn chế của đề tài là chúng tôi chưa tiến hành PCR hết tất cả các dòng nấm được phân lập. 39 4.6 Kết quả định tính GA3 bằng TLC GAs là nhóm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhóm auxin do những ứng dụng đa dạng của nó đối với sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản của cây trồng như kích thích sự kéo dài của đốt, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt và xác định phái tính của hoa (Lincoln Taiz và ctv., 2002). Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được hơn 136 loại giberelins tiết ra từ vi khuẩn, nấm và thực vật ( Trong đó, nấm Gibberella fujikuroi gây bệnh lúa von sản xuất nhiều GA3. Vì vậy chúng tôi tiến hành nuôi 20 dòng nấm Fusarium moniliforme được phân lập trên môi trường sản xuất GA3 – 20% ICI trong 7 ngày trên máy lắc 200 vòng/phút/28oC (Stefan Malonek và ctv., 2005). Sau đó tiến hành trích GA3 như Mục 3.4.3 rồi thực hiện TLC theo Mục 3.4.4. Kết quả nuôi 20 dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường 20% ICI tốt, không bị nhiễm trong quá trình nuôi cấy. Để kiểm tra giới hạn phát hiện GA3 của chuẩn chúng tôi tiến hành TLC chất chuẩn ở các nồng độ 1, 5, 10, 50 và 100 ppm. Kết quả các chuẩn ở nồng độ 1 và 5 ppm thấy không hiện vết khi quan sát dưới đèn UV, còn các chuẩn 10 và 50 ppm thì hiện vết mờ vì thế chúng tôi chọn chuẩn 100 ppm để tiến hành cùng với mẫu. Hình 4.9 Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ DNA của các dòng Fusarium moniliforme bằng cặp primer ef1-ef2. (1) DNA được khuếch đại từ dòng nấm FM1; (2) FM2; (3) FM3; (4) FM4; (5) FM5; (6) FM7; (7) FM8; (M) ladder; (8) FM9; (9) FM11; (10) FM12; (11) FM14;(12) FM15; (13) FM16; (14) FM18. 4 9 1 2 3 5 6 7 10 8 11 12 13 14 M 700bp 40 Trong 20 mẫu nấm sau khi nuôi cấy, trích GA3 và tiến hành TLC trên hệ dung môi chloroform: ethyl acetate: acid acetic (60:40:5) chúng tôi nghi ngờ 3 dòng nấm FM2, FM5 và FM15 có thể tạo ra GA3 trong môi trường nuôi cấy (Hình 4.10). Các dung dịch nuôi cấy 17 dòng còn lại không hiện vết tại vị trí có Rf tương đương với chuẩn. Theo Hình 4.10 nhận thấy vết đầu tiên trên bản TLC từ dưới lên của dung dịch nuôi cấy 3 dòng nấm FM2, FM5 và FM15 tương ứng với vị trí số 1, 2, 4 có giá trị Rf tương đương với vết GA3 chuẩn 100 ppm ở vị trí số 3 (Rf=0,12). Ghi chú: (1); (2); (4) tương ứng là dung dịch nuôi cấy các dòng nấm FM2, FM5 và FM15. (3) chuẩn GA3 100 ppm. Tuy nhiên chúng tôi tiến hành trên hệ dung môi chloroform:methanol:acid acetic (85:15:5) (Đỗ Thị Di Thiện, 2005) phân cực hơn hệ dung môi cũ nhằm khẳng định Rf của các vết từ dung dịch nấm có tương đương với vết chuẩn GA3 hay không. Kết quả thu được Rf của 3 mẫu thấp hơn Rf của chất chuẩn. Ngoài ra dựa vào Hình 4.10, các vết khác ở các mẫu có thể là các giberelins khác do nấm tiết ra trong quá trình nuôi cấy. Thật vậy, theo tác giả Nguyễn Văn Uyển (1989), dung dịch nuôi cấy một số chủng nấm lúa von Gibberella fujikuroi đã phát hiện sự tồn tại của 25 loại giberelin. Từ những kết quả trên nhận thấy qui trình thực hiện trên 20 dòng nấm không hiệu quả do một số nguyên nhân sau: điều kiện nuôi cấy nấm, qui trình trích GA3 chưa tối ưu và nồng độ GA3 trong dung dịch nuôi cấy nấm quá thấp. Hình 4.10 Kết quả TLC dịch nấm sau khi nuôi cấy các dòng nấm F.moniliforme trong môi trƣờng 20% ICI. 41 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập và tách đơn bào tử được 20 dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Có thể áp dụng qui trình 2 ở Mục 3.3.2.2 để tiến hành ly trích DNA của nấm Fusarium moniliforme. Qui trình PCR ở mục 3.3.3.2 ổn định cho sản phẩm rõ và không có tạp nên dùng để phân tích PCR trên vùng tef của nấm Fusarium moniliforme. Đã chạy thành công 14/20 dòng nấm được phân lập. Trong 20 dòng nấm, chưa phát hiện được dòng nào sản xuất GA3 trong môi trường 20% ICI bằng TLC. 5.2 Đề nghị Tiến hành thí nghiệm chủng nấm in vitro từ đó có thể xác định được dòng nấm có độc tính mạnh nhất có nghĩa là tìm dòng nấm nào tạo nhiều GA3 nhất. Tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR rồi đem kết quả đọc trình tự so sánh với trình tự trên Genbank để có thể xác định rõ loài gây bệnh. Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp và quy trình trích giberelin hiệu quả để nấm Gibberella fujikuroi có khả năng sản xuất giberelin. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu trong nƣớc 1. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chinh, 2003. Cẩm nang sâu bệnh gây hại cây trồng, quyển 1, cây lương thực, thực phẩm, hoa cảnh. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 123 – 125. 2. Bùi Chí Bửu, Ngyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 331 – 348. 3. Nguyễn Xuân Dũng và Phạm Hùng Việt, 1985. Các phương pháp sắc ký. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Trang 225 – 297. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. 5. Lại Hà Tố Hoa, 2006. Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA và vùng tef.. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 6. Đào Văn Hoằng, 2005. Kỹ thuật tổng hợp các hóa chất bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội. Trang 317 – 320. 7. Ngô Quang Hưởng, 2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dương) bằng kỹ thuật RFLP – PCR”. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 8. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998. Bệnh cây nông nghiệp. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. Trang 82 – 84. 9. Đỗ Thị Di Thiện, 2005. Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên sự ảnh hưởng của cây Hông (Paulownia fortunai) và cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L. cv samsum) nuôi cấy invitro. Khóa luận cử nhân khoa học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên. 10. Trần Tùng, 2005. Bệnh hại hạt lúa giống sau khi thu hoạch và ảnh hưởng của biện pháp xử lý thuốc hóa học đến tác nhân gây bệnh, chất lượng hạt giống. Luận án thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 43 11. Nguyễn Kim Phi Phụng. Các phương pháp nhận danh , trích ly cô lập các hợp chất hữu cơ. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên 2000 – 2001. Trang 1 – 25. 12. Nguyễn Văn Uyển, 1989. Các chất sinh trưởng trong nông nghiệp. Nhà xuất bản TP.HCM. Trang 18 – 49. 13. Tài liệu qui trình phân tích các hormon thực vật. Phòng Hóa Lý, Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 2. Tài liệu nƣớc ngoài 14. A.R.Pokalsky, W.R.Hiatt, N.Ridge, R.Rasmussen, C.M.Houck and C.K.Shewmaker, 1989. Structure and expression of elongation factor 1 in tomato. < =2748335> 15. B.Tudzynski, 1999. Biosynthesis of gibberellins in Gibberella fujikuroi: biomolecular aspects. Appl Microbiol Biotechnol 52: 298 – 310. 16. David M. Geiser, María del Mar Jiménez-Gasco, Seogchan Kang, Izabela Makalowska, Narayanan Veeraraghavan, Todd J.Ward, Ning Zhang, Gretchen A. Kuldau and Kerry O‟Donnell, 2004. FUSARIUM-ID v. 1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology 00. 17. Hiroshi Harada and Antom Lang, 1964. Effect of some (2-Chloroethyl) trimethylammonium chloride analogs and other growth retardants on gibberellin biosynthesis in Fusarium moniliforme. 18. Hiroshi Kawaide. Biochemical and molecular analyses of gibberellin biosynthesis in fungi.<www.aseanbiodiversity.info/scripts/count_article.asp?Article _code=51006656> 19. Kamel A. Abd-Elsalam, Ibrahim N. Aly, Mohmed A. Abdel-Satar, Mohmed S. Khalil and Joseph A. Verreet, 2003. PCR identification of Fusarium genus based on nuclear ribosomal-DNA sequence data. Africa journal of iotechnology vol.2. p82 – 85 . 20. Kurt Weising, Hilde Nybom, Kirsten wolff and Wieland Meyer, 1995. DNA fingerprinting in plants and fungi.CRC Press. 322 pages. 21. Lester W. Burgess, Brett A. Summerell, Suzanne Bullock, Kathryn P. Gott, and David Backhouse, 1994. Laboratory manual for Fusarium research. 3 rd edition. University of Sydney. 44 22. Lincoln Taiz and Eduardo Zeiger, 2002. Plant Physiology. 3rd edition. p509 – 540. 23. MacMillan. J and Suter. P.J, 1963. Thin layer chromatography of the gibberellins. Nature 197: 790. 24. Paul E. Nelson, 1992. Taxonomy and biology of Fusarium moniliforme. Mycopathologia 117: 29 – 36. 25. Reyes Candau, Javier Avalos and Enrique Cerdá-Olmedo, 1992. Regulation of gibberellin biosynthesis in Gibberella fujikuroi. Plant Physiol 100: 1184 – 1188. 26. S.H.Ou, 1985. Rice diseases. Second edition. Commonwealth mycological institute. p262 – 272. 27. Stefan Malonek, Christiane Bomke, Erich Bornberg-Bauer, María C. Rojas, Peter Hedden, Paul Hopkins, Bettina Tudzynski, 2005. Distribution of gibberellin biosynthesis genes and gibberellin production in the Gibberella fujikuroi species complex. Phytochemistry 66: 1296 – 1331. 3. Tài liệu internet 28. 29. 30. 31. 32. 33. Techniques/TLC/thin_layer_chrom.html. 34. 35. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bình sắc ký Phụ lục 2: Công thức tính Rf Trong đó: a: Khoảng đường di chuyển của dung môi. b: Khoảng đường di chuyển của hợp chất. Rf = b/a